CN103060228B

CN103060228B - 一株植物乳杆菌及青贮用微生态制剂

Info

Publication number: CN103060228B
Application number: CN201210534490.4A
Authority: CN
Inventors: 陶正国; 洪梅; 吴秀丽; 孙丹丹
Original assignee: GUANGZHOU LEADER BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU LEADER BIO-TECHNOLOGY Co.,Ltd.; YUNNAN LEADER BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2032-12-12
Also published as: CN103060228A

Abstract

本发明公开了一株植物乳杆菌及青贮用微生态制剂。本发明提供了从万寿菊发酵池分离的植物乳杆菌Lder01，和含该菌株的青贮用微生态制剂。本发明的植物乳杆菌Lder01在发酵液中活菌数可达到90亿CFU/mL，达到了领先水平；本发明青贮用微生态制剂在4℃保存120天的存活率为100%，解决了产品货架期的问题；使用该微生态制剂进行青贮，可有效缩短万寿菊鲜花的发酵周期，和提高叶黄素的提取率。

Description

一株植物乳杆菌及青贮用微生态制剂

技术领域

本发明属于发酵微生物和青贮领域，特别涉及一株植物乳杆菌及青贮用微生态制剂。

背景技术

青贮是指在厌氧条件下，通过附生于植物上的乳酸菌利用原料中的可溶性碳水化合物，厌氧发酵产生有机酸（主要是乳酸），导致pH值降低，从而杀灭各种微生物或抑制其活性，达到保存青绿饲料的目的。根据对发酵效果的影响，可以将青贮添加剂分为四类：1）发酵促进型添加剂，主要包括乳酸菌、纤维素酶、葡萄糖、糖蜜；2）发酵抑制型添加剂，包括硫酸、盐酸、甲酸、乙酸、甲醛等；3）营养型添加剂，包括尿素、氨、乳糖、矿物质等；4）好气性腐败菌抑制剂，如丙酸、山梨酸、丙烯酸等。

发酵促进型添加剂和发酵抑制型添加剂都是控制发酵程度的，但前者的作用是促进乳酸发酵，即通过增强乳酸菌的活动，促进乳酸的生成，从而使青贮饲料的pH值迅速下降。其中含碳水化合物丰富的物质如葡萄糖、谷类、糖蜜、蔗糖等加入到缺乏可溶性糖的青贮作物中，如豆科牧草等，非常常见。而纤维素酶的作用表现在两个方面：一是可使纤维素分解产生葡萄糖，为乳酸菌发酵提供更多的底物；二是加速细胞壁的降解，增加营养成分的含量。据赵长友等（1994）研究，纤维素酶中含有氧化还原酶成分，可以消耗氧气，从而更容易创造厌氧环境。Selmer-olsen等（1994）报道，在三叶草为主的牧草中，加入纤维素酶和半纤维素酶，加酶后青贮料达到低pH值更快一些，最终的pH值更低一些，认为对于含糖低的作物效果更加明显。

发酵抑制性添加剂的作用是部分或者全部抑制微生物的生长；营养型添加剂则是在制作青贮时加到原料中，旨在改善青贮饲料的营养价值；好气性腐败菌抑制剂主要在青贮初期发挥作用，减少青贮腐败的发生。

目前万寿菊是提取叶黄素的主要原料，其产品属于天然色素，无毒无害。天然叶黄素具有抗氧化、预防视网膜黄复病和盲眼病、预防癌症和心血管疾病等生理功效。此外，叶黄素具有显著的着色功能，因此被广泛应用于食品、医药以及饲料添加剂等领域，市场前景广阔。

万寿菊花制备叶黄素的传统生产方法是收获万寿菊花后，青贮、压榨、烘干并制粒、正己烷提取和浓缩，然后得到叶黄素浸膏。在上述过程中，万寿菊花的青贮是必不可少的前处理过程，其作用主要是有效保护万寿菊鲜花色素含量，降解植物细胞壁，分离鲜花中阻碍提取的成分，使色素更易被萃取，提高提取效率。有研究显示，在万寿菊前处理，即青贮和烘干阶段约损失20%~40%的叶黄素。因此，如何有效减少过程中叶黄素的损失，成为万寿菊花叶黄素深加工中的不可忽视的关键技术之一。

