CN103283948A - 一种以两歧双歧杆菌为主的微生态制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以两歧双歧杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌作为菌种制备微生态制剂的方法，属于微生物技术领域，具体涉及分别以两歧双歧杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌作为菌种的液体厌氧发酵方法。它包括以下步骤：分别以两歧双歧杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌作为发酵菌种，接种于经过优化的液体培养基中，在温度为37~42℃的条件下培养12~16h，放罐并测定活菌数，分别用植物淀粉吸附发酵液，经干燥后粉碎，然后将三种菌粉按质量比为50-80∶10-30∶10-30的比例进行混合，制成活性稳定的微生态制剂。本发明的优点：用普通发酵罐即可完成高密度发酵，操作简单，效果稳定，能耗低；不用离心机和冷冻干燥机等设备，降低了生产成本，提高了生产效率。

Description

一种以两歧双歧杆菌为主的微生态制剂

技术领域

 本发明涉及微生物发酵工程领域，具体地说是一种液体培养基分别经两歧双歧杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌作为发酵菌种厌氧发酵制备益生菌饲料添加剂的方法。

 

背景技术

两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）形态很不一致的杆菌，0.5～1.3 μm×1.5～8μm，常呈弯、棒状和分支状。单生、成对、V字排列，有时成链，细胞平行成栅栏状，或玫瑰花结状。偶尔呈膨大的球杆状。革兰氏阳性，通常染色不规则。不运动，不产芽孢，抗酸染色阴性，厌氧生长，少数几个种可在含10%CO2的空气中生长。pH低于4.5和高于8.5时不生长。化能有机营养。发酵碳水化合物活跃，发酵产物主要是乙酸和乳酸，二者的摩尔比是3∶2；不产生CO2。不产生丁酸和丙酸。接触酶阴性。通常要求多种维生素。最适生长温度是37～41℃。两歧双歧杆菌具有以下治疗效果：（1）维护肠道正常细菌菌群平衡，抑制病原菌的生长，防止便秘，下痢和胃肠障碍等；（2）抗肿瘤；（3）在肠道内合成维生素、氨基酸和提高机体对钙离子的吸收；（4）降低血液中胆固醇水平，防治高血压；（5）改善乳制品的耐乳糖性，提高消化率；（6）增强人体免疫机能，预防抗生素的副作用，抗衰老，延年益寿。

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）属于乳酸杆菌属，革兰氏阳性菌，最适生长温度为30~37℃，兼性厌氧，在pH4.5~9.5生长，最适pH6.5左右。目前人们所食用的酸奶等乳酸菌制品多是动物性乳酸菌发酵而来的。然而植物性乳酸菌与动物性乳酸菌相比，耐酸和耐胆盐能力更强，且能在营养不均的恶劣环境下生存，所以进入人体肠道存活率更高，定植能力更强。故植物性乳酸菌制品在改善肠道环境、提高机体免疫力方面更有优势。作为饲料添加剂用于调节动物肠道菌群，抑制葡萄球菌和大肠杆菌，防止雏鸡、子猪下痢。或用于制作青贮饲料，产生低分子脂肪酸，降低pH值，提高粗蛋白含量，改善适口性。 　　嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）兼性厌氧或微好氧的革兰氏阳性菌，过氧化氢酶反应阴性，圆形或椭圆形，成对或成链状，不产芽孢，多不运动。嗜热链球菌为健康人肠道正常菌群，可在人体肠道中生长、繁殖。可直接补充人体正常生理细菌，调整肠道菌群平衡，抑制并清除肠道中对人具有潜在危害的细菌。

嗜热链球菌应用于动物饲料的功能：（1）改善肠道微环境：降低肠道pH值，促进肠蠕动防止病原菌定植，分泌细菌素抑制病原菌的生长；（2）调节血压：抑制胆固醇合成酶活性，降低血清中胆固醇含量，其菌发酵产物可以调节控制血压；（3）抗癌作用：生成的多糖、细菌素、乳酸等具有抗肿瘤活性的作用，通过激活机体免疫***，抑制细胞的突变来抵抗肿瘤的发生；（4）延缓衰老：产生超氧化物歧化酶（SOD）可以清除体内代谢过程中产生的过量超氧阴离子自由基，延缓衰老；（5）产乳酸：乳糖的降解需要一种特殊的酶，叫β-半乳糖苷酶。乳糖不耐症的人身体内就是缺乏了这一种酶，嗜热链球菌是一种能产生β-半乳糖苷酶的细菌，所以可以帮助乳糖的消化；（6）对胃酸、胆盐的耐受性：嗜热链球菌在PH=6.8的酸性溶液中的存活率是100%，在PH=4的酸性溶液中的存活率约是75%，在PH=3的酸性溶液中的存活率约是70%；嗜热链球菌能够在较高浓度的胆汁中生存，所以应该可以在体内免受胆汁的损害而到达小肠的远端。

