CN102426187A - 石墨烯基质及其在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种石墨烯基质及其在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测的应用，它是在MALDI-TOFMS中将石墨烯作为辅助基质能高效、快速地实现从小分子化合物到生物大分子的分析和检测，更为重要的是可有效排除传统有机基质的分子离子峰的背景干扰，能够实现对氨基酸、脂类化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸等各种结构分子的分析和检测。用石墨烯作为基质的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱是不需要加入任何有机基质的解吸离子化方法，可避免被分析物分解，具有很好的重现性和高耐盐性；为天然产物及生物代谢物提供了高效、快速的检测方法，同样也可用于常见生物大分子的检测，可以在所有的MALDI-TOFMS质谱中推广和应用，实现了石墨烯的深层次应用。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测，具体是一种石墨烯基质及其在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中的应用。
背景技术
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其无论是在理论上还是在设计上都是十分简单和高效的。仪器主要由两部分组成：基质辅助激光解吸电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比，检测离子。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用。
1988年，Tanaka 和Hillenkamp各自提出了MALDI技术，这种方法的成功之处是在质谱中引入了基质（Matrix）。在MALDI-TOF MS中，基质起着吸收、传递激光能量、使样品离子化的决定性作用，而且辅助基质的引入还解决了非挥发性和热不稳定性的生物大分子在质谱中的解吸离子化问题，使其能成功检测。目前，市场上出售的常用基质为α--氰基-4-羟基肉桂酸 (CHCA)、2，5-二羟基苯甲酸(DHB)、芥子酸(SA)、纳米硅膜、类金刚石材料及其他们的衍生物等。基质的存在对于能量传递以及保持分子的完整性及其重要，但基体的引入不可避免地导致在低分子量区域内基质峰的存在，因此大大限制了该方法在小分子分析中的应用。因此，基质种类的选择，浓度的大小，样品和基质的比例大小的选择因素使样品制备更加复杂，很难实现对小分子化合物的快速分析。
熊少祥等利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析甲壳素脱乙酰化降解产物—壳聚糖，对基质、制样方法等影响MALDI-TOFMS测定结果的因素进行了研究。实验发现，以2，5-二羟基苯甲酸（DHB）为基质，二次结晶法制样分析壳聚糖，既获得了壳聚糖的分子量信息，又可以推断壳聚糖的脱乙酰度；卓慧钦等以二羟基苯甲酸（DHB）为基质，应用MALDI-TOF MS技术，采用比对法，研究在乙腈作用下HTF裂解成为各种各样短肽的规律，初步阐明其裂解机理。在乙腈作用下，HTF可能通过蛋白质去折叠途径，形成不同多聚态HTF或多肽裂解产物。推测目前用于临床诊断先天性糖基化紊乱（CDG）和慢性酒精滥用（CAA）疾病低准确率的起因可能是受HTF裂解产物或多聚体的干扰；刘念等以芥子酸(SA)为基质，通过探讨影响质谱成像实验的主要因素，建立了优化的基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的生物组织质谱成像方法。
