CN102220261A - 枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂的制备方法，其特征是它包括如下步骤：（1）制作种子培养液，分别制作含丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌的种子液，其中菌液浓度均为0.5×108至1.0×108CFU/ml；（2）制作联合培养基；（3）将步骤（1）中的枯草芽孢杆菌种子液按2%的比例加入到联合培养基，利用10%的稀盐酸或10%的氢氧化钠自动调控ph值在6.5-7.0，通气，搅拌，控制溶氧20-50%，37℃培养18-20小时，之后停止通气，继续搅拌培养2-4小时；（4）将步骤（1）中的丁酸梭菌种子液按照2%的比例利用蠕动泵加入到联合培养基中，35℃静置培养24-28小时得到枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂。将得到的微生态制剂与饲料按照0.5%混合，直接饲喂畜禽，有效降低畜禽的腹泻率及畜禽的死亡率，提高了产能并节约用药成本。
Description
技术领域
本发明涉及枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂的制备及其在畜禽养殖上的应用，具体涉及一种以枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌两种菌种为原料，利用二者在发酵过程中的协同关系，采用一次性发酵获得枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合益生菌制剂的联合制备方法及其在预防畜禽腹泻上的应用。
背景技术
枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性好氧菌，在生长过程中迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌生长；另外，枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与机体内的消化酶类一同发挥作用。文献报道，枯草芽孢杆菌孢子能够在肠道内复活，生长过程大量消耗周围环境中的氧气，促进肠道内益生菌（乳酸菌、双歧杆菌及丁酸梭菌等）的生长，同时抑制大肠杆菌、沙门氏菌等条件性病原菌。专利201010287464.7公开了一种抑制致病性大肠杆菌生长的复合微生态制剂及其制备方法，该方法是将枯草芽孢杆菌、乳酪杆菌和异常汉逊酵母菌分别培养，然后按一定比例混合。该方法的缺点是三种菌的发酵培养基需要单独灭菌，增加了能耗，而且降低了设备的利用率。由于对发酵过程对氧需求的差异，导致枯草芽孢杆菌与厌氧益生菌（如乳酸杆菌、双歧杆菌及丁酸梭菌等）的同时高效培养难以实现。专利200510136003.9公开了一种复合枯草芽孢杆菌和乳酸菌微生物制剂的制备方法，该方法将枯草芽孢杆菌及乳酸菌菌种同时置于联合培养基微好氧发酵，虽然该方法实现了好氧与厌氧菌的同时培养，但缺点是由于枯草芽孢杆菌是好氧菌，而乳酸菌是厌氧菌，微好氧对二者都是非最佳状态，不利于细菌的增值，影响最终产品的细菌含量，降低了生产效率，而且两种微生物同时培养，两者在最终产品的各自数量难于控制。
丁酸梭菌为革兰氏阳性厌氧杆菌，丁酸梭菌是调节肠道微生态平衡的有益菌， 其主要生物特性表现为：①促进肠道有益菌群(双歧杆菌， 乳酸杆菌) 的增殖和发育，抑制肠道内有害菌和腐败菌的生长、繁殖，纠正肠道菌群紊乱，减少肠毒素的发生；②在肠道内能产生B 族维生素、维生素K等物质，对机体具有保健作用；③丁酸梭菌的主要代谢产物丁酸是肠道上皮组织细胞的再生和修复主要营养物质，提高畜禽的饲料消化吸收率；④丁酸梭菌是厌氧芽孢杆菌， 稳定性好，在机体内不受胃酸、胆汁酸等影响，在体外（芽孢状态）室温下能保存三年以上。丁酸梭菌制剂被用作兽医药品，用来治疗畜禽肠道菌丛紊乱，提高生产力，取得了良好的效果。
目前已公开了多种丁酸梭菌的培养方法，但是，这些方法存在或者生产成本高、设备要求高，或者生产周期长，孢子转化率低等问题。首先，由于丁酸梭菌是一种厌氧菌，多数生产方法均需要在石蜡油、氮气或二氧化碳维持的厌氧环境中进行，仪器设备复杂昂贵，专利200610125586.X公开了一种丁酸梭菌活菌剂的生产方法，培养基需经过高压灭菌后经石蜡油维持厌氧环境45-60小时。专利200410068185.6公开了以蛋白胨、酵母浸膏粉及葡萄糖为主要成分的培养基培养嗜酸乳杆菌、粪肠球菌及丁酸梭菌，经混合后制成饲料添加剂用于畜禽养殖，其培养基消耗量大，成本昂贵。专利200610107225.2对丁酸梭菌与乳酸菌联合培养条件进行了研究，该工艺是将分别培养的种子培养液加到联合培养基中共同培养，由于涉及的两种微生物都是厌氧菌，因此操作比较简单，但采用葡萄糖作为培养基的主要碳源，同样存在价格昂贵的问题。如前所述，至于丁酸梭菌与好氧菌（如枯草芽孢杆菌）的联合培养方法更是鲜有报道。
枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌虽然在同时培养过程中由于对氧需求的差异性，导致培养难以实现，但是此种矛盾关系却为二者在体内协同发挥作用提供了基础。复合菌制剂进入消化道以后，一方面枯草芽孢杆菌消耗氧气为丁酸梭菌及其他厌氧益生菌提供厌氧环境，促进其生长和发挥功能；另一方面丁酸梭菌不仅如同一般厌氧益生菌通过产酸改善胃肠道Ph值，改善胃肠道微生态平衡，而且能进一步通过促进小肠绒毛发育提高畜禽胃肠道的消化吸收功能。因此，枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂比一般的益生菌菌剂更有利于维持畜禽胃肠道微生态平衡、促进其消化吸收功能及提高饲料消化吸收利用率。另外，枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌都属于芽孢杆菌，其芽孢具有耐高温及挤压等的特性，因此该复合菌剂能够耐受饲料高温制粒过程的高温及挤压等，可以直接添加于颗粒饲料中并且保证微生物的活性不受影响。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足（如多菌单独培养，最后混合，多次灭菌导致能耗增加或者多菌以非最佳条件同时联合培养导致生长速度受限等）而提供一种将好氧菌与厌氧菌联合发酵培养，以达到简化生产工艺，降低生产成本，提高发酵活菌总数，增强临床使用效果，进一步扩大使用用途的枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌联合培养方法，本发明的二菌联合发酵工艺，是一次性发酵获得复合益生菌，避免了生产中多次灭菌及混合的麻烦，减少了杂菌污染环节，降低了生产成本。所用菌株枯草芽孢杆菌来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号是：枯草芽孢杆菌CGMCC NO. 1.884；丁酸梭菌来自中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC其保藏编号是：丁酸梭菌NO. 10350，但不仅限于此菌株。
本发明的另一个目的是提供一种在畜禽饲养领域具有重要应用的枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂。
发明的目的是这样实现的：
本发明的具体工艺如下：
第一步，分别制作枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌的种子培养液，其中菌液浓度均为0.5×108-1.0×108CFU/ml。
第二步，制作联合培养基，具体为：高温豆饼粉1.8-3.5%、尿素0.1-0.3%、玉米浆0.1-0.5%、玉米淀粉0.5-1.0%、磷酸氢二钾0.1-0.5%、磷酸二氢钾0.1-0.5%、硫酸镁0.1-0.3%、硫酸锰0.01-0.05%。
第三步，将枯草芽孢杆菌种子液按2%的比例加入到联合培养基，利用10%的稀盐酸或10%的氢氧化钠自动调控ph值在6.5-7.0，通气，搅拌，控制溶氧20-50%，37℃培养18-20小时，之后停止通气，继续搅拌培养2-4小时。
第四步，将丁酸梭菌种子液按照2%的比例利用蠕动泵加入到联合培养基中，静置培养24-28小时。取样检测活菌总数，保证在1.0×109-5.0×109CFU/ml，观察菌体生长情况，以芽孢率达98%以上为标准。
第五步，将发酵液利用管式离心机离心，加入载体玉米芯，菌泥在40℃以下通风干燥，水分控制在5%，粉碎过100目钢筛，检测合格后，包装入库。
第六步，将得到的复合微生态制剂与饲料按照0.5%的比例混合，直接饲喂畜禽。
本发明具有如下积极效果：
1、联合培养与单独培养相比，只需对联合培养基进行一次灭菌，不必像单独培养那样需要分别进行灭菌，这样便会降低能耗且提高发酵装置的使用效率。
