CN107628615A - 表面化学官能团可控的石墨结构型纳米材料及其制备方法和在质谱分析中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种石墨结构型纳米材料及其制备方法和应用，本发明提供的石墨结构型纳米材料表面修饰的官能团为环氧基、羰基和羟基；且以所述石墨结构型纳米材料表面的碳碳键、羰基、环氧基和羟基的个数为100％计，所述碳碳键的含量为55～65％；所述羰基的含量为10～16％；环氧基的含量为0.5～1.5％；所述羟基的含量21～31％；使得本发明所述的石墨点作为一种理想的基质应用到MALDI‑MS检测技术中，成功解决了无法检测小分子的瓶颈，同时实现了小分子物质的灵敏检测和组织切片质谱成像。此外，石墨点还提供了一个改变酶活性和表征酶动力学的新手段。

Description

表面化学官能团可控的石墨结构型纳米材料及其制备方法和 在质谱分析中的应用

技术领域

本发明涉及生物化学检测领域，尤其涉及一种表面化学官能团可控的石 墨结构型纳米材料及其制备方法和在质谱分析中的应用。

背景技术

基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)是一种软电离技术，在快速 分析生物大分子(核酸，蛋白质，多肽等)和聚合物上取得了很大的成功。 在过去的30年里，基质辅助激光解吸电离质谱在大分子电离方面有很高的效 率，并且大量的有机分子(CHCA，DHB等)已经成为这项技术上主要选择的 基质。但是，在基质辅助激光解吸电离质谱中，传统有机基质在质谱质荷比 低于700时会产生很高背景噪音，干扰质谱分析小分子的信号，更糟糕的是， 有机基质倾向于形成随机分布的不同尺寸的晶体(几十微米量级)，降低了 信号的重现性，这些特性使得传统有机基质在分析生物小分子方面几乎没有 进展，阻碍了MALDI在生物小分子领域的应用。其中，生物小分子也是生物 体内非常重要的一部分，各种生物小分子是生物大分子的基石，同时也是生 命活动的参与者，各种生命活动的最后都是生物小分子的代谢。所以根据生 物小分子在生物体内的活动，专门建立起了一门***研究生物小分子变化规 律的学科——代谢组学。将代谢物分为两大类，内源代谢产物和外源化合物，内源性代谢产物是生物体内基因组内或者蛋白质组调控下的代谢途径产生的 生物小分子，主要包括：激素、小分子多肽、核酸和脂类等。他们调控生长 规律，细胞分化，细胞间相互作用和机体的新陈代谢等过程。外源化合物是 指那些不是在生物体内的代谢途径产生的小分子化合物，这类化合物可以同 样调节体内新陈代谢等生命活性，并最终可以通过代谢途径代谢。这类来自 环境中影响生物体的小分子对于生物体来说主要涉及两个领域：营养性物质 和药物。

在最近报道中，质谱学家发现无机的纳米材料或无机纳米结构表面已经 作为合适的基质被应用在MALDI里替代有机基质。其中包括硅，合金，金属 氧化物，碳纳米材料。但是，虽然它们能克服传统有机基质在低分子量区的 背景干扰，但是对于体内小分子的敏感检测和精确成像却很困难。

因此，提供一种基质，其作为MALDI-MS检测中的基质能够使得 MALDI-MS检测能对不同种类分子进行广谱分析，并可以直接应用于包括天 然产物，血液，生物样品分析、组织质谱成像分析和酶活性分析具有重要的 意义。

发明内容

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供表面化学官能团可控的 石墨结构型纳米材料及其制备方法和质谱分析中的应用，本发明提供的石墨 结构型纳米材料作为基质辅助激光解吸电离质谱的基质能够对不同种类分子 进行MALDI-MS分析，并可以直接应用于天然产物，血液，生物样品分析和 组织质谱成像分析以及酶反应活性的MALDI-MS检测。

本发明提供了一种表面化学官能团可控的石墨结构型纳米材料，其中， 所述石墨结构型纳米材料为以sp2杂化轨道和邻近的三个碳原子形成含共轭 大π键的平面六角的网状结构；

其中，所述石墨结构型纳米材料表面修饰的官能团为环氧基、羰基和羟 基；

且以所述石墨结构型纳米材料表面的碳碳键、羰基、环氧基和羟基的个 数为100％计，所述碳碳键的含量为55～65％；所述羰基的含量为10～16％；所 述环氧基的含量为0.5～1.5％；所述羟基的含量为21～31％。

优选的，所述碳碳键的含量为58～62％；所述羰基的含量为12～14％；所 述环氧基的含量为0.8～1.2％；所述羟基的含量为23～28％。

优选的，所述碳碳键的含量为60％；所述羰基的含量为13％；环氧基的 含量为1％；所述羟基的含量为26％。

优选的，所述石墨结构型纳米材料的形貌为立方块体、多面体或类球体；

所述立方块体石墨结构型纳米材料的边长为5～6nm；

所述多面体或类球体石墨结构型纳米材料的粒径为5～6nm。

石墨结构型纳米材料优选的，所述石墨结构型纳米材料在337nm和355 nm处有紫外吸收。

本发明还提供了一种石墨结构型纳米材料的制备方法，包括：

将两根石墨棒分别作为阳极和阴极置于去离子水进行电解，得到未还原 的石墨点；

将未还原的石墨点与硼氢化钠反应，得到石墨结构型纳米材料；

其中，所述未还原的石墨点与所述硼氢化钠的用量比为100mg∶(13～17) mmol。

优选的，所述未还原的石墨点与所述硼氢化钠的用量比为100mg∶ (14～15)mmol。

本发明还提供了一种检测生物小分子的方法，包括，将待测生物小分子 样滴在基质上，然后送入MALDI-MS进行检测，得到待测样的定量和定性结 果；

其中，所述基质为本发明所述的石墨结构型纳米材料。

本发明还提供了一种检测生物组织切片上的生物小分子的方法，包括： 将组织切片贴附于MALDI靶板上进行基质喷涂，然后将制得的样品送入 MALDI-MS中进行质谱成像，得到小分子的定性和定量结果；

