CN105062918A

CN105062918A - 一株植物乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN105062918A
Application number: CN201510464648.9A
Authority: CN
Inventors: 崔伟东; 梁铁
Original assignee: Ming Zhiyuan Bio Tech Ltd Of Jilin Province
Current assignee: Ming Zhiyuan Bio Tech Ltd Of Jilin Province
Priority date: 2015-07-31
Filing date: 2015-07-31
Publication date: 2015-11-18
Anticipated expiration: 2035-07-31
Also published as: CN105062918B

Abstract

本发明公开了一株植物乳杆菌及其应用。本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus？plantarum)NC301，保藏登记号为CGMCC？NO.11013。植物乳杆菌NC301在制备用于调节肠道菌群的产品中的应用也属于本发明的保护范围。本发明还保护植物乳杆菌NC301在制备抗氧化剂中的应用。本发明提供的菌株是一株具有潜在益生特性的优良乳酸菌新菌株，可以作为调节肠道菌群、改善肠道功能的益生菌应用于食品、保健品和药品领域，应用前景十分广阔。

Description

一株植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株植物乳杆菌及其应用。

背景技术

中国传统发酵食品历史悠久，风味独特，备受消费者的青睐。传统发酵食品包括发酵蔬菜、发酵肉制品、发酵乳制品、白酒及发酵调味品等，是我国食品工业的重要组成部分。传统发酵食品中的乳酸菌不仅有利于改善发酵食品的风味、口感和质地等，一些乳酸菌还具有优良的益生特性。

长白山地区优越的地理环境造就了当地丰富的自然资源，形成了极具特色的发酵食品，如泡菜、咸菜等。经过长期的自然驯化，乳酸菌成为这些传统美食中的优势菌群，是益生菌的良好来源。

发明内容

本发明的目的是提供一株植物乳杆菌及其应用。

本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)NC301，已于2015年06月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCNO.11013。植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)NC301CGMCCNO.11013，简称植物乳杆菌NC301。

植物乳杆菌NC301在制备用于调节肠道菌群的产品中的应用也属于本发明的保护范围。所述“用于调节肠道菌群的产品”的功能为(a)和\或(b)和\或(c)和\或(d)：(a)促进乳杆菌增加；(b)促进双歧杆菌增加；(c)促进肠球菌减少；(d)促进肠杆菌减少。

本发明还保护一种用于调节肠道菌群的产品，其活性成分为植物乳杆菌NC301。所述“用于调节肠道菌群的产品”的功能为(a)和\或(b)和\或(c)和\或(d)：(a)促进乳杆菌增加；(b)促进双歧杆菌增加；(c)促进肠球菌减少；(d)促进肠杆菌减少。

本发明还保护植物乳杆菌NC301在制备抗氧化剂中的应用。所述抗氧化剂的功能为清除自由基。所述自由基为羟自由基和\或DPPH自由基和\或超氧阴离子自由基。

本发明还保护一种抗氧化剂，其活性成分为植物乳杆菌NC301。所述抗氧化剂的功能为清除自由基。所述自由基为羟自由基和\或DPPH自由基和\或超氧阴离子自由基。

本发明还保护植物乳杆菌NC301在制备食品、保健品或药品中的应用。所述食品具体可为酸奶。

本发明从传统发酵辣白菜中分离得到了一株植物乳杆菌，通过体外酸耐受和胆盐耐受、黏附能力、抗氧化作用及改善肠道功能和调节肠道菌群等试验，证实了该菌株是一株具有潜在益生特性的优良乳酸菌新菌株，可以作为调节肠道菌群、改善肠道功能的益生菌应用于食品、保健品和药品领域，应用前景十分广阔。

附图说明

图1为植物乳杆菌NC301在光学显微镜下的照片。

图2为植物乳杆菌NC301在透射电镜下的照片。

图3为植物乳杆菌NC301对肠道主要菌群的调节能力。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。牛胆粉：河南利伟生物药业股份有限公司，产品编号为P333004,CAS号为8008-63-7。Caco-2细胞：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

BCP液体培养基：酵母膏2.5g/L、蛋白胨5g/L、葡萄糖5g/L、溴甲酚紫0.04g/L，溶剂为水，pH7.0；121℃灭菌15min。在BCP液体培养基的基础上添加琼脂至15g/L，即为BCP固体培养基。

MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、KH₂PO₄2g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸钠5g/L、MgSO₄·7H₂O0.2g/L、MnSO₄·4H₂O0.05g/L、吐温801mL、葡萄糖20g/L，溶剂为水，pH6.6；121℃灭菌15min。在MRS液体培养基的基础上添加琼脂至15g/L，即为MRS固体培养基

pH7.2的PBS缓冲液的制备方法：NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄1.42g，K₂HPO₄0.27g，加水定容至1L，浓盐酸调pH7.2。

pH7.4的PBS缓冲液的制备方法：NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄1.42g，K₂HPO₄0.27g，加水定容至1L，浓盐酸调pH7.4。

鼠李糖乳杆菌LGG,为一株现有的益生菌，用LGG表示。提及鼠李糖乳杆菌LGG的文献：张齐麟、马春丽、李艾黎、曹楠、宋兰兰，鼠李糖乳杆菌LGG在Cottage干酪中的应用，《食品工业》2015年04期。

实施例1、菌株的分离和鉴定

用于菌株分离的样品为中国延边地区的传统发酵辣白菜。

经BCP固体培养基平板反复划线培养，挑取产黄圈的单菌落接种于MRS固体培养基平板上继续培养，经MRS固体培养基平板反复划线培养纯化，得到多株纯培养的菌株。其中一株均命名为NC301菌株。

二、菌株的鉴定

NC301菌株在光学显微镜下的照片见图1。菌体细胞呈圆端直杆状，大多数为单个、成对或呈细胞链。

NC301菌株在透射电镜下的照片见图2。长杆状，细胞壁、细胞膜完整，胞质均匀。

NC301菌株为不运动的杆菌。

NC301菌株最适生长温度37～42℃，适宜pH为5.0～7.0。

NC301菌株的生理生化特征：革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，在15℃和45℃能够生长，耐受6.5％NaCl，不水解淀粉，不液化明胶，不产生硫化氢，发酵葡萄糖产酸不产气，联苯胺试验阴性，吲哚试验阴性，乙酰甲基甲醇试验阳性。

API50CH(法国梅里埃公司)鉴定结果表明NC301菌株为植物乳杆菌。NC301菌株能利用：核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、苦杏仁苷、熊果苷、N-乙酰-葡萄糖胺、七叶醇、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、棉籽糖、牻牛儿糖、D-***糖醇、葡萄糖酸盐。NC301菌株不能利用：***糖、木糖、阿东醇、山梨糖、鼠李糖、卫矛醇、肌醇、α-甲基-D-葡萄糖苷、α-甲基-D-甘露糖苷、菊糖、淀粉、糖原、木糖醇、D-松二糖、D-塔格糖、D-米苏糖、岩糖、L-***糖醇、2-酮基-葡萄糖酸盐、5-酮基-葡萄糖酸盐。

NC301菌株的16srDNA部分序列如序列表中序列1所示。

以上鉴定结果表明，NC301菌株属于植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。

三、菌株的保藏

本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)NC301，已于2015年06月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCNO.11013。植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)NC301CGMCCNO.11013，简称植物乳杆菌NC301，用NC301表示。

实施例2、植物乳杆菌NC301的耐受性测定

1、将植物乳杆菌NC301接种至MRS液体培养基，得到菌悬液(菌悬液中的菌浓度：log₁₀cfu/ml＝8.57±0.17)，将菌悬液分成4组(每组5个重复处理)，分别进行如下操作：

第一组：用盐酸调pH为2.0，37℃静置培养3h；

第二组：用盐酸调pH为3.0，37℃静置培养3h；

第三组：加入牛胆粉并使其浓度为0.3g/100ml，37℃静置培养3h；

第四组：加入牛胆粉并使其浓度为0.6g/100ml，37℃静置培养4h；

完成上述操作后，取50μl涂布MRS固体培养基平板，37℃静置培养48h后菌落计数。

结果见表1。植物乳杆菌NC301对pH2.0具有一定的耐受能力，存活率20.63％。植物乳杆菌NC301对pH3.0具有很好的耐受作用，存活率仍超过80％。植物乳杆菌NC301对0.3g/100ml和0.6g/100ml的牛胆盐均具有较强的耐受性。

