CN102649941B

CN102649941B - 解磷恶臭假单胞菌l13及其发酵工艺

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Publication number: CN102649941B
Application number: CN 201110047420
Authority: CN
Inventors: 陈守文; 王昌军; 信健; 冀志霞; 李进平; 祖秉桥; 祁高富; 马昕; 杨树; 李建平
Original assignee: WUHAN RUIYANG BIOTECHNOLOGY CO Ltd; Huazhong Agricultural University; Tobacco Research Institute of Hubei Province
Current assignee: WUHAN RUIYANG BIOTECHNOLOGY CO Ltd; Huazhong Agricultural University; Tobacco Research Institute of Hubei Province
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2011-02-28
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2031-02-28
Also published as: CN102649941A

Abstract

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及解磷恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)L13的分离筛选及发酵培养。分离得到一株具有解磷能力的恶臭假单胞菌L13，保藏号为CCTCC NO：2010342。其发酵工艺是：1)取L13菌株斜面种子在LB培养基平板上划线培养得到一级种子；2)接种一级种子单菌落至LB培养基摇瓶中，使OD₆₀₀至2.0，得二级种子；3)接种二级种子至摇瓶进行发酵培养，得到恶臭假单胞菌；或接种二级种子至发酵罐，经过优化培养得到恶臭假单胞菌。本发明的菌株生长速度快，产菌量高，活菌数可达到100亿以上。该解磷菌在1～3g/L植酸钙为唯一磷源的PKO培养基中的解磷量可达120～220mg/L；在4～6g/L磷酸三钙为唯一磷源的PKO培养基中的解磷量可达300～500mg/L。

Description

解磷恶臭假单胞菌L13及其发酵工艺

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一株解磷恶臭假单胞菌及其发酵工艺。

背景技术

土壤中的总磷源只有1％～5％是以可被植物利用的可溶性磷的形式存在的。由于土壤的吸附作用，传统化学肥料在施入土壤之后90％左右很快会被土壤固定而成为植物不可利用的难溶性磷，最后能以稳定形态存在的可溶性磷只有一小部分。所以，在20世纪80年代之后，随着农业的持续发展，土壤中的可溶性磷有了相当大程度的降低，而土壤中的无机总磷源降低的幅度相比之下却很少。

在作物根际中存在各种有益微生物菌群，我们称之为植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)解磷菌(PSB)就是它们之中最为典型的一员，它们在促进磷元素被植物所吸收的同时，也推动了其在广阔的自然界中的循环作用。解磷恶臭假单胞菌L13(Pseudomonas putida L13)是华中农业大学农业微生物国家重点实验室微生物工程室筛选得到的一株可高效溶解无机和有机可溶性磷的植物根际促生长菌。玉米盆栽试验结果显示这株解磷恶臭假单胞菌具有较好的应用效果：它对玉米的干重、湿重、株高、根长及磷的吸收都具有显著促进作用(p＜0.05)，其中，玉米对土壤全磷的利用率从16.15％提高到23.07％。

目前国内外虽然关于解磷菌(phosphate solubilizing bacteria，PSB)和植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria)的研究比较多，并取得一定成果，但是其培养方面的相关报道很少，对于解磷恶臭假单胞菌的培养没有固定的培养基。目前国内外应用较多的培养基-牛肉膏蛋白胨培养基来培养猪链球菌。这种培养基虽然使用方便，但在培养过程中，具有菌体生长缓慢，成本高等缺点，发酵终点活菌数为10～20亿，不适合大规模增菌使用。

解磷恶臭假单胞菌的生长繁殖所需条件较广泛，但生物量普遍不高，其培养基中若含有葡萄糖，则会由于菌体生长过程中pH的剧降导致菌体贴壁生长甚至死亡。现常用的种子培养基牛肉膏蛋白胨培养基是不含葡萄糖营养物质较丰富的培养基，但成本较高，不适合大规模生产。因此，完全有必要研制并开发适合工业规模化生产，且原料来源广泛，价格低廉，能大幅度提高活菌数的培养基。

