CN103014180A

CN103014180A - 一种人星状病毒核苷酸的检测引物和探针及检测方法

Info

Publication number: CN103014180A
Application number: CN2012105843781A
Authority: CN
Inventors: 肖性龙; 余以刚; 吴晖; 李晓凤; 唐语谦; 袁琨
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2013-04-03

Abstract

本发明公开了一种人星状病毒核苷酸的检测引物和探针及检测方法，属于生物检测技术领域。一种人星状病毒核苷酸的检测引物，由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列如SEQ NO.1和2所示。与上述检测引物配合使用的探针的核苷酸序列如SEQ NO.3所示；该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。检测人星状病毒核苷酸的方法，包括如下步骤：以待检样品RNA为模板，利用上述的正向引物、反向引物以及探针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。本发明根据人星状病毒基因组序列设计的引物特异性好，用于实时荧光RT-PCR检测的灵敏度高。

Description

一种人星状病毒核苷酸的检测引物和探针及检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种人星状病毒核苷酸的检测引物和探针及检测方法。

背景技术

人星状病毒（Human astrovirus,HAstV）是无包膜的单股正链RNA病毒，属于星状病毒科哺乳动物属。HAstV是导致幼小动物产生腹泻的一种重要病原，世界各地均已有星状病毒感染的报道，既可散发也可以引起暴发流行，亦可引起医源性感染。与轮状病毒相似，星状病毒感染多发生在2岁以内尤其是1岁以内的婴幼儿。目前认为人星状病毒是婴幼儿病毒性胃肠炎的第二位病因，仅次于轮状病毒。此外，老年人和免疫缺陷患者也是星状病毒感染的高危人群，人类免疫缺陷患者、接受骨髓移植及联合免疫缺陷患者发生星状病毒感染均已有报道。人星状病毒亦是健康成年人发生胃肠炎的病因之一。因此，疾病预防控制机构以及医院急需特异性强，敏感性高，操作方便，可用于胃肠炎等暴发疫情和临床病例的早期快速诊断的方法。

1975年Madeley首次在电镜下观察到星状病毒，由于病毒颗粒表面有5～6个星状突起，故而得名。人星状病毒颗粒直径为28～41nm，当病毒存在于高pH值环境下，其表现为典型的星状形态。它的基因组从5’端到3’端包括一个约85个核苷酸的5’非编码区、3个开放读码框架（ORF1a、ORF1b、ORF2）、1个约80个核苷酸的3’非编码区和1个大约30个核苷酸的多聚腺苷酸尾。ORF1a和ORF1b编码非结构蛋白，ORF1a编码丝氨酸蛋白酶，且其下游存在1个核定位信号；ORF1b编码RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RDRP），RDRP是通过核糖体读框移位机制合成的1个融合蛋白。HAstV衣壳蛋白由ORF2编码合成。在病毒复制的过程中，所感染的细胞内可检测出2种病毒特异性的RNA，1个是6.8KB的全长基因组RNA，另一个是2.8Kb的亚基因组RNA，2种RNA的3’端均具有多聚腺苷酸尾。亚基因组RNA包含了全部的ORF2序列，可作为mRNA表达衣壳蛋白。ORF2编码产物至少包括2个区域：第1个区域（1～415个氨基酸）在各血清型之间是高度保守的；第2个区域（416个氨基酸～结束）是高度变异的，病毒的中和抗原决定簇即在此区域内。

人星状病毒在细胞培养中增殖困难，且多数星状病毒在细胞培养物中不产生细胞病变，这为病毒分离带来了难度。目前人星状病毒的常规检测方法主要是应用电镜直接检测粪中的病毒颗粒，或用免疫诊断方法检测粪中的病毒抗原和血清中的特异性抗体。电镜检查病毒灵敏度较低，容易出现漏检；免疫学方法特异性有待提高，而且都费时费力。传统的RT-PCR也被用于人星状病毒，但检测时间需要6小时。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人星状病毒核苷酸的检测引物。

本发明的另一目的在于提供与上述检测引物配合使用的探针。

本发明的另一目的在于提供一种检测人星状病毒核苷酸的方法，该方法通过使用上述检测引物和探针进行实时荧光RT-PCR检测，能够快速简单地判断样品是否有人星状病毒，为人腹泻和胃肠炎的病原学诊断提供科学依据。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种人星状病毒核苷酸的检测引物，所述的检测引物由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列如下：