但正如上所述，上述基质易产生小分子离子峰对分析结果（尤其是对小分子化合物）产生干扰，且对于纯的样品，MALDI-FOF MS能够分析样品低至飞摩尔（femtomole，10-15）到阿托摩尔 (attomole，10-18)的样品。但是在实际分析样品时，样品来源都是非常复杂的体系如血液、细胞溶解物、组织、培养液等，其中含有大量的蛋白质、盐、表面活性剂、防腐剂等杂质，此外，样品本身的疏水性和酸碱性质也极大地影响离子化效率，因而传统基质(matrix，如α--氰基-4-羟基肉桂酸 (CHCA)、2，5-二羟基苯甲酸(DHB)、芥子酸(SA))的MALDI-TOF MS很难分析这样复杂的样品，同时对操作者也有很高的要求，而且操作者需要冗长的时间去摸索最佳实验条件，费时费力。因此限制了该项技术对低分子量化合物的分析及对小分子代谢物等生物催化反应体系的监控，急需开发新型基质。
石墨烯基质在MALDI-TOF MS质谱分析中的应用，尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供石墨烯或功能化石墨烯基质。
实现本发明目的的技术方案是：
一种石墨烯基质的制备方法，包括如下步骤：
（1）将石墨(1.5 g, 325 目)加入到12 ml 浓 H2SO4, 2.5 g K2S2O8 和 2.5 g P2O5的混合物中，加热上述混合体系至80 oC，保持该温度，磁力搅拌5小时。随后冷却反应体系至室温；
（2）将混合物倾入500ml去离子水中，静置过夜；
（3）将上述静置物经0.2微米滤膜过滤，洗涤并自然晾干，得预氧化石墨；
（4）将该预氧化的石墨加入到0 oC的浓 H2SO4 (120 ml)中；
（5）随后缓慢加入15 g KMnO4，并控制反应温度在20 oC搅拌。高锰酸钾加毕，控制反应体系在35 oC搅拌4小时，随后，加入250 ml去离子水，并通过***冰浴控制温度在50 oC以下。搅拌1.5小时后，再加入700 ml去离子水，半小时后，逐滴滴入20 ml 30% H2O2，反应体系迅速由棕色转变为棕黄色。撤去搅拌装置；
（6）过滤该棕黄混合物，用1 : 10 HCl 1 L洗涤以除去金属离子，随后再用1 L去离子水反复洗涤，得棕色固体，室温干燥后；
（7）将上述棕色固体制成水分散液(0.5% w/w)，连续透析一周，最后过滤，洗涤，重新分散超声1小时，过滤，60 oC真空干燥24小时，即可制备得到石墨烯氧化物；
（8）将上述石墨烯氧化物制成1 mg/ml分散液（100 ml），加入水合肼（1 ml），超声30 分钟后再100 oC 回流24小时，过滤，洗涤，60 oC真空干燥24小时，即可制备得到石墨烯纳米片基质。
石墨烯基质的另一种制备方法，包括如下步骤：
(1)将碳纳米管样品置于空气中400 ℃煅烧1小时，然后置于通有氩氢混合气的管式炉中于900 ℃加热1小时；
(2)将第一步处理好的碳纳米管加入到12 mol/L的浓盐酸中在100 ℃回流4小时，再过滤并用去离子水清洗至中性，在800℃烘干；
(3)将碱金属钠与碳纳米管按质量比2∶1混合，随后通过碱金属熔融法进行处理；
(4)将产物过滤洗净，于80 ℃烘干，得石墨烯纳米带基质。
除石墨烯纳米片和纳米带外，所述的石墨烯还可以是石墨烯纳米颗粒、石墨烯纳米纤维等各种石墨烯产品。
功能化石墨烯基质的制备方法，包括如下步骤：
（1）将石墨烯氧化物（200 mg）分散到40ml二氯亚砜与1 ml N,N-二甲基甲酰胺的混合介质中，室温超声0.5小时，随后回流52小时，制备得到棕色酰氯化合物（219.2 mg）
（2）将按照文献方法制备的邻苯二甲酰壳聚糖（phthaloyl chitosan，1.753 g），LiCl （1.201 g）和N，N-二甲基乙酰胺（DMAC，120 ml）混合，在氮气保护下140 oC反应2小时，冷却该反应体系后，将前一步制得的棕色酰氯化合物（219.2 mg）及14 ml吡啶加入到反应体系中，氮气保护下回流48小时，冷却后，过滤，洗涤，真空干燥；
（3）干燥后固体在120 ml蒸馏水中搅拌6小时，过滤，保留固体重新分散于200 ml水中，超声1小时，过滤，洗涤。所得固体在真空65 oC下干燥24小时，得中间体PHCS-GO(205 g)；