在本申请提出以前，华中农业大学2010年10月6日公开了一株高效解磷的丁酸梭菌A5-4及应用(专利公开号：CN101851596A，专利申请号：2010101534192，专利申请日：2010年4月21日)，该解磷丁酸梭菌A5-4为厌氧菌，主要应用于处于厌氧环境中的污水处理及水稻淹水状态下的促生菌，由于该菌只能应用于厌氧环境，其实际应用范围较窄，且发酵生产工艺较为复杂。与上述发明相比，本发明的解磷恶臭假单胞菌可应用于好氧与微好氧环境，发酵工艺操作简单，解磷能力为丁酸梭菌A5-4的两倍以上，且该菌具有更强的环境适应能力，应用领域更广，理论上可适用于绝大多数陆生作物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一株解磷恶臭假单胞菌L13及其发酵培养基，采用上述培养基培养解磷恶臭假单胞菌，有利于细菌的生长代谢，与其他培养基相比能获得较高的菌量，而且材料来源广泛且价格低廉，在微生物肥料生产过程中能得到高纯度的细菌。使用本发明提供的液体培养基进行大规模培养，可有效扩增解磷恶臭假单胞菌，获得纯化的细菌以供微生物肥料生产。

本发明提供的高效解难溶性有机磷和无机磷的解磷菌L13，在农作物的根际土壤中可将难溶性磷源转变为可溶性磷源以供作物吸收从而促进作物的生长。本发明可极大提高磷肥的利用率和改善土壤微生态环境，同时本发明的菌株具有较强的环境适应能力，可在-4～40℃及8％以内的NaCl高渗环境中生存，具有较强的应用前景。

实现本发明技术方案如下所述：

申请人从湖北省武汉市郊区的土壤中分离筛选得到一株具有高解磷能力的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)L13，该菌株于2010年12月9日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2010342。

申请人建立了一种解磷恶臭假单胞菌L13的发酵方法，其包含如下步骤：

(1)制备一级种子：取保藏号为CCTCC NO：2010342的恶臭假单胞菌L13斜面种子在LB培养基平板上划线，置28℃培养箱培养14h，出现游离单菌落，得到一级种子；

(2)制备二级种子液：用接种环取一环步骤(1)的一级种子的单菌落，接种于50mL的LB液体培养基的250mL摇瓶中，培养温度为28℃，摇床转速为200rpm，培养时间为12h，OD₆₀₀达到2.0，得到二级种子液；

(3)发酵培养：取步骤(2)的二级种子液以V/V计为0.5～3％的接种量接入装有20～40mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行发酵培养，控制摇床温度为26～30℃，转速为160～200rpm，起始pH为6.8～7.6，发酵周期为36～60h，得到恶臭假单胞菌；或

取步骤(2)的二级种子液以V/V计为0.5～3％的接种量接入装有按V/V计的40～60％发酵培养基的发酵罐中，控制发酵温度为26～30℃，通气量为0.2～0.4vvm，转速为400～800rpm，pH为6.5～7.0，发酵周期为36～60h，得到恶臭假单胞菌；

其中：

发酵培养基的组分、配制及使用方法如下：

葡萄糖10～40g/L，玉米浆1～3g/L，(NH₄)₂SO₄1～3g/L，MgSO₄.7H₂O 0.1～0.5g/L，KCl 0.1～0.3g/L；余量为水；在所述的摇瓶发酵培养中扣除10倍磷酸盐缓冲液的体积；

10倍磷酸盐缓冲液的配制方法如下：称取35.6g的磷酸氢二钠，加蒸馏水定容至100ml，配制成磷酸氢二钠溶液，为溶液1；再称取27.6g磷酸二氢钠，加蒸馏水定容至100ml，配制成磷酸二氢钠溶液，为溶液2；取85ml溶液1和15ml溶液2，混合，即得到10倍磷酸盐缓冲溶液；在121℃高压蒸汽下灭菌20min，备用；

所述的10倍磷酸盐缓冲液在摇瓶发酵的发酵培养基中添加量按V/V计为6～10％；在发酵罐发酵的发酵培养基中不加入。

10倍磷酸盐缓冲液母液的配制方法如下：称取35.6g的磷酸氢二钠，加蒸馏水定容至100ml，配制成磷酸氢二钠溶液，为溶液1；再称取27.6g磷酸二氢钠，加蒸馏水定容至100ml，配制成磷酸二氢钠溶液，为溶液2；取85ml溶液1和15ml溶液2；混合，即得到10倍磷酸盐缓冲溶液；在121℃高压蒸汽下灭菌20min，备用(为防止该磷酸缓冲液中的磷酸盐直接加入发酵培养基中会产生沉淀，应将磷酸缓冲液单独进行配制及灭菌，然后再加入至发酵培养基中)。

