CN102586155A

CN102586155A - 一种植物乳杆菌n13及其用途

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Publication number: CN102586155A
Application number: CN2012100578224A
Authority: CN
Inventors: 陈卫; 刘小鸣; 田丰伟; 张灏; 赵建新; 宋元达; 刘文玉; 范大明; 王刚; 张秋香; 陈海琴
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Priority date: 2012-03-07
Filing date: 2012-03-07
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2032-03-07
Also published as: CN102586155B

Abstract

本发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N13及其用途。本发明植物乳杆菌N13具有耐酸性、耐胆盐能力，对肠上皮细胞株HT-29细胞具有很高的粘附性，具有抑制EIEC生长、抑制EIEC对肠上皮细胞株HT-29细胞的粘附和侵袭的能力。用本发明植物乳杆菌N13制备的酸豆乳、发酵燕麦饮料、发酵蔬菜、发酵青贮饲料、乳酸菌乳饮料以及发酵乳具有非常好的应用前景。

Description

一种植物乳杆菌N13及其用途

【技术领域】

本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N13，还涉及所述植物乳杆菌N13的用途。

【背景技术】

肠侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive Escherichia coli.，EIEC)是一组能侵入大肠上皮细胞，使宿主肠上皮细胞发生炎症或形成溃疡，引起痢疾样症状的大肠杆菌菌株。EIEC致病毒力强，繁殖速度快，只要有10～100个EIEC细菌就可以引发疾病，它污染食品和水源，造成爆发流行，从而引起大规模性腹泻疾病。EIEC的毒力取决于侵入细胞的能力，侵入过程包括原发和扩散两个过程。EIEC入侵肠道上皮细胞分为四个过程：(1)EIEC通过M细胞到达肠黏膜下层；(2)在巨噬细胞中复制；(3)侵入到结肠细胞的基底外侧；(4)侵入到结肠上皮细胞，并在其中繁殖，扩散，引发炎症和痢疾症状反应。

治疗EIEC所引起的肠道疾病，通常的治疗方法是使用抗生素治疗。抗生素治疗方法具有以下作用：1、能有效控制EIEC引起的临床和亚临床感染；2、抗生素可以抑制肠道细胞壁的增生，从而提高肠道细胞对营养成分的吸收；3、起着选择肠道微生物菌群的作用，主要是通过减少有害微生物对必须营养物质的消耗，增加有益细菌的大量繁殖；4、影响动物的某些生理代谢，从而影响动物的生长。抗生素治疗具有见效快，治疗时间短等优点，但是随着人类大量使用和滥用抗生素，同时也给环境和社会带来了一系列问题，这主要包括：1、抗生素能够导致肠道菌群失调，耐药性菌株增加，从而使得抗生素治疗愈发困难；2、长期使用抗生素造成机体免疫力下降；3、易感染情况增加，引起机体二重感染；4、抗生素等药物在畜产品和环境中的残留，威胁人类的身体健康。

为了克服抗生素的副作用，越来越多的研究选用益生菌来治疗EIEC对机体的损害。Resta-Lenert等人(Resta-Lenert，S.，&Barrett，K.E.(2006).Live probiotics protect intestinal epithelial cells from the effects of infection with enteroinvasive Escherichia coli(EIEC).Gut，52，988-997.)利用活的Streptococcus thermophilus和Lactobacillus acidophilus干预EIEC，发现联合使用这两种乳酸菌能够明显的降低EIEC对宿主的粘附和侵袭，并降低EIEC引起的宿主生理功能障碍；Medici等人(Medici，M.，Vinderola，C.G.，Weill，R.，&Perdigón，G.(2005).Effect of fermented milk containing probiotic bacteria in the prevention of an enteroinvasive Escherichia coli infection in mice.Journal of Dairy Research，72，243-249.)使用含有干酪乳杆菌、德氏乳杆菌的发酵牛奶来治疗EIEC引起的感染，发现益生菌能够通过增强小鼠的肠道粘膜的免疫反应来避免EIEC的感染。这些研究表明根据细菌之间的拮抗作用，主要通过不同菌株之间的竞争性抑制作用，不仅能够控制EIEC对肠道上皮细胞的损害，还能够有益于肠道上皮细胞上细菌群落的正常分布，更加有效地发挥肠道的生理功能。这些研究仅从所选乳酸菌菌株对EIEC的拮抗和治疗方面进行考虑，并未考察这些乳酸菌的益生菌特性。益生菌应该具有以下几个主要特性：1.能够耐受胃肠道的极端环境；2.对机体肠道具有很好的粘附能力；3.能够调节机体肠道的生态平衡。本发明通过体外实验筛选出了不仅具有拮抗EIEC能力，而且还具有优良益生菌特性的乳酸菌，并考察乳酸菌对EIEC粘附和侵袭结肠上皮细胞的抑制作用。与报道的治疗EIEC感染的乳酸菌相比，本发明的植物乳杆菌N13具有更好的耐胆盐能力和对结肠上皮细胞更高的粘附能力。

鉴于益生菌对肠道病原菌具有显著的生物拮抗抑制作用和其独特的优点，因此筛选对肠侵袭性大肠杆菌具有抑制和拮抗作用的益生菌具有十分广阔的应用前景。为此，本发明人在总结现有技术的基础上进行了大量实验研究工作，完成了本发明。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N13。

本发明的另一个目的是提供所述植物乳杆菌N13的用途。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N13，该菌菌株已于2011年11月29日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.5495。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N13同时还保藏于江南大学食品微生物菌种保藏中心，保藏编号为CCFM 233。因此在本申请中，术语“CCFM 233”也指代植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N13，两者为同一株菌株。

所述的植物乳杆菌N13具有下述性质：

(1)对致病菌肠侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive Escherichia coli.，EIEC，ATCC 43893)具有显著的抑制作用；

