CN102233077A

CN102233077A - 一种药物组合物在制备提高ampk酶活性的药物中的应用

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Publication number: CN102233077A
Application number: CN2010101563320A
Authority: CN
Inventors: 仝小林; 甄重; 周水平
Original assignee: Tianjin Tasly Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Tianjin Tasly Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2010-04-27
Filing date: 2010-04-27
Publication date: 2011-11-09

Abstract

本发明属于药学领域，涉及一种药物组合物在制备提高AMPK酶活性的药物中的应用，其中所述药物组合物由下列重量份的中药原料药为组方配制而成：天花粉5-40份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5-20份。

Description

一种药物组合物在制备提高AMPK酶活性的药物中的应用

技术领域

本发明属于药学领域，涉及一种药物组合物在提高AMPK酶活性药物中的应用。

背景技术

2型糖尿病(T2DM)是严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。国际糖尿病联合会(IDF)2006发表的统计数据显示，在过去20年，全球糖尿病患者人数从3000万剧增到2.3亿。世界卫生组织专家预计，到2025年全球糖尿病患者将达到3.5亿。印度、中国、美国依次为全球糖尿病患者数量最多的三个国家，估计中国糖尿病患者总人数近4000万，仅次于印度，居世界第二位，占世界的29.63％。T2DM的防治在可预见的相当长时期内都将是人类面临的严峻挑战。

2型糖尿病也叫成人发病型糖尿病，多在35～40岁之后发病，占糖尿病患者90％以上。2型糖尿病病友体内产生胰岛素的能力并非完全丧失，有的患者体内胰岛素甚至产生过多，但胰岛素的作用效果却大打折扣，因此患者体内的胰岛素可能处于一种相对缺乏的状态。可以通过某些口服药物刺激体内胰岛素的分泌。但到后期仍有部分病人需要像1型糖尿病那样进行胰岛素治疗。2型糖尿病大致具有以下3个特点：第一个特点，2型糖尿病好发于成年人，尤其以中老年人为多。多次糖尿病流行病学研究结果都表明，2型糖尿病发病的年龄多在40-60岁，从40岁起，患病率逐渐增加，到老年期达到高峰。青年发病的成年型糖尿病相对来说，还是十分少见的。第二个特点是病情一般比较缓和、隐蔽，也就是说与1型糖尿病相比，不那么来势汹汹。2型糖尿病病人症状不明显，不见得每个患者都有喝得多、尿得多、吃得多的表现，多数人也没有显著的消瘦，当然体力和体重不同程度地下降还是比较常见的。第三个特点就是患者往往不需要靠胰岛素治疗来维持生命。也就是说，患者不打胰岛素也不至于很快就发生酮症酸中毒而危及生命。所以，2型糖尿病原来又叫非胰岛素依赖型糖尿病。2型糖尿病病人有时也需要使用胰岛素治疗，但多数是因为血糖控制不理想，或者是因为发生了急性并发症或者糖尿病的慢性并发症较重，而不像1型糖尿病病人那样是为了维持生命。

2型糖尿病是比1型糖尿病更为复杂的疾病，特别是在早期体内胰岛素仍然能自我产生时却更容易治疗。由于早期症状轻微(如无酮症酸中毒和昏迷等)且多散发，因此2型糖尿病多在病情进展多年后方被诊断。然而，2型糖尿病的控制不当会导致诸如肾衰、失明、伤口愈合慢、动脉病(包括冠状动脉疾病)等严重的并发症。

2型糖尿病患者其主要特征为胰岛素抵抗，相对胰岛素缺乏和高血糖；肝脏葡萄糖产量的增加(如来源于肝糖原的降解)，特别是在不当时机的增加(典型的原因是胰岛素水平紊乱，而胰岛素的作用之一正是调控肝脏此功能)；肌肉和脂肪组织(主要)中胰岛素介导的葡萄糖转运的减少(受体和受体后途径缺陷)；胰岛β细胞功能受损——缺失了高血糖水平刺激时早期胰岛素释放的功能。

中医药能在糖尿病治疗中起到更积极的作用。《素问·奇病论》：“……此五气之溢也，名日脾瘅。夫五味入口，藏于胃，脾为之行其精气，津液在脾，故令人口甘也。此肥美之所发也，此人必数食甘美而多肥也，肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴”。仝小林教授结合临床流行病学研究，提出由土壅木郁所致中满内热为(肥胖)T2DM基本病机，开郁清热为其基本治法，经过长期临床确立开郁清热方药并确认了开郁清热法的临床疗效，在整体水平、组织细胞水平和分子水平初步阐述了其作用机理，包括减轻甘油三酯的异位沉积，提高受体数目和结合力，影响胰岛素信号转导***等。

开郁清热方药的糖敏灵是一种治疗糖尿病的中药复方药物，由天花粉、柴胡、枳实、生大黄等中药制成。经与安慰剂对照发现，糖敏灵降低糖化血红蛋白明显优于安慰剂，糖敏灵不仅能显著改善胰岛素抵抗，还有明显的修复和保护胰岛细胞功能的作用。此外，糖敏灵对糖尿病患者有很好的降糖降脂效果，对于脂质代谢紊乱有较好的调节作用。

