具体实施方式
实时荧光PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中,引入了一种荧光化学物质。随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图。实时荧光PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种,探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。
原材料的选取和制备
一、找出HBV基因型的各型特异性碱基分布规律,根据HBV各型特异序列,设计引物和探针。
1、引物乙型肝炎病毒(HBV)基因结构包括4个部分重叠的开放读码框(ORF),即前S/S区、前C/C区、P区和X区,其中S区基因差异是HBV基因分型的依据,而P区则集中了核苷类似物耐药基因突变位点,S区短于P区并与之完全重叠。据此,查阅GenBank数据库中已经登录的HBV基因组全序列,其中B、C、D基因型HBV序列均在30例以上,进行比对分析设计引物。引物扩增片段必须包括HBV-B、C、D基因型区别位点。引物(Y1、Y2)可同时扩增HBV B/C型基因片段,引物(Y3、Y4)可扩增HBV D型基因片段。引物序列如表一(注:碱基简并:Y=C/T。)所示。
表1
HBV野生B型样本用引物Y1/Y2扩增片段如:SEQ ID NO:10所示。
HBV野生C型样本内引物Y1/Y2扩增片段如:SEQ ID NO:11所示。
HBV野生D型样本内引物Y3/Y4扩增片段如:SEQ ID NO:12所示。
使用的引物为人工合成核苷酸,引物合成纯度直接决定其质量。以扩增效率和活性保存时间为主要的衡量指标,以保证高质量为前提选择公司规模较大且成本较低的合成厂家为基本原则,在产品研发过程中筛选指定使用上海英骏生物技术有限公司合成的引物,PAGE纯化。通过对反应体系的研究,确定引物Y1/Y2的终浓度均为400nM,Y3/Y4的终浓度为200nM。
2、探针
根据HBV流行病学的调查研究结果,发现HBV具有地域性流行的特点,中国及亚洲绝大部分地区以B型和C型为主,另有少量的D型。选取GenBank数据库中此三种基因型的HBV基因组全序列各30个,用Clustal软件进行比对分析确定其两两区分的碱基位置,据此设计HBV-B、C、D基因型特异性探针各5条,其序列如表2所示。
表2
每条探针的设计除了要求在碱基差异位点具有高灵敏性和特异性外,还要力求尽可能包括差异位点之外的碱基多态性以最大程度的避免漏检。所有探针的Tm值应尽可能在同一个温度,以使杂交能在一个条件下进行而不出现非特异性信号。由于基因型差异都是1-2个碱基的差别,在满足探针特异的前提下实现探针Tm值的均一性显得格外重要,有些位点需进行反复设计及试验方能与其它多数探针杂交Tm值一致。
通过在不同型别的探针5’端加上不同荧光标记(FAM或HEX),在扩增过程中通过荧光PCR仪可检测到不同颜色的荧光,即可得到HBV基因分型结果。
探针为人工合成寡聚核苷酸,探针Y5、Y6和Y9的5’端用FAM标记,3’端用TAMRA标记;探针Y7和Y8的5’端用HEX标记,3’端用TAMRA标记,探针合成纯度和标记效率直接影响其质量。在产品研发过程中筛选指定使用上海英骏生物技术有限公司合成的探针,HPLC纯化。对反应体系的研究,确定各探针的使用浓度均为100nM。
二、Taq/UNG酶系、dN(U)TP的配制
DNA聚合酶是PCR反应中重要的成分之一,是PCR扩增效率的重要保证。以扩增效率和活性保存时间为主要的衡量指标,以保证扩增效率和较长的保存期限的基础上寻求成本较低的酶***为基本原则,在产品研发过程中我们对比了上海生工、Promega、MBI、Takara等各厂家的Taq DNA聚合酶,最后筛选指定使用Takara公司的Taq DNA聚合酶。该Taq DNA聚合酶的技术参数:SDS-PAGE检测,纯度>95%,具DNA聚合酶活性,无核酸外切酶活性及核酸内切酶活性,具热稳定性,94℃1小时后仍保持50%活性。
UNG酶,尿嘧啶DNA糖基酶,它催化尿嘧啶的单链和双链DNA释放游离尿嘧啶。主要应用于PCR扩增产物的防污染。作用原理:在PCR反应体系中以dUTP替代dTTP掺入DNA中,形成了含dU碱基的糖苷键,降解PCR扩增产物。UNG酶以消除PCR产物污染效率和活性保存时间为主要的衡量指标。在研发过程中我们对比了Promega公司和MBI公司的UNG酶,两者在实验效果上并无明显区别,考虑到价格及供货期等因素,最终选用Promega公司的UNG酶。
