CN102233074A

CN102233074A - 一种药物组合物在制备保护胰岛β细胞功能药物中的应用

Info

Publication number: CN102233074A
Application number: CN2010101563161A
Authority: CN
Inventors: 仝小林; 甄重; 常柏; 周水平
Original assignee: Tianjin Tasly Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Tianjin Tasly Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2010-04-27
Filing date: 2010-04-27
Publication date: 2011-11-09

Abstract

本发明属于药学领域，涉及一种药物组合物在制备保护胰岛β细胞的药物中的应用，其中所述药物组合物由下列重量份的中药原料药为组方配制而成：天花粉5-40份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5-20份。

Description

一种药物组合物在制备保护胰岛β细胞功能药物中的应用

技术领域

本发明属于药学领域，涉及一种药物组合物在制备保护胰岛β细胞功能药物中的应用。

背景技术

2型糖尿病(T2DM)是严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。国际糖尿病联合会(IDF)2006发表的统计数据显示，在过去20年，全球糖尿病患者人数从3000万剧增到2.3亿。世界卫生组织专家预计，到2025年全球糖尿病患者将达到3.5亿。印度、中国、美国依次为全球糖尿病患者数量最多的三个国家，估计中国糖尿病患者总人数近4000万，仅次于印度，居世界第二位，占世界的29.63％。T2DM的防治在可预见的相当长时期内都将是人类面临的严峻挑战。

2型糖尿病也叫成人发病型糖尿病，多在35～40岁之后发病，占糖尿病患者90％以上。2型糖尿病病友体内产生胰岛素的能力并非完全丧失，有的患者体内胰岛素甚至产生过多，但胰岛素的作用效果却大打折扣，因此患者体内的胰岛素可能处于一种相对缺乏的状态。可以通过某些口服药物刺激体内胰岛素的分泌。但到后期仍有部分病人需要像1型糖尿病那样进行胰岛素治疗。2型糖尿病大致具有以下3个特点：第一个特点，2型糖尿病好发于成年人，尤其以中老年人为多。多次糖尿病流行病学研究结果都表明，2型糖尿病发病的年龄多在40-60岁，从40岁起，患病率逐渐增加，到老年期达到高峰。青年发病的成年型糖尿病相对来说，还是十分少见的。第二个特点是病情一般比较缓和、隐蔽，也就是说与1型糖尿病相比，不那么来势汹汹。2型糖尿病病人症状不明显，不见得每个患者都有喝得多、尿得多、吃得多的表现，多数人也没有显著的消瘦，当然体力和体重不同程度地下降还是比较常见的。第三个特点就是患者往往不需要靠胰岛素治疗来维持生命。也就是说，患者不打胰岛素也不至于很快就发生酮症酸中毒而危及生命。所以，2型糖尿病原来又叫非胰岛素依赖型糖尿病。2型糖尿病病人有时也需要使用胰岛素治疗，但多数是因为血糖控制不理想，或者是因为发生了急性并发症或者糖尿病的慢性并发症较重，而不像1型糖尿病病人那样是为了维持生命。

2型糖尿病是比1型糖尿病更为复杂的疾病，特别是在早期体内胰岛素仍然能自我产生时却更容易治疗。由于早期症状轻微(如无酮症酸中毒和昏迷等)且多散发，因此2型糖尿病多在病情进展多年后方被诊断。然而，2型糖尿病的控制不当会导致诸如肾衰、失明、伤口愈合慢、动脉病(包括冠状动脉疾病)等严重的并发症。

2型糖尿病患者其主要特征为胰岛素抵抗，相对胰岛素缺乏和高血糖；肝脏葡萄糖产量的增加(如来源于肝糖原的降解)，特别是在不当时机的增加(典型的原因是胰岛素水平紊乱，而胰岛素的作用之一正是调控肝脏此功能)；肌肉和脂肪组织(主要)中胰岛素介导的葡萄糖转运的减少(受体和受体后途径缺陷)；胰岛β细胞功能受损——缺失了高血糖水平刺激时早期胰岛素释放的功能。