本发明的解磷恶臭假单胞菌L13，通过16S rDNA序列与GenBank已收录序列进行核苷酸比对和伯杰氏手册提供的相关生理生化特征试验进行亲缘关系鉴定。其16S rDNA如序列表SEQ ID NO：1所述。

本发明的恶臭假单胞菌L13的菌学特征

1.形态特征：

菌落呈白色，光滑，边缘整齐，菌体呈短杆状，革兰氏染色呈阴性。

2.16S rDNA鉴定方法：

A.本发明的恶臭假单胞菌L13基因片段长度为1415bp。

B.16S rDNA引物设计与PCR过程：

采用通用引物，其核苷酸序列为：27F(正向引物)P1，5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和1492R(反向引物)5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACTT-3’对筛选到的目的菌16S rDNA进行聚合酶链式反应扩增(PCR)(参见：Lane DJ et al.，1991)。

PCR产物的提取及测序由北京奥科生物技术有限责任公司完成。

C.同源性比较

同源性比较分析参照国际通用的the National Center for Biotechnology Information GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库。序列拼接使用的软件为ContigExpress(美国AB公司，2000)比对及***进化树构建使用的软件为MEGA4(美国功能基因组进化中心，2007)。按照该软件自带的程序构建恶臭假单胞菌L13***发育树(见图2)。结果表明本发明分离的恶臭假单胞菌L13(序列登录号：GQ330564)的16S rDNA序列与数据库提供标准菌株(Pseudomonas putida)D37923的相似度为99％。

3.生理生化检测

对分离到的分离菌L13进行37项相关生理生化检测，发现其与《伯杰氏***细菌学手册》提供的标准菌株(Pseudomonas putida biovar B)的生理生化结果完全一致，最终将本发明的分离菌L13鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。

4.L13的解磷特征

解磷恶臭假单胞菌L13具有较好的解有机和无机难溶性磷的能力，在加有1～3g/L植酸钙为唯一磷源的PKO培养基(葡萄糖5g/L，(NH₄)₂SO₄2g/L，NaCl 0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，KCl 0.2g/L，MnSO₄0.03g/L，FeSO₄0.03g/L，酵母粉2g/L；无机磷源：Ca₃(PO₄)₂5g/L或有机磷源：植酸钙2g/L)中培养5～7d的解磷量可达120～220mg/L。在加有4～6g/L磷酸三钙为唯一磷源的PKO培养基中培养5～7d解磷量可达300～500mg/L。

5.L13的对玉米促生长的特征

解磷恶臭假单胞菌L13在伴有无机磷肥共同使用的情况下对玉米具有较好的促生长效果，可极大提高廉价无机磷肥如磷矿粉、磷酸三钙的利用率并大大降低其施用量。

解磷恶臭假单胞菌L13为革兰氏阴性菌，菌体在100×油镜下为短杆状、无芽胞，在固体培养基中，菌落呈白色，光滑，边缘整齐。该菌株的16SrDNA序列在NCBI GenBank的编号为GQ330565。

解磷恶臭假单胞菌L13的发酵培养基通过对多种廉价的原材料进行筛选而确定，发酵条件较易控制，具有成本低、菌体产量高、简单易操作的特点。

本发明的发酵工艺条件通过下列技术方案完成：

解磷恶臭假单胞菌发酵培养基由下列组分组成(W/V)：葡萄糖10～40g/L，玉米浆1.0～3.0g/L，(NH₄)₂SO₄1.0～3.0g/L，MgSO₄.7H₂O 0.1～0.5g/L，KCl 0.1～0.3g/L，摇瓶培养时加入10倍磷酸盐缓冲液，其加入量为培养基的6～10％(V/V)，灭菌前调培养基的pH至6.8～7.6。发酵罐培养条件为：装液量40～60％(V/V)，接种量0.5～3％(V/V)，控制温度26～30℃，通气量0.2～0.4vvm，转速400～800rpm，发酵罐发酵时不加磷酸盐缓冲液，采用H₂SO₄-NaOH调控pH值在6.5～7.0，发酵周期为36～48h。