一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)在能量平衡的调节中起重作用。AMPK能感受细胞的能量状态，当细胞内AMP/ATP比率升高时AMPK被激活，通过磷酸化效应蛋白或调控各种基因的表达调节能量代谢，关闭消耗能量的合成代谢途径(如胆固醇、脂肪合成)，激活产生ATP的分解代谢途径(如脂肪酸氧化)，调节SERBP-1等下游系列因子限速酶活性，降低脂质在外周组织的沉积，改善脂质代谢。同时，AMPK活性降低是肥胖和2型糖尿病易感人群发生胰岛素抵抗的原发因素，而下丘脑的AMPK酶途径也参与摄食行为，因此，AMPK是治疗脂毒性、肥胖和2型糖尿病的关键靶点。

本发明对糖敏灵作了更加深入的研究，意外的发现糖敏灵能够提高AMPK酶活性，为糖敏灵新的治疗用途提供了依据。

发明内容

本发明目的在于提供一种药物组合物在制备提高AMPK酶活性的药物中的应用。

本发明所述的药物组合物(又称为糖敏灵制剂，开郁清热制剂)，由下列重量份的中药原料药为组方配制而成：天花粉5-40份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5-20份。

上述组方中还可以加入中药山楂，得到的配方为：天花粉10-30份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5-20份、山楂3-15份。

上述组方中还可以加入中药山楂，黄精，人参和苦瓜，得到的配方为：天花粉10-30份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄，1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5-20份、山楂3-15份、黄精3-15份、人参3-15份、苦瓜3-15份。

优选的本发明的配方为：天花粉9份、柴胡12份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅9份。

或：

天花粉30份、柴胡12份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅15份、山楂9份。

或：

天花粉30份、柴胡12份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅15份、山楂9份、黄精9份、人参9份、苦瓜9份。

以上组成中，重量是以生药计算的，份为重量份，若以克为单位，以上组成可制成药物制剂5-50个制剂单位，所述制剂单位指，制成的成品药物制剂，如制成固体制剂5-50单位，口服液5-50ml等。

以上组成可制成1-6次服用剂量的制剂，如作为片剂，制成18片，每次服用剂量可以是3-18片，共可服用1-6次。如作为颗粒剂，制成6袋，每次服用1-2袋，共可服用3-6次。

以上组成是按重量份作为配比的，在生产时可按照相应比例增大或减少，如大规模生产可以以公斤为单位，或以吨为单位，小规模生产也可以以毫克为单位，重量可以增大或者减小，但各组成之间的生药材重量配比的比例不变。

以上重量配比的比例是经过科学筛选得到的，对于特殊病人，如重症或轻症，肥胖或瘦小的病人，可以相应调整组成的量的配比，增加或减少不超过300％，药效不变。

以上组成中的单味中药，尤其是臣药和佐药，也可以被适当的具有相同药性的中药替换，替换后的中药制剂其药物作用不变。

本发明的中药组合物，是通过将上述配方组成的中药原料经过提取或其他方式加工，制成药物活性物质，随后，以该物质为原料，需要时加入药物可接受的载体，按照制剂学的常规技术制成的。所述活性物质可以通过分别提取中药原料得到，也可以通过共同提取中药原料得到，也可以通过其他方式得到，如：通过粉碎、压榨、煅烧、研磨、过筛、渗漉、萃取、水提、醇提、酯提、酮提、层析等方法得到、这些活性物质可以是浸膏形式的物质，可以是干浸膏也可以是流浸膏，根据制剂的不同需要决定制成不同的浓度。

本发明的中药组合物中的药物活性物质，其在制剂中所占重量百分比可以是0.1-99.9％，其余为药物可接受的载体。本发明的药物组合物，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每袋等。

本发明的中药组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、***剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。

本发明的中药组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。

适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。

可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。

口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或***胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。

对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。

本发明的中药组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明的组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次1-20剂，如：1-20袋或粒或片。

本发明的组合物是经过以下方法制备，具体步骤如下：

本发明所述糖敏灵制剂的制备方法为：(1)按比例取上述原料，(2)加入4倍量70-90％的乙醇，50-80℃减压回收乙醇，70-90℃真空干燥，粉碎过80目筛，得药物提取物；加入辅料制成任意种药剂学上可以接受的剂型。

本发明的药物组合物及其制备方法可参考中国专利CN1726929。

本发明其他最优选的制备方法在实施例中。

通过以下实验进一步说明本发明的药物组合物的治疗效果。

实验一糖敏灵对自发2型糖尿病大鼠糖、脂代谢的影响

1.材料与方法

1.1实验动物

以自发性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠和其同系非糖尿病对照鼠LETO鼠为实验对象。大鼠皆为雄性，OLETF 40只，LETO大鼠10只，四周龄，由日本大冢制药株式会社德岛研究所引进。