(2)具有耐酸性，在pH 2.0的条件下可以生长；

(3)具有耐胆盐能力，在1-3‰胆盐条件下能够生长；

(4)对肠上皮细胞株HT-29细胞具有很高的粘附能力；

(5)能够明显抑制EIEC对肠上皮细胞株HT-29细胞的粘附；

(6)能够明显降低EIEC对肠上皮细胞株HT-29细胞的侵袭。

本发明涉及所述的植物乳杆菌N13在制备酸豆乳、燕麦发酵饮料、发酵青贮饲料、发酵蔬菜、乳酸菌乳饮料以及发酵乳制品中的用途。

所述的含植物乳杆菌N13的酸豆乳是采用下述方法制备的：

按照软水与大豆的体积比2-4在温度75-85℃下用软水浸泡大豆1-2h，去除大豆皮，去掉浸泡水，再按照大豆与沸水的重量比1∶6-10加沸水磨浆，其浆料在温度80-85℃的条件下保持10-15min，然后用150目筛网过滤，得到一种豆乳；先往该豆乳中加入以豆乳重量计5％-10％的蔗糖，再使用均质机在压力15-25MPa下进行均质，随后在温度95℃下进行杀菌处理10min，其温度降至36-38℃时，再按照以豆乳重量计0.04-0.05％的接种量接入商业干粉发酵剂保加利亚乳杆菌、商业干粉发酵剂嗜热链球菌和下述制备的植物乳杆菌N13发酵剂，其重量比例为1∶1∶1，在温度35-42℃下发酵6-8小时，然后在4℃冷藏保存即得到含植物乳杆菌N13活菌的酸豆乳；

植物乳杆菌N13发酵剂干粉制剂是按照如下方法制备的：植物乳杆菌N13以MRS液体培养基体积计1-3％接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养20-28h，使植物乳杆菌N13活菌数达到10⁸cfu/mL以上，然后其培养液在转速3800-4200r/min与温度2-6℃的条件下离心8-12min，其离心沉淀物再用pH 7.2的PBS缓冲液冲洗2-4次，然后把其菌体沉淀加到冻干保护剂中，调整细胞浓度至10⁹cfu/mL，混合均匀后进行真空冷冻干燥，冻干后得到所述的植物乳杆菌N13发酵剂干粉制剂。所述的冻干保护剂组成是以重量计蔗糖1.5％、脱脂乳14％、乳糖5％、甘油1％、淀粉3％和75.5％水。

所述的燕麦发酵饮料是采用下述方法制备的：

A)以燕麦为原料，将燕麦拣选、去杂、去除表皮并洗净；

B)向燕麦中加入以燕麦重量计100％的50-55℃水进行混合，然后加入到打浆机中打成浆液；

C)步骤B)得到的浆液用磨浆机进行磨浆，再用150目的滤网过滤，得到一种浆液；

D)向步骤C)得到的浆液中添加以浆液重量计10-15％白砂糖和1000-1200％水，在温度121℃下灭菌20min，冷却至36-38℃，得到燕麦发酵基料；

E)植物乳杆菌N13以MRS液体培养基体积计1-3％接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养20-24h，离心分离，弃去发酵上清液，余下菌体沉淀物用无菌水重悬，使植物乳杆菌N13活菌浓度达到10⁸cfu/mL以上，从而得到所述的植物乳杆菌N13液体发酵剂；

F)按照以燕麦发酵基料的体积计6-10％接种量，把保加利亚乳杆菌液体发酵剂、嗜热链球菌液体发酵剂和上述步骤E)制备的植物乳杆菌N13液体发酵剂按照体积比1∶1∶1接种于在步骤D)制备的燕麦发酵基料中，在发酵温度36-38℃下培养18-22h，使植物乳杆菌N13的浓度达到10⁶cfu/mL以上，然后在温度3-4℃下冷藏保存即得到含植物乳杆菌N13活菌的燕麦发酵饮料。

所述的发酵蔬菜是采用下述方法制备的：

A)选用的蔬菜经清洗与沥干后，用0.005-0.01g/kg次氯酸钠溶液浸泡7-10分钟进行消毒，将所述的蔬菜去皮、切分，得到一种预处理蔬菜；

B)往步骤A)得到的预处理蔬菜中加入按照所述蔬菜重量计0.6-1.0％糖与4.0-6.0％食盐，搅拌均匀，在室温预腌制20-28h，沥干水分，得到一种预腌制蔬菜；

C)称取食用香辛料，使用以所述食用香辛料重量计8-10倍水在温度75-85℃下浸提2-4h，冷却后再添加以所述食用香辛料重量计7-9％白酒，混匀得到一种香辛料汁；

D)将植物乳杆菌N13以MRS液体培养基体积计1-3％接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养20-28h，离心分离，弃去发酵上清液，余下沉淀物用无菌水重悬，使植物乳杆菌N13活菌浓度达到10⁸cfu/mL以上，从而得到一种菌悬液；

E)往步骤B)得到的预腌制蔬菜中添加以所述预腌制蔬菜重量计12-14％在步骤C)得到的香辛料汁与1-5％在步骤D)得到的菌悬液，混匀，装罐，密封，在室温下发酵，直到其发酵液的pH值达3.6-4.0，这样得到所述的发酵蔬菜。

其中，所述的蔬菜是一种或多种选自卷心菜、胡萝卜、莴笋、甜椒、洋葱或芹菜的蔬菜。

所述的香辛料是一种或多种选自辣椒、花椒、胡椒、姜、蒜、八角、茴香、桂皮、橘皮或丁香的香辛料。

所述的发酵青贮饲料是采用下述方法制备的：

将玉米秸秆饲料原料揉切至1～4cm后待用；

称取45-55kg玉米秸秆饲料原料，把0.5-0.7g上述制备的植物乳杆菌N13干粉制剂与200-240mL无菌水混合均匀后喷洒到所述的玉米秸秆饲料原料中，翻拌混和均匀后，装入青贮饲料桶中压实密封，然后在常温条件下贮存9-12个月后即得到含植物乳杆菌N13的玉米秸秆饲料。