（4）将该中间体分散于15 ml水合肼中，80 oC下反应16小时去除邻苯二甲酰保护。过滤，洗涤，真空干燥得含活性胺基的壳聚糖功能化石墨烯(175 mg)纳米片基质。
功能化石墨烯纳米材料的另一种制备方法，包括如下步骤：
（1）将方法1制备的功能化石墨烯 (100 mg)加入1.5 ml水。随后，加入10 ml乙二醇，超声20分钟，逐滴加入氯化钯乙二醇溶液10 ml(2.03 mg Pd/ml)，调节pH值到5-6，反应体系剧烈超声5分钟，随后搅拌过夜；
（2）随后，用2.5 M的氢氧化钠调节pH值到13，140 oC下反应3小时，整个反应过程均采取氮气保护。冷却到室温后，过滤；
（3）水及乙醇洗涤各三次，真空65 oC下干燥24小时，得功能化石墨烯：钯纳米颗粒/壳聚糖修饰的石墨烯类纳米片基质。
所述的功能化石墨烯基质包括：羟基、巯基等功能团修饰、小分子修饰、高分子修饰、量子点、金属纳米粒子修饰、金属氧化物修饰、DNA等生物大分子等功能材料修饰的石墨烯。
石墨烯基质表征：
检测所用仪器有：
产物尺寸和形貌的表征是在JEM-2010F透射电镜(TEM)，JEOL-2010F高分辨透射电镜(HRTEM) 以及JSM-7401F场发射扫描电镜(FESEM)上进行的，电镜的工作电压为200 kV。X射线能谱（EDS）及选区衍射（SAED）实验是在JEOL-2010F高分辨透射电镜下完成的。产物的粉末X射线衍射(XRD)表征是在德国Bruker D8-advance X射线衍射仪上进行的，X射线是单色的CuKα辐射线(λ=1.5418 ?)，2θ扫描角度从10到70°，步长0.02°。傅里叶红外光谱(FTIR)实验FTIR-8201(PerkinElmer公司)红外光谱仪上进行。红外光谱分析通过样品与KBr压片后进行测试。拉曼光谱选用英国雷绍尼公司Renishaw microprobe RM1000型拉曼光谱仪，激发波长633 nm（He/Ne激光器）。原子力测试 (Atomic force microscopic，AFM)采用美国维易科精密仪器有限公司的Nanoscope III MultiMode SPM (数显)型扫描探针原子力显微镜。元素分析采用美国EAI公司的CE-440元素分析仪。
检测结果为：
典型功能化石墨烯材料表征结果如下：以钯纳米颗粒/石墨烯复合材料为例，负载前石墨烯纳米片基本为单层或少层叠加形貌，单层石墨烯层厚约0.80 nm，石墨烯大小约为1-5μm，负载后钯纳米粒子的直径范围在2-8 nm之间，具有较小的粒径及较窄带粒径分布（依据透射电镜及扫描电镜表征结果）；拉曼光谱显示其在1331 cm-1及1590 cm-1具有特征拉曼峰，分别归属为石墨烯的D带和G带；X射线衍射图（XRD）观察到24.7 o 、39.6°、45.5° 和 67.3°等四个布拉格反射峰，第一个对应于石墨烯的（002）晶面，后三个峰依次对应钯的(111), (200), (220)晶面；红外光谱显示该纳米材料具有1545 cm-1 特征峰，可归属为石墨烯的骨架震动。
本发明的另一个目的是提供石墨烯或功能化石墨烯材料作为基质应用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测。
石墨烯或功能化石墨烯在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中的应用方法，包括如下步骤：
（1）仪器与试剂的准备：BIFLEX III 型MALDI TOF质谱仪；氮激光器，波长337 nm，采用离子延迟引出及反射的工作方式，正离子检测；所采集的数据利用Flexcontrol 2.2，数据分析软件 FlexAnalysis 2.4，质谱成像软件 FlexImaging 1.0，差异分析软件 ClinProtools 2.0等软件处理；
（2）在载体上制备石墨烯膜或石墨烯涂层，气体吹干备用；所述的石墨烯膜为单层或2-4层，是以石墨烯或功能化石墨烯粉末为原料，经物理方法在载体表面形成均匀的镀层，厚度约为100-500 nm；所述石墨烯涂层亦为单层或2-4层。