大鼠在无特定病原体级(SPF级，specific pathogen-free)条件下单笼饲养，饲以标准饲料。环境温度控制在22-25℃，湿度为55±5％，12/12小时光照黑暗循环(光照时间7:00-19:00)，自由获取食物和饮水。

饲养地点：中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心SPF级动物饲养房。

1.2分组及给药

1.2.1OLETF糖尿病诊断分组标准

大鼠定期行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。试验前隔夜禁食15小时、不禁水，按2g/kg予30％葡萄糖溶液灌胃(取葡萄糖粉82.5g，加蒸馏水定容至250ml，加热溶解为清亮液体，得到浓度为30％葡萄糖溶液)。

于空腹及糖负荷后30、60、90和120min取血，以德国内卡BIOSEN5030快速葡萄糖分析仪测定血糖值。血糖峰值＞16.7mmol/L和负荷后120min血糖＞11.1mmol/L诊为糖尿病，具备上述一条者为糖耐量减低。

1.2.2实验动物分组及给药

至30周时，共有成模OLETF鼠27只，随机分为模型组、罗格列酮组、糖敏灵组，LETO为空白对照组。

罗格列酮组：罗格列酮(文迪雅)：史克必成天津有限公司产品每片含马来酸罗格列酮4mg，购自由美国葛兰素史克(中国)投资有限公司，临用前搅拌至完全溶解，以蒸馏水稀释，给药剂量为3mg/kg/d^-1。

糖敏灵组(即：开郁清热组)，采用本发明实施例1的配方配制成浸膏，4℃冰箱保存，以蒸馏水稀释，灌胃剂量为9mg/kg/d^-1(按所含原药材量计算)。

模型组与空白组以等量蒸馏水灌胃，各组均灌胃给药12周，每日1次。

1.3实验方法

1.3.1实验动物摄食量

每周称量大鼠摄食量1次。每周给大鼠预投足量饲料，一周后称取余量(饲料余量称量时间为周一上午8点)。

1.3.2实验动物体质量

体质量：每周用电子计重器称鼠体质量并记录，称取时间为周一上午9:00。

1.3.3口服糖耐量试验

大鼠给药前及给药后每4周进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。试验前隔夜禁食15小时、不禁水，按2g/kg予30％葡萄糖溶液灌胃，空腹及糖负荷后30、60、90和120min剪尾取血，测定血糖。32周口服糖耐量实验时，同步目内眦取血，测定胰岛素。

血糖由德国内卡BIOSEN5030快速葡萄糖分析仪测定。

胰岛素测定用放免法(用Linco公司大鼠胰岛素专用药盒，专人同批测定)。

胰岛素、血糖曲线下面积计算(AUC)：采用近似梯形的计算公式，0-120min血糖AUC＝1/2(0min值+120min值)+30min值+60min值+90min值。

1.3.4血脂四项、血清游离脂肪酸、糖化血清蛋白检测

灌胃结束后，大鼠隔夜禁食12小时，次晨大鼠颈静脉取血2.5ml，离心取血清，-70℃保存备测。

甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。TC、LDL-C、HDL-C采用酶法，TG采用乙酰丙酮显色法，转氨酶，在日立-7150全自动生化分析仪上进行，由广安门医院检验科检测；糖化血清蛋白BecKmanCX-5全自动生化分析仪进行测定，样本为同一批测定。

1.3.5高胰岛素正葡萄糖钳夹试验

大鼠隔夜禁食，不禁水，称重后以2％的戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，仰卧位固定，麻醉显效后，切开颈部皮肤，钝性分离皮下组织及肌肉，分离暴露右侧颈总动脉和左侧颈内或颈外静脉，进行右侧颈总动脉和左侧颈内或颈外静脉插管，穿线结扎，固定(美国产硬膜外麻醉用硅胶导管，内径0.6mm，外径1mm)，并用含肝素50U/ml的生理盐水充满导管，保持其通畅。动脉插管以取血测血糖，静脉插管连接小三通管，出口端与静脉相连，两进口端分别与微电脑数字式微量注射泵连接以输注胰岛素及葡萄糖。插管完毕后，将大鼠静置30分钟后测定血糖。并同时对其进行保温。

胰岛素、20％葡萄糖分别用2个微电脑数字式微量注射泵由颈静脉泵入，血液标本由颈动脉导管获取。将静置30分钟的插管大鼠颈动脉导管所接的注射器取下，取血一滴，用微型血糖仪在30s内测定基础血糖值。

开始时先恒定输注短效猪胰岛素(输注速率为8mU/kg·min^-1，临用时胰岛素用0.5％牛血清白蛋白稀释)。每10分钟测定血糖一次，当血糖值超出基础值±0.5mmol/L的范围时，即开始输注浓度为20％葡萄糖，调整葡萄糖输注速度(即葡萄糖输注率，GIR)，使血糖值控制在基础值±0.5mmol/L的范围左右，如果血糖值超出基础值±0.5mmol/L的范围，即可继续输注葡萄糖。输注葡萄糖后仍每10分钟测一次血糖，并根据血糖值在最短的时间内调整葡萄糖输注率，使血糖恢复到基础值±0.5mmol/L的范围内。如此反复进行，当连续三次血糖值均稳定在上述范围内，即达到稳定状态。将钳夹的处于稳态的三个GIR值(单位为mg·kg^-1·min^-1)求平均值。该指标用于判断是否存在IR及IR的程度。