将两歧双歧杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌分别经过高密度液体发酵，获得高菌体密度的发酵培养液，经植物淀粉吸附后，干燥，粉碎，按照一定比例混匀，制成的微生态制剂应用于畜牧养殖，能够调节动物肠道菌群平衡，提高抗病能力。

 

发明内容

本发明的目的是提供一种含有两歧双歧杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌微生态制剂的制备方法。

实现本发明目的的技术方案如下：

一种以两歧双歧杆菌为主的微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）配制培养基；

（2）溶解上罐的培养基，装上pH电极并调整pH值，然后将培养基装入发酵罐中；

（3）对发酵罐中的培养基加温灭菌；

（4）接种种子菌：在发酵罐降温后加入无机盐溶液，然后加入液体石蜡及接入种子菌；

（5）控温发酵；控制pH值和温度，在保温的状态下发酵；

（6）放罐并测定发酵液菌数；

（7）用玉米粉、小麦粉或者大豆粉及其组合物吸附发酵液；

（8）将吸附后的混合物干燥和粉碎，按照一定比例混匀，即获得粉状微生态制剂。

与现有技术相比，本发明的技术优势：

（1）直接利用普通发酵罐即可进行生产，操作简单，质量稳定，成本低廉，易于产业化生产；

（2）两歧双歧杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌微生态制剂

（3）产品发酵周期明显缩短，产品到达终点酸度或pH值的时间为12～14小时，产品成本与发酵污染风险降低:本发明由于生产周期缩短，生产成本降低，同时，发酵乳基料前期产酸较快、pH值下降迅速，能较好抑制杂菌污染，产品发酵失败风险大大降低；

（4）采用厌氧培养罐或通过持续通入二氧化碳或氮气维持其厌氧环境来进行，原料不能重复使用，操作较复杂，成本较高；用于隔绝空气的液体石蜡可以多次反复使用，大大降低了生产成本；

（5）本发明采用玉米粉、小麦粉和豆饼粉作为发酵培养基的主要成分，与其他发明采用的胰化蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏及其酶解产物等作为主要成分相比，成本大大降低，并且菌数含量明显提高，三种益生菌的发酵产物活菌浓度均可达1.0~2.5×10¹⁰ CFU/mL；

（6）本发明采用植物淀粉吸附发酵液，后处理工艺不需要用高速冷冻离心机，本发明将植物淀粉吸附混合物直接干燥和粉碎，包装后即制成产品，后处理工艺大大简化，生产成本更低；

（7）国内外有关粉末发酵剂的研制，大多采用真空冷冻干燥法，此方法的优点是菌体细胞存活率高，但是工艺复杂，制作成本高，而吸附后干燥法的生产成本低，操作工艺简单，较易用于大规模的工业化生产和推广应用，适合于我国饲料企业在现有设备条件下生产微生态制剂产品。

 

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为本发明的限制。

实施例1 一种以两歧双歧杆菌为主的微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：

   （1） 菌种的活化与增值：

本发明采用两歧双歧杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌作为发酵菌种，菌种均购于中国微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号分别是：两歧双歧杆菌CICC21712，植物乳杆菌ACCC11016，嗜热链球菌ACCC10651；从平板上挑取单菌落，分别接种到装有20mL MRS培养基（蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2~6.6，高温高压灭菌）的试管中，37℃深层静置培养14小时，菌液以2%的接种量接种到装有适当体积MRS培养基的三角瓶中，37℃深层静置培养14小时备用，菌种活化一般1~3次；若培养基灭菌后未立即使用，则需在沸水浴中加热10min驱氧后使用。

   （2）配制发酵培养基：

培养基包括的原料及重量份数为：玉米粉70，小麦粉20，豆饼粉10，葡萄糖10，酵母浸出粉1.5，蛋白胨3，原料当以克计，蒸馏水相应以mL计的份数为800~1000，溶解，加入发酵罐内进行121℃，时间为20分钟的高温高压灭菌，在发酵罐降温至35~45℃时，加入无机盐1.0g/1000mL基料，无机盐：CaCl₂ 0.02%，MgSO_4·7H₂O 0.04%，MnSO₄·H₂O 0.04%，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡至厚度为2cm。

（3）控温发酵：分别接入液体种子的接种量为4%，搅拌均匀，起始pH 6.4，发酵过程中控制 pH 6.0~6.8，发酵温度控制在37~42℃，发酵13个小时，放罐，将混合菌培养物进行菌落计数，经过这样发酵的活菌体浓度分别为：两歧双歧杆菌2.3×10¹⁰CFU/mL，植物乳杆菌2.1×10¹⁰CFU/mL，嗜热链球菌1.6×10¹⁰CFU/mL。

   （4）分别用植物淀粉吸附发酵液：以质量比为7:2:1的玉米粉、豆饼粉和小麦粉的混合物，作为发酵液的吸附剂来吸附发酵液。

   （5）将植物淀粉吸附的混合菌发酵液混合物进行烘干干燥，粉碎，两歧双歧杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌培养物的用量比为80∶10∶10混合均匀，制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。

 