（3）将载体固定在MALDI靶上；
（4）将溶剂分散后样品滴加到石墨烯膜或涂层表面后，使样品与基质形成的混晶二次结晶，溶剂挥发后即制得待测分析样品，进行激光解析离子化质谱分析。
所述的石墨烯或功能化石墨烯膜作为基质可用于分子量为50-8500Da.（道尔顿）有机小分子化合物、生物大分子、聚合物、C60、一些配合物的质谱检测，且石墨烯不易被分析物分析，并具有很好的重现性和高耐磨性。
所述的有机小分子化合物为50-1000Da，包括小肽核苷酸单体、氨基酸、脂类或糖类化合物。
所述的生物大分子为1000-8500Da，包括多钛、蛋白质、寡糖、寡核苷酸等。
本发明的优点是：
1、特质性强：作为基质的石墨烯（功能化石墨烯）膜或涂层具有独特的物理和化学特性，如高硬度、低摩擦系数、高耐磨性、化学稳定性、耐腐蚀性、导热性、光学透过性、生物相容性等；
2、适应性强：载体可以是商品化MALDI靶、硅片、载玻片、玻璃、金属片或高分子塑料；
3、成本低，通用性强：使用后的基质：石墨烯膜或涂层经有机溶剂清洗、再生后，可重复使用；
4、灵敏度高：有效排除有机基质产生的背景影响，避免基质分子离子峰信号的干扰，实现了对小分子化合物的准确定性分析；
5、分析范围宽：可成功实现氨基酸、核苷酸单体等小分子量化合物、聚醚等高分子聚合物、C60、一些配合物乃至DNA、蛋白质等生物大分子的高灵敏检测，检测范围：分子量50-8500 Da.（道尔顿）；
6、重现性和高耐盐性: 应用石墨烯为新型基体可避免被分析物分解，具有很好的重现性和高耐盐性；
7、高效、快速、简便的特点：用石墨烯（功能化石墨烯）作为基质的MALDI-TOF MS，是一种不需要加入任何有机基质的新的解吸离子化方法，为天然产物及生物代谢物提供了高效、快速的检测方法，同样也适用于常见生物大分子的检测，可以在所有的MALDI-TOF MS质谱中推广和应用，实现了石墨烯的深层次应用。
附图说明
图1为以石墨烯为基质检测精胺(分子离子峰 203 [M+H]+，205 [M+Na]+)，精脒（分子离子峰168 [M+Na]+）及腐胺（分子离子峰111 [M+Na]+）等混合胺的MALDI-TOF MS谱图；
图2为微波辅助法制备的石墨烯的原子力图；基底：云母片，尺寸：4.0 × 4.0 μm；
图3为XRD射线衍射分析：a）石墨烯；b）钯纳米粒子功能化的的石墨烯；
图4为轮烯的MALDI-TOF MS谱图（基质：石墨烯，分子离子峰：300.1）；
图5为以石墨烯为基质检测氯苯Ullmann反应中间体捕捉的MALDI-TOF MS谱图。
具体实施方式
下面通过几个典型应用实施例进一步阐述石墨烯基质或功能化石墨烯基质在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中的应用。
实施例中所述石墨烯基质或功能化石墨烯基质采用如前所述的制备方法制得，在此不再重述。
实施例1：检测精胺精脒腐胺等混合胺样品的方法
（1）仪器与试剂为：BIFLEX III 型MALDI TOF质谱仪（Bruker公司）；氮激光器，波长337 nm，采用离子延迟引出（delayed extraction）及反射（reflectorn）的工作方式，正离子检测；所采集的数据利用Flexcontrol 2.2，数据分析软件 Flex Analysis 2.4，质谱成像软件 Flex Imaging 1.0，差异分析软件 Clin Protools 2.0等软件处理；
（2）在载体上制备石墨烯纳米片涂层，气体吹干备用；
（3）将载体固定在MALDI靶上；
（4）将N,N-二甲基甲酰胺溶剂分散后的精胺精脒腐胺等混合胺(等摩尔比)样品溶液滴加到石墨烯膜或涂层表面后，使样品与基质形成的混晶二次结晶，溶剂挥发后即制得待测分析样品，进行激光解析离子化质谱分析（图1）。
实施例2：检测轮烯样品的方法