1.3.6大鼠胰腺组织的采集和处理

高胰岛素正葡萄糖钳夹试验结束后，即处死大鼠，打开腹腔，在脾、胃之间和十二指肠弯处游离胰腺，滤纸吸干水份后称重，沿胰腺纵轴切开，取胰尾部分组织置于冰盘上，迅速切成1mm³小块，4℃戊二醛固定，用于电子显微镜检测。

部分新鲜胰腺组织放入Bouins液固定，用于形态学检测；部分新鲜胰腺组织迅速置于冻存管内，液氮保存，用于分子生物学检测。

1.3.7大鼠肝脏组织的采集和处理

部分新鲜肝脏组织放入10％中性***溶液固定，用于形态学检测；部分新鲜肝脏组织迅速置于冻存管内，液氮保存，用于分子生物学检测。

1.3.8大鼠腹内脂肪的采集和处理

处死大鼠，取附睾、肠系膜、返折腹膜脂肪称重，计为内脏脂肪重量，并计算内脏脂肪重量占体重百分比；部分新鲜睾周脂肪放入10％中性***溶液固定，用于形态学检测。

1.3.9大鼠骨骼肌的采集和处理

部分新鲜腓肠肌组织放入10％中性***溶液固定，用于形态学检测；部分新鲜腓肠肌组织迅速置于冻存管内，液氮保存，用于分子生物学检测。

1.3.10大鼠骨骼肌及肝脏AMPK检测前期处理

分别取出实验动物肝脏、肌肉组织，并称重500毫克组织重量

放进预冷的15毫升锥形离心管

加入GENMED清理液(Reagent A)清洗

抽去清理液

移入到一个液氮冻存管

即刻放进液氮罐过夜

次日从液氮罐里取出，即刻用研磨棒碾碎组织成粉末状

放进一个15毫升锥形离心管

加入置于冰槽里的GENMED裂解液(Reagent B)

强力涡旋震荡30秒，充分混匀

放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒

即刻放进4℃台式离心机离心10分钟

小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管，-80℃保存

1.3.11胰腺及肝脏HE染色步骤：

石蜡切脱蜡至水。

蒸馏水冲洗5分钟。

切片入Harris苏木素15分钟。

流水冲洗5分钟。

0.5％盐酸酒精分化30秒

流水冲洗10分钟。

伊红染色10分钟。换两遍自来水。

梯度酒精脱水，二甲苯I、II透明封片

1.3.12统计方法

采用SPSS16.0软件作统计分析，实验数据计量资料以均数±标准差

表示，服从正态分布的两组间均数比较用t检验进行统计，同批次多组间比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，两两比较采用最小显著差法(LSD)。

2.结果

2.1实验动物一般情况

OLETF大鼠较LETO肥胖，活动迟缓、懒动、毛色干枯无光泽。

实验期间取血意外死亡动物5只，其中OLETF 3只，LETO 2只。

2.2大鼠摄食量比较

实验周期内，模型组、开郁清热组、罗格列酮组摄食量比较无明显差异，三组摄食量均高于LETO组(P＜0.05)。

表1实验大鼠摄食量比较

注：同周龄比较，模型组与正常组比较^##P＜0.01，^#P＜0.05；治疗组与模型组比较^**P＜0.01，^*P＜0.05

2.3大鼠体质量的比较

如表2所示，实验周期内，模型组、开郁清热组及罗格列酮组体质量均显著高于LETO组(p＜0.01)，开郁清热组体质量明显低于模型组与罗格列酮组(p＜0.05)

表2实验大鼠体质量的变化

2.4大鼠腹腔脂肪含量的比较

42周剖杀结果显示，模型组腹内脂肪含量较LETO组明显增加(P＜0.05)，开郁清热组较模型组减少(P＜0.05)，罗格列酮组较模型组增加(P＜0.05)，见表3，这种体重和腹脂含量的变化可能与胰岛功能恢复，血糖水平下降有关。

表342W实验大鼠腹内脂肪含量、脂体比的比较

2.5大鼠口服糖耐量试验葡萄糖水平的变化

如表4所示，模型组与LETO组在治疗前后的AUC始终差异明显(P＜0.01)。随病程进展，模型组AUC逐渐上升，两治疗组与模型组比较AUC下降，实验结束时，开郁清热组与罗格列酮组AUC均明显低于模型组(P＜0.01)，罗格列酮组稍低于开郁清热组，但这种差异没有统计学意义。

表442W各组OGTT各时点血糖(mmol/L)及AUG(mmol·min/L)变化

注：AUC，同周龄比较，与正常组比较##P＜0.01，#P＜0.05；与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05；开郁清热组与罗格列酮组比较^△△P＜0.01，^△P＜0.05

