CN104706708B

CN104706708B - 红芪乙醇提取物在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用及其中有效成分鉴定方法

Info

Publication number: CN104706708B
Application number: CN201510077488.2A
Authority: CN
Inventors: 封士兰; 赵良功; 陈心悦; 柳小亚
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2015-02-13
Filing date: 2015-02-13
Publication date: 2018-11-20
Anticipated expiration: 2035-02-13
Also published as: CN104706708A

Abstract

本发明提供红芪乙醇提取物在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用及其中有效成分鉴定方法。本发明首次探讨了红芪乙醇提取物对四氯化碳所致小鼠肝纤维化的防治作用，并选择10批不同产地红芪研究其抗肝纤维化药效，在大量样本的基础上，进一步验证了红芪乙醇提取部位的药效；运用高效液相色谱（HPLC）—二极管阵列检测器（DAD）鉴定了其中主要成分，通过对一系列色谱条件的优化，得到分离度良好，峰形较佳的指纹图谱，鉴定出腺苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素及美迪紫檀素5个成分，为研究红芪乙醇提取物中发挥主要作用的成分奠定了基础。

Description

红芪乙醇提取物在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用及其中有效成分鉴定方法

技术领域

本发明属于中药提取技术领域，具体涉及红芪乙醇提取物在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用及其中有效成分鉴定方法。

背景技术

红芪(Radix Hedysari)也称为 “独根” ,是豆科植物多序岩黄芪(Hedysarumpolybotrys Hand.-Mazz.)的干燥根。红芪性微温、味甘，归肺、脾经。具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血等功效。其化学成分主要有多糖、黄酮、皂苷、微量元素及氨基酸。

肝纤维化为一病理组织学概念，是多种慢性肝病共有的病理改变，肝纤维化是由于多种损肝因素引起肝脏星状细胞 (HSC)的激活，细胞外基质(ECM)过多生长而致细胞转化生长因子1(TGF- 1) TNF等促胶原降解减少而大量堆积所致，它持续发展的中心环节在于肝细胞损伤或坏死对周围非实质细胞的不断刺激，从而导致ECM大量合成与沉积，超过其降解速度，由此造成肝细胞结构的改建与破坏，并逐渐演变成肝硬化。肝纤维化是一种主动进展的、可逆的基质代谢失衡和肝脏***重构的过程，由肝炎病毒、酒精、药物与毒物、血吸虫、代谢和遗传、胆汁淤积、自身免疫性肝病等各种损伤因素长期慢性刺激肝脏引起炎症而形成的。为大多数慢性肝病所共有的病理特征，也是慢性肝炎、肝硬化进一步发展、恶化的重要中间环节。研究表明，肝纤维化患者中的20%-40%最终发展为肝硬化乃至肝癌。20世纪50年代，国际肝病学术权威Hans Popper教授首先提出“谁能阻止肝纤维化，谁就能治愈大多数肝病”，因此有效地阻断肝纤维化的发生发展，对防治肝硬化肝癌具有重要意义。

单味中药及有效单体治疗肝纤维化亦取得了一定进展，报道较多具有抗肝纤维化作用的单味药主要有黄芪、桃仁、红花、三七、丹参、赤芍、汉防己、川芎、冬虫夏草、当归、苦参等几十余种，对肝纤维化均具有较好的防治作用，但大部分并未深入研究发挥疗效的药物所含化学成分。本发明通过研究10批不同产地红芪，发现其乙醇提取物对肝纤维化有良好效果，同时鉴定了其中5种化学成分，为进一步研究其发挥药效的物质奠定了基础。

发明内容

本发明提供了红芪乙醇提取物在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用，并对其中发挥药效的主要化学成分进行了鉴定。

本发明首先提供红芪乙醇提取物在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用。

优选地，所述红芪乙醇提取物的有效成分包括腺苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素和美迪紫檀素。

优选地，所述红芪乙醇提取物的制备方法为：用2-10倍量的95%-50%乙醇回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压回收至无乙醇味，将残留液依次用与残留液体积相等的石油醚和乙酸乙酯萃取5次后，将下层溶液浓缩至干，加入95%-50%乙醇，能溶于其中的即为红芪乙醇提取物。

本发明还提供红芪乙醇提取物的制备方法，步骤如下：用2-10倍量的95%-50%乙醇回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压回收至无乙醇味，将残留液依次用与残留液体积相等的石油醚和乙酸乙酯萃取5次后，将下层溶液浓缩至干，加入95%-50%乙醇，能溶于其中的即为红芪乙醇提取物。