胰岛素是由胰岛β细胞分泌的控制机体能量平衡的最重要激素。胰岛β细胞能感应血糖浓度的高低及变化，并通过迅速释放胰岛素将血糖浓度控制在适当范围。胰岛β细胞具有很强的可塑性。它的功能除了随着诱导物的本质、量及摄入途径而变化外，还随胰岛素敏感性而改变。

胰岛β细胞功能保护的临床与基础研究为2型糖尿病的防治提供了新的思路。有效中药保护β细胞功能对于延缓糖尿病的发生和控制糖尿病病程的进展有十分重要的意义。动物实验和人体研究均发现，胰岛β细胞凋亡增加可能是T2DM胰岛B细胞分泌胰岛素功能不足的主要原因，提示胰岛β细胞凋亡增加同样可能在糖脂毒性导致胰岛B胞功能障碍的过程中发挥着重要作用，新近的研究表明，胰岛细胞凋亡增加确实在糖脂毒性导致高脂肥胖大鼠胰岛β细胞分泌功能不足中起着重要作用。

近年来，随着对细胞凋亡发病机制研究的深入，越来越多的研究证实，线粒体不仅是细胞能量代谢的调控中心，而且在细胞凋亡过程中发挥着重要作用，多种促凋亡因素可以引起线粒体损伤，启动细胞凋亡的线粒体信号转导通路，诱导细胞凋亡。在线粒体凋亡通路诱导的细胞凋亡过程中，线粒体膜通透性转运孔道(permeability transitionpore，PTP)开放，使水和溶质由胞质进入线粒体基质，导致线粒体基质肿胀。肿胀的线粒体基质使内膜膨胀，内膜的皱褶被展开，加之线粒体外膜表面积远远小于内膜，线粒体外膜因此而破裂，释放出线粒体膜间隙中的各种促凋亡蛋白。

发明人通过对糖敏灵深入的研究，意外的发现糖敏灵可以保护胰岛β细胞功能，为糖敏灵新的治疗用途提供了依据。

发明内容

本发明目的在于提供一种药物组合物在制备保护胰岛β细胞的药物中的应用。

本发明所述的药物组合物(又称为糖敏灵制剂，开郁清热制剂)，由下列重量份的中药原料药为组方配制而成：天花粉5-40份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5-20份。

上述组方中还可以加入中药山楂，得到的配方为：天花粉10-30份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5-20份、山楂3-15份。

上述组方中还可以加入中药山楂，黄精，人参和苦瓜，得到的配方为：天花粉10-30份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄，1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5-20份、山楂3-15份、黄精3-15份、人参3-15份、苦瓜3-15份。

优选的本发明的配方为：天花粉9份、柴胡12份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅9份。

或：

天花粉30份、柴胡12份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅15份、山楂9份。

或：

天花粉30份、柴胡12份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅15份、山楂9份、黄精9份、人参9份、苦瓜9份。

以上组成中，重量是以生药计算的，份为重量份，若以克为单位，以上组成可制成药物制剂5-50个制剂单位，所述制剂单位指，制成的成品药物制剂，如制成固体制剂5-50单位，口服液5-50ml等。

以上组成可制成1-6次服用剂量的制剂，如作为片剂，制成18片，每次服用剂量可以是3-18片，共可服用1-6次。如作为颗粒剂，制成6袋，每次服用1-2袋，共可服用3-6次。

以上组成是按重量份作为配比的，在生产时可按照相应比例增大或减少，如大规模生产可以以公斤为单位，或以吨为单位，小规模生产也可以以毫克为单位，重量可以增大或者减小，但各组成之间的生药材重量配比的比例不变。

以上重量配比的比例是经过科学筛选得到的，对于特殊病人，如重症或轻症，肥胖或瘦小的病人，可以相应调整组成的量的配比，增加或减少不超过300％，药效不变。

以上组成中的单味中药，尤其是臣药和佐药，也可以被适当的具有相同药性的中药替换，替换后的中药制剂其药物作用不变。

本发明的中药组合物，是通过将上述配方组成的中药原料经过提取或其他方式加工，制成药物活性物质，随后，以该物质为原料，需要时加入药物可接受的载体，按照制剂学的常规技术制成的。所述活性物质可以通过分别提取中药原料得到，也可以通过共同提取中药原料得到，也可以通过其他方式得到，如：通过粉碎、压榨、煅烧、研磨、过筛、渗漉、萃取、水提、醇提、酯提、酮提、层析等方法得到、这些活性物质可以是浸膏形式的物质，可以是干浸膏也可以是流浸膏，根据制剂的不同需要决定制成不同的浓度。