（1）仪器与试剂为：BIFLEX III 型MALDI TOF质谱仪（Bruker公司）；氮激光器，波长337 nm，采用离子延迟引出（delayed extraction）及反射（reflectorn）的工作方式，正离子检测；所采集的数据利用Flexcontrol 2.2，数据分析软件 Flex Analysis 2.4，质谱成像软件 Flex Imaging 1.0，差异分析软件 Clin Protools 2.0等软件处理；
（2）在载体上制备石墨烯纳米片涂层，气体吹干备用；
（3）将载体固定在MALDI靶上；
（4）将二甲苯溶剂分散后的轮烯样品溶液滴加到石墨烯涂层表面后，使样品与基质形成的混晶二次结晶，溶剂挥发后即制得待测分析样品，进行激光解析离子化质谱分析(图4)。
实施例3：检测鲨烯样品的方法
（1）仪器与试剂为：BIFLEX III 型MALDI TOF质谱仪（Bruker公司）；氮激光器，波长337 nm，采用离子延迟引出（delayed extraction）及反射（reflectorn）的工作方式，正离子检测；所采集的数据利用Flexcontrol 2.2，数据分析软件 Flex Analysis 2.4，质谱成像软件 Flex Imaging 1.0，差异分析软件 Clin Protools 2.0等软件处理；
（2）在载体上制备石墨烯纳米片涂层，气体吹干备用；
（3）将载体固定在MALDI靶上；
（4）将N,N-二甲基甲酰胺溶剂分散后鲨烯样品溶液滴加到石墨烯膜或涂层表面后，使样品与基质形成的混晶二次结晶，溶剂挥发后即制得待测分析样品，进行激光解析离子化质谱分析。
实施例4：检测黄连碱样品的方法
（1）仪器与试剂BIFLEX III 型MALDI TOF质谱仪（Bruker公司）；氮激光器，波长337 nm，采用离子延迟引出（delayed extraction）及反射（reflectorn）的工作方式，正离子检测。所采集的数据利用Flexcontrol 2.2，数据分析软件 Flex Analysis 2.4，质谱成像软件 Flex Imaging 1.0，差异分析软件 Clin Protools 2.0等软件处理。
（2）在载体上制备石墨烯纳米片涂层，气体吹干备用；
（3）将载体固定在MALDI靶上；
（4）将四氢呋喃溶剂分散后黄连碱样品溶液滴加到石墨烯纳米片涂层表面后，使样品与基质形成的混晶二次结晶，溶剂挥发后即制得待测分析样品，进行激光解析离子化质谱分析。
实施例5：检测甲基丙烯酸甲酯（PMMMA，聚合物）样品的方法
（1）仪器与试剂BIFLEX III 型MALDI TOF质谱仪（Bruker公司）；氮激光器，波长337 nm，采用离子延迟引出（delayed extraction）及反射（reflectorn）的工作方式，正离子检测。所采集的数据利用Flexcontrol 2.2，数据分析软件 Flex Analysis 2.4，质谱成像软件 Flex Imaging 1.0，差异分析软件 Clin Protools 2.0等软件处理。
（2）在载体上制备石墨烯纳米带膜，气体吹干备用；
（3）将载体固定在MALDI靶上；
（4）将1,4-二氧六环溶剂分散后的甲基丙烯酸甲酯（PMMMA，聚合物）样品溶液滴加到石墨烯纳米带膜表面后，使样品与基质形成的混晶二次结晶，溶剂挥发后即制得待测分析样品，进行激光解析离子化质谱分析。
实施例6：检测小肽Gly-Val样品的方法
（1）仪器与试剂BIFLEX III 型MALDI TOF质谱仪（Bruker公司）；氮激光器，波长337 nm，采用离子延迟引出（delayed extraction）及反射（reflectorn）的工作方式，正离子检测。所采集的数据利用Flexcontrol 2.2，数据分析软件 Flex Analysis 2.4，质谱成像软件 Flex Imaging 1.0，差异分析软件 Clin Protools 2.0等软件处理。
（2）在载体上制备壳聚糖功能化石墨烯纳米片膜，气体吹干备用；
（3）将载体固定在MALDI靶上；
（4）将乙酸乙酯溶剂分散后的小肽Gly-Val样品溶液滴加到壳聚糖功能化石墨烯纳米片膜表面后，使样品与基质形成的混晶二次结晶，溶剂挥发后即制得待测分析样品，进行激光解析离子化质谱分析。