Promega公司UNG酶,1U UNG酶37℃处理3分钟后,103拷贝以下含有dU碱基糖苷键DNA被降解,不能产生扩增产物。技术参数:SDS-PAGE检测,纯度>95%,具有特异降解DNA链中dUTP位点的特性,95℃5分钟后可将其灭活。
UNG酶(1U/μL)与Taq DNA聚合酶(5U/μL)以1∶1(v/v)混合均匀,再进行配液或-18℃以下保存。我们将这种混合物命名为Taq/UNG酶系。
2、dN(U)TP
dN(U)TP是PCR反应中重要的成分之一,包括dATP、dCTP、dGTP和dUTP,是PCR扩增效率的重要保证。世界各知名品牌的dN(U)TP中进行比较和挑选,以扩增效率和活性保存时间为主要的衡量指标,以保证扩增效率和较长的保存期限的基础上寻求成本较低的酶***为基本原则,在产品研发过程中我们对比了上海宏泰和Promega公司的dN(U)TP,最后筛选指定使用Promega公司的dN(U)TP,技术参数:HPLC纯,PCR级,无DNase、RNase污染。
在本试剂盒中以dUTP代替常规PCR使用的dTTP,是基于建立了dUTP/UNG酶防污染体系。
三、纯水
试剂盒生产用水为纯水,由本公司制备。肉眼观察纯水清澈无杂质,经DDB-305型电导率仪测定其电阻率取值范围在1.0MΩ/cm以上。通过使用市售纯水及纯水仪制备的纯水为对照,生产试剂盒,经过试剂盒成品质检合格确认该纯水适用于本试剂盒的生产。
四、质量控制品
产品试剂盒的主要原材料包括引物、探针、Taq/UNG酶系和dN(U)TP等,为了控制原材料质量,我们进行了相应的研究并建立了质量检定规程。由于目前国内外都没有HBV基因型标准品,因此本公司制备了一套工作参考品用于质量控制。
1.工作参考品的组成
阳性参考品的组成:包括临床上HBV感染中最为常见的B、C、D亚型和B/C、B/D、C/D、B/C/D混合型感染。具体为:
P1:HBV B亚型感染;
P2:HBV C亚型感染;
P3:HBV D亚型感染;
P4:HBV B/C混合感染;
P5:HBV B/D混合感染;
P6:HBV C/D混合感染;
P7:HBV B/C/D混合感染;
分别使用这7种阳性参考品进行检测,只在其相应的型别检测通道呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1。
阴性参考品的组成:混合临床收集的HBV阴性血清样本,标记为N1,混合国家乙肝阳性参考品,标记为N2、N3,将N1-N3作为阴性参考品。
使用这3种阴性参考品进行检测,检测结果各通道均无典型S型扩增曲线或Ct值=40,结果判定为HBV B/C/D阴性。
精密度参考品的组成:选用阳性参考品P1作为精密度参考品。
使用精密度参考品进行检测,重复10次。精密度参考品P1的检测结果为呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1,结果判定为HBV B型,且10次Ct值的变异系数(CV)均小于10%。
灵敏度参考品的组成:灵敏度参考品为HBV-B单亚型,浓度为1.0×107拷贝/mL,标记为S-1。检测时,将S-1按以下梯度稀释,即:
S-1:1.0×107拷贝/ml;
S-2:1.0×106拷贝/ml;
S-3:1.0×105拷贝/ml;
S-4:1.0×104拷贝/ml;
S-5:1.0×103拷贝/ml;
S-6:1.0×102拷贝/ml;
按照本试剂盒产品使用说明书进行检测。结果应该是:
灵敏度参考品S-1,S-2,S-3,S-4,S-5:检测结果均呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1,结果判定为HBV B型。
考虑到最低检出限的可靠性,从最低检出稀释度上推一个梯度,本试剂盒的的最低检出量定为1.0×103拷贝/ml。
2、工作参考品的制备
工作参考品的来源均为从“福建省立医院”收集的HBV阳性和HBV阴性的临床血清样本,实验前均经100℃5min灭活处理(依据《慢性乙肝防治指南》)。因任何一种试剂或方法均不能保证100%的准确性,故仍不排除潜在的生物危险,操作时应小心。使用泡沫箱加冰袋密封运输,在途时限不超过48小时。工作参考品的组成如表3所示。
表3
除本产品试剂盒之外,使用的试剂包括:
国家参考品:“乙型肝炎病毒PCR核酸检测试剂国家参考品(非人用)”,批准文号:(2001)国生参字0009,产品批号0711,由中国药品生物制品检定所提供。”
市售乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒:“乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒”,国食药监械(准)字2009第3400580号,中山大学达安基因股份有限公司)。
测序PCR:测序PCR引物(Y5、Y6)可同时扩增HBV B、C、D型基因片段。由上海英骏生物技术有限公司按要求合成,PAGE纯化,核对合成报告应与合成要求(序列)一致。
引物序列如表4所示。
表4
引物名称 |
序列 |
YS1 |
5’-TCACCATATTCTTGGGAACAAGA-3’ |
YS2 |
5’-TTCCTGAACTGGAGCCACCA-3’ |
按照下表5配制测序PCR反应液:所有组分试剂配制同本试剂盒组分试剂配制。
表5
试剂 |
1人份(μL) |
纯水 |
30.5 |
10×PCR buffer |
5 |
25mM MgCl2 |
6 |
dNTP(10mM) |
1 |
10μM YS1 |
1 |
10μM YS2 |
1 |
5U/μL Taq酶 |
0.5 |
总量 |
45 |
HBV DNA提取和加样:用本试剂盒提取样本DNA,每个样本取5μL提取的HBV DNA加入装有45μL测序PCR反应液的PCR管中,放入普通PCR仪进行扩增。
测序PCR扩增程序:(a)95℃预变性5min,(b)95℃变性30s,(c)55℃退火30s,(d)72℃延伸60s,b-d运行40个循环,最后72℃再延伸5min。
制备的工作参考品按照规定体积分装,于-18℃冻存,禁止反复冻融,从制备日起4年有效。
1、阳性参考品的制备
用本公司的“乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒检测(PCR-荧光探针法)”(具体操作参考本试剂盒使用说明书)对收集的临床样本进行检测。从中选取HBV-B、C、D单亚型的样本进行测序PCR,扩增产物和测序引物YS1送往上海英骏生物技术有限公司进行测序。测得的序列通过网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST进行序列比较,合并比较结果与试剂盒检测结果一致样本,以国家参考品为对照,采用市售乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒进行检测,获得相应的定量结果。然后根据性能研究结果,用以国家参考品为对照,市售乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒检测为阴性的血清将上述血清样本稀释到5×104~5×106IU/ml,充分混匀,P1为HBV-B;P2为HBV-C;P3为HBV-D;P4为HBV-B、HBV-C单亚型样本等比例混合;P5为HBV-B、HBV-D单亚型样本等比例混合;P6为HBV-C、HBV-D单亚型样本等比例混合;P7为HBV-B、HBV-C、HBV-D单亚型样本等比例混合;以100μL/管分装,1套7份,编号P1-P7。做好标识后-18℃以下冷冻保存。
2、阴性参考品的制备
收集临床检测HBV感染阴性的血清样本,以国家参考品为对照,采用市售乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒检测为阴性的血清样本,即可作为本试剂盒的阴性参考品。检测及判断方法参见上述产品的使用说明书。
选取检测结果为阴性的样本,合并诸样本并充分混匀,按100μL/管分装,编号N1,-18℃以下冷冻保存;选取国家乙肝阴性参考品,合并诸阴性参考品并充分混匀,按100μL/管分装,编号N2、N3,-18℃以下冷冻保存。
3、精密度参考品的制备
精密度参考品即为阳性参考品P1,100μL/管分装。做好标识后-18℃以下冷冻保存。
4、灵敏度参考品的制备
收集临床诊断为HBV感染患者血清,用“乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒检测(PCR-荧光探针法)”(具体操作参考本试剂盒使用说明书)进行检测,统计检测结果,选择具有代表性的样本:HBV-B单亚型样本。