本发明的中药组合物中的药物活性物质，其在制剂中所占重量百分比可以是0.1-99.9％，其余为药物可接受的载体。本发明的药物组合物，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每袋等。

本发明的中药组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、***剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。

本发明的中药组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。

适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。

可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。

口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或***胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。

对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。

本发明的中药组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明的组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次1-20剂，如：1-20袋或粒或片。

本发明的组合物是经过以下方法制备，具体步骤如下：

本发明所述糖敏灵制剂的制备方法为：(1)按比例取上述原料，(2)加入4倍量70-90％的乙醇，50-80℃减压回收乙醇，70-90℃真空干燥，粉碎过80目筛，得药物提取物；加入辅料制成任意种药剂学上可以接受的剂型。

本发明的药物组合物及其制备方法可参考中国专利CN1726929。

通过以下实验进一步说明本发明的药物组合物的治疗效果。

1.材料与方法

1.1实验动物

以自发性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠和其同系非糖尿病对照鼠LETO鼠为实验对象。大鼠皆为雄性，OLETF 40只，LETO大鼠10只，四周龄，由日本大冢制药株式会社德岛研究所引进。

大鼠在无特定病原体级(SPF级，specific pathogen-free)条件下单笼饲养，饲以标准饲料。环境温度控制在22-25℃，湿度为55±5％，12/12小时光照黑暗循环(光照时间7:00-19:00)，自由获取食物和饮水。

饲养地点：中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心SPF级动物饲养房。

1.2分组及给药

1.2.1OLETF糖尿病诊断分组标准

大鼠定期行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。试验前隔夜禁食15小时、不禁水，按2g/kg予30％葡萄糖溶液灌胃(取葡萄糖粉82.5g，加蒸馏水定容至250ml，加热溶解为清亮液体，得到浓度为30％葡萄糖溶液)。

于空腹及糖负荷后30、60、90和120min取血，以德国内卡BIOSEN5030快速葡萄糖分析仪测定血糖值。血糖峰值＞16.7mmol/L和负荷后120min血糖＞11.1mmol/L诊为糖尿病，具备上述一条者为糖耐量减低。

1.2.2实验动物分组及给药

至30周时，共有成模OLETF鼠27只，随机分为模型组、罗格列酮组、糖敏灵组，LETO为空白对照组。

罗格列酮组：罗格列酮(文迪雅)：史克必成天津有限公司产品每片含马来酸罗格列酮4mg，购自由美国葛兰素史克(中国)投资有限公司，临用前搅拌至完全溶解，以蒸馏水稀释，给药剂量为3mg/kg/d^-1。

糖敏灵组(即：开郁清热组)，采用本发明实施例1的配方配制成浸膏，4℃冰箱保存，以蒸馏水稀释，灌胃剂量为9mg/kg/d^-1(按所含原药材量计算)。

模型组与空白组以等量蒸馏水灌胃，各组均灌胃给药12周，每日1次。

2指标与检测

2.1OGTT同步胰岛素释放

大鼠隔夜禁食，不禁水，称重后以2％的戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，仰卧位固定，麻醉显效后，切开颈部皮肤，钝性分离皮下组织及肌肉，分离暴露右侧颈总动脉和左侧颈内或颈外静脉，进行右侧颈总动脉和左侧颈内或颈外静脉插管，穿线结扎，固定(美国产硬膜外麻醉用硅胶导管，内径0.6mm，外径1mm)，并用含肝素50U/ml的生理盐水充满导管，保持其通畅。动脉插管以取血测血糖，静脉插管连接小三通管，出口端与静脉相连，两进口端分别与微电脑数字式微量注射泵连接以输注胰岛素及葡萄糖。插管完毕后，将大鼠静置30分钟后测定血糖。并同时对其进行保温。

胰岛素、20％葡萄糖分别用2个微电脑数字式微量注射泵由颈静脉泵入，血液标本由颈动脉导管获取。将静置30分钟的插管大鼠颈动脉导管所接的注射器取下，取血一滴，用微型血糖仪在30s内测定基础血糖值。