下面将更详细地描述本发明。

所述的植物乳杆菌N13是采用下述筛选方法获得的。

该筛选方法步骤如下：

A、乳杆菌菌株的筛选。

称取25g传统发酵食品、泡菜、腌肉、发酵面团或婴儿粪便样品，加到225mL无菌水中，混匀后在温度37℃下培养2h，然后取0.5mL这种培养液加到4.5mL无菌水中，得到的稀释培养液再在温度37℃下培养2h，这样得到的培养液重复进行上述稀释培养操作，使该样品浓度稀释至10^-4，取稀释度分别为10^-1～10^-4的菌悬液各50μL分别涂布于MRS固体培养基上，在温度37℃下厌氧培养46-50h后，挑选典型单菌落，采用平板划线法，得到纯乳酸菌菌株，具体情况见表1。

B、分离菌株拮抗EIEC的试验

将筛选得到的和其他来源的乳酸菌菌株(见表1)各自接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下进行厌氧培养24h，然后离心分离，得到的发酵上清液进行常规的拮抗EIEC试验；将指示菌大肠杆菌EIEC(Enteroinvasive Escherichia coli ATCC 43893，购自美国典型培养物保藏中心ATCC)活化后接种于LB液体培养基中，于温度37℃下培养24h，然后测定其培养液在600nm处的吸光度OD₆₀₀值，并用无菌LB液体培养基将其OD值调节至0.66-0.70，以pH 3.2的MRS液体培养基作为阴性对照，320μg/mL的庆大霉素作为阳性对照，重复实验3次，筛选具有拮抗EIEC能力的乳杆菌。其拮抗EIEC试验结果列于表2。

表1：本发明使用的乳酸菌编号、菌株名称和来源

表2：部分乳酸菌对EIEC的抑制作用

^*表示实验组与对照组之间具有显著差异(P＜0.05)。

表2结果表明，植物乳杆菌N13对EIEC具有明显的抑制作用。采用不同酶、pH和热处理的植物乳杆菌N13发酵上清液(见附图5)表明，在其发酵上清液中起抑制作用的物质是一种蛋白质类物质，这种物质具有热稳定性，在酸性条件下具有最大活性。因此植物乳杆菌N13上清液对EIEC 的抑制作用是酸和蛋白质类抑菌物质的综合作用。

C、耐酸性试验

将冷冻保存的分离菌株(见附图1)分别接种于MRS液体培养基中，在37℃培养24h，如此反复传代培养2～3次后，取1mL所述培养液，接种于19mL pH 2.0的MRS液体培养基中，在温度37℃下分别培养4h，测定初始(0h)和培养结束后(4h)在波长600nm处的吸光度OD₆₀₀值，以每株乳酸菌0h的OD值作为参照，考察培养4h时每株乳酸菌OD₆₀₀的增加值。通过测量OD₆₀₀的变化大小，与耐酸性的对照菌株(瑞士乳杆菌ATCC 15019)进行比较，得到了良好耐酸性的乳杆菌。

这些试验结果列于附图1。该试验结果表明，植物乳杆菌N13在pH 2.0条件下培养四小时后OD值的增加量为0.048，高于耐酸性对照菌株瑞士乳杆菌ATCC 15019的增加量，因此，植物乳杆菌N13具有良好的耐酸能力。

D、耐胆盐试验

用猪胆汁盐将MRS液体培养基中的胆汁盐含量分别调至1、2、3‰(重量百分比)，然后在温度121℃下灭菌15min。以MRS-胆汁盐培养基体积计1％，将用液体MRS培养基方法活化的分离菌株(菌株见附图2、3、4，菌株具体信息见表1)培养液接种于所述的MRS-胆汁盐培养基中，在温度37℃下进行培养。在培养0h、3h和6h时取样测量该乳杆菌培养液的OD₆₀₀值，重复3次。以每株乳酸菌0h的OD值作为参照，考察培养3h和6h时，每株乳酸菌OD₆₀₀的增加值，以此判断该菌株的耐胆盐能力。这些试验结果列于附图2、3、4中。这些试验结果表明，植物乳杆菌N13在含有1、2、3‰猪胆盐的MRS液体培养基中培养3h后，该乳杆菌培养液的OD₆₀₀值的增加量分别为0.56、0.48和0.34，由此可见，植物乳杆菌N13具有良好的耐胆盐能力。

表1列出的部分乳酸菌进行了耐酸性试验和耐胆盐试验，其试验结果表明，其中植物乳杆菌N13具有耐酸特性和良好的耐胆汁能力，因此，可以认为植物乳杆菌N13在经过人体胃液的低酸环境和肠道胆汁极端环境后仍具有较高的存活率，具有作为优良益生菌的条件。