2、将鼠李糖乳杆菌LGG接种至MRS液体培养基，得到菌悬液(菌悬液中的菌浓度：log₁₀cfu/ml＝8.25±0.37)，将菌悬液分成4组(每组5个重复处理)，分别进行如下操作：

第一组：用盐酸调pH为2.0，37℃静置培养3h；

第二组：用盐酸调pH为3.0，37℃静置培养3h；

结果见表1。

表1菌株对酸和胆盐的耐受能力

实施例3、植物乳杆菌NC301的黏附能力

表面疏水性与菌株的黏附能力有关。菌株表面的疏水特性是影响菌株肠道上皮细胞黏附能力的重要因素之一。

一、疏水性测定

1、取待测菌株，用pH7.2的PBS缓冲液悬浮菌体，得到OD_600nm＝0.4的菌悬液。

2、取3mL步骤1得到的菌悬液，与1mL有机试剂混合，漩涡震荡30s，然后室温静置30min，取水相。

3、取步骤2得到的水相，测定600nm下的吸光度值(记为A_x)。

菌株疏水能力(％)＝[1－(A_x/A₀)]×100％；A₀＝0.4。

待测菌株为植物乳杆菌NC301或鼠李糖乳杆菌LGG。

有机试剂为二甲苯、三氯甲烷或乙酸乙酯。

进行三次重复试验，结果取平均值。

结果见表2。与鼠李糖乳杆菌LGG相比，植物乳杆菌NC301对二甲苯、氯仿和乙酸乙酯均具有较强的疏水能力，表明其表面具有极强的电子供体特性。

二、Caco-2细胞黏附试验

待测菌株为植物乳杆菌NC301或鼠李糖乳杆菌LGG。

1、在24孔细胞培养板中，采用含10％(体积比)新生牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM培养液培养Caco-2细胞，长至单层细胞贴壁时进行计数，每孔细胞数目为3.5×10⁵个。

2、取待测菌株，用pH7.2的PBS缓冲液悬浮菌体，得到菌浓度为3.4×10⁹cfu/m1的菌悬液。

3、分组处理

试验组：取步骤1得到的24孔细胞培养板，每孔加入0.5mL步骤2得到的菌悬液和0.5mL新鲜的DMEM培养液，置37℃、5％CO₂、90％湿度的环境中静置孵育2h，然后用pH7.4的PBS缓冲液漂洗细胞5次(以除去未黏附的菌)。

对照组：用等体积pH7.2的PBS缓冲液代替步骤2得到的菌悬液，其它同试验组。

每组设置三个重复处理。

4、完成步骤3后，取所述24孔板，用0.4％多聚甲醛固定30min，革兰氏染色，镜检。

5、完成步骤4后，取所述24孔板，每孔加入0.2mL0.25％胰酶消化10min，然后每孔加入0.125mL含20％(体积比)血清的DMEM培养液以终止反应，然后每孔加入0.175mL0.1％(体积比)TritonX-100水溶液，室温静置10min(以裂解细胞)，然后进行平板菌落计数。

黏附率(％)＝每孔中黏附于细菌的总数/每孔中添加的细菌数×100％。

结果见表2。与鼠李糖乳杆菌LGG相比，植物乳杆菌NC301黏附能力较强，表明植物乳杆菌NC301对肠上皮细胞具有较强的黏附能力。

表2表面疏水性和Caco-2细胞黏附能力

实施例4、植物乳杆菌NC301对肠道菌群的调节作用

肠道菌群调节能力，是益生菌的重要和基本功能。益生菌功能的实现除了菌株自身具有的功能性外，主要是靠调节宿主肠道的菌群来完成，肠道菌群常被比作人体的器官，具有促进营养元素的合成与代谢，激活和调节免疫***，减轻肠道不适和腹泻，预防和减少肠道感染的发生和机体自我修复等功能。

昆明小鼠(4周龄，雄性，18-22g)，购自长春市高新医学动物中心。

将昆明小鼠随机分为2组(每组10只)，分别进行如下处理：

试验组：每天灌胃一次植物乳杆菌菌液(体积为0.4mL，含4×10⁸cfu植物乳杆菌NC301，溶剂为pH7.2的PBS缓冲液)，连续灌胃14天(试验第1至14天)，然后正常饲养；