开始时先恒定输注短效猪胰岛素(输注速率为8mU/kg·min^-1，临用时胰岛素用0.5％牛血清白蛋白稀释)。每10分钟测定血糖一次，当血糖值超出基础值±0.5mmol/L的范围时，即开始输注浓度为20％葡萄糖，调整葡萄糖输注速度(即葡萄糖输注率，GIR)，使血糖值控制在基础值±0.5mmol/L的范围左右，如果血糖值超出基础值±0.5mmol/L的范围，即可继续输注葡萄糖。输注葡萄糖后仍每10分钟测一次血糖，并根据血糖值在最短的时间内调整葡萄糖输注率，使血糖恢复到基础值±0.5mmol/L的范围内。如此反复进行，当连续三次血糖值均稳定在上述范围内，即达到稳定状态。将钳夹的处于稳态的三个GIR值(单位为mg·kg^-1·min^-1)求平均值。该指标用于判断是否存在IR及IR的程度。

2.2糖敏灵对实验大鼠胰岛细胞胰岛素表达的影响

选用各组大鼠胰腺组织常规石蜡包埋，用SAKURA石蜡切片机进行连续石蜡切片，厚度4微米连续取四张邻片进行展片，分别用于HE染色、免疫组化检测。

取胰腺组织切片，用豚鼠抗猪胰岛素抗体1∶100，胰高糖素抗体1∶100进行β细胞，α细胞染色。二抗：EnVisionTM***，DAB显色液(所有试剂均为DAKO公司产品)

Envision操作程序

脱蜡，水化组织切片。

蒸馏水漂洗，置于TBS中。

滴加0.3％H₂O₂阻断内源性过氧化物酶，孵育15分钟。

蒸馏水漂洗，置于TBS中5分钟X3次。

一抗孵育2小时

TBS漂洗TBS中5分钟X3次

滴加EnvisionTM孵育60分钟。

TBS漂洗5分钟X3次。

色源DAB溶液显色3分钟，蒸馏水终止显色。

梯度酒精脱水，封片胶封片。

显微镜下观察结果。

实验时同时设阴性对照，采用TBS代替一抗作为空白阴性对照。

结果判定：胰岛细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性。

图像分析：北京大学医学部图像分析中心。

2.3糖敏灵对实验大鼠胰岛B细胞凋亡率的影响

胰岛B细胞凋亡：原位术端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞(Roche公司)。凋亡细胞核着染深棕色，同时对照连续切片中胰岛素染色阳性的细胞定为凋亡的B细胞。每个胰岛中B细胞的凋亡率＝每个胰岛中B细胞的凋亡数/该胰岛中B细胞的总数×100％，每张切片选取5个胰岛，分别计算凋亡率后取平均值作为该样本胰岛B细胞的凋亡率。

2.4实时荧光定量PCR法检测大鼠胰腺caseaspe3 mRNA表达的影响

主要仪器

GeneAmp 5700TaqMAN PCR仪美国Applied Biosystems公司

凝胶图像分析仪ImageMaster VDS 美国pharmacia Biotech公司

高速冷冻离心机德国BACKMAN公司Allagra.21R Centrifcige

紫外线分光光度计德国BACKMAN公司DU640型

电泳仪北京六一仪器厂OYY-III-5型

主要试剂：

Trizol(Invitrogen)

RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)

SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)

引物采用primer premier5.0设计，由赛百盛公司合成。

2.4.1从组织中提取总RNA

●取约100mg组织加1ml Trizol后，研磨至组织完全破碎、液体粘稠，室温放置5分钟，使其充***解。

●按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，摇匀15秒，室温放置15分钟。

●4℃12000g离心15分钟。

●吸取上层水相，至另一个预冷的离心管中。

●按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇(预冷)混匀，室温放置5-10min。

●4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

●按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇(预冷)，温和震荡离心管，悬浮沉淀。

●4℃7500g离心5min，尽量弃上清。

●室温晾干5-10min。

●用50μl RNase-free H₂O，溶解RNA样品，55-60℃10min。

●测O.D值定量RNA浓度。

2.4.2分光光度法测定核酸的浓度

带氩灯的分光光度计，使用前预热稳定15分钟。

●吸取6μl RNA样品，加水至1.5ml混匀后，转入分光光度计的石英比色杯中。

●分光光度计先用1ml水校正零点。

●在260nm和280nm分别读出光密度，RNA样品的浓度为：OD260*核酸稀释倍数*40/1000；浓度单位为μg/μl。

2.4.3RNA样品反转录

●取出RNA模板、试剂，于室温融化后，立即放在冰浴中，混旋器上混匀，短暂离心。

●模板变性：

Template RAN x ul(5.0ug)