E、分离菌株对肠上皮细胞株HT-29细胞的粘附试验

采用以重量计0.25％胰蛋白酶溶液消化肠上皮细胞株HT-29细胞，使用美国Gibco公司生产的RPMI-1640细胞培养液进行稀释，将其细胞浓度调整至2×10⁵个/mL，在六孔板中，先在每孔中加入18×18mm的盖玻片，再在每个孔加入2mL上述含HT-29细胞的细胞培养液，震荡，使得细胞均匀平铺在盖玻片上。然后置于5％二氧化碳培养箱中在温度37℃下培养24h，使得该细胞贴在孔板底部。移取采用液体MRS培养基方法活化的三代乳酸菌(稳定期)(菌株见表2，菌株具体信息见表1)，用PBS缓冲液(pH7.2)清洗2次，调整其乳酸菌浓度达到1～2×10⁸cfu/mL。六孔板的每个孔用pH 7.2的PBS缓冲液清洗3次，每个孔加入1mL所述乳酸菌菌液和1mLRPMI-1640细胞培养液(不含双抗和小牛血清)，在5％二氧化碳培养箱中在温度37℃下共孵育两个小时，每个孔再用pH 7.2的PBS缓冲液清洗5次，以除去未粘附的乳酸菌，然后每个孔用无水甲醇固定30min，清洗后，取出盖玻片进行革兰氏染色，在油镜下选取20个视野进行观察，计算100个HT-29细胞上粘附的乳酸菌个数，以鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus GG，ATCC533103)作为对照，筛选出对肠上皮细胞株HT-29细胞粘附能力高的乳酸菌。其试验结果列于表3。

表3部分乳酸菌对HT-29细胞的粘附率

^**表示实验组与对照之间具有非常显著的差异(P＜0.01)。

表3的结果表明，植物乳杆菌N13对肠上皮细胞株HT-29细胞的粘附能力最强。

F、乳酸菌对EIEC粘附和侵袭的抑制试验

按照与上述E)步骤相同的方式进行，把乳杆菌(菌株见附图6和7)加入到铺满肠上皮细胞株HT-29细胞的六孔板中，每个孔中加入1mL乳杆菌菌液和1mL RPMI-1640细胞培养液(不含双抗和小牛血清)，在37℃、5％二氧化碳培养箱中共孵育两个小时，然后每个孔再用pH 7.2的PBS缓冲液清洗5次，以除去未粘附的乳酸菌，再往每孔中加入浓度1～2×10⁸cfu/mL的EIEC，在5％二氧化碳培养箱中在温度37℃下共孵育4h，用pH 7.2的PBS缓冲液清洗3次，除去未粘附的EIEC。用0.5％Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)裂解细胞，再用pH 7.2的PBS缓冲液进行梯度系列稀释，稀释梯度分别为10^-2，10^-3和10^-4，并进行平板计数，计算粘附到细胞上和侵入到细胞内的EIEC细胞数目。同样地，用100μg/mL庆大霉素和该细胞共孵育1h，以杀死粘附在该细胞上的EIEC细胞，用0.5％Triton X-100裂解细胞，再用pH 7.2的PBS缓冲液进行梯度系列稀释，稀释梯度分别为10^-1，10^-2和10^-3，并进行平板计数，计算侵入到细胞内EIEC的细胞数目。

选取具有良好耐酸性、耐胆盐性以及高粘附性的乳杆菌CCFM 235、N13、CCFM 232、CCFM 236、CCFM 231，并以植物乳杆菌LP-onlly为参照，研究了它们对EIEC粘附(见附图6)和侵袭(见附图7)HT-29细胞的抑制作用。

由附图6可以看出，高粘附的植物乳杆菌N13能够明显降低EIEC对肠上皮细胞株HT-29的粘附，与对照组(未加乳酸菌干预组)相比，粘附到细胞上的EIEC数目降低了46％，说明高粘附的植物乳杆菌N13能够占据EIEC在肠上皮细胞株HT-29细胞上的粘附位点或通过空间阻碍作用抑制EIEC粘附在肠上皮细胞株HT-29细胞上。

由附图7可以看出，高粘附性能的植物乳杆菌N13同样显著地降低EIEC对肠上皮细胞株HT-29细胞的侵袭，EIEC对HT-29的粘附率降低直接导致了EIEC的侵袭率的降低，N13对肠道上皮细胞HT-29细胞具有明显的保护作用。

通过上述这些试验证明，本发明的植物乳杆菌N13(CCFM233)具有下述性质：

(2)具有耐酸性，在pH 2.0的条件下仍然可以生长；

(3)具有耐胆盐能力，在1-3‰胆盐条件下能够生长；

(4)对肠上皮细胞株HT-29细胞具有很好的粘附能力；

(5)能够明显抑制EIEC在肠上皮细胞株HT-29细胞上的粘附；

(6)能够明显降低EIEC对肠上皮细胞株HT-29细胞的侵袭。

所述的植物乳杆菌N13的生物学特性如下：

(1)菌体形态呈杆状，不运动，不形成芽孢，革兰氏染色阳性；

(2)能专性分解糖，主要代谢产物为乳酸；

(3)接触酶反应呈阴性。

所述的植物乳杆菌N13的菌种培养方法如下：

(1)MRS平板纯化分离：无菌条件下用接种环挑植物乳杆菌N13，在MRS平板上划线，平板置于培养箱中37℃培养72h，挑选单菌落进行镜检，实现菌株纯种分离；

(2)菌株活化：从-80℃中取出冻藏菌种，常温下融化，并取100微升保菌液(含30％甘油，70％无菌水的乳酸菌菌株悬液)接种于灭菌的MRS液体培养基中，在温度37℃下生长18-24h后，划线，在固体MRS中在温度37℃下培养72h，挑选单菌落接种于灭菌的MRS液体培养基，活化三代后进行实验；

(3)MRS培养基的组成：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母提取物、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1g吐温80、200mg硫酸镁、54mg硫酸锰与1000mL蒸馏水，pH 6.4，该培养基在温度115℃下进行灭菌20min；

(4)培养条件：在厌氧条件与温度37℃下静置培养；

(5)菌数量的检测方法：采用十倍系列稀释法，选取合适的稀释度，把稀释液加入到平板中，采用标准平板计数法，把20mL固体MRS(温度低于50℃)倒入每个平板中，混匀，待凝固后在温度37℃与厌氧的条件下培养72h，对形成的菌落进行计数。