选取HBV-B单亚型样本进行测序PCR,扩增产物和测序引物YS1送往上海英骏生物技术有限公司进行测序。测得的序列通过网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST进行序列比较,比较结果与试剂盒检测结果一致的,以国家参考品为对照,采用市售乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒进行检测,获得相应的定量结果。然后根据性能研究结果,用以国家参考品为对照,市售乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒检测为阴性的血清将上述血清样本稀释到1×107拷贝/ml,充分混匀,作为灵敏度参考品S-1。
5、工作参考品的检测标准:
(1)阳性参考品符合率:应用7份阳性参考品进行检测,结果应该是:
阳性参考品P1:检测样本呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1,结果判定为HBV B型。
阳性参考品P2:检测样本呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1,结果判定为HBV C型。
阳性参考品P3:检测样本呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1,结果判定为HBV D型。
阳性参考品P4:检测样本呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1,结果判定为HBV B/C混合型。
阳性参考品P5:检测样本呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1,结果判定为HBV B/D混合型。
阳性参考品P6:检测样本呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1,结果判定为HBV C/D混合型。
阳性参考品P7:检测样本呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1,结果判定为HBV B/C/D混合型。
(2)阴性参考品符合率
应用3份阴性参考品进行检测,具体操作按照本试剂盒产品使用说明书进行。结果应该是:阴性参考品N1-N3的检测结果均为无典型S型扩增曲线或Ct值=40,结果判定为HBV B/C/D阴性。
(3)精密度
应用1份精密度参考品(P1)进行检测,重复10次,具体操作按照本试剂盒产品使用说明书进行。结果应该是:精密度参考品P1的检测结果为呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1,结果判定为HBV B型,且10次Ct值的变异系数(CV)均小于10%。
(4)最低检出量:应用1份灵敏度参考品S-1(浓度为1.0×107拷贝/ml)进行检测,将S-1分别10倍梯度稀释,即:S-1:1.0×107拷贝/ml;S-2:1.0×106拷贝/ml;S-3:1.0×105拷贝/ml;S-4:1.0×104拷贝/ml;S-5:5.0×103拷贝/ml;S-6:5.0×102拷贝/ml;
结果应该是:灵敏度参考品S-1,S-2,S-3,S-4,S-5:检测结果均呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1,结果判定为HBV B型。
考虑到最低检出限的可靠性,从最低检出稀释度上推一个梯度,本试剂盒的的最低检出量定为1.0×103拷贝/ml。
6、使用工作参考品检测主要原材料的检测标准
引物检测标准
使用1个灵敏度参考品S-5和1个阴性参考品N1进行检测,检测标准为检测样本呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1。
探针检测标准使用1个灵敏度参考品S-5和1个阴性参考品N1进行检测,检测标准为检测样本呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1。
Taq/UNG酶系和dN(U)TP检测标准
使用1个灵敏度参考品S-5和1个阴性参考品N1进行检测,检测标准为检测样本呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1。
7、工作参考品的使用
