CN109752447A - 石墨炔在作为maldi基质检测小分子物质中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了石墨炔在作为MALDI基质检测小分子物质中的应用。该应用具体为石墨炔在作为基质辅助激光解吸电离质谱基质检测质荷比为0～1000小分子物质中的应用。所述小分子物质可为氨基酸、寡肽、小分子药物、尿酸、芦丁、双酚A或四溴双酚A。所述基质辅助激光解吸电离质谱的待测样品可为小分子溶液、人血清、人尿液、植物提取液或材料提取液。本发明克服了常用有机小分子基质在低分子量区易产生基质背景干扰现象从而导致不能有效分析小分子样品的缺点。本发明采用的基质，无需加入离子化试剂，减少了对样本处理的要求；在测试范围内(m/z 0‑1000)背景干扰小，对多种复杂混合体系也可进行分析；性质稳定，方便保存和使用，且易于合成。

Description

石墨炔在作为MALDI基质检测小分子物质中的应用

技术领域

本发明属于质谱分析领域，尤其涉及石墨炔在作为MALDI基质检测小分子物质中的应用。

背景技术

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)具有灵敏、快速、高通量、耐盐、准确等优点，是各国研究者的重要的科研工具。基质辅助激光解吸电离质谱可以检测蛋白质、核酸、高分子材料等，在蛋白组学、疾病诊断、环境科学等领域发挥着重要作用。基质辅助激光解吸离子化法是一种软电离方法，对于极性或非极性分子均可进行分析，所获得的分析物产生少量的碎片离子或不产生碎片离子，可以有效的进行生物大分子的分析。当样品为混合物时，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱也能进行分析。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的工作原理为是，待测样品与基质混合，使样品均匀地分散在基质中，当干燥的样品与基质的混合物受到激光照射时，基质吸收激光的能量，并转移给样品分子，使样品分子离子化，进入飞行时间质量检测器，根据离子到达检测器的时间的不同来进行检测。实验中基质的作用有包括将样品分子分散开，保护分析分子，吸收激光能量并传递给样品分子。所以基质必须具备在某一范围的激光能量具有吸光特性的能力来吸收能量，并且要具有良好的传递能量的能力向分析物传递能量；基质自身具有稳定的化学性质，易于保存使用且不与分析物发生反应导致分析物的氧化分解等；与分析物有较好的相容性，能够将分析物分子分散开。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱中，基质对于实验结果可以造成重要的影响，因而基质的选择十分重要。有机小分子化合物包括2,5-二羟基苯甲酸(DHB)、α-腈基-4-羟基肉桂酸(CCA)、3-羟基-2-吡啶甲酸(3-HPA)、芥子酸(SA)、3-氨基喹啉(3-AQ)、蒽三酚(DI)等是常用的基质。上述基质分子在分析过程中在低质量范围内易发生碎裂或发生分子间的缔合，从而造成严重的背景干扰使谱图复杂化，给谱图的解析造成不便。然而对于一些科研领域，小分子物质的检测也是十分重要的，生物代谢、天然产物、环境污染物中有很多的小分子物质，此外，一些药物例如石杉碱甲等也是小分子药物。

一些改进方法被提出用以克服基质的背景干扰现象，包括引入纳米材料作基质或制造多孔硅表面并对其修饰从而达到不用基质来进行解吸电离的方法。但是一些纳米材料的合成和表面修饰的过程较为繁琐。所以，一种性质稳定，合成简便，成本低廉，操作简单，适用广，在低质量区干扰小的基质具有广泛的实用意义。

发明内容

本发明的目的是提供石墨炔在作为MALDI基质检测小分子物质中的应用，克服了常用有机小分子基质在低分子量区易产生基质背景干扰现象从而导致不能有效分析小分子样品的缺点。

本发明提供了石墨炔在作为基质辅助激光解吸电离质谱基质检测质荷比为0～1000小分子物质中的应用。

上述的应用中，所述基质辅助激光解吸电离质谱所采用的质谱质量分析器不受限制，在本发明的实施例中，所述基质辅助激光解吸电离质谱为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，即所用质量分析器为飞行时间质量分析器。

上述的应用中，所述小分子物质可为任何基质辅助激光解吸电离质谱可检测的物质，包括但不限于氨基酸、寡肽、小分子药物、尿酸、芦丁、双酚A或四溴双酚A。具体地，所述小分子药物可为抗癌药物、激素药物或者治疗痴呆药物。更具体地，所述抗癌药物可为盐酸阿霉素；所述激素药物可为***或炔雌醇；所述治疗痴呆药物可为石杉碱甲。

上述的应用中，所述基质辅助激光解吸电离质谱的待测样品可为小分子溶液、人血清、人尿液、植物提取液或材料提取液。

上述的应用中，所述待测样品为小分子溶液或人血清；所述石墨炔与所述小分子物质的比例可为(0.05～0.2)g：(0.005～1)mmol，优选为0.1g：(0.005～1)mmol。具体地，所述石墨炔与所述小分子物质的比例可为0.1g：(0.01～1)mmol、0.1g：1mmol、0.1g：0.5mmol。