本发明还涉及所述的植物乳杆菌N13在制备酸豆乳、燕麦发酵饮料、发酵青贮饲料、发酵蔬菜、乳酸菌乳饮料以及发酵乳制品中的用途。

所述的酸豆乳是采用下述方法制备的：

按照软水与大豆的体积比2-4在温度75-85℃下用软水浸泡大豆1-2h，去除大豆皮，去掉浸泡水，再按照大豆与沸水的重量比1∶6-10加沸水磨浆，其浆料在温度80-85℃的条件下保持10-15min，然后用150目筛网过滤，得到一种豆乳；先往该豆乳中加入以豆乳重量计5％-10％的蔗糖，再使用均质机在压力15-25MPa下进行均质，随后在温度95℃下进行杀菌处理10min，其温度降至36-38℃时，再按照以豆乳重量计0.04-0.05％的接种量接入商业干粉发酵剂保加利亚乳杆菌、商业干粉发酵剂嗜热链球菌和下述制备的植物乳杆菌N13发酵剂干粉制剂，其重量比例为1∶1∶1，在温度35-42℃下发酵6-8小时，然后在4℃冷藏保存即得到含植物乳杆菌N13活菌的酸豆乳。

所述的软水应该理解是不含或含少量可溶性钙、镁化合物的水。水的硬度主要由其中的钙(Ca²⁺)、镁(Mg²⁺)离子构成。当含有硬度的原水通过交换器的树脂层时，水中的钙、镁离子被树脂吸附，同时释放出钠离子，这样交换器内流出的水就是去掉了硬度离子的软化水。

在本发明中，所述的过滤器是海宁市联众过滤设备科技有限公司销售的150目的不锈钢双联袋式过滤器。

在本发明中，使用的均质机是常州市均质机械有限公司生产的GJB型均质机(压力为10-80MPa)。灭菌所使用的设备例如是由三洋电机公司生产的SANYO牌灭菌锅。

在本发明中，植物乳杆菌N13浓度的测定方法是采用上述的十倍系列稀释法，使用MRS平板进行标准平板计数法计数的。

所述的燕麦发酵饮料是采用下述方法制备的：

A)以燕麦为原料，将燕麦拣选、去杂、去除表皮并洗净；

E)植物乳杆菌N13以MRS液体培养基体积计1-3％接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养20-24h，离心分离，弃去发酵上清液，余下菌体沉淀物用无菌水重悬，使植物乳杆菌N13活菌数达到10⁸cfu/mL以上，从而得到植物乳杆菌N13液体发酵剂；

F)按照以燕麦发酵基料的体积计6-10％的接种量，把保加利亚乳杆菌液体发酵剂、嗜热链球菌液体发酵剂和上述步骤E)制备的植物乳杆菌N13液体发酵剂按照体积比1∶1∶1接种于在步骤D)制备的燕麦发酵基料中，在发酵温度36-38℃下培养18-22h，使植物乳杆菌N13的浓度达到10⁶cfu/mL以上，然后在温度3-4℃下冷藏保存即得到含植物乳杆菌N13活菌的燕麦发酵饮料。

所述的发酵蔬菜是采用下述方法制备的：

C)称取食用香辛料，使用以所述食用香辛料重量计8-10倍水在温度75-85℃下浸提2-4h，冷却后再添加以所述食用香辛料重量计7-9％白酒，得到一种香辛料汁；

D)植物乳杆菌N13以MRS液体培养基体积计1-3％接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养20-28h，离心分离，弃去发酵上清液，余下沉淀物用无菌水重悬，使植物乳杆菌N13活菌浓度达到10⁸cfu/mL以上，从而得到一种菌悬液；

根据本发明，所述的蔬菜是一种或多种选自卷心菜、胡萝卜、莴笋、甜椒、洋葱或芹菜的蔬菜。

这些蔬菜需要进行去皮，去烂叶等处理，例如卷心菜、胡萝卜需要削去须根，莴笋、洋葱需要去粗皮，甜椒需要除去蒂把，芹菜需要除去乱叶。

这些蔬菜用糖和盐进行腌制。盐能使蔬菜组织软化，以保存可溶性细胞内容物风味，还可以防止腐败菌繁殖，达到保存蔬菜的目的。添加的糖可以是蔗糖、葡萄糖、果糖等，它可以使口味柔和，促进食欲。

根据本发明，所述的香辛料是一些具有刺激性香味，赋予食物特定风味，增进食欲，帮助消化和吸收的植物种子、花蕾、叶茎、根块及其提取物。香辛料通常都含有挥发油(精油)、辣味成分及有机酸、纤维、淀粉、胶质等成分。

根据本发明，所述的香辛料是一种或多种选自辣椒、花椒、胡椒、姜、蒜、八角、茴香、桂皮、橘皮或丁香的香辛料。

本发明中使用的MRS液体培养基是本技术领域的技术人员熟知的培养基，其组成如下：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1g吐温80、200mg硫酸镁、54mg硫酸锰与1000mL蒸馏水，pH 6.4，该培养基在温度115℃下进行灭菌20min后可以使用。

所述的发酵饲料是采用下述方法制备的：

将玉米秸秆饲料原料揉切至1～4cm后待用；

称取45-55kg玉米秸秆饲料原料，把0.5-0.7g上述制备的植物乳杆菌N13发酵剂干粉制剂与200-240mL无菌水混合均匀后喷洒到所述的玉米秸秆饲料原料中，翻拌混和均匀后，装入青贮饲料桶中压实密封，然后在常温条件下贮存9-12个月后即得到含植物乳杆菌N13的玉米秸秆饲料。

作为饲料原料的玉米秸秆外，还可以使用水稻、玉米、高粱、小麦等秸秆以及各种青饲料。青饲料主要包括天然牧草、栽培牧草、田间杂草、菜叶类、水生植物、嫩枝树叶等。

本发明中使用的PBS缓冲液(pH 7.2)组成如下：NaCl 137mmol/L、KCl 2.7mmol/L、Na₂HPO₄ 10mmol/L、KH₂PO₄ 2mmol/L。