按照“乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒(PCR荧光探针法)”使用说明书进行操作,最终观察检测结果是否与上述标准一致,以此来判断产品和原材料是否合格。
8、工作参考品的保存
所有参考品应做好标识后于-18℃以下进行保存。有效期为4年。
9、工作参考品的定值试验
灵敏度参考品的使用终浓度为1.0×107拷贝/mL。
精密度参考品的使用终浓度为2.0×105拷贝/mL。
10、用于产品使用质量控制的标准品
为了对试剂盒使用过程进行质量控制,本试剂盒配备阳性质控品和阴性质控品。在产品检定质量控制工作参考品的研究基础上,选择阳性参考品P1作为试剂盒使用时的阳性质控品;同时选择阴性参考品(N1)作为试剂盒使用时的阴性质控品。以阳性质控品检测结果呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1,结果判定为HBV B型,且阴性质控品检测结果均为无典型S型扩增曲线或Ct值=40,结果判定为HBV B/C/D阴性,作为试验成立的前提条件。阳性质控品和阴性质控品按照100μL/管进行分装,做好标识后-18℃以下冷冻保存待用。
实施例1本发明试剂盒的制备
1.本发明PCR反应液的配制及分装
实验室本发明,PCR反应液的配液量每次约为20人份,配制方法如下:
1.1配液准备
1.1.1dN(U)TP准备
将购买的100mM的dATP、dUTP、dGTP、dCTP,按照1∶2∶1∶1(体积比)混合,混合液各成分浓度分别为:20mM、40mM、20mM、20mM,取0.5mL离心管,分装成每管50μL的dN(U)TP贮存液。
使用前分别在上述dN(U)TP贮存液中加入50μL纯水,稀释成100μL浓度为10mM的dN(U)TP使用液。
1.1.2引物
将合成的引物13000rpm离心1min,加入适量纯水(根据合成量计算)将引物溶解成100μM,取0.5mL离心管,分装成每管40μL的引物贮存液。
使用前在引物贮存液中加入360μL纯水,稀释成400μL浓度为10μM的引物使用液。
1.1.3探针
将合成的探针13000rpm离心1min,加入适量纯水(根据合成量计算)将探针溶解成100μM,取0.5mL离心管,分装成每管40μL的探针贮存液。
使用前在探针贮存液中加入360μL纯水,稀释成400μL浓度为10μM的探针使用液。
1.2配液:如表6为本发明B/C型PCR反应液配液单。如表7为本发明D型PCR反应液配液单。
表6
试剂 |
1人份(μL) |
纯水 |
26 |
10×PCR buffer |
5 |
25mM MgCl2 |
6 |
dN(U)TP(10、20mM) |
1 |
10μM Y1 |
2 |
10μM Y2 |
2 |
10μM Y5 |
0.5 |
10μM Y6 |
0.5 |
10μM Y7 |
0.5 |
10μM Y8 |
0.5 |
总量 |
44 |
表7
试剂 |
1人份(μL) |
纯水 |
29.5 |
10×PCR buffer |
5 |
25mM MgCl2 |
6 |
dN(U)TP(10、20mM) |
1 |
10μM Y3 |
1 |
10μM Y4 |
1 |
10μM Y9 |
0.5 |
总量 |
44 |
1.3分装
将上述PCR反应液按每管440μL分装于1.5mL离心管中,作好标识,-18℃以下冰箱中保存。
1.4检验结果
抽取6人份PCR反应液用1个阳性参考品和1个阴性参考品做检测,各重复3次,阳性参考品检测呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1,结果判定为HBV B型,阴性参考品检测无典型S型扩增曲线或Ct值=40,结果判定为HBV B/C/D阴性,检测结果合格。
2、本发明试剂盒的使用
在本发明,因每次的配液量仅约20人份,为了避免加样量小造成配液不准不稳定,先将引物、探针、dN(U)TP稀释10倍成使用液后再进行配液。
(1)试剂配制
按样本数(样本数=待检血清样本数+质控品2个)n配制反应液:分别取出B/C型PCR反应液和D型PCR反应液,置于室温溶解后,将n×44μL B/C型PCR反应液和n×1μL Taq/UNG酶系加入一个离心管中并震荡混匀,瞬时离心后,45μL/管分装于PCR反应管中,作为B/C型PCR反应液管;将n×44μL D型PCR反应液和n×1μL Taq/UNG酶系加入一个离心管中并震荡混匀,瞬时离心后,45μL/管分装于PCR反应管中,作为D型PCR反应液管。各反应液管盖上管盖后转移到加样区,避光4℃保存备用。