2.6实验大鼠胰岛素分泌功能的变化

大鼠口服糖耐量试验同步测胰岛素分泌及曲线下面积的变化，模型组OGTT同步胰岛素曲线下面积大于LETO组，结合正糖钳夹实验结果，提示模型组存在着较明显的胰岛素抵抗，经开郁清热中药以及罗格列酮治疗后，两组胰岛素曲线下面积显著增加，提示两组对胰岛B细胞胰岛素分泌功能有较好的改善作用。如表5所示

表542W各组OGTT各时点胰岛素(ng/ml)及AUC(ng·min/ml)变化

注：AUC，同周龄比较，与正常组比较##P＜0.01，#P＜0.05；与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05

42W时通过0GTT同步的胰岛素释放试验，我们计算了胰岛素分泌指数(ΔI30/ΔG30)，结果显示模型组较LETO明显下降，而开郁清热与罗格列酮组较模型组明显上调，开郁清热组优于罗格列酮。如表6所示

表642W实验各组胰岛素分泌指数比较(ng/mmol)

注：与正常组比较##P＜0.01，#P＜0.05；与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05；

2.7实验各组高胰岛素正葡萄糖钳夹试验结果比较

如表7所示，模型组大鼠稳态葡萄糖输注率较LETO组显著下降，(P＜0.01)，表明模型大鼠具有明显的胰岛素抵抗，中药组和西药组干预治疗后葡萄糖输注率均显著提高(P＜0.01)，显示二者均具有良好的改善胰岛素抵抗的作用。

表742W实验各组高胰岛素正葡萄糖钳夹试验结果

注：与正常组比较##P＜0.01，#P＜0.05；与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05

2.8实验各组血脂变化情况

模型组的甘油三酯水平极显著增高，胆固醇、游离脂肪酸水平明显增高，与文献记载相似，符合OLETF血脂变化特点，开郁清热中药具有明显的降低甘油三酯的作用，对胆固醇、游离脂肪酸亦有统计学意义的下降，显示具有较好的调脂作用。如表8所示

表842W实验各组血脂情况比较

3小结

3.1OLETF-符合西医糖尿病诊断，体现中医病机特征的动物模型

经30周左右时间饲养，部分OLETF大鼠血糖明显升高，经口服糖耐量试验，部分大鼠血糖峰值＞16.7mmol/L和负荷后120min血糖＞11.1mmol/L，达到糖尿病诊断标准，糖尿病模型成功。

3.2糖敏灵减轻体重，减少腹内脂肪含量

本实验观察到OLETF较LETO组体重、腹内脂肪堆积均明显增加。经12周治疗，糖敏灵减轻OLETF体质量，并减少腹内脂肪含量，与罗格列酮比较，体现出较大优势。

3.3糖敏灵有效改善糖、脂代谢水平

本实验的研究结果表明，糖敏灵可改善2型糖尿病模型大鼠的糖代谢异常，其降糖机理初步分析在于两方面：一是胰岛素抵抗的改善，我们用胰岛素敏感性评价的金标准进行判定，模型组大鼠存在明显的胰岛素抵抗，中药组和西药组胰岛素抵抗均明显改善，其葡萄糖输注率甚至大于正常对照组，中药组与模型组相比具有显著性差异，这与研究团队以往研究结果一致；二是胰岛细胞分泌功能的改善，结果显示，模型大鼠的胰岛素曲线下面积明显下降，中药组和西药组经治疗后明显提高。同时，中药组显著提高胰岛素分泌指数(ΔI30/ΔG30)，改善胰岛素分泌的模式。

糖敏灵还显示出较好的调脂作用，在减肥的同时改善了脂代谢。2型糖尿病糖、脂代谢紊乱是一个整体，二者相互联系，相互影响，因此在治疗上要从疾病的整体观念出发，全面考虑，避免单独降糖或降脂治疗，影响疗效，必须把降糖、调脂放在同等重要的地位，这对于控制糖尿病的进程，防治并发症的发生发展具有重要的意义。

实验二糖敏灵对自发2型糖尿病大鼠肝脏AMPK的影响

1.材料与方法

1.1实验动物(同实验一)

1.2分组及给药(同实验一)

1.3.实验大鼠肝脏标本的采集及HE染色(同实验一)

1.4.指标及检测

1.4.1肝脏AMPK活性定量测定

主要仪器：Herolab微型台式离心机、V-1800PC分光光度仪及比色皿

主要试剂：GENMED公司组织AMPK激酶活性比色定量检测试剂盒

1.4.1.1前期处理

分别取出实验动物新鲜肝脏组织，并秤重500毫克组织重量

放进预冷的15毫升锥形离心管

加入GENMED清理液(Reagent A)清洗

抽去清理液

移入到一个液氮冻存管

即刻放进液氮罐过夜

次日从液氮罐里取出，即刻用研磨棒碾碎组织成粉末状

放进一个15毫升锥形离心管

加入置于冰槽里的GENMED裂解液(Reagent B)

强力涡旋震荡30秒，充分混匀

放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒

即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g

小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管，-80℃保存

测定准备

准备好待测样品(例如细胞裂解悬液等)，置于冰槽里

设定好分光光度仪(温度为30℃)：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次(共5分钟)，并置零