我国应用青贮饲料已经有多年的历史，为了减少青贮发酵过程中的营养物质的损失和提高青贮饲料的品质，人们通过多种途径并使用了不同类型的青贮饲料添加剂，相关试验研究取得了很大成就。需要注意的是，无论是添加剂青贮还是混合青贮，大多数的研究都是针对玉米、紫花苜蓿等常见饲料原料，而关于万寿菊青贮的研究少之又少，专门用于万寿菊青贮的微生态制剂产品种类不多。

发明内容

本发明的目的在于提供一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）Lder01。

本发明的另一个目的在于提供上述菌株在青贮中的应用。

本发明的再一个目的在于提供一种青贮用微生态制剂。

本发明所采取的技术方案是：

一株植物乳杆菌Lder01，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC M2012461。

一种青贮用微生态制剂，含有植物乳杆菌Lder01。

一种青贮用微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：

1) 将植物乳杆菌Lder01接种至活化培养基中，30～37℃下培养10～20h，得到活化菌液；

2) 将活化菌液以1%～10%的接种量接种至发酵罐中，pH值控制在5.0～7.0，温度为30～37℃，在发酵培养基中培养12～30h得到发酵液；

3) 将上述发酵液在20～25℃下，离心分离，得到发酵菌泥；

4) 向发酵菌泥中加入适量冻干保护剂后，进行冷冻干燥、粉碎、过筛，得到植物乳杆菌Lder01冻干粉；

5) 按每克微生态制剂中含植物乳杆菌Lder01 100～1000亿CFU、纤维素酶1000～1600U、半纤维素酶200～1800U、葡萄糖0.5～0.7克、二氧化硅0.02～0.05克称取各组分，复配得到青贮用微生态制剂成品。

上述活化培养基成分为：大豆蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，醋酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，吐温80 0.1%(v/v)。

上述发酵培养基成分为：大豆蛋白胨10~20g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖5～15g/L，柠檬酸铵2g/L，醋酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，吐温80 0.1%(v/v)，玉米蛋白粉1～10g/L。

优选的，上述发酵培养基成分为：大豆蛋白胨10～20g/L，酵母粉5g/L，糖蜜5～15g/L，柠檬酸铵2g/L，醋酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，吐温80 0.1%(v/v)，玉米蛋白粉1～10g/L。优选的，步骤2）中，pH值控制在6.0～6.5。

优选的，上述冻干保护剂为脱脂奶粉和蔗糖的混合物。

申请人将上述菌株保藏于位于湖北武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏中心于2012年11月19日收到申请人提供的菌株植物乳杆菌Lder01。保藏中心给予该培养物的保藏号为CCTCC M2012461，建议的分类命名为Lactobacillus plantarum Lder01，已于2012年11月29日鉴定保藏的菌株是存活的。

本发明的有益效果是：

本发明的植物乳杆菌Lder01在发酵液中活菌数可达到90亿CFU/mL，处理得到的菌粉（冻干粉）含菌量达到3200亿CFU/g以上，达到了领先水平。

本发明青贮用微生态制剂在4℃保存120天的存活率为100%，解决了产品货架期的问题。

使用本发明微生态制剂青贮后的万寿菊鲜花颜色橙黄，具有特殊的甘香味，产酸快，能有效缩短发酵周期；青贮后的万寿菊鲜花破壁效果好，叶黄素提取率与自然发酵相比提高了40%以上。

具体实施方式

菌株的分离：

分离源：2011年9月黑龙江省青冈县万寿菊发酵池，取若干重量的青贮万寿菊；

培养基：MRS培养基；

分离筛选：将25g青贮万寿菊加入225mL的去离子水中（含若干玻璃珠），振荡摇匀，即成10^-1稀释液，静置，取上清液依次稀释至10^-2、10^-3、10^-4、10^-5。取每个梯度各0.1mL涂平板（MRS），各3个重复，于恒温培养箱中培养。分离纯化菌株，4℃保藏备用。

菌株Lder01的形态特征如下：

菌落在培养基上呈凸透镜状突起，直径0.5～1.0mm，表面光滑，质地均匀，圆形，呈浅黄色，在挑取菌体时有一定的黏性；MRS培养液中生长物浑浊，菌体为直径0.8～1.2μm的短杆状，排列成链状或栅栏状。

菌株Lder01的生理生化特征如下：

+：阳性；—：阴性

根据以上形态特征及生理生化实验结果，查《伯杰细菌鉴定手册》及《常见细菌***鉴定》可知该菌株与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）最相似，可见该菌株为一株植物乳杆菌。