正向引物：5’-GCCAGACTCACAGAAGAGCAAC-3’；

反向引物：5’-GGACTTGCTAGCCATCACACTTC-3’。

与上述检测引物配合使用的探针的核苷酸序列如下：

探针：5’-CCTCCCCTCCAAATGCGATGGAG-3’，该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料；优选的，该探针的5’端标记有报告荧光染料，3’端标记有淬灭荧光染料。

所述的报告荧光染料优选为Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3或Cy5。

所述的淬灭荧光染料优选为Tamra、Rox、Dabcy1、BHQ1或BHQ2。

根据TaqMan技术，在常规PCR的基础上添加了一条标记有两个荧光染料基团的核苷酸探针，例如将报告荧光染料标记的探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对人星状病毒的检测。

一种检测人星状病毒核苷酸的方法，包括如下步骤：以待检样品RNA为模板，利用上述的正向引物、反向引物以及探针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

所述的检测人星状病毒核苷酸的方法的实时荧光RT-PCR反应体系包括如下组分：2.5μL10×One Step RNA PCR Buffer，2μL dNTP（各2.5mM），上述正向引物和反向引物（10μM）各1.5μL，0.5μL上述探针（10μM），0.5μL Taq酶，0.5μL RNase Inhibitor（40U/μL），0.5μL AMV RTase XL（5U/μL），5μL RNA，10.5μL RNase Free dH₂O。

当然，可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物序列设计其它类型的探针，以适用不同方法的荧光PCR检测。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明根据人星状病毒基因组序列设计的引物特异性好，用于实时荧光RT-PCR检测的灵敏度高。

（2）本发明检测方法准确性高，灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有人星状病毒，为人腹泻、胃肠炎的病原学诊断及鉴别诊断提供了科学依据。

附图说明

图1是人星状病毒核酸Real-time RT-PCR检测方法的特异性试验结果图。

图2是人星状病毒核酸Real-time RT-PCR检测方法的灵敏性试验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1引物和探针的设计

从NCBI数据库下载所有的已知人星状病毒全基因组序列，并进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段，设计引物和探针，其序列如下：

正向引物：5’-GCCAGACTCACAGAAGAGCAAC-3’；

反向引物：5’-GGACTTGCTAGCCATCACACTTC-3’。

探针的序列为：5’-CCTCCCCTCCAAATGCGATGGAG-3’；该探针的5’端用报告荧光染料VIC标记，3’端用淬灭荧光染料BHQ2标记。

实施例2人星状病毒核酸荧光RT-PCR条件的优化

利用灭活的人星状病毒作为待检样品，用商业RNA提取试剂盒提取病毒基因组RNA，分别分装后储存于-20℃备用。

（1）引物浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将实施例1中的引物浓度分别从0.1μmol/L至1.6μmol/L作倍比连续稀释，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.4μmol/L。

（2）镁离子浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将MgCl₂的浓度从1mmol/L至10mmol/L以1mmol/L递增，确定镁离子最佳镁离子浓度为5mmol/L。

（3）反转录酶（AMV RnaseXL）用量的优化：使用不同浓度反转录酶的试验结果比较，选定5U作为反转录酶的用量。

（4）Taq DNA聚合酶（Taq酶）用量的优化：通过比较Taq酶用量的优化实验结果，选定5U作为Taq酶的用量。

（5）dNTPs浓度的优化：通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，综合评估后选1mmol/L作为dNTPs的使用量。

（6）探针浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将实施例1中的探针浓度分别从0.1μmol/L至0.5μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳探针终浓度为0.2μmol/L。

利用实施例1的引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的人星状病毒实时荧光RT-PCR反应体系为25μl体系，所需各组分及相应浓度见表1。

表1人星状病毒实时荧光RT-PCR反应中的各组分情况

组分	用量/终浓度
		10×One Step RNA PCR Buffer	1×
25mmol/L MgCl₂	5mmol/L
		dNTPs	1mmol/L
RNase Inhibitor	40Unit
		引物	0.4μmol/L each
探针	0.2μmol/L
		模板	10μl
AMV RNaseXL	5Unit
		Taq	5Unit