对照组：每天灌胃一次pH7.2的PBS缓冲液(体积为0.4mL)，连续灌胃14天(试验第1至14天)，然后正常饲养。

分别于试验第0天、第7天、第14天、第16天、第21天采集小鼠的粪便，检测其中乳杆菌、双歧杆菌、肠球菌和肠杆菌的数量。

检测乳杆菌采用选择平板培养与形态观察结合的方式。采用的选择平板为乳杆菌琼脂培养基(LBS)，制备方法如下：胰酪蛋白胨10g，酵母浸粉5g，磷酸二氢钾6g，硫酸亚铁0.034g，硫酸镁0.575g，葡萄糖20g，乙酸钠25g，柠檬酸铵2g，硫酸锰0.12g，吐温801mL，琼脂12g，盐酸调pH值至5.5，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，115℃高压灭菌15min。培养条件：37℃，48h。乳杆菌的形态特征：白色或乳白色，革兰氏染色呈阳性的无芽孢杆菌。

检测双歧杆菌采用选择平板培养与形态观察结合的方式。采用的选择平板为双歧杆菌培养基(MRS+NNLP)，为含有萘啶酸15mg/L、硫酸新霉素100mg/L、硫酸巴龙霉素200mg/L、氯化锂3g/L、L-半胱氨酸盐酸盐500mg/L的MRS固体培养基。培养条件：37℃厌氧，48h。双歧杆菌的形态特征：微白色，表面光滑，凸起，革兰氏染色呈阳性的叉状或棒状菌落。

检测肠杆菌采用选择平板培养与形态观察结合的方式。采用的选择平板为肠道菌计数琼脂培养基(VioletRedBileDextroseAgar，VRBDA)，制备方法如下：酵母粉3g，蛋白胨7g，氯化钠5g，葡萄糖10g，胆盐1.5g，结晶紫0.002g，中性红0.03g，琼脂12g，盐酸调pH值7.3，加热溶解于1000mL蒸馏水中，煮沸不要超过2min，冷至50℃左右时，倾入无菌平皿。培养条件：37℃，24h。肠杆菌的形态特征：发酵乳糖，革兰氏染色呈阴性的菌落。

检测肠球菌采用选择平板培养与形态观察结合的方式。采用的选择平板为肠球菌琼脂(胆盐－七叶苷－叠氮钠琼脂)培养基(BileEsculinAzideAgar，BEA)，制备方法如下：牛肉浸粉3g，胰酪蛋白胨17g，酵母粉5g，牛胆粉10g，氯化钠5g，七叶苷1g，柠檬酸铁铵0.5g，叠氮化钠0.25g，柠檬酸钠1g，琼脂13g，盐酸调pH值7.1，加热溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。培养条件：37℃，48h。肠球菌的形态特征：明显褐色圈，革兰氏染色呈阳性的菌落。

结果见图3(黑色填充柱代表对照组，灰色填充柱代表试验组；A：乳杆菌；B：肠球菌；C：双歧杆菌；D：肠杆菌)。与对照组相比，试验组小鼠的粪便中乳杆菌和双歧杆菌的数量明显增加，肠球菌和肠杆菌的数量降低。结果表明，植物乳杆菌NC301可以促进小鼠肠道中乳杆菌和双歧杆菌增多，肠球菌和肠杆菌减少。

实施例5、植物乳杆菌NC301的体外抗氧化能力

一、羟自由基清除能力测定(Fenton法)

1、用pH7.2的PBS缓冲液悬浮待测菌(待测菌为植物乳杆菌NC301或鼠李糖乳杆菌LGG)，得到菌浓度为1×10¹⁰cfu/mL的菌悬液。

2、分组处理

试验组：取试管，依次加入0.435mM亮绿水溶液1mL、0.5mM硫酸亚铁水溶液2mL、3％(体积比)过氧化氢水溶液1.5mL(Fe²⁺与过氧化氢构成的氧化体系称为Fenton试剂)和1mL步骤1制备的菌悬液，混合均匀，然后37℃恒温水浴保温20min，然后测定上清液在624nm处的吸光度；