其中，所述基质为本发明所述的石墨结构型纳米材料。

本发明还提供了一种检测酶活性的方法，包括：将酶和基质复合的复合 物加入反应中进行催化反应，然后将催化反应的反应液送入MALDI-MS进行 检测，得到酶活性数据；

其中，所述基质为本发明所述的石墨结构型纳米材料。

与现有技术相比，本发明提供了一种表面化学官能团可控的石墨结构型 纳米材料，所述石墨结构型纳米材料为以sp2杂化轨道和邻近的三个碳原子形 成三个共价双键并排列成平面六角的网状结构；其中，所述石墨结构型纳米 材料表面修饰的官能团为环氧基、羰基和羟基；且以所述石墨结构型纳米材 料表面的碳碳键、羰基、环氧基和羟基的个数为100％计，所述碳碳键的含量 为55～65％；所述羰基的含量为10～16％；环氧基的含量为0.5～1.5％；所述羟 基的含量21～31％；使得本发明所述的石墨点作为一种理想的基质应用到 MALDI-MS检测技术中，成功解决了无法检测小分子的瓶颈，同时实现了小 分子物质的灵敏检测和组织切片质谱成像。此外，石墨点还提供了一个改变 酶活性和表征酶动力学的新手段。实验结果表明，本发明可以利用石墨点作 为基质成功的检测出糖类和多肽类小分子，且没有背景噪声干扰，获得的质 谱图非常干净，灵敏度大大提高，检测限达到fmol数量级。同时，使用石墨 点进行了传统中医药活性物质检测和小分子药物的活体质谱成像，结果表明， 本发明提供的方法不但提高了成像的速度和灵敏性，同时还免去筛选传统有机基质这一过程，以及简化了传统成像方法繁琐的样品处理过程；此外，本 发明提供的石墨点还可以与酶复合形成复合体，不仅提高酶的反应活性，同 时，石墨点本身还是一种比较好的MALDI质谱的基质，可以通过石墨点-based MALDI技术准确的检测了酶的活性。

本发明还提供了一种表面化学官能团可控的石墨结构型纳米材料的制备 方法，其中，通过控制石墨点与硼氢化钠的比例，使得得到的石墨点平均粒 径为6纳米左右，且为高度结晶化的、纯度很高的晶体，实验结果表明，本 发明所述石墨点中只含有碳、氢和氧三种元素。

附图说明

图1为GD-2的透射电镜表征结果图；

图2为GD-2的原子力显微镜表征结果；

图3为GD-2的紫外光谱、红外光谱、电导滴定曲线以及拉曼光谱表征结 果；

图4为GD-2与传统基质CHCA在MALDI-MS的正离子和负离子模式下 的背景噪声；

图5为GD-2作为基质检测葡萄糖和多肽小分子的质谱图；

图6为GD-2作为基质的信号重现性检测结果；

图7为正离子模式下葡萄糖和同位素13C标记的葡萄糖的MALDI质谱 图；

图8为石墨点的稳定性检测结果；

图9为以GD-2为基质通过MALDI检测麦芽糖系列寡糖的检测结果；

图10为以GD-2作为基质通过正离子模式检测巴戟天提取物的MALDI 质谱图；

图11为基于GD-2的MALDI技术检测葛根素的检测结果；

图12为葛根素代谢物黄豆苷原和二氢黄豆苷原的质谱分析图；

图13为葛根素、黄豆苷原和二氢黄豆苷原通过质谱分析获得的药物代谢 曲线；

图14是葛根素、黄豆苷原和二氢黄豆苷原在小鼠肾脏组织切片上的质谱 成像；

图15为石墨点复合酶的表征结果；

图16为GD-2石墨点对酶催化动力学影响结果；

图17为使用MALDI-MS分析酶活性的检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种表面化学官能团可控的石墨结构型纳米材料，其特征 在于，所述石墨结构型纳米材料为以sp2杂化轨道和邻近的三个碳原子形成含 共轭大π键的平面六角的网状结构；

其中，所述石墨结构型纳米材料表面修饰的官能团为环氧基、羰基和羟 基；

且以所述石墨结构型纳米材料表面的碳碳键、羰基、环氧基和C-OH的 个数为100％计，所述碳碳键的含量为55～65％；所述羰基的含量为10～16％； 环氧基的含量为0.5～1.5％；所述C-OH(羟基)的含量21～31％。

按照本发明，所述碳碳键的含量优选为58～62％，更优选为60％；所述羰 基的含量优选为12～14％，更优选为13％；所述环氧基的含量优选为0.8～1.2％， 更优选为1％；所述C-OH的含量优选为23～28％，更优选为26％。

按照本发明，所述石墨结构型纳米材料的形貌优选为立方块体、多面体 或类球体；所述多面体或类球体石墨结构型纳米材料的粒径为5～6nm；所述 立方块体石墨结构型纳米材料的边长为5～6nm；微观表现为良好结晶的蜂窝 状石墨结构；且所述石墨结构型纳米材料在337nm和355nm处有较强的紫 外吸收，覆盖了MALDI-MS最广泛使用的激光波长。这表明GD-2是在电离 过程中良好的激光能量受体，这也是作为基质分子必须要有的性质；此外， 本发明所述的石墨结构型纳米材料仅含有碳、氢和氧三种元素，为纯度很高 的石墨结构型纳米材料。

本发明还提供了一种石墨结构型纳米材料的制备方法，包括：

将两根石墨棒分别作为阳极和阴极置于去离子水进行电解，得到未还原 的石墨点；

将未还原的石墨点与硼氢化钠反应，得到石墨结构型纳米材料；

其中，所述未还原的石墨点与所述硼氢化钠的用量比为100mg∶(13～17) mmol。

按照本发明，本发明将两根石墨棒分别作为阳极和阴极置于去离子水进 行电解，得到未还原的石墨点；其中，所述电解的电压优选为30V；所述电 解的时间优选为12～14天；在电解过程中优选持续保持高强度搅拌；本发明 还优选将得到的石墨点经过滤和离心，得到粒径均一且水溶性好的未还原的 石墨点；