本发明提供的发酵培养基通过下列方法制备：

A、将玉米浆1.0～3.0g、(NH₄)₂SO₄1.0～3.0g、MgSO₄.7H₂O 0.1～0.5g、KCl 0.1～0.3g，用少量蒸馏水溶解后，再用蒸馏水定容至1000ml，灭菌前调整培养基的pH至6.8～7.6；121℃高压蒸汽灭菌20min，备用；

B、称取葡萄糖10～40g，用蒸馏水定容至100ml，此为10倍葡萄糖母液；115℃高压蒸汽灭菌30min，备用；

C、称取35.6g的磷酸氢二钠，加蒸馏水定容至100ml，配制成磷酸氢二钠溶液，为溶液1。称取27.6g磷酸二氢钠，加蒸馏水定容至100ml，配制成磷酸二氢钠溶液，为溶液2。取85ml溶液1和15ml溶液2，混合，配成10倍浓度磷酸盐缓冲液；121℃高压蒸汽灭菌20min，备用；

D、将步骤B的葡萄糖溶液和步骤C的磷酸盐缓冲液加入到灭过菌的步骤A的培养基中，得到适用于摇瓶发酵用的解磷恶臭假单胞菌发酵培养基。其中步骤B中的葡萄糖溶液的添加量为5～15％(V/V)，步骤C的磷酸盐缓液加入量为6～10％(V/V)。

本发明的发酵工艺有如下特点：

本发明的培养基含有解磷恶臭假单胞菌生长代谢所需的营养要求，其中选用葡萄糖作为碳源，但由于解磷恶臭假单胞菌自身的特点，在含有葡萄糖的培养基中生长时，会在短时间内向培养基质中释放H⁺，并使一些中间代谢产物如草酸、乳酸、富马酸等有机酸释放到培养基中，导致pH值剧降，影响酶的活性，进而抑制微生物生长和产物的合成，由于该菌可耐高盐，缓冲盐的加入较好的解决了该问题，此外，缓冲盐中的磷亦可为菌体生长中核酸、磷酸、ATP、和辅酶的合成提供丰富的磷源。有机无机混合N源玉米浆和(NH₄)₂SO₄营养丰富，成本低廉，除可提供菌体生长繁殖所需N源营养外，玉米浆中还含有很多生长因子能有效促进解磷恶臭假单胞菌的生长繁殖。另外，该培养基中的无机盐成分MgSO₄.7H₂O和KCl可供给菌体生长某些合成酶提高活性所必须的Mg⁺和K⁺，能缩短延滞期，促进解磷恶臭假单胞菌菌体的生长。

本发明的发酵生产条件具有较好的可操作性，发酵参数较少且控制简单，在实际发酵生产过程中采用H₂SO₄-NaOH调控pH的方法在提供了该菌最适pH生长环境的同时也极大程度地降低了生产成本，由于该菌在发酵过程中基本不产表面活性剂类代谢产物，且胞外多糖较少，溶氧和混合效果较好，比较适合做大规模生产。

该解磷菌菌液或固体制剂可应用于各种土壤中的陆生禾本科类农作物，具有较好的促生长作用，且该菌还具有较强的环境适应能力，可在-4～40℃及8％以内的NaCl高渗环境中生存。

同时，该解磷菌具有优异的溶解难溶性无机磷和有机磷的能力，在加有1～3g/L植酸钙为唯一磷源的PKO培养基中培养5～7d解磷量可达120～220mg/L。在加有4～6g/L磷酸三钙为唯一磷源的PKO培养基中培养5～7d解磷量可达300～500mg/L。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离的解磷恶臭假单胞菌L13的16S rDNA序列，序列长度为1415bp。

图1：是本发明的解磷恶臭假单胞菌L13在100×油镜下的菌体形态。

图2：是本发明的解磷恶臭假单胞菌L13基于16s rDNA的***发育树示意图。

图3：是本发明的解磷恶臭假单胞菌L13在3L发酵罐中的生长曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例，其中实施例1～3为摇瓶培养，实施例4～6为发酵罐培养。

实施例1 摇瓶发酵培养

A、一级种子制备：取斜面种子解磷恶臭假单胞菌L13(保藏号为CCTCC NO：2010342)在LB培养基平板上划线，放入28℃培养箱培养14h，出现游离单菌落，此为一级种子；