2、联合培养第一阶段枯草芽孢杆菌发酵末期，在停止通气的情况下，枯草芽孢杆菌会迅速耗尽培养基中残存的氧，为厌氧丁酸梭菌提供无氧环境，大大节约了用氮气或二氧化碳驱氧的原料及能耗成本。同时，枯草芽孢杆菌体内好氧过程能促进丁酸梭菌的生长和定植。
3、由于枯草芽孢杆菌在发酵过程中产生淀粉酶，因此我们可以选择相对廉价的淀粉作为联合培养基的碳源，这样便会降低生产成本。
4、通过联合培养，两株菌有足够的时间进行适用，互生共生，便于两株菌进入肠道之后协同发挥医疗作用。
5、枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌都属于芽孢杆菌，其芽孢具有耐高温及挤压等的特性，因此该复合菌剂能够耐受饲料高温制粒过程的高温及挤压等，可以直接添加于颗粒饲料中并且保证微生物的活性不受影响。
本发明通过枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌的联合发酵工艺，提高了发酵单位，缩短了发酵时间，降低了生产成本，增强了其在畜禽养殖上的效果，使产品具有更强竞争力。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
实施例1
1、分别制作枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌的种子培养液，其中菌液浓度均为5.0×108CFU/ml。
2、制作联合培养基，具体为：高温豆饼粉1.8%、尿素0.1%、玉米浆0.1%、玉米淀粉0.5%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%、硫酸锰0.01%。
3、将步骤1中的枯草芽孢杆菌种子液按2%的比例加入到联合培养基，利用10%的稀盐酸或10%的氢氧化钠自动调控ph值在7.0，通气，搅拌，控制溶氧20%，37℃培养20小时，之后停止通气，继续搅拌培养2小时。
4、将步骤1中的丁酸梭菌种子液按2%的比例利用蠕动泵加入到联合培养基中，35℃静置培养28小时。取样检测活菌总数，活菌总数为2.70×109CFU/ml，芽孢率为100%。
5、将发酵液利用管式离心机离心，加入载体玉米芯，在40℃以下通风干燥，水分控制在5%，粉碎过100目钢筛，检测合格后，包装入库。
实施例2
1、分别制作枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌的种子培养液，其中菌液浓度均为1.0×108CFU/ml。
2、制作联合培养基，具体为：高温豆饼粉2.5%、尿素0.2%、玉米浆0.3%、玉米淀粉0.7%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.2%、硫酸锰0.02%。
3、将步骤1中的枯草芽孢杆菌种子液按2%的比例加入到联合培养基，利用10%的稀盐酸或10%的氢氧化钠自动调控ph值在6.8，通气，搅拌，控制溶氧30%，37℃培养20小时，之后停止通气，继续搅拌培养2小时。
4、将步骤1中的丁酸梭菌种子液按2%的比例利用蠕动泵加入到联合培养基中，35℃静置培养26小时。取样检测活菌总数，活菌总数为3.18×109CFU/ml，芽孢率为99.1%。
5、将发酵液利用管式离心机离心，加入载体玉米芯，在40℃以下通风干燥，水分控制在5%，粉碎过100目钢筛，检测合格后，包装入库。
实施例3
1、分别制作枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌的种子培养液，其中菌液浓度均为0.5×108CFU/ml。
2、制作联合培养基，具体为：高温豆饼粉3.5%、尿素0.3%、玉米浆0.5%、玉米淀粉1.0%、磷酸氢二钾0.5%、磷酸二氢钾0.5%、硫酸镁0.3%、硫酸锰0.05%。
3、将步骤1中的枯草芽孢杆菌种子液按5%的比例加入到联合培养基，利用10%的稀盐酸或10%的氢氧化钠自动调控ph值在6.5，通气，搅拌，控制溶氧20%，37℃培养18小时，之后停止通气，继续搅拌培养2小时。
4、将步骤1中的丁酸梭菌种子液按2%的比例利用蠕动泵加入到联合培养基中，35℃静置培养24小时。取样检测活菌总数，活菌总数为4.36×109CFU/ml，芽孢率为98.6%。
5、将发酵液利用管式离心机离心，加入载体玉米芯，在40℃以下通风干燥，水分控制在5%，粉碎过100目钢筛，检测合格后，包装入库。
实施例4
枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂在预防初生仔猪腹泻上的应用