实施例7：检测维生素B1（锌配合物）样品的方法
（1）仪器与试剂BIFLEX III 型MALDI TOF质谱仪（Bruker公司）；氮激光器，波长337 nm，采用离子延迟引出（delayed extraction）及反射（reflectorn）的工作方式，正离子检测。所采集的数据利用Flexcontrol 2.2，数据分析软件 Flex Analysis 2.4，质谱成像软件 Flex Imaging 1.0，差异分析软件 Clin Protools 2.0等软件处理。
（2）在载体上制备钯纳米颗粒/壳聚糖修饰的石墨烯纳米片涂层，气体吹干备用；
（3）将载体固定在MALDI靶上；
（4）将N,N-二甲基甲酰胺溶剂分散后维生素B1（锌配合物）样品溶液滴加到钯纳米颗粒/壳聚糖修饰的石墨烯纳米片涂层表面后，使样品与基质形成的混晶二次结晶，溶剂挥发后即制得待测分析样品，进行激光解析离子化质谱分析。
实施例8：检测马肌红蛋白样品的方法
（1）仪器与试剂BIFLEX III 型MALDI TOF质谱仪（Bruker公司）；氮激光器，波长337 nm，采用离子延迟引出（delayed extraction）及反射（reflectorn）的工作方式，正离子检测。所采集的数据利用Flexcontrol 2.2，数据分析软件 Flex Analysis 2.4，质谱成像软件 Flex Imaging 1.0，差异分析软件 Clin Protools 2.0等软件处理。
（2）在载体上制备石墨烯纳米片膜，气体吹干备用；
（3）将载体固定在MALDI靶上；
（4）将乙醇溶剂分散后马肌红蛋白样品溶液滴加到石墨烯纳米片膜表面后，使样品与基质形成的混晶二次结晶，溶剂挥发后即制得待测分析样品，进行激光解析离子化质谱分析。
实施例9：检测Bicr6蛋白(人血清中肿瘤标志物)样品的方法
（1）仪器与试剂BIFLEX III 型MALDI TOF质谱仪（Bruker公司）；氮激光器，波长337 nm，采用离子延迟引出（delayed extraction）及反射（reflectorn）的工作方式，正离子检测。所采集的数据利用Flexcontrol 2.2，数据分析软件 Flex Analysis 2.4，质谱成像软件 Flex Imaging 1.0，差异分析软件 Clin Protools 2.0等软件处理。
（2）在载体上制备巯基化石墨烯纳米片膜，气体吹干备用；
（3）将载体固定在MALDI靶上；
（4）将乙醇溶剂分散后Bicr6蛋白(人血清中肿瘤标志物)样品溶液滴加到巯基化石墨烯膜表面后，使样品与基质形成的混晶二次结晶，溶剂挥发后即制得待测分析样品，进行激光解析离子化质谱分析。
实施例10：检测DNA(序列：ACCCGTTAG CGG CGG TCG TCG AATC CGGG ATCG TG TCGAGGG AAGAAG ACACGATCGC)样品的方法
（1）仪器与试剂BIFLEX III 型MALDI TOF质谱仪（Bruker公司）；氮激光器，波长337 nm，采用离子延迟引出（delayed extraction）及反射（reflectorn）的工作方式，正离子检测。所采集的数据利用Flexcontrol 2.2，数据分析软件 Flex Analysis 2.4，质谱成像软件 Flex Imaging 1.0，差异分析软件 Clin Protools 2.0等软件处理。
（2）在载体上制备石墨烯纳米片膜，气体吹干备用；
（3）将载体固定在MALDI靶上；
（4）将正己烷溶剂分散后DNA(序列：ACCCGTTAG CGG CGG TCG TCG AATC CGGG ATCG TG TCGAGGG AAGAAG ACACGATCGC)样品溶液滴加到石墨烯纳米片膜表面后，使样品与基质形成的混晶二次结晶，溶剂挥发后即制得待测分析样品，进行激光解析离子化质谱分析。
实施例11：检测Ullmann反应中间体的方法