B、制备二级种子：用接种环取一环步骤A的一级种子的单菌落，接入装有50mL LB液体培养基的250mL摇瓶中，控制温度28℃，摇床转速180rpm，发酵培养12h，OD₆₀₀达到2.0此为二级种子；

C、发酵培养：取步骤B的二级种子液以2％(V/V)的接种量接入装有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行发酵培养，控制摇床温度为28℃，转速为180rpm，发酵培养至48h，OD₆₀₀达到16.0；

D、发酵结束，收获菌体。

其中所述的发酵培养基组分及配制方法如下所示：

葡萄糖25g/L，玉米浆2.0g/L，(NH₄)₂SO₄2.0g/L，MgSO₄.7H₂O 0.3g/L，KCl 0.2g/L，10倍磷酸盐缓冲液加入量为8％(V/V)，其余用水补至1L，灭菌前调培养基的pH至7.2。

10倍磷酸盐缓冲液的配制方法如下：称取35.6g的磷酸氢二钠，加蒸馏水定容至100ml，配制成磷酸氢二钠溶液，为溶液1；再称取27.6g磷酸二氢钠，加蒸馏水定容至100ml，配制成磷酸二氢钠溶液，为溶液2；取85ml溶液1和15ml溶液2；混合，即得到10倍磷酸盐缓冲溶液；在121℃高压蒸汽下灭菌20min，备用；

实施例2 摇瓶发酵培养

B、制备二级种子：用接种环取一环步骤A的一级种子的单菌落，接入装有50mL LB液体培养基的250mL摇瓶中，控制温度30℃，摇床转速200rpm，发酵培养14h，OD₆₀₀达到2.0此为二级种子；

C、发酵培养：取步骤B的二级种子液以3％(V/V)的接种量接入装有40mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行发酵培养，控制摇床温度为30℃，转速为200rpm，发酵培养至60h，OD₆₀₀达到15.0；

D、发酵结束，收获菌体。

其中所述的发酵培养基组分及配制方法如下所示：

葡萄糖40g/L，玉米浆3.0g/L，(NH₄)₂SO₄3.0g/L，MgSO₄.7H₂O 0.5g/L，KCl 0.3g/L，10倍磷酸盐缓冲液母液加入量为10％(V/V)，其余用水补至1L，灭菌前调培养基的pH至7.6。

10倍磷酸盐缓冲液按照实施例的方法制备。

实施例3 摇瓶发酵培养

A、一级种子制备：取斜面种子解磷恶臭假单胞菌L13(保藏号为CCTCC NO：2010342)在LB培养基平板上划线，放入28℃培养箱培养10h，出现游离单菌落，此为一级种子；

B、制备二级种子：用接种环取一环步骤A的一级种子的单菌落，接入装有30mL LB液体培养基的250mL摇瓶中，控制温度26℃，摇床转速160rpm，发酵培养10h，OD₆₀₀达到2.0此为二级种子；

C、取步骤B的二级种子液以0.5％(V/V)的接种量接入装有20mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行发酵培养，控制摇床温度为26℃，转速为160rpm，发酵培养至36h，OD₆₀₀达到15.0；

D、发酵结束，收获菌体。

其中所述的发酵培养基组分及配制方法如下所示：

葡萄糖10g/L，玉米浆1.0g/L，(NH₄)₂SO₄1.0g/L，MgSO₄.7H₂O 0.1g/L，KCl 0.1g/L，10倍磷酸盐缓冲液母液加入量为6％(V/V)，其余用水补至11，灭菌前调培养基的pH至6.8。

10倍磷酸盐缓冲液按照实施例的方法制备。

实施例4 发酵罐发酵培养

C、发酵培养：取步骤B的二级种子液以2％(V/V)的接种量接入装有50％(V/V)发酵培养基的发酵罐中，控制发酵温度为28℃，通气量为0.3vvm，转速为600rpm，控制发酵过程pH为6.5～7.0，发酵培养至48h，OD₆₀₀达到16.0；

D、发酵结束，收获菌体。

其中所述的发酵培养基组分及配制方法如下所示：

葡萄糖25g/L，玉米浆2.0g/L，(NH₄)₂SO₄2.0g/L，MgSO₄.7H₂O 0.3g/L，KCl 0.2g/L，其余用水补至1L，灭菌前调培养基的pH至7.2。