使用植物乳杆菌N13制备发酵乳，其制备方法如下：

首先，制备植物乳杆菌N13工作发酵剂。

上述制备的脱脂乳在温度121℃下高压灭菌7min后冷却备用。将植物乳杆菌N13菌种按照以脱脂乳体积计8-10％接种于脱脂乳中，于温度37℃下静置培养8-12h至凝乳良好，将凝乳的脱脂乳培养物震荡均匀，再将植物乳杆菌N13菌种按照以脱脂乳体积计1-3％的接种量接种于所述的凝乳脱脂乳中，于温度37℃下静置培养8-12h至凝乳良好，得到植物乳杆菌N13工作发酵剂。

然后，制备发酵乳，其步骤如下：

A)选择优质的原料乳，用200目筛网过滤，去除杂质。然后采用常规方法进行标准化，使得脂肪含量为8.0-11.0％，非脂乳固体含量为22.5-24.5％。

B)向原料乳中加入以原料乳重量计8-12％的蔗糖，搅拌溶解。

C)将乳化稳定剂溶解后按0.2-0.4％量加入到牛乳中，在压力为18-22MPa进行均质。

D)将均质乳加热到90℃，保持10min进行巴氏杀菌，冷却。

E)按照乳体积计3-5％向乳中接种保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和上述制备的植物乳杆菌N13工作发酵剂(其体积比例为1∶1∶1)。

F)接种后的牛乳在温度37℃下进行发酵，发酵时间为6-8小时，至凝乳，然后将凝乳后的酸乳置于4℃冷藏22-26h后熟，即得到所述的发酵乳。

所述的乳是牛乳、马乳、羊乳或它们的混合物。

使用植物乳杆菌N13制备乳酸菌乳饮料，其制备方法如下：

称取脱脂奶粉加水搅拌溶解，制备成以重量计10-12％的脱脂乳。按照以脱脂乳重量计3-5％接种量在所述脱脂乳中接种保加利亚乳杆菌液体发酵剂、嗜热链球菌液体发酵剂和上面在制备发酵乳时制备的植物乳杆菌N13发酵剂(其体积比例为1∶1∶1)进行发酵。在温度37℃的条件下培养6-8h，当培养液的pH达到4.3-4.4时终止发酵，然后使用均质机在压力18-22MPa的条件下进行均质4-6min，再冷却至温度4℃，然后往其中添加白砂糖、复配稳定剂、柠檬酸、复合甜味剂、香精、水进行调配，搅拌溶解使得发酵体系的总酸度为0.4-0.6％，pH 3.9-4.0。然后使用均质机在压力18-22MPa的条件下进行第二次均质4-6min，接着在温度95℃下进行杀菌10min，冷却至10℃以下后进行灌装，即得到所述的乳酸菌乳饮料。

[有益效果]

本发明的有益效果是：本发明植物乳杆菌N13(CCFM 233)具有耐酸性、耐胆盐能力，对肠上皮细胞株HT-29细胞具有很高的粘附性，具有抑制EIEC生长，降低EIEC对结肠上皮细胞的粘附和侵袭的能力，因此N13是一株具有优良益生菌特性的植物乳杆菌。用本发明植物乳杆菌N13制备的酸豆乳、燕麦发酵饮料、发酵蔬菜、乳酸菌乳饮料、发酵乳与发酵青贮饲料产品具有非常好的应用前景。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N13菌株已于2011年11月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，其保藏号为CGMCC 5495。

【附图说明】

图1表示不同乳酸菌菌株在pH 2的条件下培养4h后的生长情况；

图2表示在1‰猪胆盐浓度条件下乳酸菌的生长情况；

图3表示在2‰猪胆盐浓度条件下乳酸菌的生长情况；

图4表示在3‰猪胆盐浓度条件下乳酸菌的生长情况；

图5表示在不同条件下处理的CCFM233上清液对其抑制EIEC的影响；

1-未处理组；2-胰蛋白酶处理组；3-蛋白酶K处理组；4-过氧化氢酶处理组；5-热处理组；6-发酵上清液pH调为中性处理组；

图6表示乳酸菌预处理对EIEC粘附HT-29细胞的影响；

图7表示乳酸菌与EIEC共培养对EIEC侵袭HT-29细胞的影响。

【具体实施方式】

实施例1：利用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N13(CCFM 233)制造酸豆乳

制备方法如下：

制备本发明的植物乳杆菌N13发酵剂干粉制剂：植物乳杆菌N13以MRS液体培养基体积计3％接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养24h，使植物乳杆菌N13活菌数达到10⁸cfu/mL以上，然后其培养液在转速4000r/min与温度4℃的条件下离心10min，其离心沉淀物再用pH 7.2的PBS缓冲液冲洗3次，然后把经洗涤离心得到的菌体沉淀加到冻干保护剂中，调整细胞浓度至10⁹cfu/mL，混合均匀后进行真空冷冻干燥，冻干后就得到一种植物乳杆菌N13发酵剂干粉制剂。所述的冻干保护剂的重量百分比组成为：蔗糖1.5％、脱脂乳14％、乳糖5％、甘油1％、淀粉3％和75.5％水。

按照软水与大豆的体积比3在温度80℃下用软水浸泡大豆1.5h，去除大豆皮，去掉浸泡水，再按照大豆与沸水的重量比1∶8加沸水磨浆，其浆料在温度80℃的条件下保持12min，然后用150目筛网过滤，得到一种豆乳；先往该豆乳中加入以豆乳重量计8％的蔗糖，再使用均质机在压力20MPa下进行均质，随后在温度95℃下进行杀菌处理10min，其温度降至37℃时，再按照以豆乳重量计0.04％的接种量接入商业干粉发酵剂保加利亚乳杆菌、商业干粉发酵剂嗜热链球菌和上述制备的植物乳杆菌N13发酵剂干粉制剂(其重量比例为1∶1∶1)，在温度38℃下发酵8小时，然后在4℃冷藏保存即得到含植物乳杆菌N13活菌的酸豆乳。