1.4.1.2背景对照测定

移取GENMED缓冲液(Reagent C)到新的比色皿

加入GENMED酶促液(Reagent D)

加入GENMED阴性液(Reagent G)

放进30℃培养箱里静置2分钟

分光光度仪，置零

取出比色皿

1.4.1.3样品测定

移取GENMED缓冲液(Reagent C)到新的比色皿

加入GENMED酶促液(Reagent D)

加入5微升待测样品，放进30℃培养箱里静置2分钟

加入GENMED反应液(Reagent E)

加入GENMED底物液(Reagent F)

上下倾倒数次，混匀(限定在3秒之内)

即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数：

340波长读数0分钟-340波长读数5分钟

依照公式，计算AMPK酶活性定量指数

1.4.2实时荧光定量PCR法检测肝脏SREBP-1的mRNA表达

主要仪器

GeneAmp 5700TaqMAN PCR仪美国Applied Biosystems公司

凝胶图像分析仪ImageMaster VDS美国pharmacia Biotech公司

高速冷冻离心机德国BACKMAN公司Allagra.21R Centrifcige

紫外线分光光度计德国BACKMAN公司DU640型

电泳仪北京六一仪器厂OYY-III-5型

主要试剂：

Trizol(Invitrogen)

RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)

SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)

引物采用primer premier5.0设计，由赛百盛公司合成。

1.4.2.1从组织中提取总RNA

●取约100mg组织加1ml Trizol后，研磨至组织完全破碎、液体粘稠，室温放置5分钟，使其充***解。

●按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，摇匀15秒，室温放置15分钟。

●4℃12000g离心15分钟。

●吸取上层水相，至另一个预冷的离心管中。

●按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇(预冷)混匀，室温放置5-10min。

●4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

●按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇(预冷)，温和震荡离心管，悬浮沉淀。

●4℃7500g离心5min，尽量弃上清。

●室温晾干5-10min。

●用50μl RNase-free H₂O，溶解RNA样品，55-60℃10min。

●测OD值定量RNA浓度。

1.4.2.2分光光度法测定核酸的浓度

带氩灯的分光光度计，使用前预热稳定15分钟。

●吸取6μl RNA样品，加水至1.5ml混匀后，转入分光光度计的石英比色杯中。

●分光光度计先用1ml水校正零点。

●在260nm和280nm分别读出光密度，RNA样品的浓度为：OD260*核酸稀释倍数*40/1000；浓度单位为μg/μl。

1.4.2.3RNA样品反转录

●取出RNA模板、试剂，于室温融化后，立即放在冰浴中，混旋器上混匀，短暂离心。

●模板变性：

Template RAN x ul(5.0ug)

Oligo(dT)₁₈primer 0.5ug/ul 1.0ul

DEPC处理过的水至 12.0ul

混匀，短暂离心，70℃温浴10分钟，立即放在冰浴中至少1分钟。

●配制反应混合液(每管按下述量配制)

5×reaction buffer 4.0ul

10mM dNTP Mix 2.0ul

RNase Inhibitor(20U/ul) 1.0ul

混合液配制量为样品数N+2。

●每管加7.0uL的上述混合液混匀。37℃温浴5分钟。

●每管加入1.0uL M-MuLV Reverse Transciptase(200u/uL)，42℃温浴60分钟，70℃温浴10分钟。-20℃保存备用。

1.4.2.4荧光定量PGR检测

●引物及试剂

SYBR Green PCR Master Mix：ABI(Applied Biosystems)，Catalog No.43049155

引物序列：

β-actin-FP：5’-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3’

β-actin-RP：5’-AAT GTC ACG CAC GAT TTC CC-3’扩增片段为263bp。

SREBP：扩增片段为168bp

上游：5′-CGC TAC CGT TCATCTATC AAT G-3′

下游：5′-ACTTCG CAG GGT CAG GTT CT-3`

●引物稀释：将引物按终浓度10pmol/ul进行稀释，具体方法为：V(ul)＝O.D.值×33ug/10M(V＝所需DEPC处理水体积，M＝引物分子量)

●反应混合液的配制：

取出2×Buffer，RNase-free water，cDNA放在室温中，融化，立即放在冰浴中，混旋器上混匀，短暂离心。

每人份混合液(反应体系V＝25ul)所含试剂见下表

Component Volnme

2×SYBR Green PCR Master Mix， 12.5ul

xxx-F primer(10pmol/ul) 1ul

xxx-R primer(10pmol/ul) 1ul

Nuclease-free H₂O 8.5ul

Total Volume 23ul

配好混合液后，每个反应管中加入23ul混合液。

●加样：每个反应管加入2.0ul cDNA模板，混旋器上混匀，短暂离心(小于5sec)。

●在GeneAmp 5700荧光定量PCR仪进行，反应条件如下：

95.0℃：10min

72.0℃：50sec

72.0℃：5min

以上反应设定均在与PCR仪相连的计算机上进行，每个循环电脑自动记录反应管中的荧光信号值，并描绘曲线。反应结束由PE 5700软件分析结果，自动计算定量数值。

实验结果以内参基因与目的基因的Ct值比值作为目的基因的mRNA相对表达量，(因为Ct值与实际表达量成反比关系，为了直观，我们在分析数据时将目的基因与Beta-actin的Ct值比值取倒数，也就是Beta-actin与目标基因的Ct值比值作为其mRNA的相对表达量)

