CN102268465B - 一种大量生产γ-聚谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种γ-聚谷氨酸的生产方法，特别是涉及一种大量生产高浓度的γ-聚谷氨酸的方法。本发明的技术方案概述如下：1.菌种的活化；2.种子液的制备；3.发酵罐发酵；其特征在于通过在发酵过程中补加由葡萄糖、硝酸铵、CaCl2·6H2O和FeCl3·6H2O组成的流加培养基，使发酵产率达到1.18g/l·h，从而达到高效制备大量γ-聚谷氨酸的目的。
Description
技术领域：
本发明属于高分子材料制备领域，本发明涉及一种生产γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术：
γ-聚谷氨酸是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基间的酰胺键结合而成的一种多功能生物可降解高分子材料。由于γ-聚谷氨酸及其衍生物具有优良的水溶性和吸附性，能彻底被生物降解，对人和动物安全无毒，可以食用等优点，因而可作为保水剂、增稠剂、絮凝剂、重金属吸附剂、药物/肥料缓释剂及药物载体等，在农业、食品、医药、化妆品、环保、合成纤维和涂膜等领域具有广阔的应用前景。随着化工合成材料造成的环境污染日益严重，开发生物可降解材料在一定程度上替代化学材料已成为整个国际社会的迫切需求。
聚谷氨酸的制备方法有化学合成、提取和微生物发酵三种方法。微生物发酵法比前两种方法的生产成本低，生产过程对环境的污染小，所以现在主要采用微生物发酵法生产γ-聚谷氨酸。国内外对γ-聚谷氨酸的发酵工艺进行了广泛的研究，主要以液体深层发酵的培养基配方和培养工艺为主。南京工业大学筛选得一株γ-聚谷氨酸高产菌株Bcillius subtilis NX-2，并对液体发酵生产γ-聚谷氨酸做了比较全面的研究，并申请了专利，专利公开号为CN1346891。华中农业大学也进行了γ-聚谷氨酸产生菌的筛选和工艺开发的工作，其菌种和液体生产工艺也已经申请了专利，专利公开号为CN1536071。韩国研究人员在2.5升发酵罐中对Bacillus licheniformis ATCC9945a采用流加高密度培养的方法，发酵35小时后可达到35g/L的终产量(Yoon SH，DO JH，Lee SY.Biotechnol.Lett，2000，22：585-588)。Kubota在Osaka City University土壤中分离得到的一株Bacillus subtilis F201，该菌株在最佳发酵生产条件下可达到50g/L的最高产量，这是文献报道的最高产量(Kubota H.Biosci Biotec Biochem，1993：1212-1213)。
虽然γ-聚谷氨酸的发酵生产取得了较大的进展，但是仍然存在生产周期较长，生产效率低下，生产成本较高的问题。因此，高效、低成本生产γ-聚谷氨酸仍有待进一步研究。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是提供一种大量生产高浓度γ-聚谷氨酸的方法
本发明的技术方案概述如下：
一种大量生产γ-聚谷氨酸的方法，包括菌种的活化、种子液的制备和发酵罐发酵，发酵培养基中糖浓度降至5-20g/L时，以0.1-2.0ml/min的速度补加流加培养基至发酵结束前2-6小时；流加培养基中各物质浓度分别为：葡萄糖600-1000g/L，硝酸铵30-60g/L，CaCl2·6H2O 5-20g/L，FeCl3·6H2O 0.05-0.15g/L。
发酵培养基组成如下(g/L)：葡萄糖60-100，谷氨酸钠60-100，酵母膏10-30，硝酸铵3.0-6.0，NaCl 5.0-15，MgSO4·6H2O 0.1-1.5，CaCl2·6H2O 0.5-2.0，FeCl3·6H2O 0.005-0.015，pH6.0-8.0。
所述流加培养基的成分为(g/L)：葡萄糖600-900，硝酸铵30.0-60.0，CaCl2·6H2O 5.0-20.0，FeCl3·6H2O 0.05-0.15；
流加培养基的成分为(g/L)：葡萄糖800，硝酸铵41，CaCl2·6H2O 10，FeCl3·6H2O0.1，；
流加培养基的成分为(g/L)：葡萄糖700，硝酸铵30，CaCl2·6H2O 5，FeCl3·6H2O0.05；
流加培养基的成分为(g/L)：葡萄糖900，硝酸铵60，CaCl2·6H2O 20，FeCl3·6H2O0.15；
流加培养基的成分为(g/L)：葡萄糖1000，硝酸铵45，CaCl2·6H2O 15，FeCl3·6H2O 0.1；
流加培养基的成分为(g/L)：葡萄糖600，硝酸铵41，CaCl2·6H2O 10，FeCl3·6H2O0.1；
所述发酵培养基中糖浓度降至7-15g/L时，补加流加培养基；
发酵条件：30L发酵罐装液量为15L，按上述发酵培养基所示的配方配制发酵培养基，种子液的接种量为5.0％-15.0％，发酵温度30-40℃，发酵时间24-72小时，通风量1.0-2.0vvm，转速200-600rpm；发酵过程中当残糖降至5-20g/L时补加流加培养基至发酵结束前6小时，流加速度为0.1-2.0ml/min；
有益效果：
(1)本发明使用的地衣芽孢杆菌微生物菌株可以高效的发酵生产γ-聚谷氨酸；