按照本发明，本发明将未还原的石墨点与硼氢化钠反应，得到石墨结构 型纳米材料；其中，所述未还原的石墨点与所述硼氢化钠的用量比优选为 100mg∶(14～16)mmol，更优选为100mg∶15mmol。所述反应的时间优选 为6～8小时；反应完毕后，本发明优选还使用透析袋透析3～5天，得到石墨 结构型纳米材料。

本发明提供的制备石墨结构型纳米材料的制备方法制备的石墨结构型纳 米材料通过将粒径均一的未还原的石墨结构型纳米材料与特定硼氢化钠进行 反应，使得本发明得到的石墨结构型纳米材料纯度高，仅含有碳、氢、氧三 种元素。

本发明还提供了一种检测生物小分子的方法，包括，将待测生物小分子 样滴在基质上，然后送入MALDI-MS进行检测，得到待测样的定量和定性结 果；其中，所述基质为本发明所述的石墨结构型纳米材料；所述生物小分子 包括本领域公知的内源代谢产物和外源化合物，其中，所述内源性代谢产物 是生物体内基因组内或者蛋白质组调控下的代谢途径产生的生物小分子，主 要包括：激素、小分子多肽、核酸和脂类等。外源化合物是指那些不是在生 物体内的代谢途径产生的小分子化合物，这类化合物可以同样调节体内新陈 代谢等生命活性，并最终可以通过代谢途径代谢。这类来自环境中影响生物 体的小分子对于生物体来说主要涉及两个领域：营养性物质和药物。

本发明还提供了一种检测生物组织切片上的生物小分子的方法，包括： 将组织切片贴附于MALDI靶板上进行基质喷涂，然后将制得的样品送入 MALDI-MS中进行质谱成像，得到小分子的定性和定量结果；其中，所述基 质为本发明所述的石墨结构型纳米材料。所述生物小分子包括本领域公知的 内源代谢产物和外源化合物，其中，所述内源性代谢产物是生物体内基因组 内或者蛋白质组调控下的代谢途径产生的生物小分子，主要包括：激素、小 分子多肽、核酸和脂类等。外源化合物是指那些不是在生物体内的代谢途径 产生的小分子化合物，这类化合物可以同样调节体内新陈代谢等生命活性， 并最终可以通过代谢途径代谢。这类来自环境中影响生物体的小分子对于生 物体来说主要涉及两个领域：营养性物质和药物。

本发明还提供了一种检测酶活性的方法，包括：将酶和基质复合的复合 物加入反应中进行催化反应，然后将催化反应的反应液送入MALDI-MS进行 检测，得到酶活性数据；其中，所述基质为本发明所述的石墨结构型纳米材 料；本发明在检测反应时，不需要额外添加基质，反应液中的基质即可作为 MALDI-MS检测的基质。

本发明提供了一种石墨结构型纳米材料，所述石墨结构型纳米材料为以 sp2杂化轨道和邻近的三个碳原子形成三个共价双键并排列成平面六角的网 状结构；其中，所述石墨结构型纳米材料表面修饰的官能团为环氧基、羰基 和羟基；且以所述石墨结构型纳米材料表面的碳碳键、羰基、环氧基和羟基 官能团的个数为100％计，所述碳碳键的含量为55～65％；所述羰基的含量为 10～16％；环氧基的含量为0.5～1.5％；所述C-OH的含量21～31％；使得本发 明所述的石墨点作为一种理想的基质应用到MALDI质谱检测技术中，成功解 决了MALDI无法检测小分子的瓶颈，同时实现了小分子物质的灵敏检测和组 织切片质谱成像。并且，石墨点还提供了一个改变酶活性和表征酶动力学的 新手段。实验结果表明，本发明可以利用石墨点作为基质成功的检测出糖类 和多肽类小分子，且没有背景噪声干扰，获得的质谱图非常干净，灵敏度大 大提高，检测限达到fmol。同时，使用石墨点进行了传统中医药活性物质检 测和小分子药物的活体质谱成像，结果表明，本发明提供的方法不但提高了 成像的速度和灵敏性，同时还免去筛选传统有机基质这一过程，以及简化了 传统成像方法繁琐的样品处理过程；此外，本发明提供的石墨点还可以与酶 复合形成复合体，不仅提高酶的反应活性，同时，石墨点本身还是一种比较 好的MALDI质谱的基质，可以通过石墨点-based MALDI技术准确的检测了 酶的活性。

下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所 描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的 所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

表1实验所需试剂以及生产厂家

表2

实施例1石墨结构型纳米材料的制备

最初的石墨点是由电化学腐蚀的方法得到的。首先将两根石墨棒(99.99％， AlfaAesar Co.Ltd)平行的***去离子水中，一个作为阳极，一个作为阴极， 同时保证两极之间的静态电压为30V.整个电解过程持续两周，并且持续保持 高强度的磁力搅拌，然后产生最初始的石墨点。但是此时的石墨点溶液中还 混杂着大块的石墨颗粒，所以需要经过过滤和高速离心(22000rpm，30min) 然后获得最后实验使用的粒径均一且水溶性非常好的未还原的石墨点(记为 GD1)。

称取获得的石墨点(GD-1)100mg溶于100ml水中，然后加入适量的硼 氢化钠，使反应体系中的硼氢化钠的浓度为150mM。在室温条件下，磁力搅 拌反应6小时。然后使用透析袋透析3天，最后获得石墨结构型纳米材料(记 为GD-2)。