微生态制剂的制备：

以下所用培养基原料均为工业级别。

方法一

1) 活化培养基：大豆蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，醋酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，吐温80 0.1%(v/v)，用蒸馏水溶解、定容，调pH值为6.3～6.5，115℃高压灭菌20min备用；

发酵培养基：大豆蛋白胨10～20g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖5～15g/L，柠檬酸铵2g/L，醋酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，吐温80 0.1%(v/v)，玉米蛋白粉1～10g/L，用蒸馏水溶解、定容，调pH值为6.3～6.5，115℃高压灭菌20min备用；

2) 将植物乳杆菌Lder01（保藏号CCTCC M2012461）菌种在500mL活化培养基中35℃下培养10h，得到活化菌液；

3) 将活化菌液以1%的接种量接种到发酵罐中，其中装有50L发酵培养基，pH值控制在5.0～7.0，35℃培养14h得到发酵液，经检测计数，发酵液含菌量为65亿CFU/mL；

4) 将上述发酵液在25℃、5000～8000转/分下，进行离心处理30～40分钟，弃上清液，即得发酵菌泥2kg，经检测计数，菌泥含菌量为1625亿CFU/克；

5) 称取质量比1:1的蔗糖和脱脂奶粉，分别配制成5%～12%与6%～15%的溶液，混合后作为冻干保护剂，灭菌处理；

6) 向发酵菌泥中加入6倍菌泥重量的冻干保护剂后，混合均匀，进行真空冷冻干燥30小时，使其含水量＜5%，得冻干粉1kg ；

7) 将冻干粉进行粉碎，过40目筛，所得即为植物乳杆菌冻干粉；经检测计数，冻干粉含菌量为3250亿CFU/克。

8) 按每克微生态制剂中含植物乳杆菌原粉100～1000亿CFU、纤维素酶1000～1600U、半纤维素酶200～1800U、葡萄糖0.5～0.7克、二氧化硅0.02～0.05克称取各组分，复配制得微生态制剂成品。

方法二

发酵培养基成分为：大豆蛋白胨10～20g/L，酵母粉5g/L，糖蜜5～15g/L，柠檬酸铵2g/L，醋酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，吐温80 0.1%(v/v)，玉米蛋白粉1～10g/L；步骤3）接种量不变，接种后的pH值控制在6.0～6.5，35℃培养12h得到发酵液，经检测计数，此时发酵液含菌量为90亿CFU/mL。

其他步骤均同方法一。

称取不同的组分量，复配成5种微生态制剂，见表1。

上述工艺采用了易于放大、成本低、易于产业化生产的培养基和发酵条件，所用培养基成分均为工业级别。根据实践，活化培养宜控制在30～37℃下培养10～20h；活化菌液的接种量宜控制为1%～10%；发酵条件宜控制在30～37℃下培养10～30h；将发酵液离心分离时，宜控制在20～25℃温度下进行。当然，相信随着后续研究和生产中对培养基成分和发酵条件的进一步优化（如将原料由工业级别换做纯度较高的分析纯级别），可以预见，植物乳杆菌Lder01的发酵水平会有很大程度的提高。

相较于本发明，专利文献“青贮专用乳酸菌接种剂及其制造方法 02123443.4”中植物乳杆菌的发酵液含菌量仅达到30亿CFU/mL；且发明人从市售优质酸奶中分离纯化得到一株植物乳杆菌，采用上述相同的培养和发酵条件，其发酵液含菌量为48亿CFU/mL。其结果都显著低于本发明使用的植物乳杆菌Lder01。

微生态制剂产品货架期的观察：

观察结果显示，低温保存有利于延长货架期。植物乳杆菌在4℃下、120天内的活菌数量几乎没有减少；室温下保存至30天时失活10%，90天时失活75%，见表2。

微生态制剂用于万寿菊的青贮：

1) 将采摘后的万寿菊鲜花在阴凉处晾晒，使其含水量为60%～75%；

2) 青贮窖为地下式发酵池，高3米，宽4米，一端开口便于取料；取料口端先装料，逐渐向里，并逐层装料，每层鲜花上均匀喷洒接种剂，接种剂使用前，将产品稀释，稀释比例为产品（重量）：水（重量）=1:200；产品添加量为每吨万寿菊鲜花添加10克；