注：a.使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。

b.根据检测样本来源不同，应适当调整模板加量。

q荧光RT-PCR条件选择如下：

50℃30分钟，95℃2分钟，1个循环；95℃5秒，60℃40秒，40个循环。

实施例3人星状病毒核酸实时荧光RT-PCR检测方法的建立

（1）待测模板的制备：病毒样品RNA的抽提用Roche High Pure viral RNA kit试剂盒提取。

1）取0.5克粪便标本，加TE500μL制成10-20%的悬液，8000rpm离心5分钟；

2）取200μL标本上清加400μL结合液，混合均匀，加入纯化过滤管中，1000rpm，15s；

3）弃去过滤液，换一新的收集管，加入500μL inhibitor removal buffer，10000rpm离心1分钟；

4）弃去过滤液，换一新的收集管，加入450μL洗液，10000rpm离心1分钟；

5）重洗一次；最后离心，13000rpm，10s，弃去残余的洗液；

6）去掉收集管，换一个干净的无RNA的1.5mL Eppendrof离心管，用50μL洗脱液加入过滤管中，10000rpm离心1分钟，将提取的RNA移到一个新的离心管中，于-80℃保存。

（2）人星状病毒实时荧光RT-PCR反应的扩增条件

根据表1加样，将加好样的PCR管放在荧光PCR仪中，设置相应荧光收集条件后进行扩增，反应程序如下：

1）50℃30分钟进行RNA的反转录，95℃3分钟灭活反转录酶；

2）95℃15秒变性，55℃30秒退火，72℃1分钟延伸，如此重复5个循环进行预扩增；

3）95℃10秒变性，60℃40秒退火、延伸，如此重复40个循环进行目的片段的扩增检测，试验结果可以实时监测。

（3）人星状病毒实时荧光RT-PCR的检测结果

经检测，若待检样品中含有人星状病毒则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可达到50个拷贝/mL；若待检培养液中不含有人星状病毒则无扩增信号。

实施例4人星状病毒核酸Real-time RT-PCR检测方法的特异性试验

利用建立起实施例3的检测方法对10株不同的人类病毒进行检测（HAstV病毒3株，脊髓灰质病毒PolioⅠ、PolioⅡ、PolioⅢ各1株，轮状病毒3株、诺如病毒1株），检测结果如图1所示，3株HAstV病毒（编号为HAstV-SZ11，HAstV-SZ12，HAstV-SZ13）均出现相应的特异性荧光扩增曲线（参见图中A所指），呈阳性反应。而其它7株人类病毒（包括3株灭活的脊髓灰质病毒PolioⅠ、PolioⅡ、PolioⅢ，3株轮状病毒、1株诺如病毒。）则均没有荧光信号产生（参见图中B所指），判为阴性。结果表明，所设计的引物探针只对目的病毒（即，HAstV病毒）特异，与其它检测对象无交叉反应。

以人星状病毒的RNA为模板，通过实时荧光RT-PCR检测可观察到明显的荧光强度变化，结果均为阳性。而其它病毒的荧光强度没有变化，结果均为阴性。表明该检测方法有良好的特异性。

实施例5人星状病毒核酸Real-time RT-PCR检测方法的灵敏性试验

将HAstV病毒的RNA用DEPC处理的水分别稀释，进行相对灵敏度检测，在25μL反应体系中，RNA分别被稀释成5.0×10⁷、5.0×10⁶、5.0×10⁵、5.0×10⁴、5.0×10³、5.0×10²、5.0×10¹拷贝数，检测结果如图2所示，结果证实人星状病毒检测的最低检测限均达到50个模板拷贝。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种人星状病毒核苷酸的检测引物，其特征在于：所述的检测引物由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列如下：

正向引物：5’-GCCAGACTCACAGAAGAGCAAC-3’；

反向引物：5’-GGACTTGCTAGCCATCACACTTC-3’。

2.与权利要求1所述的检测引物配合使用的探针，其特征在于：所述探针的核苷酸序列如下：：5’-CCTCCCCTCCAAATGCGATGGAG-3’；该探针的5’端标记有报告荧光染料，3’端标记有淬灭荧光染料。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于：所述探针的5’端标记有报告荧光染料，3’端标记有淬灭荧光染料。

4.根据权利要求2所述的探针，其特征在于：

所述的报告荧光染料优选为Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3或Cy5；

所述的淬灭荧光染料优选为Tamra、Rox、Dabcy1、BHQ1或BHQ2。

5.一种检测人星状病毒核苷酸的方法，其特征在于包括如下步骤：以待检样品RNA为模板，利用上述的正向引物、反向引物以及探针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的实时荧光RT-PCR反应体系包括如下组分：2.5μL10×One Step RNA PCR Buffer，2μL dNTP（各2.5mM），上述正向引物和反向引物（10μM）各1.5μL，0.5μL上述探针（10μM），0.5μLTaq酶，0.5μLRNase Inhibitor（40U/μL），0.5μL AMV RTase XL（5U/μL），5μL RNA，10.5μL RNase Free dH₂O。