1.4.3免疫组化法检测肝脏SREBP-1蛋白表达

仪器：各种常规试剂及设备由中日友好医院临床研究所中心实验室提供。超低温冰箱ULTRA LOW-70℃，日本SANYO公司；樱花平推式切片机，日本SAKURA PTERATOMECRM-440；展片器，日本SAKURA Slide warner PS-53；旋转式自动脱水机，日本SAKURATissue-Tek Tissue processor；组织包埋机，日本SAKURA Tissue-Tek TECTM5SMC1-042-SO

试剂：SREBP-1兔抗鼠一抗抗体，Santa Cruz Biotechnology公司产品；二抗为EnVisionTM***；DAB显色液(所有常规试剂均为丹麦DAKO公司产品)。

1.4.3.1固定、脱水、透明、浸蜡、包埋

新鲜组织固定后，梯度酒精脱水(75％酒精1小时→80％酒精1小时→90％酒精1小时→95％酒精1小时→100％酒精1小时→100％酒精1小时→二甲苯45分钟→二甲苯45分钟)，最后浸蜡包埋成蜡块。

1.4.3.2切片处理

载玻片处理：新购载玻片经洗浸泡24-48小时，流水冲洗2-3小时，蒸馏水浸泡1小时，60℃烤箱烤干，浸泡于新配制的铬酸明胶液，浸湿后捞出，自然干燥备用。

在石蜡切片机上将蜡块切成4微米厚的切片，将组织片移入40℃的恒温热水容器中，待组织片完全展开后，附于载玻片上，平放在展片器上，裱好的切片56℃恒温箱过夜，取出备用。

1.4.3.3免疫组化染色步骤：

脱蜡，水化组织切片。

蒸馏水漂洗，

滴加0.3％H₂O₂阻断内源性过氧化物酶，孵育15分钟。

蒸馏水漂洗，置于TBS中5分钟共3次。

一抗孵育2小时

蒸馏水漂洗，置于TBS中5分钟共3次

滴加EnvisionTM孵育60分钟。

TBS漂洗5分钟共3次。

色源DAB溶液显色3分钟，蒸馏水终止显色。

梯度酒精脱水，封片胶封片。

显微镜下观察结果。

实验时同时设阴性对照，采用TBS代替一抗作为空白阴性对照。肝细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性。

1.4.3.4图像分析

肝脏的SREBP的染色及定量：采用中国中医研究院分子免疫室的医学图像分析***分析，每张切片选5个视野，每组至少选8张切片，测定每个视野中染色阳性区域的总面积代表该物质细胞的数量，测量平均光密度(MOD)值代表单位面积细胞该物质的表达量，最后以每组的均值比较。

1.4.4统计学处理

由SPSS16.0统计软件包完成，计量资料用均数±标准差

表示，同批次多组间比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，两两比较采用最小显著差法(LSD)。

2结果

2.1实验大鼠脂代谢的比较(见实验一)

2.2实验各组肝脏脂质异位沉积情况

正常对照组(LETO)：汇管区小动脉、小静脉及胆管结构正常，肝细胞为单核或双核，胞浆粉染，颗粒大小均匀一致。

模型组：肝索排列紊乱，无放射状排列，胞浆内大量大小不等的脂滴；一些肝细胞核则被脂肪滴挤得明显偏位。

罗格列酮组：光镜下脂肪变，肝细胞肿胀不明显，部分细胞内有细小脂滴。

本发明的开郁清热组：肝细胞脂肪变不明显，肝小叶和肝血窦结构清晰，细胞结构较完整。

2.3、实验大鼠肝脏AMPK活性定量的变化

经GENMED试剂盒测定，与LETO大鼠相比较，模型组AMPK酶活性明显降低，开郁清热组与罗格列酮较模型组显著上升。如表9所示

表9各组大鼠肝脏AMPK活性定量比较

本发明通过上述实验证明药品糖敏灵通过调节肝脏AMPK酶活性，从而改善2型糖尿病人脂代谢水平，降低脂质在外周组织的沉积，达到治疗和预防2型糖尿病的作用。

另外，糖敏灵通过调节下丘脑的AMPK酶，从而控制摄食行为。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限制。

实施例1、本发明的糖敏灵胶囊的制备

取天花粉30g、柴胡12g、枳实9g、生大黄3g，半夏6g、黄芩9g、黄连6g、白芍9g、乌梅15g、山楂9g、黄精9g、人参9g、苦瓜9g；

加入4倍量80％的乙醇，60℃回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，70℃加压回收乙醇，80℃真空干燥，粉碎过80目筛，得药物提取物；