（1）仪器与试剂BIFLEX III 型MALDI TOF质谱仪（Bruker公司）；氮激光器，波长337 nm，采用离子延迟引出（delayed extraction）及反射（reflectorn）的工作方式，正离子检测。所采集的数据利用Flexcontrol 2.2，数据分析软件 Flex Analysis 2.4，质谱成像软件 Flex Imaging 1.0，差异分析软件 Clin Protools 2.0等软件处理。
（2）在载体上制备钯纳米颗粒/壳聚糖修饰的石墨烯纳米片涂层，气体吹干备用；
（3）将载体固定在MALDI靶上；
（4）将氯苯溶剂（同时也作为Ullmann反应的反应物，0.5 ml）与锌粉（0.01 g，还原剂）和酸性离子液体[bmim(HSO3C4)] [HSO4]（0.25 ml）混合，并逐渐滴加到石墨烯纳米带膜表面后，钯纳米颗粒/壳聚糖修饰的石墨烯纳米片除作为基质外，还可作为Ullmann反应催化剂，随着混合样品的滴加，部分Ullmann反应产物可被检测器俘获并进行激光解析离子化质谱分析（图5）。
Claims (10)
1.石墨烯基质在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中的应用，其特征是：包括如下步骤：
（1）仪器与试剂的准备：BIFLEX III 型MALDI TOF质谱仪；氮激光器，波长337 nm，采用离子延迟引出及反射的工作方式，正离子检测；所采集的数据利用Flexcontrol 2.2，数据分析软件 Flex Analysis 2.4，质谱成像软件 Flex Imaging 1.0，差异分析软件 Clin Protools 2.0等软件处理；
（2）在载体上制备石墨烯膜或涂层，气体吹干备用；
（3）将载体固定在MALDI靶上；
（4）将溶剂分散后样品滴加到石墨烯或功能化石墨烯膜或涂层表面后，使样品与基质形成的混晶二次结晶，溶剂挥发后即制得待测分析样品，进行激光解析离子化质谱分析。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述石墨烯基质采用包括如下步骤的制备方法制得：
（1）将石墨(1.5 g, 325 目)加入到12 ml 浓 H2SO4, 2.5 g K2S2O8 和 2.5 g P2O5的混合物中，加热上述混合体系至80 oC，保持该温度，磁力搅拌5小时，随后冷却反应体系至室温；
（2）将混合物倾入500ml去离子水中，静置过夜；
（3）将上述静置物经0.2微米滤膜过滤，洗涤并自然晾干，得预氧化石墨；
（4）将该预氧化的石墨加入到0 oC的浓 H2SO4 (120 ml)中；
（5）随后缓慢加入15 g KMnO4，并控制反应温度在20 oC搅拌，高锰酸钾加毕，控制反应体系在35 oC搅拌4小时，随后，加入250 ml去离子水，并通过***冰浴控制温度在50 oC以下，搅拌1.5小时后，再加入700 ml去离子水，半小时后，逐滴滴入20 ml 30% H2O2，反应体系迅速由棕色转变为棕黄色，撤去搅拌装置；
（6）过滤该棕黄混合物，用1 : 10 HCl (1 L)洗涤以除去金属离子，随后再用1 L去离子水反复洗涤，得棕色固体，室温干燥后；
（7）将上述棕色固体制成水分散液(0.5% w/w)，连续透析一周，最后过滤，洗涤，重新分散超声1小时，过滤，60 oC真空干燥24小时，即可制备得到石墨烯氧化物；
（8）将上述石墨烯氧化物制成1 mg/ml分散液（100 ml），加入水合肼（1 ml），超声30 分钟后再100 oC 回流24小时，过滤，洗涤，60 oC真空干燥24小时，即可制备得到石墨烯纳米片。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述石墨烯基质采用包括如下步骤的制备方法制得：
(1)将碳纳米管样品置于空气中400 ℃煅烧1小时，然后置于通有氩氢混合气的管式炉中于900 ℃加热1小时；
(2)将第一步处理好的碳纳米管加入到12 mol/L的浓盐酸中在100 ℃回流4小时，再过滤并用去离子水清洗至中性，在800℃烘干；