通过采用原子力显微镜、透射电镜、红外光谱、拉曼光谱(Raman spectra) 和紫外吸收光谱对得到的GD-2进行结构表征；结果见图1～图3，图1为GD-2 的透射电镜表征结果图，其中，(A)GD-2透射电子显微镜图，(B)高分 辨率透射电子显微镜图，(C)单GD-2颗粒的选区电子衍射模式。图2为 GD-2的原子力显微镜表征结果；图3为GD-2的紫外光谱、红外光谱、电导 滴定曲线以及拉曼光谱表征结果；其中，(A)GD-2的紫外可见吸收光谱， (B)电导滴定曲线，(C)GD-2的红外吸收图谱，(D)拉曼光谱图。从图 1可以看出，GD-2拥有良好分散性，并且粒径分布比较均一大约5-6nm。从 高分辨率透射电子显微镜图像看出GD-2颗粒为具有良好结晶的蜂窝状石墨 结构，且沿晶带轴{002}，电子衍射区域显示出石墨的标准六边形晶体结构， 它展现出了GD-2的高石墨性。图2的轻敲模式下GD-2的原子力显微镜(AFM)图像显示出GD-2水平尺寸高度均一(大约6nm)。同时表明GD-2近似为一 个立方块体，从图3可以看出，GD-2在337nm和355nm处有较强的紫外的 吸收，覆盖了MALDI-MS最广泛使用的激光波长。这表明GD-2是在电离过 程中良好的激光能量受体，这也是作为基质分子必须要有的性质。电导滴定 法测量的GD-2表面官能团含量，VA代表羧基，VB-VA代表羟基。经计算得出羟基(1.42×10^-19mol/颗粒)，羰基(0.71×10^-19mol/颗粒)，GD-2表面环氧 化学基团(0.05×10^-19mol/颗粒)，从GD-2的红外吸收图谱看出GD-2主要含有 羟基(-OH)、羰基(C＝O)、环氧(C-O-C)这三种官能团。其中3400cm^-1处为羟基 的伸缩振动，1650cm^-1处为羰基的伸缩振动，1200cm^-1处为碳碳键伸缩振动 特征峰。从GD-2的拉曼光谱图看出，在1350cm^-1(D峰)有峰对应着无序的 石墨中的碳原子sp3振动，在1600cm^-1(G峰)有峰对应着二维六边形晶格中 碳原子的sp2振动。

通过对GD-4表面的官能团含量进行测定，其中，C-C含量为60％，C＝O 含量为13％，C-O-C(环氧基)含量为1％，C-OH的含量为26％。

实施例2石墨点(GD-2)作为基质的MALDI-TOF MS检测

1)MALDI-MS分析检测过程使用的是Bruker Ultraflex III TOF/TOF质 谱仪，它配备的是355nm的Nd：YAG激光。在检测中应用了它的反射正负 离子模式以及串联质谱。使用的滴样方法主要为两层法，首先将石墨点溶液 (1μL，1mg/mL)滴在MALDI的靶板上，在室温下自然干燥形成一层基质层， 然后将需要分析的样品(1μL)滴在基质层上，使样品与石墨点充分结晶，然 后室温干燥送入MALDI MS真空舱进行检测。

具体的，首先，在没有加入任何分析物的条件下进行纯基质的质谱检测， 结果见图4，图4为GD-2与传统基质CHCA在MALDI-MS的正离子和负离 子模式下的背景噪声，其中，(A)在正离子模式下CHCA和GD-2的MALDI 质谱图(没有分析物)，(B)在负离子模式下CHCA和GD-2的MALDI质 谱图(没有分析物)。使用断轴(y轴)强调CHCA与GD-2在背景噪音上有 显著的区别。从图中可以看出，在相同的激光强度照射下，CHCA在低分子 量区(m/z＜800)产生了连续的高强度的背景杂峰，使得小分子物质在这个区域 无法准确的被检测。而GD-2作为基质不管是在正离子模式还是负离子模式 下，它的背景非常的干净，没有噪音杂峰的干扰，在正离子模式下存在的那 两个质谱峰分别是Na离子峰(m/z：23)和K离子峰(m/z：39)。这样干净的背景噪 声使得GD-2作为一种理想的基质应用到MALDI的小分子物质检测分析方 面。

然后，选择了葡萄糖和多肽(Ala-Gln)作为标准分析物，用CHCA和 GD-2作为基质进行MALDI-MS检测。当使用CHCA作为基质检测时，发现 质谱图上是一堆连续的杂峰，是由于基质本身在激光的照射下被破坏产生了 一系列杂峰掩盖了分析物的信号，造成了不能检测葡萄糖和多肽小分子。而 当使用GD-2作为基质检测葡萄糖和多肽时，结果如图5所示，图5为GD-2 作为基质检测葡萄糖和多肽小分子的质谱图，其中，(A)正离子模式葡萄糖 和(B)负离子模式丙氨酰-谷氨酰胺二肽的MALDI质谱，使用GD-2作为基质。 两幅插图分别为分析物的检测极限(s/n＞3)，葡萄糖为2fmol，丙氨酰-谷氨 酰胺二肽的检测极限为1fmol。从图中可以看出，图5(A)清晰的展示出了 正离子模式下葡萄糖的特征峰(([M+Na]⁺，m/z：203，[M+K]⁺，m/z：219)。图5 (B)图清晰展示了在负离子模式下丙氨酰-谷氨酰胺二肽的质谱特征峰 ([M-H]^-，m/z：216)。这证明了GD-2可以成功的作为基质检测小分子，并且避 免了基质产生的杂峰的干扰。同时进一步探究了它作为基质的灵敏性，而且， 从图还可以看出，使用石墨点作为基质检测葡萄糖和多肽，可以使检测限提 高到fmol数量级，这与以前报到的纳米材料作为基质检测小分子相比较提高 了一个数量级。

2)石墨点作为基质实现了MALDI的小分子定量

传统有机基质因为结晶的不均一性造成了同一点或者点与点之间的信号 重复性差并且信号不均一，这样使得MALDI技术不能很好的去定量或者半定 量，同时也使得样品之间的误差比较大。然而当GD-2作为基质后，结果如图 6所示，图6为GD-2作为基质的信号重现性检测结果，其中，(A)将一个 点分成13个位置进行质谱检测，(B)在3×3的阵列中的九个不同的点进行质谱 检测。从图中可以看出，分析随机的一个点内3个位置上的质谱信号强度， 信号强度重复性非常好，其变异系数CV＜5％，然后又对比了在同一阵列内同一分析样品在九个不同点上的信号强度变化，发现点与点之间的重复性也非常 好，变异系数CV为4.8％同样小于5％。这证明了GD-2作为基质成功解决了 传统有机基质信号重复性差和信号不均一的问题，为解决MALDI技术定量的 问题打下基础。