本发明的第三个目的是提供红芪乙醇提取物中有效成分的鉴定方法，将红芪乙醇提取物用高效液相色谱—二极管阵列检测器进行鉴定，色谱柱为Spursil C18 柱，流动相为乙腈和水，梯度洗脱：0-40min 40%乙腈、60%水，40-75min 60%乙腈、40%水；检测波长260nm；流速为1.0 ml/min；柱温为25℃；进样量为20μl。

本发明的第四个目的是提供一种预防和治疗肝纤维化药物，所述药物的有效成分为红芪乙醇提取物。

优选地，所述药物的剂型为溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、冻干粉剂、贴剂、凝胶剂、膜剂、滴丸剂、酒剂、浸膏剂或缓控释制剂。

上述不同剂型药物的制备方法与现有技术中相同。

经试验，红芪乙醇提取物小鼠给药剂量为灌胃给药12g原药材/kg/天，成人剂量为口服给药1g原材料/kg/天。

本申请采用四氯化碳经典造模方式，它能准确反映肝细胞功能、代谢及形态学变化，重复性较好；同时选取具有表征性的5个血清指标（AST、ALT、Tp、Alb、A/G）及肝重指数全面评价肝纤维化程度，实验结果良好；本发明首次探讨了红芪乙醇提取物对四氯化碳所致小鼠肝纤维化的防治作用，并选择10批不同产地红芪研究其抗肝纤维化药效，在大量样本的基础上，进一步验证了红芪乙醇提取部位的药效；运用高效液相色谱（HPLC）—二极管阵列检测器（DAD）鉴定了其中主要成分，通过对一系列色谱条件的优化，得到分离度良好，峰形较佳的指纹图谱，鉴定出腺苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素及美迪紫檀素5个成分，为研究红芪乙醇提取物中发挥主要作用的成分奠定了基础。本申请不仅通过研究10批不同产地红芪药材，进一步验证了红芪乙醇提取物抗肝纤维化的药效，同时深入研究了发挥该药效的红芪中的化学成分，方案清晰合理，结果良好，对于促进红芪药材资源的有效利用和产地经济的发展具有重大意义。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为红芪乙醇提取部位HPLC-DAD指纹图谱；

图2为对照品的HPLC-DAD指纹图谱；其中，1为腺苷；2为毛蕊异黄酮；3为芒柄花苷；4为芒柄花素；5为美迪紫檀素。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

一、药效学实验

1. 试验材料

1.1动物：昆明种小鼠，雄性，体重18-25g，兰州大学动物实验中心提供，合格证号：SCXK（甘）2013-0002。

1.2主要试剂：乙腈（分析纯，Merck）；娃哈哈纯净水；对照品腺苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素（购自中国药品生物制品检定研究院和上海顺勃生物工程有限公司，纯度>98%）秋水仙碱片（西双版纳药业有限责任公司，规格0.5 mg/粒）；四氯化碳（CCl4，天津市富宇精细化工有限公司）；花生油（山东鲁花集团有限公司）；谷草转氨酶试剂盒（ALT）、谷丙转氨酶试剂盒（AST）、总蛋白试剂盒（TP）、白蛋白试剂盒（ALB）（均购自南京建成生物制药公司）；10批甘肃省不同产地红芪药材，自采或购买，编号及来源见表1。经兰州大学药学院生药学研究所教授鉴定为多序岩黄芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.的干燥根。

表1 红芪药材来源

1.3主要仪器：Waters Alliance 2695 高效液相色谱仪, 包括2996 二极管阵列检测器，717自动进样器，Millennium 32 色谱工作站 (美国Waters公司)；中南大学中药色谱指纹图谱计算机辅助相似性评价软件（11.0）；旋转蒸发仪（N-1100，东京理化器械[株]独资工厂）；涡旋混匀器（XK96-B，姜堰市新康医疗器械有限公司）；550酶联免疫检测仪（美国Bio-Rad公司）；超声波清洗器（KQ3200BE数控，昆山市超声仪有限公司）；Sartorius BP211D电子天平（误差±0.00001，德国赛多利斯）；FA2104电子天平（误差±0.0001，上海市安亭电子仪器厂）。

1.4统计方法：所有试验数据以均数±标准差表示,用SPSS 13.0 统计软件包进行统计处理。采用单因素方差分析(ANOVA) 进行组间比较及各组均值的两两比较。