(3)将碱金属钠与碳纳米管按质量比2∶1混合，随后通过碱金属熔融法进行处理；(4)将产物过滤洗净，于80 ℃烘干，得石墨烯纳米带基质。
4.根据权利要求1或2或3所述的石墨烯基质，其特征是：所述的石墨烯为石墨烯纳米片、石墨烯纳米带或石墨烯纳米纤维。
5.功能化石墨烯基质在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中的应用，其特征是：包括如下步骤：
（1）仪器与试剂：BIFLEX III 型MALDI TOF质谱仪；氮激光器，波长337 nm，采用离子延迟引出及反射的工作方式，正离子检测；所采集的数据利用Flexcontrol 2.2，数据分析软件 Flex Analysis 2.4，质谱成像软件 Flex Imaging 1.0，差异分析软件 Clin Protools 2.0等软件处理；
（2）在载体上制备石墨烯膜或涂层，气体吹干备用；
（3）将载体固定在MALDI靶上；
（4）将溶剂分散后样品滴加到石墨烯或功能化石墨烯膜或涂层表面后，使样品与基质形成的混晶二次结晶，溶剂挥发后即制得待测分析样品，进行激光解析离子化质谱分析。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征是：所述功能化石墨烯基质采用包括如下步骤的制备方法制得：
（1）将石墨烯氧化物（200 mg）分散到40ml二氯亚砜与1 ml N,N-二甲基甲酰胺的混合介质中，室温超声0.5小时，随后回流52小时，制备得到棕色酰氯化合物（219.2 mg）
（2）将按照文献方法制备的邻苯二甲酰壳聚糖（phthaloyl chitosan，1.753 g），LiCl （1.201 g）和N，N-二甲基乙酰胺（DMAC，120 ml）混合，在氮气保护下140 oC反应2小时，冷却该反应体系后，将前一步制得的棕色酰氯化合物（219.2 mg）及14 ml吡啶加入到反应体系中，氮气保护下回流48小时，冷却后，过滤，洗涤，真空干燥；
（3）干燥后固体在120 ml蒸馏水中搅拌6小时，过滤，保留固体重新分散于200 ml水中，超声1小时，过滤，洗涤，所得固体在真空65 oC下干燥24小时，得中间体PHCS-GO(205 g)；
（4）将该中间体分散于15 ml水合肼中，80 oC下反应16小时去除邻苯二甲酰保护，过滤，洗涤，真空干燥得含活性胺基的壳聚糖功能化石墨烯(175 mg)纳米片基质。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征是：所述功能化石墨烯基质采用包括如下步骤的制备方法制得：
（1）将方法1制备的功能化石墨烯 (100 mg)加入1.5 ml水，随后，加入10 ml乙二醇，超声20分钟，逐滴加入氯化钯乙二醇溶液10 ml(2.03 mg Pd/ml)，调节pH值到5-6，反应体系剧烈超声5分钟，随后搅拌过夜；
（2）随后，用2.5 M的氢氧化钠调节pH值到13，140 oC下反应3小时，整个反应过程均采取氮气保护，冷却到室温后，过滤；
（3）水及乙醇洗涤各三次，真空65 oC下干燥24小时，得功能化石墨烯：钯纳米颗粒/壳聚糖修饰的石墨烯类纳米片基质。
8.根据权利要求1-7之一所述的应用，其特征是：所述的石墨烯膜为单层或2-4层，是以石墨烯或功能化石墨烯粉末为原料，经物理方法在载体表面形成均匀的镀层，厚度约为100-500 nm。
9.根据权利要求1-7之一所述的应用，其特征是：石墨烯或功能化石墨烯膜作为基质用于分子量50-8500 Da.有机小分子化合物、生物大分子、聚合物、C60或一些配合物的激光解吸离子化质谱检测。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征是：所述的有机小分子化合物为50-1000 Da.，包括小肽、核苷酸单体、氨基酸、脂类或糖类化合物；所述的生物大分子为1000-8500 Da.，包括多肽、蛋白质、寡糖或寡核苷酸。
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