实施例2  与上述实施例1不同的是：

（1）培养基配方：培养基包括的原料及重量份数为：玉米粉60，小麦粉25，豆饼粉15，葡萄糖15，酵母浸出粉2，蛋白胨4，原料当以克计，蒸馏水相应以mL计的份数为900，溶解，加入发酵罐内进行100℃，时间为30分钟的高温高压灭菌，在发酵罐降温至35~45℃时，加入无机盐1.3g/1000mL基料，无机盐的组成： MgSO_4·7H₂O 0.04%，MnSO₄·H₂O 0.04%，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡厚度为1cm。

（2）控温发酵：接入种子菌的接种量为3%，搅拌均匀，起始pH 6.3，控制 pH 6.0~6.8，发酵温度控制在37~42℃，发酵12个小时，放罐，将培养物进行菌落计数，经过这样发酵的活菌体浓度分别为：两歧双歧杆菌2.1×10¹⁰CFU/mL，植物乳杆菌2.0×10¹⁰CFU/mL，嗜热链球菌1.8×10¹⁰CFU/mL。

（3）用植物淀粉吸附发酵液：以等质量的玉米粉和小麦粉混合均匀，作为发酵液的吸附剂。

   （4）将植物淀粉吸附的发酵液进行烘干干燥，粉碎，两歧双歧杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌培养物的用量比为60∶20∶20混合均匀，制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。

Claims (6)

1.一种以两歧双歧杆菌为主的微生态制剂的制备方法包括以下步骤：

   （1） 菌种的活化与增值：

本发明采用两歧双歧杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌作为发酵菌种，菌种均购于中国微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号分别是：两歧双歧杆菌CICC21712，植物乳杆菌ACCC11016，嗜热链球菌ACCC10651；从平板上挑取单菌落，分别接种到装有20mL MRS培养基（蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2~6.6，高温高压灭菌）的试管中，37℃深层静置培养12~16小时，菌液以2%的接种量接种到装有适当体积MRS培养基的三角瓶中，37℃深层静置培养12~16小时备用，菌种活化一般1~3次；若培养基灭菌后未立即使用，则需在沸水浴中加热10min驱氧后使用；

   （2）配制发酵培养基：

培养基包括的原料及重量份数为：玉米粉40~70，小麦粉20~30，豆饼粉5~15，葡萄糖10~15，酵母浸出粉1~3，蛋白胨2~4，原料当以克计，蒸馏水相应以mL计的份数为800~1000，溶解，加入发酵罐内进行100~121℃，时间为10~30分钟的高温高压灭菌，在发酵罐降温至35~45℃时，加入无机盐0.7~1.5g/1000mL基料，无机盐选自CaCl₂ 、MgSO_4·7H₂O及MnSO₄·H₂O中的两种或者三种，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀，然后加入液体石蜡至厚度为1~2cm；

   （3）控温发酵：分别接入液体种子的接种量为2~4%，搅拌均匀，起始pH 6.4，发酵过程中控制 pH 6.0~6.8，发酵温度控制在37~42℃，发酵12~14个小时，放罐，将混合菌培养物进行菌落计数，经过这样发酵的三种菌活菌体浓度均可达1.0~2.5×10¹⁰CFU/mL；

   （4）分别用植物淀粉吸附发酵液：以玉米粉、豆饼粉或小麦粉，或者其任意组合，作为发酵液的吸附剂；

   （5）将植物淀粉吸附的混合菌发酵液混合物进行烘干干燥，粉碎，两歧双歧杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌培养物的用量比为50-80∶10-30∶10-30混合均匀，制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。

2.根据权利要求1所述的以两歧双歧杆菌为主的微生态制剂，其特征在于所述的培养基：玉米粉40~70，小麦粉20~30，豆饼粉5~15，葡萄糖10~15，酵母浸出粉1~3，蛋白胨2~4，原料当以克计，蒸馏水相应以mL计的份数为800~1000，溶解，加入发酵罐内进行100~121℃，时间为10~30分钟的高温高压灭菌，在发酵罐降温至35~45℃时，加入无机盐0.7~1.5g/1000mL基料，无机盐选自CaCl₂ 、MgSO_4·7H₂O及MnSO₄·H₂O中的两种或者三种，为避免形成沉淀，在加入过程中搅拌均匀。

3.根据权利要求1所述的以两歧双歧杆菌为主的微生态制剂，其特征在于：培养温度为37~42℃。

4.根据权利要求1所述的以两歧双歧杆菌为主的微生态制剂，其特征在于：种子菌接种量为2~4%的接种量。

5.根据权利要求1所述的以两歧双歧杆菌为主的微生态制剂，其特征在于：所用的菌种为双歧杆菌属的两歧双歧杆菌种、乳杆菌属的植物乳杆菌种和链球菌属的嗜热链球菌种，制剂中三种菌粉质量比依次为50-80∶10-30∶10-30。

6.根据权利要求1所述的以两歧双歧杆菌为主的微生态制剂，其特征在于：作为饲料添加剂应用于畜禽养殖。