所述石墨炔可以石墨炔分散液的形式与待测样品进行混合；所述石墨炔分散液的质量体积浓度可为0.05～0.2mg/mL，优选为0.1mg/mL。所述石墨炔分散液的溶剂可为任意可分散石墨炔的溶剂；具体地，所述石墨炔分散液的溶剂可为PEG 2000的水溶液；更具体地，所述PEG 2000的水溶液的质量体积浓度可为0.1mg/mL。所述小分子物质的浓度可为0.005～1mM，如0.5mM、1mM。所述基质溶液与所述待测样品的体积比可为1：1。

本发明在使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对小分子物质进行检测时，选择负离子模式，运行条件为：加速电压20kv，延迟引出电压17.7kv，反射器电压21.10kv，透镜电压6.4kv，频率1000Hz，激光能量20％，累加次数500次。

本发明具有如下有益效果：

本发明克服了常用有机小分子基质在低分子量区易产生基质背景干扰现象从而导致不能有效分析小分子样品的缺点。本发明采用的基质，无需加入离子化试剂，减少了对样本处理的要求；在测试范围内(m/z 0-1000)背景干扰小，对多种复杂混合体系也可进行分析；性质稳定，方便保存和使用，且易于合成。

附图说明

图1为本发明实施例样品的检测流程图。

图2为石墨炔基质的背景图。

图3为四种寡肽混合液在使用石墨炔作为基质的质谱检测图。

图4为血清在使用石墨炔作为基质的质谱检测图。

图5为尿液在使用石墨炔作为基质的质谱检测图。

图6为植物提取液在使用石墨炔作为基质的质谱检测图以及检测图的部分区域放大图。

图7为纸张提取液在使用石墨炔作为基质的质谱检测图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例所用的石墨炔是由炔键将苯环共轭连接形成的具有类似石墨烯的二维平面网络结构的碳材料，具有平面二维材料的特点同时又具有三维多孔材料的特征，有高的比表面积，具体按照Li,G.X.,et al.,Architecture of graphdiyne nanoscalefilms.Chemical Communications,2010.46(19):p.3256-3258.中公开的制备方法合成得到。合成过程简单表述如下：石墨炔是在铜表面上经过单体六炔基苯的偶联合成；铜箔在石墨炔的形成过程中不仅作为催化剂，还是石墨炔的生长基底。

本发明以石墨炔作为基质的基质辅助激光解吸离子化质谱分析法通常采用飞行时间质量分析器进行分析，但实际应用中，与其他质谱质量分析器也兼容。下述实施例所用的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的型号为UltrafleXtreme(Bruker)。

实施例1、石墨炔作为MALDI-TOF MS基质检测小分子物质寡肽

按照图1所示流程图对寡肽进行检测，具体步骤如下：

(1)将石墨炔与PEG2000水溶液混合，得基质溶液。基质溶液中石墨炔的浓度为0.1mg/ml，PEG2000浓度为0.1mg/ml。

(2)配置寡肽混合液作为分析物，混合液中含有4种寡肽，分别为Gly-Ala,Gly-Asp,Gly-Glu,Gly-Leu-Tyr，每种肽浓度均为1mM。

(3)取1μL分析物与1μL石墨炔基质溶液混合后，取1μL点靶，于空气中干燥后送入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪进行检测。选择负离子模式，质谱运行条件为：加速电压20kv，延迟引出电压17.7kv，反射器电压21.10kv，透镜电压6.4kv，频率1000Hz，激光能量20％，累加次数500次。

所得谱图见图2(背景)和图3。从谱图可以看出该基质对于四种肽的失质子峰都能检测出，并且获得较高的强度、信噪比以及干净的背景。此方法可避免基质对低质量区的干扰。

实施例2、石墨炔作为MALDI-TOF MS基质鉴定血清中盐酸阿霉素

按照图1所示流程图对血清中盐酸阿霉素进行检测，具体步骤如下：

(1)将石墨炔与PEG2000水溶液混合，得基质溶液。基质溶液中石墨炔的浓度为0.1mg/ml，PEG2000浓度为0.1mg/ml。

(2)取一定体积的正常人血清，加入乙腈溶液，血清和乙腈的体积比为1:2。放入离心机离心(转速为3600rpm，时间为10min)。离心后收集上清液，去除沉淀物。在上清液中加入盐酸阿霉素，使最终获得血清上清液中的盐酸阿霉素浓度是0.5mM。