Oligo(dT)18primer 0.5ug/ul 1.0ul

DEPC处理过的水至 12.0ul

混匀，短暂离心，70℃温浴10分钟，立即放在冰浴中至少1分钟。

●配制反应混合液(每管按下述量配制)

5×reaction buffer 4.0ul

10mM dNTP Mix 2.0ul

RNase Inhibitor(20U/ul) 1.0ul

混合液配制量为样品数N+2。

●每管加7.0uL的上述混合液混匀。37℃温浴5分钟。

●每管加入1.0uL M-MuLV Reverse Transciptase(200u/uL)，42℃温浴60分钟，70℃温浴10分钟。-20℃保存备用。

2.4.4荧光定量PCR检测

●引物及试剂

SYBR Green PCR Master Mix：ABI(Applied Biosystems)，Catalog No.43049155引物序列：

β-actin-FP：5’-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3’

β-actin-RP：5’-AAT GTC ACG CAC GAT TTC CC-3’扩增片段为263bp。

Casepase3

上游：5′-AAT TCAAGG GAC GGG TCATG-3′

下游：5′-GCT TGC GCG TAC AGT TTC-3′扩增片段为475bp

●引物稀释：将引物按终浓度10pmol/ul进行稀释，具体方法为：V(ul)＝O.D.值×33ug/10M(V＝所需DEPC处理水体积，M＝引物分子量)

●反应混合液的配制：

取出2×Buffer，RNase-free water，cDNA放在室温中，融化，立即放在冰浴中，混旋器上混匀，短暂离心。

每人份混合液(反应体系V＝25ul)所含试剂见下表

Component Volnme

2×SYBR Green PCR Master Mix， 12.5ul

xxx-F primer(10pmol/ul) 1ul

xxx-R primer(10pmol/ul) 1ul

Nuclease-free H₂O 8.5ul

Total Volume 23ul

配好混合液后，每个反应管中加入23ul混合液。

●加样：每个反应管加入2.0ul cDNA模板，混旋器上混匀，短暂离心(小于5sec)。

●在GeneAmp 5700荧光定量PCR仪进行，反应条件如下：

95.0℃：10min

72.0℃：50sec

72.0℃：5min

以上反应设定均在与PCR仪相连的计算机上进行，每个循环电脑自动记录反应管中的荧光信号值，并描绘曲线。反应结束由PE 5700软件分析结果，自动计算定量数值。

实验结果以内参基因与目的基因的Ct值比值作为目的基因的mRNA相对表达量，(因为Ct值与实际表达量成反比关系，为了直观，我们在分析数据时将目的基因与Beta-actin的Ct值比值取倒数，也就是Beta-actin与目标基因的Ct值比值作为其mRNA的相对表达量)

2.5胰腺组织石蜡切片细胞色素C免疫组化染色

石蜡切片二甲苯I、II脱蜡各15分钟，梯度酒精即出即入至水；

流水浸洗5分钟；

0.3％的H₂O₂溶液氧化15分钟；

流水浸洗5分钟，PBS洗5分钟×3次；

滴加适当稀释的1∶100细胞色素C一抗，4℃冰箱孵育过夜；

PBS洗5分钟×3次；

滴加1∶400生物素标记二抗，湿盒中留置1.5小时(室温)；

PBS洗5钟×3次；

DAB溶液显色2分钟；

流水浸洗5分钟；

梯度酒精脱水，二甲苯I、II透明各15分钟；

DPX封片；

2.6糖敏灵对实验大鼠胰岛B细胞超微结构的观察

取大鼠新鲜胰腺组织各5块，立即固定于2.5％(体积分数)戊二醛溶液，再用1％(体积分数)锇酸固定。丙酮梯度脱水，Epon812包埋。半薄切片定位胰岛后做超薄切片色。JBVI-1230型透射电镜观察。