对照组甲：用等体积pH7.2的PBS缓冲液代替步骤1制备的菌悬液，其它同试验组；

对照组乙：用等体积pH7.2的PBS缓冲液代替步骤1制备的菌悬液，用等体积水代替亮绿水溶液，用等体积水代替过氧化氢水溶液，其它同试验组；

每组设置五个重复处理。

菌株对羟自由基的清除能力(％)＝[(As-Ao)/(A-Ao)]×100％；

式中：As试验组的吸光度值；Ao表示对照组甲的吸光度值；A表示对照组乙的吸光度值。

二、DPPH自由基清除能力测定

2、分组处理

试验组：取2mL0.5mMDPPH溶液(DPPH的全称为1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，DPPH溶液的溶剂为甲醇)，加入1mL步骤1得到的菌悬液，混合均匀，然后室温避光放置30min，然后4℃、8000g离心10min，取上清液，测定上清液在517nm处的吸光度；

阴性对照组：用等体积pH7.2的PBS缓冲液代替步骤1制备的菌悬液，其它同试验组；

空白对照组：用等体积甲醇代替DPPH溶液，其它同试验组；

每组设置五个重复处理。

菌株对DPPH自由基的清除能力(％)＝[1-(A_样品-A_空白)/A_对照]×100％；

式中：A_样品代表试验组的吸光度值；A_空白代表空白对照组的吸光度值；A_对照代表阴性对照组的吸光度值。

三、超氧阴离子清除能力测定

2、分组处理

试验组：取试管，依次加入0.3mL步骤1得到的菌悬液、2.8mL3mM二乙三胺五乙酸水溶液、0.2mL1.2mM邻苯三酚水溶液，混合均匀，然后25℃恒温水浴保温10min，然后测定325nm处的吸光度；

对照组甲：用等体积水代替邻苯三酚水溶液，其它同试验组；

对照组乙：用等体积pH7.2的PBS缓冲液代替步骤1制备的菌悬液，其它同试验组；

对照组丙：用等体积pH7.2的PBS缓冲液代替步骤1制备的菌悬液，用等体积水代替邻苯三酚水溶液，其它同试验组；

每组设置五个重复处理。

菌株对超氧阴离子的清除能力(％)＝[1-(A₁₁-A₁₀)/(A₀₁-A₀₀)]×100％

式中：A₁₁试验组的吸光度值；A₁₀代表对照组甲的OD值；A₀₁代表对照组乙的OD值；A₀₀代表对照组丙的OD值。

步骤一、步骤二和步骤三的结果见表3。植物乳杆菌NC301对羟自由基、DPPH自由基、超氧阴离子自由基的清除率均超过了50.0％。

表3自由基清除能力

菌株	羟自由基(％)	DPPH自由基(％)	超氧阴离子自由基(％)
				LGG	52.05±2.01	42.10±1.23	39.01±2.01
NC301	62.35±1.28	60.14±1.54	54.35±1.90

Claims

1.植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）NC301，其保藏编号为CGMCCNO.11013。

2.权利要求1所述的植物乳杆菌在制备用于调节肠道菌群的产品中的应用。

3.一种用于调节肠道菌群的产品，其活性成分为权利要求1所述的植物乳杆菌。

4.如权利要求2所述的应用或如权利要求3所述的产品，其特征在于：所述“用于调节肠道菌群的产品”的功能为（a）和\或（b）和\或（c）和\或（d）：（a）促进乳杆菌增加；（b）促进双歧杆菌增加；（c）促进肠球菌减少；（d）促进肠杆菌减少。

5.权利要求1所述的植物乳杆菌在制备抗氧化剂中的应用。

6.一种抗氧化剂，其活性成分为权利要求1所述的植物乳杆菌。

7.如权利要求5所述的应用或如权利要求6所述的抗氧化剂，其特征在于：所述抗氧化剂的功能为清除自由基。

8.如权利要求7所述的应用或产品，其特征在于：所述自由基为羟自由基和\或DPPH自由基和\或超氧阴离子自由基。

9.权利要求1所述的植物乳杆菌在制备食品、保健品或药品中的应用。