(3)将上述含有盐酸阿霉素的血清上清液取1μL与1μL石墨炔基质溶液混合后，取1μL混合液点靶，于空气中干燥后进入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪进行检测。选择负离子模式，质谱运行条件为：加速电压20kv，延迟引出电压17.7kv，反射器电压21.10kv，透镜电压6.4kv，频率1000Hz，激光能量20％，累加次数500。由此方法可避免基质对低质量区的干扰。

所得谱图见图4，从谱图可以看出该基质对于检测血液中的盐酸阿霉素能够获得较高的强度和信噪比以及干净的背景。此方法可避免基质对低质量区的干扰。

实施例3、石墨炔作为MALDI-TOF MS基质鉴定尿液中代谢物

按照图1所示流程图对尿液中代谢物进行检测，具体步骤如下：

(1)将石墨炔与PEG2000水溶液混合，得基质溶液。基质溶液中石墨炔的浓度为0.1mg/ml，PEG2000浓度为0.1mg/ml。

(2)取健康成年人尿液1μL与1μL石墨炔基质溶液混合，混合物取1μL点靶，待样品点干燥后进入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪进行检测。选择负离子模式，质谱运行条件为：加速电压20kv，延迟引出电压17.7kv，反射器电压21.10kv，透镜电压6.4kv，频率1000Hz，激光能量20％，累加次数500次。

所得谱图见图5。从谱图可以看出该基质对于尿液中尿酸的失质子峰167能轻易检测出，并且获得较高的强度和信噪比。由此方法可避免基质对低质量区的干扰。由此方法通过简单的操作，除去了复杂的前处理。

实施例4、石墨炔作为MALDI-TOF MS基质鉴定黄皮叶中天然产物

按照图1所示流程图对血清中盐酸阿霉素进行检测，具体步骤如下：

(1)将石墨炔与PEG2000水溶液混合，得基质溶液。基质溶液中石墨炔的浓度为0.1mg/ml，PEG2000浓度为0.1mg/ml。

(2)取10.38mg黄皮果叶子加入519μL乙醇，超声30min(功率为110W，频率为40KHz)后获得绿色溶液。

(3)取1μL绿色溶液与1μL基质混合后，向MALDI靶板加入1uL混合液，充分干燥。送入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪检测。选择负离子模式，质谱运行条件为：加速电压20kv，延迟引出电压17.7kv，反射器电压21.10kv，透镜电压6.4kv，频率1000Hz，激光能量20％，累加次数500次。

所得谱图见图6。从谱图可以看出该基质能检测出植物提取液中的天然产物，并且获得较高的强度和信噪比以及干净的背景。谱图显示的质荷比在609、301的质谱峰是黄皮中的常见产物芦丁的特征峰。谱图中的质荷比201的质谱峰可能来源于芸香科植物中的天然产物花椒毒醇的失质子峰。由此方法可避免基质对低质量区的干扰。而且此方法操作简单，避免了复杂的前处理。

实施例5、石墨炔作为MALDI-TOF MS基质鉴定纸张中双酚A

按照图1所示流程图对纸张中双酚A进行检测，具体步骤如下：

(1)将石墨炔与PEG2000水溶液混合，得基质溶液。基质溶液中石墨炔的浓度为0.1mg/ml，PEG2000浓度为0.1mg/ml。

(2)取3.24mg热敏纸于离心管，加入648μL甲醇，超声20min(功率为110W，频率为40KHz)后，收集提取液。

(3)取1μL提取液与1μL石墨炔基质溶液混合，分析物与基质的混合液取1μL点靶，于空气中干燥后进入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪检测。选择负离子模式，质谱运行条件为：加速电压20kv，延迟引出电压17.7kv，反射器电压21.10kv，透镜电压6.4kv，频率1000Hz，激光能量20％，累加次数500次。

所得谱图见图7，从谱图可以看出双酚A的失质子峰227能够以高强度以及高信噪比检出。且此方法通过操作简单，避免了复杂的前处理。

Claims (8)

1.石墨炔在作为基质辅助激光解吸电离质谱基质检测质荷比为0～1000小分子物质中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述基质辅助激光解吸电离质谱为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述小分子物质为氨基酸、寡肽、小分子药物、尿酸、芦丁、双酚A或四溴双酚A。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述小分子药物为抗癌药物、激素药物或者治疗痴呆药物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗癌药物为盐酸阿霉素；所述激素药物为***或炔雌醇；所述治疗痴呆药物为石杉碱甲。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于：所述基质辅助激光解吸电离质谱的待测样品为小分子溶液、人血清、人尿液、植物提取液或材料提取液。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的应用，其特征在于：所述待测样品为小分子溶液或人血清；所述石墨炔与所述小分子物质的比例为(0.05～0.2)g：(0.005～1)mmol。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的应用，其特征在于：所述石墨炔以石墨炔分散液的形式与待测样品进行混合；所述石墨炔分散液的质量体积浓度为0.05～0.2mg/mL；所述基质溶液与所述待测样品的体积比为1：1。