2.7统计学处理

用SPSS16.0统计分析软件处理实验数据，所得数据以均数±标准差

表示，服从正态分布的两组间均数比较用t检验进行统计，多组间比较采用方差分析。

3结果

OGTT胰岛素同步释放试验

见表1，大鼠口服糖耐量试验同步测胰岛素分泌及曲线下面积的变化，模型组OGTT同步胰岛素曲线下面积大于LETO组，结合正糖钳夹实验结果，提示模型组存在着较明显的胰岛素抵抗，经开郁清热中药以及罗格列酮治疗后，两组胰岛素曲线下面积显著增加，提示两组对胰岛B细胞胰岛素分泌功能有较好的改善作用。

表142W各组OGTT各时点胰岛素(ng/ml)及AUC(ng·min/ml)变化

表242W实验各组胰岛素分泌指数比较(ng/mmol)

注：与正常组比较##P＜0.01，#P＜0.05；与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05；

42W时通过OGTT同步的胰岛素释放试验，我们计算了胰岛素分泌指数(ΔI30/ΔG30)，结果见表2，显示模型组较LETO明显下降，而开郁清热与罗格列酮组较模型组明显上调，开郁清热组优于罗格列酮

糖敏灵对实验大鼠胰岛形态的影响

胰腺：在LETO组胰岛数目较多，胰岛分布均匀，大小一致。呈着色浅淡的细胞团，轮廓清楚，胰岛细胞排列整齐、大小一致，细胞核呈紫蓝色，胞浆丰富呈淡粉色，胰岛内末见淋巴细胞、单核细胞浸润。模型组胰腺，胰岛萎缩细胞数量明显减少，细胞大小不等，排列不规则，大鼠胰岛体积明显增加，多数胰岛增生并纤维化，胰岛呈不规则圆形，纤维组织增殖穿插生长于胰岛细胞团之间。中药组和西药组与模型相比均有明显改观。

糖敏灵对实验大鼠胰岛细胞胰岛素表达的影响

胰岛素免疫组化染色结果显示：表达胰岛素的免疫反应阳性产物为棕黄色颗粒，存在β细胞胞质内。LETO组胰岛素染色阳性β细胞位于胰岛中央部，染色较深，模型组胰岛素染色阳性β细胞数量明显减少，染色较浅，且散在分布。开郁清热组和罗格列酮组胰岛素染色阳性β细胞数量较模型组增多，但仍然较正常组减少(见图1)。

定量分析结果显示：与LETO组相比，模型组(P＜0.01)胰岛素染色阳性的细胞面积和积分下吸光度显著低于正常组，开郁清热组与罗格列酮组均有不同程度改善。(见图2)

表3糖敏灵对OLETF大鼠胰岛素表达的影响(OD

)

注：与正常组比较##P＜0.01，#P＜0.05；与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05

糖敏灵对实验大鼠胰岛B细胞凋亡率的影响

模型组B细胞凋亡率高于LETO，两治疗组优于模型组。

表442W实验各组大鼠胰骨骼肌AMPK活性定量比较

糖敏灵对实验大鼠胰岛caseaspe3mRNA表达的影响

与正常组相比，模型组胰岛组织caseaspe3mRNA表达显著高于正常组(P＜0.01)；与模型组相比，糖敏灵组骨骼肌组织中caseaspe3mRNA显著低于模型组(P＜0.01)。(见表3，图3、图4)

表5各组胰腺β-actin与casepase3荧光表达量比值比较(％)

注：与正常组比较##P＜0.01，#P＜0.05；与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05透射电子显微镜下胰岛β细胞超微结构的变化

LETO组：胰岛较大，胰岛内可见多量B细胞，胞质内充满大小一致的圆形颗粒。颗粒有膜包绕，大部分颗粒有一个明显的空晕及偏位的致密核心，部分颗粒低电子密度，均匀。高尔基复合体、线粒体及粗面内质网结构正常。小血管基底膜均匀。