(2)通过对地衣芽孢杆菌菌株培养条件的优化，特别是在发酵过程中补加葡萄糖、硝酸铵、CaCl2·6H2O及FeCl3·6H2O，使发酵液中的γ-聚谷氨酸的含量高达40-50g/L，并且使γ-聚谷氨酸的产率达到1.0-1.2g/L·h，从而提供一种高效廉价制备γ-聚谷氨酸的方法。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明中聚谷氨酸的生产方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本实用新型的保护范围。
实施例1对照试验
1.菌种的活化：在富含营养的固体培养基斜面上于37℃培养16小时，制备成熟的斜面种子，固体培养基的成分包含：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂20g/L，pH7.2；
2.种子液的制备：
将一环上述种子转入含富含营养的液体培养基的三角瓶中，37℃，220rpm培养16小时至对数生长期；
按照每升培养基的加入量配制种子培养基：葡萄糖30；酵母膏7；胰蛋白胨10；K2HPO40.5；MgSO4·6H2O 0.5，灭菌前pH7.2；500ml的三角瓶中分装50ml的培养基；
3.发酵罐发酵：
发酵培养基：发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖80，谷氨酸钠80，酵母膏20，硝酸铵4.1，NaCl 10，MgSO4·6H2O 0.5，CaCl2·6H2O 1.0，FeCl3·6H2O 0.01，pH7.0；
发酵条件：30L发酵罐装液量为15L，按上述发酵培养基所示的配方配制发酵培养基，种子液的接种量为10％，发酵温度37℃，发酵时间48小时，通风量1.5vvm，转速400rpm；发酵结束后经检测γ-聚谷氨酸的产量为22.5g/L，γ-聚谷氨酸的产率为0.47g/l·h；
实施例2
菌种的活化和种子液的制备基本同实施例1；
3.发酵罐发酵：
发酵培养基：发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖80，谷氨酸钠80，酵母膏20，硝酸铵4.1，NaCl 10，MgSO4·6H2O 0.5，CaCl2·6H2O 1.0，FeCl3·6H2O 0.01，pH7.0；
流加培养基：流加培养基的成分为(g/L)：葡萄糖800，硝酸铵41，CaCl2·6H2O10，FeCl3·6H2O 0.1；
发酵条件：30L发酵罐装液量为15L，按上述发酵培养基所示的配方配制发酵培养基，种子液的接种量为10％，发酵温度37℃，发酵时间36小时，通风量1.5vvm，转速400rpm；发酵过程中当残糖降至10g/L时补加流加培养基至发酵结束前6小时，流加速度为0.1ml/min；发酵结束后经检测γ-聚谷氨酸的产量为22.0g/L，γ-聚谷氨酸的产率为0.61g/l·h；
实施例3
菌种的活化和种子液的制备基本同实施例1；
3.发酵罐发酵：
发酵培养基：发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖80，谷氨酸钠80，酵母膏20，硝酸铵4.1，NaCl 10，MgSO4·6H2O 0.5，CaCl2·6H2O 1.0，FeCl3·6H2O 0.01，pH7.0；
流加培养基：流加培养基的成分为(g/L)：葡萄糖700，硝酸铵30，CaCl2·6H2O5，FeCl3·6H2O 0.05；
发酵条件：30L发酵罐装液量为15L，按上述发酵培养基所示的配方配制发酵培养基，种子液的接种量为10％，发酵温度37℃，发酵时间36小时，通风量1.5vvm，转速400rpm；发酵过程中当残糖降至20g/L时补加流加培养基至发酵结束前2小时，流加速度为0.5ml/min；发酵结束后经检测γ-聚谷氨酸的产量为30g/L，γ-聚谷氨酸的产率为0.83g/l·h；
实施例4
菌种的活化和种子液的制备基本同实施例1；
3.发酵罐发酵：
发酵培养基：发酵培养基成分为(g/L)：发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖80，谷氨酸钠80，酵母膏20，硝酸铵4.1，NaCl 10，MgSO4·6H2O 0.5，CaCl2·6H2O1.0，FeCl3·6H2O 0.01，pH7.0；
流加培养基：流加培养基的成分为(g/L)：葡萄糖900，硝酸铵60，CaCl2·6H2O20，FeCl3·6H2O 0.15；
发酵条件：30L发酵罐装液量为15L，同实施例1配制发酵培养基，种子液的接种量为10％，发酵温度37℃，发酵时间36小时，通风量1.5vvm，转速400rpm；发酵过程中当残糖降至5g/L时补加流加培养基至发酵结束前4小时，流加速度为1ml/min；发酵结束后经检测γ-聚谷氨酸的产量为42.5g/L，γ-聚谷氨酸的产率为1.18g/l·h；
实施例5
菌种的活化和种子液的制备基本同实施例1；
3.发酵罐发酵：
发酵培养基：发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖80，谷氨酸钠80，酵母膏20，硝酸铵4.1，NaCl 10，MgSO4·6H2O 0.5，CaCl2·6H2O 1.0，FeCl3·6H2O 0.01，pH7.0；