同时，因为定量或者半定量主要依据峰的强度，所以分析物在MALDI 中定量还受它的分子结构，环境中的盐浓度等因素影响。为了消除这些因素 的干扰，在GD-2作为基质的基础上引入了同位素内标法。同为素标记的分析 物不会改变分析物的结构，从而保持了原有的在激光下的解析电离效率，并 且将所有的干扰因素扣除。图7为正离子模式下葡萄糖和同位素13C标记的 葡萄糖的MALDI质谱图，其中，插图是葡萄糖定量分析的校正曲线。同位素 13C标记的葡萄糖做内标：100pmol。从图中可以看出，将同位素13C标记的 葡萄糖做内标(100pmol)，将不同浓度的葡萄糖的峰([Glucose+Na]⁺，m/z：203) 和同为素标记的葡萄糖的质谱峰([Glucose-1-C¹³+Na]⁺，m/z：204)做信号强度的 比值，可以在插图中看到获得了一条线性非常好(R²＞0.99)的定量矫正曲线。 从而表明了利用GD-2结合同位素内标法可以实现MALDI的小分子定量。

基质的保质期也是衡量一个基质是否可以大规范商业化的一个关键因 素，这个问题也制约了一些基质的开发和推向市场应用，本发明所述的石墨 点的稳定性检测结果见图8，图8为石墨点的稳定性检测结果，其中，(A) 新鲜制备获得的GD-2，(B)新鲜制备的GD-2的背景噪声，(C)新鲜制备 的GD-2作为基质检测葡萄糖([M+Na]⁺，m/z 203)，(D)存放两年后的GD-2， (E)存放两年后的GD-2的背景噪声，(F)存放两年后的GD 4作为基质检 测葡萄糖([M+Na]⁺，m/z 203)。从图中可以看出，GD-2因为性状的稳定性， 使得它在保存了两年后依旧像刚合成的那样，拥有非常好的性能。这保证了 它可以大规模商业化。

3)石墨点作为基质实现了MALDI检测小分子糖类

对于糖类物质的检测一直是一个是质谱技术面临的问题，因为糖类属于 中性物质，很难发生电离，使得它无法在电场中飞行。糖类物质本身却是生 命活动中不可或缺的一部分，它提供了生命活动的能量，同时也是分子识别 的重要标记物，对它的研究探索一直是生命科学领域的重要组成部分。所以 快速灵敏检测寡糖类物质是MALDI技术必须要克服的问题。但传统的基质包 括CHCA，DHB因为它们本身的离子碎片干扰了低分子量寡糖的检测。GD-2 基质的出现很好的解决了MALDI-MS中寡糖的快速灵敏检测，其检测结果见 图9，图9为以GD-2为基质通过MALDI检测麦芽糖系列寡糖的检测结果， 其中，(A)麦芽三糖(B)麦芽四糖(C)麦芽五糖(D)麦芽六糖(E)麦 芽七糖，同时还获得了它们相应的串联质谱图。从图中可以看出，选择麦芽 糖系列包括麦芽二到七糖作为分析物。可以看到清晰的每个糖的质谱图，并 且可以进行串联质谱分析得到每个糖的碎片指纹谱(每隔162荷质比代表一个葡萄糖单元)。

4)中药巴戟天中有效成分多糖的提取和分析

试验中使用的巴戟天根茎主要是由中国北京同仁堂药业提供。首先，巴 戟天中药要研磨成粉末，在90℃条件下用超纯水提取(w/w，1∶20)3个小时。 然后等待获得的提取溶液冷却到室温后，加入原体积4倍的乙醇搅拌形成混 合溶液，在4℃条件下保存过夜，最后将沉淀过滤掉，获得巴戟天的多糖组 分。因为它的浓度过高，当进行MALDI MS检测时需要进行1000倍的稀释。

检测结果见图10，图10为以GD-2作为基质通过正离子模式检测巴戟天 提取物的MALDI质谱图；其中，(A)DP2：蔗糖，DP3：菊粉三糖，DP4：菊粉四 糖，DP5：菊粉五糖，DP6：菊粉六糖，DP7：菊粉七糖，DP8：菊粉八糖，DP9：菊 粉九糖。插图：质荷比1300-1600的质谱放大视图。(B)寡糖(DP8和DP9) 的串联质谱。从图中可以看出，巴戟天提取物中整个系列的菊淀粉型低聚糖 (DP2-DP9)可以一次全部显示在一个MALDI-MS质谱中。对于每个菊淀粉 型寡聚糖也都拥有非常高质量的质谱信号，使得对每种寡糖进行串联质谱分 析成为可能。特别是其中，DP8(质荷比：1353)和DP9(质荷比：1499)这两 种糖的糖链特别长并且含量比较低所以很难被质谱检测到，而当GD-2作为基 质用MALDI检测时，它们的图谱能够非常清晰的获得，同时串联质谱数据也 显示在图10(B)。串联质谱中系列的周期性的峰对应有质荷比为162的间 隔(糖苷间隙)的寡糖碎片。这些数据证明了GD-2作为基质可以成功的分析 具有挑战性的寡糖组分。接下来，用基于GD-2的MALDI方法分析巴戟天提 取物中DP2-9的寡糖，与传统的HPLC技术平行比较。获得的DP2到DP7的 寡糖定量结果(HPLC和MALDI MS)彼此一致。但是DP8和DP9这两种寡 糖在样品中含量很低，所以DP8和DP9的寡糖在高效液相色谱法(HPLC)中未 检出，所以相对于HPLC，MALDI MS提供了更高的灵敏性。同时，GD-2 辅助的MALDI-MS技术缩减了冗长的样品准备过程，它的耐盐度极高，减少 了大量的除盐步骤，可以直接从巴戟天提取物中检测出相当好的信号。