模型组：胰岛小，B细胞胞核固缩，大小不等团块集中于核膜处，胞质内颗粒稀疏，大小及分布不均。胞质内见多量空泡，大量溶酶体。线粒体基质肿胀、峭断裂。小血管基底膜薄厚不均，管壁增厚，结构疏松。血管周围多量胶原原纤维及纤维母细胞增多。

开郁清热组：胰岛较小，B细胞胞质内颗粒较多，颗粒形态更接近于LETO，大小及分布较均匀，可见溶酶体，高尔基复合体、线粒体及粗面内质网扩张，小血管基底膜稍增厚。

罗格列酮组：胰岛较小，B细胞胞质内颗粒减少，大小及分布不均。部分颗粒有空晕机偏位致密核心；部分颗粒低电子密度，均匀，呈空泡状。见溶酶体及斑层小体。高尔基复合体及粗面内质网扩张，小血管基底膜薄厚不均，管壁增厚，结构疏松。

本发明研究显示，糖敏灵对自发2型糖尿病大鼠OLETF胰岛B细胞功能具有较好的保护作用，这不仅表现在对胰岛素分泌的量的保护作用，更体现在对胰岛素分泌模式的保护上，而后者对于糖耐量的改善具有明显意义，且提示胰岛功能的变化趋势。

通过电子显微镜的观察，不仅在超微结构上证实了糖敏灵的胰岛保护作用，更提示我们，自发2型糖尿病大鼠的线粒体损伤明显，糖敏灵的胰岛保护作用部分与保护、修复线粒体结构以及功能有关。其次，通过对胰岛形态的病理学研究，更加明确了糖敏灵对胰岛保护作用的特点一整体调控，在微观层面上，不仅保护胰岛B细胞的形态与功能，还对与之密切联系的胰岛微环境具有一定的保护作用。

综上，通过上述实验进一步证明，糖敏灵对胰岛β细胞具有保护作用，具体表现在对胰岛素分泌的量和分泌的模式上，通过对胰岛素分泌模式的保护，进而改善糖耐量，并且具有提示胰岛功能的变化趋势的作用。

另外，糖敏灵对胰岛β细胞保护作用与保护、修复线粒体结构以及功能有关，还与减轻糖脂的联合毒性有关系。在微观层面上，糖敏灵不仅保护胰岛β细胞的形态与功能，还对与之密切联系的胰岛微环境具有一定的保护作用。糖敏灵通过对胰岛β细胞保护，从而起到治疗和预防2型糖尿病的作用。

附图说明

图1各组大鼠胰岛胰岛素表达情况

图2糖敏灵对OLETF大鼠胰岛素表达的影响

图3糖敏灵对OLETF大鼠胰岛casepase3荧光表达量的影响

图41.5％琼脂糖凝胶ceaspease3产物电泳结果

图4中：自左向右5条泳道分别为Marker、LETO组、模型组、开郁清热组、罗格列酮组。Marker为DL1000，由上而下电泳条带的分子量分别片段长度自上而下分别为：100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，700bp，1000bp。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限制。

实施例1、本发明的糖敏灵胶囊的制备

取天花粉30g、柴胡12g、枳实9g、生大黄3g，半夏6g、黄芩9g、黄连6g、白芍9g、乌梅15g、山楂9g、黄精9g、人参9g、苦瓜9g；

加入4倍量80％的乙醇，60℃回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，70℃加压回收乙醇，80℃真空干燥，粉碎过80目筛，得药物提取物；