2. 试验步骤

2.1．红芪不同提取部位的制备：称取红芪500g，用2-10倍量的95%-50%乙醇回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压回收至无醇味，取残留液1/4浓缩至干，得红芪总提取物；剩余3/4移至分液漏斗，分别用与残留液体积相等的石油醚和乙酸乙酯萃取5次，分别合并上层石油醚液和乙酸乙酯液，浓缩至干，即为石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位；下层溶液浓缩至干，加入95%-50%乙醇，能溶于其中的即为乙醇提取部位。按照该步骤，依次得到红芪总提取物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、乙醇部位，根据各提取部位的出膏率换算小鼠的给药剂量。

2.2. 红芪不同提取部位的抗肝纤维化作用：取雄性昆明种小鼠84只，适应性饲养一周后，随机分为空白组、模型组、阳性对照组和4个红芪提取部位给药组，每组12只。除空白组外，其余各组均皮下注射40%四氯化碳花生油溶液诱发肝纤维化，0.1ml/10 g（首剂加倍），1次/5d，连续35天，即可形成肝纤维化。造模同时阳性对照组灌胃给予秋水仙碱片（0.6mg/kg/天），4个给药组灌胃给予各自提取部位（10g原药材/kg/天），空白组和模型组均给予生理盐水，剂量同上。末次给药后，摘眼球取血，静置离心后，分离出血清，按试剂盒说明测定ALT、AST、Tp、Alb、A/G各项指标；同时摘除小鼠肝脏，称重，计算肝脏指数。具体结果见表2。

表2 红芪不同提取部位对四氯化碳致小鼠肝纤维化的影响（）

注：与模型组比较，^*** p<0.001，^** p<0.01，^* p<0.05。

由表2可知，红芪乙醇提取部位对四氯化碳致小鼠肝纤维化有明显的抑制作用，与模型组相比各指标均具有显著性差异（p<0.001，p<0.01）。进一步选择10不同产地红芪乙醇提取部位来进行抗肝纤维化作用的研究，以期在大样本的基础上验证实验结果。

2.3. 不同产地红芪乙醇提取部位的抗肝纤维化作用：

取10批不同产地红芪，按“2.1”项下步骤制备乙醇提取部位。取雄性昆明种小鼠156只，随机分为空白组、模型组、阳性对照组和10 批红芪乙醇提取部位给药组，每组12只。各组实验方法和周期均同“2.2”项。具体结果见表3。

表3 不同产地红芪乙醇提取部位对四氯化碳所致小鼠肝纤维化的药效指标（）

注：与模型组比较，^*** p<0.001，^** p<0.01，^* p<0.05。

从表3可以看出，10 批不同产地红芪乙醇提取部位与模型组相比，综合6 个指标来看，大部分指标均具有极显著性差异（P<0.001），说明小鼠肝纤维化造模成功，红芪乙醇提取部位抗肝纤维化药效显著。

二、红芪乙醇提取部位的HPLC指纹图谱

1 色谱条件：色谱柱为Spursil C18 柱（250×4.6 mm，5μm）；流动相（梯度洗脱，A为乙腈，B为水，0-40 min:40%A； 40-75 min:60%A）；检测波长260 nm；流速为1.0 ml/min；柱温为25℃；进样量为20μl。

2 对照品溶液的制备：精密称取对照品腺苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素5.0mg,置于5ml容量瓶中，加甲醇定容分别制成1.0mg/ml的对照品储备溶液。取每个对照品储备溶液0.9ml,置于同一5ml容量瓶中，加甲醇定容，制成0.18mg/ml的对照品溶液

3 供试品溶液的制备：取红芪药材乙醇提取部位的干燥品0.5g，精密称定，加甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取过滤液，即得。

4 红芪乙醇提取部位HPLC指纹图谱色谱峰归属

分别精密吸取腺苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素对照品以及红芪乙醇部位供试品溶液，按照上述色谱条件进样并测定，结果见图1、图2。通过与对照品的保留时间及紫外吸收比较，红芪乙醇提取部位的HPLC-DAD指纹图谱中鉴定了1~5号峰分别为腺苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素。

实施例1

本发明的红芪乙醇提取物胶囊剂的制备方法为：

红芪药材粉碎后，用6倍量的50%乙醇回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压回收至无乙醇味，残留液移至分液漏斗，分别用与残留液相等体积的石油醚和乙酸乙酯萃取5次后，将下层溶液浓缩至干，加入50%乙醇，溶解，过滤，去除不溶物，浓缩后60℃以下干燥，加80%乙醇制颗粒，装1号胶囊（装量为0.1g-1.0g），得到红芪乙醇提取物的胶囊剂。