5)动物实验和药物代谢检测

昆明小鼠权重25±3g是由河实验室(中国北京)提供。食物可以自由摄取(Keaoxieli动物饲料有限公司，北京，中国)，水是补充每周两次。所有动物保健 和实验过程进行的动物实验指南基本医学科学学院是经动物实验伦理委员会 批准。给药的药物选择了葛根素这个小分子药物，它是一种主要的有生物活 性的大豆异黄酮(MW：417)，从植物葛根的根中提取，现在广泛的用于治 疗心血管和神经障碍。

老鼠(n＝72，分成6组)接受腹腔注射给药，每一只的给药剂量为0.5g/Kg 的葛根素(0.05M CBS缓冲溶液，pH值9.6)。分别在给药10分钟、20分钟、30 分钟、45分钟、1h、1.5h、2小时、3小时、4h、6h、8h、12h后取得一毫 升血液样本。另外六个老鼠在给药前牺牲用于提供对照血清样本。血液取样 后一个小时用1.2毫升甲醇加入300μl的血清样本(4∶1，v/v)在5毫升玻璃离 心管中快速混合。然后用离心方法(3000rpm，15分钟)获得血清。

通过对得到的血清在以GD-2为基质的MALDI-MS中检测，检测结果见 图11～图12，图11为基于GD-2的MALDI技术检测葛根素的检测结果，其 中，(A)给药30min后直接从小鼠血液中检测葛根素。负离子模式，GD-2 作为基质。(B)葛根素及其两个代谢物(黄豆苷原和二氢黄豆苷原)的代谢 途径。图12为葛根素代谢物黄豆苷原和二氢黄豆苷原的质谱分析图，其中， (A)黄豆苷原标准品的MALDI质谱，(B)黄豆苷原定量校准曲线，(C) 黄豆苷原标准品的串联质谱图，(D)血液样品中的黄豆苷原的串联质谱图， (E)二氢黄豆苷原标准品的MALDI质谱，(F)二氢黄豆苷原定量校准曲 线，(G)二氢黄豆苷原标准品的串联质谱图，(H)血液样品中的二氢黄豆 苷原的串联质谱图。从图中可以看出，葛根素的特征峰([M-H]^-，质荷比：416， 负离子模式)在质谱中可以清晰的被检测到。且B中显示了葛根素的代谢过 程是经历了黄豆苷原和二氢黄豆苷原——葛根素中两个重要的代谢物，它们 的分子量分别为MW：254和MW：256[42，43]。通过检测给药后的血液样品 发现两个代谢产物的离子峰的确存在([Daidzein+Na]⁺m/z：277，[dihydrodaidzein+Na]⁺m/z：279，正离子模式)，然后通过与标准品的串联质谱 相比较，发现碎片指纹谱相符合，从而确认了这两个峰的确属于黄豆苷原和 二氢黄豆苷原。同时通过将一个浓度梯度(0到2μg/mL)的葛根素及其代谢 物标准品依次加入小鼠血液中，在相同模式、相同激光强度和累加条件下检 测，发现获得的目标峰的强度跟分析物的浓度成线性关系，从而实现了葛根素 和它的代谢物在血液中浓度为0到2μg/mL之间的定量测定。

然后又进行了药物代谢研究，结果见图13，图13为葛根素、黄豆苷原和 二氢黄豆苷原通过质谱分析获得的药物代谢曲线。从图中可以看出，葛根素、 黄豆苷原和二氢黄豆苷原的代谢曲线，葛根素进入血液快速吸收并在腹腔注 射25-30分钟后富集到最大浓度，然后开始降低，经过12小时后血液中的葛 根素降低到最低水平。而黄豆苷原和二氢黄豆苷原这两种代谢物的表现相似， 到达最高血液浓度的时间与葛根素近似，并且黄豆苷原和二氢黄豆苷原的药 代动力学行为与葛根素的改变一致，这与先前报道的工作是一致的。

代谢分析的标准过程有许多步骤，包括用液相色谱法(LC)进行小分子 预分离或多反应监测模式(MRM)级联过滤技术。相比之下，本发明提供的 方法可以避免液相色谱法(LC)和多反应监测模式(MRM)级联过滤技术的 处理的枯燥过程，能在干扰最小的情况下直接分析新鲜生物样品中小分子及 其代谢产物。这种方法不仅快而且能将所需的样品量降低至1微升(样品数 量级远低于LC/MRM)。同时极大节省样品量，缓解取血时动物的负担，还能促进小分子药品及其代谢物大规模筛选的技术发展。

6)质谱成像组织切片制备与检测

从步骤5)收集到的组织器官首先在液氮中浸泡10分钟，然后储存在-20 ℃冰箱。切片时，在-20℃条件下，在a Leica CM-1950cryostat(Leica Biosystems)切片机中切成10μm厚的组织切片。为了获得最大面积的组织切 片，我们选择了小鼠肾的中部切片进行组织成像。在进行质谱测试之前，将 组织切片贴在成像玻璃片表面，抽真空半小时。制好的样品在CanoScan 9000-F scanner(Canon)扫描仪上获得光学照片。

将组织切片贴附于MALDI靶板上进行基质喷涂，基质会与样品中的分析 物在原位共结晶，然后制得的样品送入质谱中进行质谱成像，将扫描产生的 离子信号通过数据处理与图像重建技术结合形成质谱图像，颜色的深浅代表检 测物的相对含量，同时相邻切片进行H&E染色确定组织结构。结果见图14， 图14是葛根素、黄豆苷原和二氢黄豆苷原在小鼠肾脏组织切片上的质谱成像， 其中，肾组织切片中药物及其代谢物(葛根素，分子量：417；黄豆苷原，分子 量：254；二氢黄豆苷原，分子量：256)的MALDI质谱成像图像(负离子模 式，80μm光斑大小)，苏木精-伊红(H&E)连续染色切片的光学显微照片， 从图可知，根据MALDI-MS的信号分布，就可以判断葛根素及其代谢物(黄 豆苷原和二氢黄豆苷原)在肾组织切片中的空间分布。对于每个分析物，根 据质谱峰强度显示不同的颜色。葛根素主要分布在肾盂和肾大盏中，由于肾 小球毛细血管壁过滤效果，葛根素在肾实质(皮质，髓质)的含量相对较低。 有趣的是，代谢物(黄豆苷原和二氢黄豆苷原)主要存在在于肾皮质附近， 在肾髓质中几乎不存在。葛根素代谢过程涉及级联反应包括葡萄糖单元的解 离，随后黄豆苷原还原成二氢黄豆苷原的过程。这些代谢物与原药不同的空 间分布表明了分步代谢过程和小分子的在器官水平的可分辨性的滞留。这证 明了GD基质辅助质谱成像方法可以实现在器官水平上生物小分子及其代谢 物的直接成像。