1、将实施例2得到的复合菌制剂与饲料按0.5%混合，直接喂食。
2、试验结果
实验对象为某商品猪的出生仔猪。
实验组：初生仔猪饲喂添加微生态制剂的饲料，不进行抗生素注射剂用药等方法的防控，其他的饲养管理按猪场的常规方法进行。
对照组：仔猪发生腹泻后注射抗生素及其它药物，并结合猪场的治疗管理给予一定的其他药物的治疗，日粮、营养成分及饲养管理等完全与实验组相同。
试验结果如表1：
结果表明：实验组与对照组相比，该复合微生态制剂可以有效预防仔猪的腹泻，并且降低用药成本。
实施例5
枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂在预防蛋鸡腹泻上的应用
1、将实施例2得到的复合菌制剂与饲料按0.5%混合，直接喂食。
2、试验结果
实验对象为某商品蛋鸡场的蛋鸡。
实验组：蛋鸡饲喂添加微生态制剂的饲料，不进行抗生素用药等方法的防控，其他的饲养管理按鸡场的常规方法进行。
对照组：蛋鸡发生腹泻后投放抗生素及其它药物，并结合鸡场的治疗管理给予一定的其他药物的治疗，日粮、营养成分及饲养管理等完全与实验组相同。
结果表明：实验组蛋鸡与对照组比较，腹泻率，死亡率大幅度降低，并且用药大幅降低，但是终末体重却明显提高，增加了经济效益。
Claims (6)
1.一种枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂的制备方法，其特征是它包括如下步骤：
（1）制作种子培养液，分别制作含丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌的种子液，其中菌液浓度均为0.5×108-1.0×108CFU/ml；
（2） 制作联合培养基，具体为：高温豆饼粉1.8-3.5%、尿素0.1-0.3%、玉米浆0.1-0.5%、玉米淀粉0.5-1.0%、磷酸氢二钾0.1-0.5%、磷酸二氢钾0.1-0.5%、硫酸镁0.1-0.3%、硫酸锰0.01-0.05%；
（3）将步骤（1）中的枯草芽孢杆菌种子液按2%的比例加入到联合培养基，利用10%的稀盐酸或10%的氢氧化钠自动调控ph值在6.5-7.0，通气，搅拌，控制溶氧20-50%，37℃培养18-20小时，之后停止通气，继续搅拌培养2-4小时；
（4）将步骤（1）中的丁酸梭菌种子液按照2%的比例利用蠕动泵加入到联合培养基中，35℃静置培养24-28小时得到枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌混合培养物。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂的制备方法，其特征是将枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌混合培养物利用管式离心机离心，加入载体玉米芯，菌泥在40℃以下通风干燥，水分控制在5%，粉碎过100目钢筛得到枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂。
3. 根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂的制备方法，其特征是步骤（3）培养结束后，联合培养基中的溶氧为零，包括芽孢在内的活菌总数保证在0.5×109-2.5×109CFU/ml。
4.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂的制备方法，其特征是步骤（4）联合培养培养结束后，取样检测活菌总数，保证在1.0×109-5.0×109CFU/ml，观察菌体生长情况，以98%以上菌体转化成芽孢为宜。
5.一种枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂的应用，其特征是将枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂在畜禽养殖上用作饲料添加剂。
6.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂的应用方法，其特征枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂以0.5%的比例与饲料混合，直接饲喂畜禽。
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