实施例2

本发明的红芪乙醇提取物胶囊剂的制备方法为：

红芪药材粉碎后，用2倍量的95%乙醇回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压回收至无乙醇味，残留液移至分液漏斗，分别用与残留液相等体积的石油醚和乙酸乙酯萃取5次后，将下层溶液浓缩至干，加入95%乙醇，溶解，过滤，去除不溶物，浓缩后60℃以下干燥，加60%乙醇制颗粒，装1号胶囊（装量为0.1g-1.0g），得到红芪乙醇提取物的胶囊剂。

实施例3

本发明的红芪乙醇提取物胶囊剂的制备方法为：

红芪药材粉碎后，用5倍量的70%乙醇回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压回收至无乙醇味，残留液移至分液漏斗，分别用与残留液相等体积的石油醚和乙酸乙酯萃取5次后，将下层溶液浓缩至干，加入70%乙醇，溶解，过滤，去除不溶物，浓缩后60℃以下干燥，加75%乙醇制颗粒，装1号胶囊（装量为0.1g-1.0g），得到红芪乙醇提取物的胶囊剂。

实施例4

本发明的红芪乙醇提取物口服液的制备方法为：

红芪药材粉碎后，用2倍量的95%乙醇回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压回收至无乙醇味，残留液移至分液漏斗，分别用与残留液相等体积的石油醚和乙酸乙酯萃取5次后，将下层溶液浓缩至干，加入95%乙醇，能溶于其中的即为红芪乙醇提取液。将提取液浓缩至无醇味的浸膏，向浸膏中加甜味剂和矫味剂，再加入水制得每1ml液体相当于0.01-1g红芪乙醇提取物饮料。

实施例5

本发明的红芪乙醇提取物口服液的制备方法为：

红芪药材粉碎后，用6倍量的70%乙醇回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压回收至无乙醇味，残留液移至分液漏斗，分别用与残留液相等体积的石油醚和乙酸乙酯萃取5次后，将下层溶液浓缩至干，加入70%乙醇，能溶于其中的即为红芪乙醇提取液。将提取液浓缩至无醇味的浸膏，向浸膏中加甜味剂和矫味剂，再加入水制得每1ml液体相当于0.01-1g红芪乙醇提取物饮料。

实施例6

本发明的红芪乙醇提取物口服液的制备方法为：

红芪药材粉碎后，用10倍量的50%乙醇回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压回收至无乙醇味，残留液移至分液漏斗，分别用与残留液相等体积的石油醚和乙酸乙酯萃取5次后，将下层溶液浓缩至干，加入50%乙醇，能溶于其中的即为红芪乙醇提取液。将提取液浓缩至无醇味的浸膏，向浸膏中加甜味剂和矫味剂，再加入水制得每1ml液体相当于0.01-1g红芪乙醇提取物饮料。

实施例7

本发明的红芪乙醇提取物片剂的制备方法为：

红芪的提取方法同实施例1及4，将红芪乙醇提取液浓缩至无醇味的浸膏后，冷冻干燥，加药物制剂常用的润滑剂、崩解剂，压片，制片剂。

实施例8

本发明的红芪乙醇提取物颗粒剂的制备方法为：

红芪的提取方法同实施例1及4，将红芪乙醇提取液浓缩至无醇味的浸膏后，冷冻干燥，加药物制剂常用的润湿剂、稀释剂，制颗粒剂。

实施例9

本发明的红芪乙醇提取物胶囊剂的制备方法为：

红芪的提取方法同实施例1及4，将红芪乙醇提取液浓缩至无醇味的浸膏后，冷冻干燥，加药物制剂常用的润湿剂、稀释剂，制颗粒，装1号胶囊（装量为0.1g-1.0g）。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.红芪乙醇提取物在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用；所述红芪乙醇提取物的制备方法为：用2-10倍量的95%-50%乙醇回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压回收至无乙醇味，将残留液依次用与残留液体积相等的石油醚和乙酸乙酯萃取5次后，将下层溶液浓缩至干，加入95%-50%乙醇，能溶于其中的即为红芪乙醇提取物。

2.一种预防和治疗肝纤维化药物，其特征在于：所述药物的有效成分为红芪乙醇提取物；所述红芪乙醇提取物的制备方法为：用2-10倍量的95%-50%乙醇回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压回收至无乙醇味，将残留液依次用与残留液体积相等的石油醚和乙酸乙酯萃取5次后，将下层溶液浓缩至干，加入95%-50%乙醇，能溶于其中的即为红芪乙醇提取物。

3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于：所述药物的剂型为溶液剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、冻干粉剂、贴剂、凝胶剂、膜剂、酒剂或浸膏剂。