综上，本发明所述的石墨点(GD-2)作为MALDI的新基质用于小分子分 析和成像。打破了传统有机基质检测小分子(质荷比＜700)的壁垒，显示出 了极低的背景噪音和极高的敏感度。使用GD-2基质，MALDI-MS对小分子 (丙氨酰-谷氨酰胺或葡萄糖)的检测限达到1fmol。GDs辅助MALDI-MS提 供了直接敏感的方法分析在小鼠模型内的巴戟天及其代谢物。非常有意义的 事情是GDs辅助MALDI-MS成像第一次完成了器官水平小分子及其代谢物高分辨率成像。

实施例3石墨点(GD-2)作为基质检测酶活性

1)合成石墨点和脂肪酶(LPS)复合物

将20mg脂肪酶粉末溶解到20mL 50mM的Tris-HCl缓冲溶液中(pH＝7.0)， 在4℃条件下搅拌12个小时，随后5000rpm离心去除不溶解的部分。然后加 入还原石墨点到酶溶液中，在4℃条件下搅拌12小时。获得的混合物在离心 30min去除不溶解的部分，最后获的PL/GD-2复合物。

对PL/GD-2复合物进行分析，结果见图15，图15为石墨点复合酶的表 征结果，其中，(A)PL和PL/GD-2的SDS-PAGE图，(B)PL和PL/GD-2 的圆二色谱，(C)PL和PL/GD-2荧光光谱，(D)PL和PL/GD-2的热稳定 曲线。

从电泳结果可以看出，PL/GD-2复合物相对于PL在电场中移动距离更短， 这意味着GD-2很稳定的结合到了LPS上，在电场中都没有发生分离。从圆 二色谱可以看出在GD-2结合在石墨点上后使得α-螺旋的峰降低β-转角的峰 提高，这意味着LPS的结构发生了变化部分α-螺旋转变为β-转角，这种变化 使得整个酶的结构变的松散，柔性提高，同时有利于活性空间与底物的结合。 同时使用荧光光谱去测试LPS和GD-2/LPS复合体，发现光谱位置并没有发 生移动这说明GD-2是非共价键连接到LPS上的。PL/GD-2复合体和PL在0 到70℃加热30分钟后的剩余酶活性曲线显示出当孵育温度超过30℃后，酶 的活性急剧下降，然而，PL/GD-2复合体的下降速度要明显低于PL的下降速 度，PL/GD-2复合体的T₅₀ ³⁰的值提高了10℃。这证明了GD-2结合到LPS上 后可以显著提高LPS的热稳定性。这有可能是由于PL固定到GD-2表面，使 得它的结构更加稳固，提高了它抵抗热变性的能力。所以图15证明了PL以 非共价键形式稳固的结合到GD-2上形成复合体，同时因为GD-2的参与使得 PL的结构发生了改变，提高了PL的热稳定性。

2)酶活性检测和热稳定测试

脂肪酶水解三丁酸甘油酯和三辛酸甘油酯产生脂肪酸进而改变了体系中 的pH，因此通过酸碱滴定方法就可以获得脂肪酸的总量从而确定LPS和 LPS/GD-2的催化活性。在水浴反应中，将底物加入，在38℃下反应300min， 加入酚酞指示剂，使用NaOH滴定。到指示剂变色后到达滴定终点，使用的 NaOH总量代表了消耗脂肪酸的量。

LPS和LPS/GD-2复合体首先在水浴中加热(0℃-70℃)30分钟。然后 将酶溶液放入冰浴中放置20分钟后进行酶活测试，将放置在0℃条件下30 分钟的LPS和LPS/GD-2复合体的酶活性设定为100％。

米氏方程反映了在一个稳定条件下的酶的动力学。

V_max代表酶反应的最大反应速度，K_m是米氏常数，它代表了当反应速度 到达最大反应速度一半时的底物浓度。通过变换方程获得了双倒数方程。

这个线性曲线表述了1/V和1/[S]的关系，同时，直线于Y轴的交点代表 V_max，于X轴的交点代表-1/K_m。因此通过改变底物浓度来获得一系列反应速 度，然后将它们带入方程就可以获得V_max和K_m准确的值。

测试结果见图16，图16为GD-2石墨点对酶催化动力学影响结果，其中， PL和PL/GD-2的Lineweaver-Burk曲线。从图中可以看出，PL和PL/GD-2 复合物的双倒数方程。通过截距可以获得PL/GD-2复合物的K_m是10gL^-1，明 显低于PL的K_m(142gL^-1)，这显示出PL/GD-2复合物对三丁酸甘油酯底物有更 大的亲和性。同时，PL/GD-2的V_max提高了2倍。所以，推测PL与GD-2结 合改变了PL的结构进而使得它的酶动力学参数(V_max，K_m)发生改变。然后， 使用了三丁酸甘油酯进行水解反应来测得酶的活性。在反应300分钟后滴定 分别获得PL/GDs和PL自身的催化反应降解速率，GD-2/LPS复合物得到了 最高的反应速度，比纯酶LPS提高了大约20％。