加入乳糖制成胶囊。

实施例2、本发明的糖敏灵片剂的制备

加入糊精制成片剂。

实施例3、本发明的糖敏灵颗粒剂的制备

60℃鼓风干燥，制粒，整粒，即得颗粒剂。

实施例4、本发明的糖敏灵滴丸的制备

加入的聚乙二醇，混合均匀，熔融，上滴丸机，制成滴丸。

实施例5、本发明的糖敏灵口腔崩解片的制备

加入5％交联聚维酮，0.1％的硬脂酸镁，50％的微晶纤维素，用适量乙醇溶液制成软材，制粒，60℃鼓风干燥，制粒，整粒，压制成片，即得口腔崩解片。

实施例6、本发明的糖敏灵胶囊剂的制备

加入适量淀粉，蔗糖和硬脂酸镁，制粒，装入胶囊，即得胶囊剂。

实施例7、本发明的糖敏灵片剂的制备

与淀粉，羧甲基纤维素钠、滑石粉混合均匀，制粒，压片即得片剂。

实施例8、本发明的糖敏灵口服液的制备

与糖浆4g、溶于100ml的纯净水中，均质，过滤，经过高温瞬时灭菌(135℃，4s)。无菌灌装、分装，制得口服液。

实施例9、本发明的糖敏灵口服液的制备

与糖浆5g、溶于100ml的纯净水中，均质，过滤，经过高温瞬时灭菌(135℃，4s)。无菌灌装、分装，制得口服液。

实施例10、本发明的糖敏灵胶囊的制备

取天花粉9g、柴胡12g、枳实9g、生大黄3g，半夏6g、黄芩9g、黄连6g、白芍9g、乌梅9g；

加入乳糖制成胶囊。

实施例11、本发明的糖敏灵胶囊的制备

取天花粉30g、柴胡12g、枳实9g、生大黄3g，半夏6g、黄芩9g、黄连6g、白芍9g、乌梅15g、山楂9g；

加入乳糖制成胶囊。

实施例12、本发明的糖敏灵片剂的制备

加入糊精制成片剂。

实施例13、本发明的糖敏灵片剂的制备

加入糊精制成片剂。

实施例14、本发明的糖敏灵颗粒剂的制备

60℃鼓风干燥，制粒，整粒，即得颗粒剂。

实施例15、本发明的糖敏灵颗粒剂的制备

60℃鼓风干燥，制粒，整粒，即得颗粒剂。

实施例16、本发明的糖敏灵滴丸的制备

加入的聚乙二醇，混合均匀，熔融，上滴丸机，制成滴丸。

实施例17、本发明的糖敏灵滴丸的制备

加入的聚乙二醇，混合均匀，熔融，上滴丸机，制成滴丸。

实施例18、本发明的糖敏灵口腔崩解片的制备

实施例19、本发明的糖敏灵口腔崩解片的制备

实施例20、本发明的糖敏灵胶囊剂的制备

实施例21、本发明的糖敏灵胶囊剂的制备

实施例22、本发明的糖敏灵胶囊剂的制备

实施例23、本发明的糖敏灵胶囊剂的制备

实施例24、本发明的糖敏灵胶囊剂的制备

实施例25、本发明的糖敏灵胶囊剂的制备

实施例26、本发明的糖敏灵粉针剂的制备

再加入葡萄糖4.5g、硫代硫酸钠0.9g和蒸馏水1ml，上述组分混合均匀后，冷冻干燥，分装，即得粉针剂。

实施例27、本发明的糖敏灵粉针剂的制备

实施例28、本发明的糖敏灵粉针剂的制备

上述实施例内的组分量可以根据生产需要同时扩大或缩小比例。

Claims

1.一种药物组合物在制备提高AMPK酶活性的药物中的应用，其中所述药物组合物由下列重量份的中药原料药为组方配制而成：天花粉5-40份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5-20份。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，药物组合物组方中还可以加入中药山楂，得到的配方为：天花粉10-30份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5-20份、山楂3-15份。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，药物组合物组方中还可以加入中药山楂，黄精，人参和苦瓜，得到的配方为：天花粉10-30份、柴胡10-30份、枳实3-15份、生大黄，1-6份，半夏1-12份、黄芩3-15份、黄连1-12份、白芍3-15份、乌梅5-20份、山楂3-15份、黄精3-15份、人参3-15份、苦瓜3-15份。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，药物组合物组方为：天花粉9份、柴胡12份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅9份。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，药物组合物组方为：天花粉30份、柴胡12份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅15份、山楂9份。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，药物组合物组方为：天花粉30份、柴胡12份、枳实9份、生大黄3份，半夏6份、黄芩9份、黄连6份、白芍9份、乌梅15份、山楂9份、黄精9份、人参9份、苦瓜9份。

7.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物通过调节肝脏AMPK酶活性，从而改善2型糖尿病人脂代谢水平。

8.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物通过调节肝脏AMPK酶活性，从而降低脂质在外周组织的沉积。

9.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物通过调节下丘脑的AMPK酶活性，从而控制摄食行为。

10.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物通过调节AMPK酶活性，治疗和预防2型糖尿病。