3) 最后压实，密封，当pH值＜3.9时，可判断为发酵终端。

发酵适合温度为25℃～40℃，夏季常温发酵约7天，即可达到理想的万寿菊鲜花发酵效果。

试验设空白组（2组）和处理组（1组），空白组中新鲜万寿菊鲜花直接密封贮存，处理组在新鲜万寿菊鲜花中按照要求添加表1所示的第1种制剂后密封青贮。青贮结束，与空白组相比，处理组的万寿菊鲜花颜色橙黄，具有特殊的甘香味；其乳酸菌数量显著高于空白组，而酵母菌的数量显著少于空白组，同时未检测到霉菌。

万寿菊青贮后的叶黄素产出率对比试验：

1) 空白组1：取新鲜万寿菊花瓣，真空冷冻干燥24h，粉碎、过60目筛，制成冻干粉；

2) 空白组2：不加微生态制剂，将万寿菊鲜花青贮10天后，取万寿菊花瓣，真空冷冻干燥24h，粉碎、过60目筛，制成冻干粉；

3) 处理组：添加表1中微生态制剂1，当万寿菊鲜花青贮10天后，取万寿菊花瓣，真空冷冻干燥24h，粉碎、过60目筛，制成冻干粉。

用紫外分光光度计法检测不同处理冻干粉中叶黄素的含量，每组重复3次。结果显示，青贮10天，加入微生态制剂的处理组与空白组相比，叶黄素产出率提高了40%以上（见表3）。

本发明提供了从万寿菊发酵池分离的植物乳杆菌Lder01，并制备了含植物乳杆菌Lder01的青贮用微生态制剂，研究了其对万寿菊青贮和叶黄素提取率的影响。通过上述实施例可以看出，本发明的植物乳杆菌Lder01在发酵液中能快速繁殖，发酵液活菌数可达到90亿CFU/mL，处理得到的菌粉（冻干粉）含菌量达3200亿CFU/g以上，达到了领先水平；将本发明微生态制剂用于万寿菊青贮，植物乳杆菌能够快速生长，产生乳酸，快速降低万寿菊的pH值，缩短发酵周期，从而抑制腐败菌的生长繁殖活动，青贮后的万寿菊鲜花颜色橙黄，具有特殊的甘香味；微生态制剂中植物乳杆菌和复合酶协同作用可有效降解鲜花细胞壁组分，分离鲜花中的水分，使鲜花易烘干，色素易萃取，叶黄素提取率与自然发酵相比提高了40%以上。

Claims

1.一株植物乳杆菌Lder01，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC M2012461。

2.权利要求1所述的植物乳杆菌Lder01在青贮中的应用。

3.权利要求1所述的植物乳杆菌Lder01在万寿菊青贮中的应用。

4.一种青贮用微生态制剂，其特征在于：所述微生态制剂中含有权利要求1所述的植物乳杆菌Lder01。

5.一种青贮用微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：

1）将权利要求1所述的植物乳杆菌Lder01接种至活化培养基中，30～37℃下培养10～20h，得到活化菌液；

2）将活化菌液以1%～10%的接种量接种至发酵罐中，pH值控制在5.0～7.0，温度为30～37℃，在发酵培养基中培养12～30h得到发酵液；

3）将上述发酵液在20～25℃ 下，离心分离，得到发酵菌泥；

4）向发酵菌泥中加入适量冻干保护剂后，进行冷冻干燥、粉碎、过筛，得到植物乳杆菌Lder01冻干粉；

5）按每克微生态制剂中含植物乳杆菌Lder01 100～1000亿CFU、纤维素酶1000～1600U、半纤维素酶200～1800U、葡萄糖0.5～0.7克、二氧化硅0.02～0.05克称取各组分，复配得到青贮用微生态制剂成品。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述活化培养基成分为：大豆蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，醋酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，吐温80 0.1%(v/v)。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基成分为：大豆蛋白胨10～20g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖5～15g/L，柠檬酸铵2g/L，醋酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，吐温80 0.1%(v/v)，玉米蛋白粉1～10g/L。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基成分为：大豆蛋白胨10～20g/L，酵母粉5g/L，糖蜜5～15g/L，柠檬酸铵2g/L，醋酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，吐温80 0.1%(v/v)，玉米蛋白粉1～10g/L。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中，pH值控制在6.0～6.5。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述冻干保护剂为脱脂奶粉和蔗糖的混合物。