3)使用MALDI MS分析酶活性

首先将三辛酸甘油酯加入LPS和LPS/GD-2溶液中(pH7.0，50mM Tris-HCl，CaCl₂20mM)。混合物被分成6组在38℃条件下进行反应，分别 对这六个组的反应在0min，50min，100min，150min，200min，250min and 300min的时候进行终止。然后将1μL样品取出与1μL标准同位素标记的三 辛酸甘油酯混合后直接滴到靶板上。样品不需要任何预处理直接进行MALDI MS检测。

结果见图17，图17为使用MALDI MS分析酶活性的检测结果，其中， (A)GD-2和CHCA的纯基质背景噪声。(B)三辛酸甘油酯定量分析的校 正曲线。同位素¹³C标记的三辛酸甘油酯做内标：100mM。(C)不同pH下 使用MALDI技术测得的PL/GD-2复合体的活性。(D)不同温度下使用MALDI 技术测得的PL/GD-2复合体的活性。从图中可以看出，当传统基质CHCA作 为基质时，它会产生很多背景噪声掩盖了分析物本身的峰。而当使用GD-2后， 它克服了这一问题，在小分子区域背景非常干净，这一特点保证了小分子底 物可以非常准确的被MALDI检测到。然后，使用GD-2作为基质检测和分析 检测了LPS的底物三辛酸甘油酯，将底物浓度配成梯度(20～200mM)，将 检测环境定为LPS反应buffer溶液，从而获得定量校准曲线。它是根据三辛 酸甘油酯的峰([tricaprylin+Na]⁺)和同位素标记的三辛酸甘油酯的峰([tricaprylin-¹³C₃+Na]⁺)做比值获得的，线性方程为y＝0.0104x-0.0256， R²＞0.99。这满足了定量分析PL酶活性的要求。然后通过直接使用反应物进 行MALDI检测的方法(PL/GD-2作为催化剂和基质，不需使用基质)检测了 PL/GD-2复合物的最适pH(图17(C))。复合体在pH 6.0的时候催化活性相 对较低(1000u/g)，随着pH的增加，催化活性逐渐提高，当到达pH7.0的 时候，它的活性到达最高点，在超过pH 7.0后，继续提高pH，复合体的活性 反而逐渐在降低。图17(D)显示的是反应温度对PL/GD-2复合体的影响， 检测方法同样采用了直接使用反应物进行MALDI检测。在同pH 7.0条件下， 当温度在303K时，由于低温酶的活性相对较低，随着温度的升高，催化活性 逐渐提高，当温度到达311K时，到达了它的最适反应温度，活性为399u/g。 然后继续升温，复合物的活性逐渐降低。这证明了PL/GD-2可以准确的作为一个反应的检测者直接进行MALDI-MS分析检测。

综上，使用石墨点与酶复合形成复合体。且通过控制石墨点表面官能团 的含量比值，实验结果表明酶的活性也发生了调节，随着羟基含量的增加和 羧基含量的减少，脂肪酶的活性逐渐提高到120％。同时，石墨点本身还是一 种比较好的MALDI质谱的基质，它提供了一种新的检测酶活性的技术，通过 GD-2-based MALDI技术准确的检测了脂肪酶的活性，同时对它的酶动力学 进行了表征。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当 指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下， 还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要 求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种表面化学官能团可控的石墨结构型纳米材料，其特征在于，所述石墨结构型纳米材料为以sp2杂化轨道和邻近的三个碳原子形成含共轭大π键的平面六角的网状结构；

其中，所述石墨结构型纳米材料表面修饰的官能团包括环氧基、羰基和羟基；

且以所述石墨结构型纳米材料表面的碳碳键、羰基、环氧基和羟基的个数为100％计，所述碳碳键的含量为55～65％；所述羰基的含量为10～16％；所述环氧基的含量为0.5～1.5％；所述羟基的含量为21～31％。

2.根据权利要求1所述的石墨结构型纳米材料，其特征在于，所述碳碳键的含量为58～62％；所述羰基的含量为12～14％；所述环氧基的含量为0.8～1.2％；所述羟基的含量为23～28％。

3.根据权利要求2所述的石墨结构型纳米材料，其特征在于，所述碳碳键的含量为60％；所述羰基的含量为13％；环氧基的含量为1％；所述羟基的含量为26％。

4.根据权利要求1所述的石墨结构型纳米材料，其特征在于，所述石墨结构型纳米材料的形貌为立方块体、多面体或类球体；

所述立方块体石墨结构型纳米材料的边长为5～6nm；

所述多面体或类球体石墨结构型纳米材料的粒径为5～6nm。

5.根据权利要求1所述的石墨结构型纳米材料，其特征在于，所述石墨结构型纳米材料在337nm和355nm处有紫外吸收。

6.一种表面化学官能团可控的石墨结构型纳米材料的制备方法，包括：

将两根石墨棒分别作为阳极和阴极置于去离子水进行电解，得到未还原的石墨点；

将未还原的石墨点与硼氢化钠反应，得到石墨结构型纳米材料；

其中，所述未还原的石墨点与所述硼氢化钠的用量比为100mg∶(13～17)mmol。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述未还原的石墨点与所述硼氢化钠的用量比为100mg∶(14～15)mmol。

8.一种检测生物小分子的方法，包括，将待测生物小分子样滴在基质上，然后送入MALDI-MS进行检测，得到待测样的定量和定性结果；

其中，所述基质为权利要求1～5任意一项所述的石墨结构型纳米材料或权利要求6～7所述的制备方法制备的石墨结构型纳米材料。

9.一种检测生物组织切片上的生物小分子的方法，包括：将组织切片贴附于MALDI靶板上进行基质喷涂，然后将制得的样品送入MALDI-MS中进行质谱成像，得到小分子的定性和定量结果；

其中，所述基质为权利要求1～5任意一项所述的石墨结构型纳米材料或权利要求6～7所述的制备方法制备的石墨结构型纳米材料。

10.一种检测酶活性的方法，包括：将酶和基质复合的复合物加入反应中进行催化反应，然后将催化反应的反应液送入MALDI-MS进行检测，得到酶活性数据；

其中，所述基质为权利要求1～5任意一项所述的石墨结构型纳米材料或权利要求6～7所述的制备方法制备的石墨结构型纳米材料。