(2)样本、质控品处理和加样
在0.5mL离心管中加入100μL DNA浓缩液及100μL待检血清样本,振荡混匀,12000rpm离心10分钟。吸弃上清(注意不要碰到底部沉淀),加入30μL DNA提取液至沉淀中(DNA提取液使用时须充分混匀),100℃保温10分钟,12000rpm离心5分钟,保留上清作为PCR反应模板。上清如不立即使用,必须置于-18℃以下保存,重新使用时需解冻后稍加离心。
加样:取样品处理上清液5μL分别加入B/C型PCR反应液管和D型PCR反应液管中,PCR反应液管瞬时离心,放入全自动荧光PCR仪。
注:HBV分型阳性质控品和HBV分型阴性质控品同步处理。
(3)PCR扩增:按下列如表8所述程序条件进行扩增。
表8
注:在Stage 3的60℃---45sec收集荧光,荧光素设定为FAM和HEX(无HEX可以设定为JOE)。
(4)结果分析:反应结束后自动保存结果,根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整,Start值可以在2-6、End值可设在10-15,调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线),点击Analysis自动获得分析结果,在Report界面察看结果。质量控制如表9所示。
表9
上述质控要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效,需重新进行。
试验结果的判定:反应结束后自动保存结果,根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整,Start值可以在2-6、End值可设在10-15,调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线),点击Analysis自动获得分析结果,在Report界面察看结果,具体判断如表10。
表10
注:35.1<Ct>40为检测灰区,建议复检,如复检结果仍为35.1<Ct>40参考Ct≤35.1判断。
请参阅图1、图2、图3、图4,通过对本产品准确性、特异性、重复性、稳定性、灵敏度和精密度进行研究,显示其具备以下性能:
图1为阳性参考品P1-P7检测结果图:P1-P7检测符合率为100%。
图1为阴性参考品N1-N3检测结果图:国家标准品中阴性参考品N1-N3检测符合率为100%。
图3精密度参考品P1重复10次,检测结果图,检测符合率为100%。
图4为灵敏度参考品S-1到S-6检测结果图(所测浓度依次为1.0×107copies/ml、1.0×106copies/ml、1.0×105copies/ml、1.0×104copies/ml、1.0×103copies/ml、1.0×102copies/ml)。
3、优点和效果:
荧光PCR技术与传统PCR技术相比,具有无与伦比的优势。其主要特点是:(1)传统PCR采用终点分析法,荧光PCR实时收集指数扩增期的数据;(2)报告基团的荧光信号与扩增产物成正比;(3)操作简便、快速高效,而且具有很高的敏感性和特异性;(4)在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定,大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作;(5)可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增,即多重扩增。本项目在大量分析现有已分型的HBV-DNA序列的基础上,找出HBV基因型的型特异性碱基的分布规律,采取了特异性引物和特异性探针结合的荧光PCR检测方法,既提高了分型灵敏度、准确度,又延续了荧光PCR检测方法的快速简便性能,实现了本项目的目的。
本品采用聚合酶链式反应(PCR)结合Taqman荧光探针技术,检测样品中B、C和D型乙型肝炎病毒,可检测B、C和D型单独感染和混合感染。采用双色探针,FAM波长检测B(或D)型乙型肝炎病毒,HEX波长检测C型乙型肝炎病毒。本品的优点在于一次实验同时检测B、C和D型乙型肝炎病毒,操作简单。试剂盒中使用dUTP和UNG酶,能够有效消除污染的扩增产物对检测结果的干扰。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。