实施例5 发酵罐发酵培养

C、发酵培养：取步骤B的二级种子液以3％(V/V)的接种量接入装有60％(V/V)发酵培养基的发酵罐中，控制发酵温度为30℃，通气量为0.4vvm，转速为800rpm，控制发酵过程pH为6.5～7.0，发酵培养至60h，OD₆₀₀达到15.0；

D、发酵结束，收获菌体。

其中所述的发酵培养基组分及配制方法如下所示：

葡萄糖40g/L，玉米浆3.0g/L，(NH₄)₂SO₄3.0g/L，MgSO₄.7H₂O 0.5g/L，KCl 0.3g/L，其余用水补至1L，灭菌前调培养基的pH至7.6。

实施例6 发酵罐发酵培养

C、取步骤B的二级种子液以0.5％(V/V)的接种量接入装有40％(V/V)发酵培养基的发酵罐中，控制发酵温度为26℃，通气量为0.2vvm，转速为400rpm，控制发酵过程pH为6.5～7.0，发酵培养至36h，OD₆₀₀达到15.0；

D、发酵结束，收获菌体。

其中所述的发酵培养基组分及配制方法如下所示：

葡萄糖10g/L，玉米浆1.0g/L，(NH₄)₂SO₄1.0g/L，MgSO₄.7H₂O 0.1g/L，KCl 0.1g/L，其余用水补至11，灭菌前调培养基的pH至6.8。

表1：本发明的解磷菌与先前报道的解磷菌的主要特点和发明效果的比较

表2：本发明的解磷恶臭假单胞菌L13对玉米的促生长效果

说明：“CK”为不施加磷肥对照；“+”为接菌处理。

表3：解磷恶臭假单胞菌L13的生理生化特征

“+”阳性反应，“-”阴性反应

表4：本发明的解磷恶臭假单胞菌L13在3L发酵罐中的活菌计数

Claims

1.一株适用于在农作物的根际土壤中将难溶性磷源转变为可溶性磷源以供作物吸收从而促进作物生长的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)L13，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：M2010342。

2.一种应用权利要求1所述的恶臭假单胞菌L13的发酵方法，其特征在于如下步骤：

(1)制备一级种子：取保藏号为CCTCC NO：M2010342的恶臭假单胞菌L13斜面种子在LB培养基平板上划线，置28℃培养箱培养14h，出现游离单菌落，得到一级种子；

(2)制备二级种子液：用接种环取一环步骤(1)的一级种子的单菌落，接种于装有50mL的LB液体培养基的250mL摇瓶中，培养温度为28℃，摇床转速为200rpm，培养时间为12h，使OD₆₀₀达到2.0，得到二级种子液；

(3)发酵培养：取步骤(2)的二级种子液以V/V计为0.5～3％的接种量接入装有20～40mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行发酵培养，控制摇床温度为26～30℃，转速为160～200rpm，起始pH为6.8～7.6，发酵周期为36～60h，得到恶臭假单胞菌菌剂；或

取步骤(2)的二级种子液以V/V计为0.5～3％的接种量接入装有按V/V计的40～60％发酵培养基的发酵罐中，控制发酵温度为26～30℃，通气量为0.2～0.4vvm，转速为400～800rpm，pH为6.5～7.0，发酵周期为36～60h，得到恶臭假单胞菌菌剂；

其中：

发酵培养基的组分、配制及使用方法如下：

葡萄糖10～40g/L，玉米浆1～3g/L，(NH₄)₂SO₄1～3g/L，MgSO₄.7H₂O0.1～0.5g/L，KCl0.1～0.3g/L；余量为水；在所述的摇瓶发酵培养中扣除10倍磷酸盐缓冲液的体积；

10倍磷酸盐缓冲液的配制方法如下：称取35.6g的磷酸氢二钠，加蒸馏水定容至100ml，配制成磷酸氢二钠溶液，即为溶液1；再称取27.6g磷酸二氢钠，加蒸馏水定容至100ml，配制成磷酸二氢钠溶液，即为溶液2；取85ml溶液1和15ml溶液2，混合，即得到10倍磷酸盐缓冲溶液；在121℃高压蒸汽下灭菌20min，备用；

所述的10倍磷酸盐缓冲液在摇瓶发酵的发酵培养基中添加量按V/V计为6～10％。