加入乳糖制成胶囊。

实施例2、本发明的糖敏灵片剂的制备

加入糊精制成片剂。

实施例3、本发明的糖敏灵颗粒剂的制备

60℃鼓风干燥，制粒，整粒，即得颗粒剂。

实施例4、本发明的糖敏灵滴丸的制备

加入的聚乙二醇，混合均匀，熔融，上滴丸机，制成滴丸。

实施例5、本发明的糖敏灵口腔崩解片的制备

加入5％交联聚维酮，0.1％的硬脂酸镁，50％的微晶纤维素，用适量乙醇溶液制成软材，制粒，60℃鼓风干燥，制粒，整粒，压制成片，即得口腔崩解片。

实施例6、本发明的糖敏灵胶囊剂的制备

加入适量淀粉，蔗糖和硬脂酸镁，制粒，装入胶囊，即得胶囊剂。

实施例7、本发明的糖敏灵片剂的制备

与淀粉，羧甲基纤维素钠、滑石粉混合均匀，制粒，压片即得片剂。

实施例8、本发明的糖敏灵口服液的制备

与糖浆4g、溶于100ml的纯净水中，均质，过滤，经过高温瞬时灭菌(135℃，4s)。无菌灌装、分装，制得口服液。

实施例9、本发明的糖敏灵口服液的制备

与糖浆5g、溶于100ml的纯净水中，均质，过滤，经过高温瞬时灭菌(135℃，4s)。无菌灌装、分装，制得口服液。

实施例10、本发明的糖敏灵胶囊的制备

取天花粉9g、柴胡12g、枳实9g、生大黄3g，半夏6g、黄芩9g、黄连6g、白芍9g、乌梅9g；

加入乳糖制成胶囊。

实施例11、本发明的糖敏灵胶囊的制备

取天花粉30g、柴胡12g、枳实9g、生大黄3g，半夏6g、黄芩9g、黄连6g、白芍9g、乌梅15g、山楂9g；

加入乳糖制成胶囊。

实施例12、本发明的糖敏灵片剂的制备

加入糊精制成片剂。

实施例13、本发明的糖敏灵片剂的制备

加入糊精制成片剂。

实施例14、本发明的糖敏灵颗粒剂的制备

60℃鼓风干燥，制粒，整粒，即得颗粒剂。

实施例15、本发明的糖敏灵颗粒剂的制备

60℃鼓风干燥，制粒，整粒，即得颗粒剂。

实施例16、本发明的糖敏灵滴丸的制备

加入的聚乙二醇，混合均匀，熔融，上滴丸机，制成滴丸。

实施例17、本发明的糖敏灵滴丸的制备

加入的聚乙二醇，混合均匀，熔融，上滴丸机，制成滴丸。

实施例18、本发明的糖敏灵口腔崩解片的制备

实施例19、本发明的糖敏灵口腔崩解片的制备

实施例20、本发明的糖敏灵胶囊剂的制备

实施例21、本发明的糖敏灵胶囊剂的制备

实施例22、本发明的糖敏灵胶囊剂的制备

实施例23、本发明的糖敏灵胶囊剂的制备

实施例24、本发明的糖敏灵胶囊剂的制备

实施例25、本发明的糖敏灵胶囊剂的制备

实施例26、本发明的糖敏灵粉针剂的制备

再加入葡萄糖4.5g、硫代硫酸钠0.9g和蒸馏水1ml，上述组分混合均匀后，冷冻干燥，分装，即得粉针剂。

实施例27、本发明的糖敏灵粉针剂的制备

实施例28、本发明的糖敏灵粉针剂的制备

上述实施例内的组分量可以根据生产需要同时扩大或缩小比例。

Claims

1.一种药物组合物在制备保护胰岛β细胞的药物中的应用，其中所述药物组合物山下列重量份的中药原料药为组方配制而成：天花粉5-40份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5-20份。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，药物组合物组方中还可以加入中药山楂，得到的配方为：天花粉10-30份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5-20份、山楂3-15份。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，药物组合物组方中还可以加入中药山楂，黄精，人参和苦瓜，得到的配方为：天花粉10-30份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄，1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5-20份、山楂3-15份、黄精3-15份、人参3-15份、苦瓜3-15份。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，药物组合物组方为：天花粉9份、柴胡12份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅9份。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，药物组合物组方为：天花粉30份、柴胡12份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅15份、山楂9份。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，药物组合物组方为：天花粉30份、柴胡12份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅15份、山楂9份、黄精9份、人参9份、苦瓜9份。

7.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物对胰岛β细胞的保护表现在对胰岛素分泌的量和分泌的模式上。

8.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物通过对胰岛素分泌模式的保护，进而改善糖耐量，并且具有提示胰岛功能的变化趋势。

9.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物对胰岛β细胞保护作用与保护、修复线粒体结构以及功能有关。

10.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物通过保护胰岛β细胞，治疗和预防2型糖尿病。