流加培养基：流加培养基的成分为(g/L)：葡萄糖1000，硝酸铵45，CaCl2·6H2O15，FeCl3·6H2O 0.1；
发酵条件：30L发酵罐装液量为15L，同实施例1配制发酵培养基，种子液的接种量为10％，发酵温度37℃，发酵时间36小时，通风量1.5vvm，转速400rpm；发酵过程中残糖降至7g/L时补加流加培养基至发酵结束前6小时，流加速度为1.5ml/min；发酵结束后经检测γ-聚谷氨酸的产量为34.5g/L，γ-聚谷氨酸的产率为0.96g/l·h；
实施例6
菌种的活化和种子液的制备基本同实施例1；
3.发酵罐发酵：
发酵培养基：发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖80，谷氨酸钠80，酵母膏20，硝酸铵4.1，NaCl 10，MgSO4·6H2O 0.5，CaCl2·6H2O 1.0，FeCl3·6H2O 0.01，pH7.0；
流加培养基：流加培养基的成分为(g/L)：葡萄糖600，硝酸铵41，CaCl2·6H2O10，FeCl3·6H2O 0.1；
发酵条件：30L发酵罐装液量为15L，同实施例1配制发酵培养基，种子液的接种量为10％，发酵温度37℃，发酵时间36小时，通风量1.5vvm，转速400rpm；发酵过程中残糖降至15g/L时补加流加培养基至发酵结束前6小时，流加速度为2.0ml/min；发酵结束后经检测γ-聚谷氨酸的产量为18.7g/L，γ-聚谷氨酸的产率为0.52g/l·h；
Claims (7)
1.一种大量生产γ-聚谷氨酸的方法，通过对地衣芽孢杆菌菌株培养条件的优化，特别是在发酵过程中补加流加培养基，可以有效提高γ-聚谷氨酸产量；所述方法包括如下步骤：
(1)菌种的活化：在富含营养的固体培养基斜面上于37℃培养16小时，制备成熟的斜面种子，固体培养基的成分包含：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂20g/L，pH7.2；
(2)种子液的制备：
将一环上述种子转入富含营养的种子液体培养基的三角瓶中，37℃，220rpm培养16小时至对数生长期；
按照每升培养基的加入量配制种子液体培养基：葡萄糖30；酵母膏7；胰蛋白胨10；K2HPO40.5；MgSO4·6H2O0.5，灭菌前pH7.2；500ml的三角瓶中分装50ml的种子液体培养基；
(3)发酵罐发酵：
发酵培养基组成如下：葡萄糖60-100，谷氨酸钠60-100，酵母膏10-30，硝酸铵3.0-6.0，NaCl5.0-15，MgSO4·6H2O0.1-1.5，CaCl2·6H2O0.5-2.0，FeCl3·6H2O0.005-0.015，pH6.0-8.0，以上成分单位均为g/L；
发酵条件：30L发酵罐装发酵培养基量为15L，按上述发酵培养基所示的配方配制发酵培养基，种子液的接种量为10％，发酵温度37℃，发酵时间48小时，通风量1.5vvm，转速400rpm；
补加流加培养基：当发酵培养基中糖浓度降至5-20g/L时，以0.1-2.0ml/min的速度补加流加培养基至发酵结束前2-6小时；流加培养基中各物质浓度分别为：葡萄糖600-1000g/L，硝酸铵30-60g/L，CaCl2·6H2O5-20g/L，FeCl3·6H2O0.05-0.15g/L。
2.如权利要求1所述一种大量生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述步骤(3)中流加培养基的成分为：葡萄糖600-900，硝酸铵30.0-60.0，CaCl2·6H2O5.0-20.0，FeCl3·6H2O0.05-0.15，以上成分单位均为g/L。
3.如权利要求1所述一种大量生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述步骤(3)中流加培养基的成分为：葡萄糖800，硝酸铵41，CaCl2·6H2O10，FeCl3·6H2O0.1，以上成分单位均为g/L。
4.如权利要求1所述一种大量生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述步骤(3)中流加培养基的成分为：葡萄糖700，硝酸铵30，CaCl2·6H2O5，FeCl3·6H2O0.05，以上成分单位均为g/L。
5.如权利要求1所述一种大量生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述步骤(3)中流加培养基的成分为：葡萄糖900，硝酸铵60，CaCl2·6H2O20，FeCl3·6H2O0.15，以上成分单位均为g/L。
6.如权利要求1所述一种大量生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述步骤(3)中流加培养基的成分为：葡萄糖1000，硝酸铵45，CaCl2·6H2O15，FeCl3·6H2O0.1，以上成分单位均为g/L。
7.如权利要求1所述一种大量生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述步骤(3)中流加培养基的成分为：葡萄糖600，硝酸铵41，CaCl2·6H2O10，FeCl3·6H2O0.1，以上成分单位均为g/L。
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