实施例2：利用植物乳杆菌N13制造发酵泡菜

制备方法如下：

A)选用的蔬菜经清洗与沥干后，用0.008g/kg次氯酸钠溶液浸泡8分钟进行消毒，将所述的蔬菜去皮、切分，得到一种预处理蔬菜；

B)往步骤A)得到的预处理蔬菜中加入按照所述蔬菜重量计0.8％糖与5.0％食盐，搅拌均匀，在室温预腌制24h，沥干水分，得到一种预腌制蔬菜；

C)称取食用香辛料，使用以所述食用香辛料重量计8倍水在温度80℃下浸提3h，冷却后再添加以所述食用香辛料重量计8％白酒，得到一种香辛料汁；

D)植物乳杆菌N13以MRS液体培养基体积计2％接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养24h，离心分离，弃去发酵上清液，余下沉淀物用无菌水重悬，使植物乳杆菌N13活菌浓度达到10⁸cfu/mL以上，从而得到一种菌悬液；

E)往步骤B)得到的预腌制蔬菜中添加以所述预腌制蔬菜重量计12％在步骤C)得到的香辛料汁与3％在步骤D)得到的菌悬液，混匀，装罐，密封，在室温下发酵，直到其发酵液的pH值达3.8，这样得到所述的发酵蔬菜。

实施例3：制造含植物乳杆菌N13的燕麦发酵饮料

制备方法如下：

A)以燕麦为原料，将燕麦拣选、去杂、去除表皮并洗净；

B)向燕麦中加入以燕麦重量计100％的52℃水进行混合，然后加入到打浆机中打成浆液；

D)向步骤C)得到的浆液中添加以浆液重量计12％白砂糖和1000％水，在温度121℃下灭菌20min，冷却至36-38℃，得到燕麦发酵基料；

E)植物乳杆菌N13以MRS液体培养基体积计2％接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养24h，离心分离，弃去发酵上清液，余下菌体沉淀物用无菌水重悬，使植物乳杆菌N13活菌数达到10⁸cfu/mL以上，从而得到植物乳杆菌N13液体发酵剂。

F)将上述制备的植物乳杆菌CCFM233液体发酵剂、商业保加利亚乳杆菌液体发酵剂和商业嗜热链球菌液体发酵剂(三者体积比例为1∶1∶1)，按照以燕麦发酵基料的体积8％的接种量接入到在步骤D)制备的燕麦发酵基料中，在发酵温度37℃下发酵20h，使植物乳杆菌CCFM233浓度达到 10⁶cfu/mL以上，然后在温度3-4℃下冷藏保存即得到含植物乳杆菌N13活菌的燕麦发酵饮料。

实施例4：制造含植物乳杆菌N13的玉米秸秆青贮饲料

制备方法如下：

将玉米秸秆饲料原料揉切至1～4cm后待用；

植物乳杆菌N13以MRS液体培养基体积计1-3％接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养24h，使植物乳杆菌N13活菌浓度达到10⁸cfu/mL以上，然后其培养液在转速4000r/min与温度4℃的条件下离心10min，其离心沉淀物再用pH 7.2的PBS缓冲液冲洗3次，然后把经洗涤离心得到的菌体沉淀加到冻干保护剂中，调整细胞浓度至10⁹cfu/mL，混合均匀后进行真空冷冻干燥，冻干后得到一种植物乳杆菌N13干粉制剂；所述冻干保护剂是由以重量计1.5％蔗糖、14％脱脂乳、5％乳糖、1％甘油、3％淀粉和75.5％水组成的；

然后，称取50kg玉米秸秆饲料原料，把0.6g所述的植物乳杆菌N13干粉制剂与220mL无菌水混合均匀，喷洒加入到所述的玉米秸秆饲料原料中，翻拌混和均匀，然后装入青贮饲料桶中压实密封，然后在常温条件下贮存10个月后即得到含植物乳杆菌N13的玉米秸秆饲料。

实施例5：制备植物乳杆菌N13发酵剂，并制备发酵乳

植物乳杆菌N13的发酵剂制备方法如下：

本说明书实施例5制备的脱脂乳在温度121℃下高压灭菌7min后冷却备用。将植物乳杆菌N13菌种按照体积计10％接种于脱脂乳中，于温度37℃下静置培养10h至凝乳良好，将凝乳的脱脂乳培养物震荡均匀，再按照以脱脂乳体积计2％的接种量接种于所述的脱脂乳中于温度37℃下静置培养10h至凝乳良好，得到植物乳杆菌N13工作发酵剂。

用上述发酵剂制备发酵乳的方法如下：

原料：鲜牛乳、上述制备的植物乳杆菌N13工作发酵剂、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、蔗糖、乳化稳定剂(广州市合力维有限公司生产均乳素CL 6121)。

具体制备步骤如下：

A)选择优质的原料牛乳，用200目筛网过滤，去除杂质。然后进行标准化，使得脂肪含量为10.0％，非脂乳固体含量为23.5％。

B)向原料乳中加入以原料乳重量计10％的蔗糖，搅拌溶解。

C)将乳化稳定剂溶解后按0.3％量加入到牛乳中，在压力为20MPa进行均质。

D)将均质的牛乳加热到90℃，保持10min进行巴氏杀菌，冷却。

E)按照牛乳体积计4％向牛乳中接种保加利亚乳杆菌液体发酵剂、嗜热链球菌液体发酵剂和上述制备的植物乳杆菌N13发酵剂，其体积比例为1∶1∶1。

F)接种后的牛乳在温度37℃下进行发酵8小时，至凝乳，然后将凝乳后的酸牛乳置于4℃冷藏24h后熟，即得到所述的发酵乳。

实施例6：使用植物乳杆菌N13制备乳酸菌乳饮料：

制备方法如下：

原料：脱脂奶粉(天津天泽中孚公司销售的新西兰NZMP脱脂奶粉)、乳酸菌种(植物乳杆菌N13)、稳定剂(广州市合力维有限公司生产均乳素CL 6121)，白砂糖。配料组成：以脱脂奶粉重量计35％白砂糖、0.3％厦门康汇生物科技科技有限公司以复配牛奶花生汤稳定剂商品名销售的复配稳定剂、0.4％柠檬酸、0.2％深圳市佳加甜味剂有限公司以纽甜商品名销售的复合甜味剂、0.06％上海科岛香精香料公司以大草原牛奶香精(58509)商品名销售的香精、余量为脱脂奶粉。

制备步骤：称取脱脂奶粉加水搅拌溶解，制备成以重量计10％的脱脂乳。按照以脱脂乳重量计4％接种量在所述脱脂乳中接种保加利亚乳杆菌液体液体发酵剂、嗜热链球菌液体液体发酵剂和实施例5制备的植物乳杆菌N13工作发酵剂(其体积比例为1∶1∶1)进行发酵。在温度37℃的条件下培养8h，当培养液的pH达到4.3-4.4时终止发酵，然后使用均质机在压力20MPa的条件下进行均质5min，再冷却至温度4℃，然后往其中添加白砂糖、复配稳定剂、柠檬酸、复合甜味剂、香精、水进行调配，搅拌溶解使得发酵体系的总酸度为0.5％，pH 3.9-4.0。然后使用均质机在压力20MPa的条件下进行第二次均质5min，接着在温度95℃下进行杀菌10min，冷却至10 ℃以下后进行灌装，即得到所述的乳酸菌乳饮料。

Claims

1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)N13，该菌菌株已于2011年11月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，其保藏号为CGMCC 5495。

2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌N13，其特征在于它具有下述性质：

(2)具有耐酸性，在pH 2.0的条件下可以生长；

(3)具有耐胆盐能力，在1-3‰胆盐条件下能够生长；

(4)对肠上皮细胞株HT-29细胞具有很高的粘附能力；

(5)能够明显抑制EIEC对肠上皮细胞株HT-29细胞的粘附；

(6)能够明显降低EIEC对肠上皮细胞株HT-29细胞的侵袭。

3.根据权利要求1所述的植物乳杆菌N13在制备酸豆乳、燕麦发酵饮料、发酵青贮饲料、发酵蔬菜、乳酸菌乳饮料以及发酵乳制品中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的含植物乳杆菌N13的酸豆乳是采用下述方法制备的：

按照软水与大豆的体积比2-4在温度75-85℃下用软水浸泡大豆1-2h，去除大豆皮，去掉浸泡水，再按照大豆与沸水的重量比1∶6-10加沸水磨浆，其浆料在温度80-85℃的条件下保持10-15min，然后用150目筛网过滤，得到一种豆乳；先往该豆乳中加入以豆乳重量计5％-10％的蔗糖，再使用均质机在压力15-25MPa下进行均质，随后在温度95℃下进行杀菌处理10min，其温度降至36-38℃时，再按照以豆乳重量计0.04-0.05％的接种量接入商业干粉发酵剂保加利亚乳杆菌、商业干粉发酵剂嗜热链球菌和下述制备的植物乳杆菌N13发酵剂干粉制剂，其重量比例为1∶1∶1，在温度35-42℃下发酵6-8小时，然后在4℃冷藏保存即得到含植物乳杆菌N13活菌的酸豆乳；

植物乳杆菌N13发酵剂干粉制剂是按照如下方法制备的：植物乳杆菌N13以MRS液体培养基体积计1-3％接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养20-28h，使植物乳杆菌N13活菌数达到10⁸cfu/mL以上，然后其培养液在转速3800-4200r/min与温度2-6℃的条件下离心8-12min，其离心沉淀物再用pH 7.2的PBS缓冲液冲洗2-4次，然后把其菌体沉淀加到冻干保护剂中，调整细胞浓度至10⁹cfu/mL，混合均匀后进行真空冷冻干燥，冻干后得到所述的植物乳杆菌N13发酵剂干粉制剂；所述的冻干保护剂组成是以重量计蔗糖1.5％、脱脂乳14％、乳糖5％、甘油1％、淀粉3％和75.5％水。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的燕麦发酵饮料是采用下述方法制备的：

A)以燕麦为原料，将燕麦拣选、去杂、去除表皮并洗净；

6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的发酵蔬菜是采用下述方法制备的：

7.根据权利要求3或6所述的用途，其特征在于所述的蔬菜是一种或多种选自卷心菜、胡萝卜、莴笋、甜椒、洋葱或芹菜的蔬菜。

8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述的香辛料是一种或多种选自辣椒、花椒、胡椒、姜、蒜、八角、茴香、桂皮、橘皮或丁香的香辛料。

9.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的发酵青贮饲料是采用下述方法制备的：

将玉米秸秆饲料原料揉切至1～4cm后待用；

称取45-55kg玉米秸秆饲料原料，把0.5-0.7g根据权利要求4所述的植物乳杆菌N13干粉制剂与200-240mL无菌水混合均匀后喷洒到所述的玉米秸秆饲料原料中，翻拌混和均匀后，装入青贮饲料桶中压实密封，然后在常温条件下贮存9-12个月后即得到含植物乳杆菌N13的玉米秸秆饲料。