CN103602614A - 一种复合微生态饲料添加剂的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生态饲料添加剂领域，具体涉及一种复合微生态饲料添加剂的制备及应用。本发明的微生态饲料添加剂由筛选到的活性复合益生菌组成，能够预防和治疗家畜细菌性感染引起的腹泻。本发明所用的两株益生菌具有抑制动物常见胃肠道致病菌包括痢疾杆菌、致病性大肠埃希菌、肠炎沙门菌感染的能力，而且还能够降低痢疾杆菌感染Caco-2细胞引起的毒性、抑制痢疾杆菌对Caco-2细胞的粘附，最后达到刺激动物机体免疫力、提高动物胃肠道消化能力，促进动物生长的明显效果。菌种的生产工艺采用液体发酵培养技术和低温冷冻干燥技术，使所获得菌剂存活率和纯度都很高，是一种绿色环保型的饲料添加剂。

Description

一种复合微生态饲料添加剂的制备及应用

技术领域

本发明涉及微生态饲料添加剂领域，该添加剂主要由筛选到的活性复合益生菌组成，能够预防和治疗家畜细菌性感染引起的腹泻。 

背景技术

数十年以来，国际上以抗生素、防腐剂为主的饲料药物添加剂为畜牧、家禽、水产等养殖业生产带来了很大的效益。然而，随着这些化学药品的广泛应用，耐药菌株的产生、抗生素在畜禽鱼产品中的残留及二重感染等问题受到国际社会的普遍关注与担忧。许多国家已禁止或限制抗生素、防腐剂作为饲料添加剂的使用。因此，开发和推广一些既能有效替代抗生素和防腐剂，又能有效防病、保健、促生长的新型安全饲料添加剂已成为当务之急。 

微生态制剂又称微生态调节剂，是根据微生态学原理，利用对宿主有益的正常微生物或其促进物质制备成的制剂，具有维持或调整微生态平衡，防治疾病和增进宿主健康的作用。它能有效地克服抗生素和防腐剂所产生的各种副作用，且具有防病、增强动物机体免疫力和促生长的效果。许多中草药及其成分具有提高免疫力的作用，与微生态制剂结合的生物制剂，又叫合生元（snbyioties），由Gibosnll首先提出，是微生态制剂的一个发展方向，也是现今研究的热点。 

发明内容

本发明从猪的健康粪便中筛选到了一株具有适应动物胃肠道微环境的丁酸梭菌，拉丁名：Clostridium butyricum.代号CPU-1（简称CB），其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.7281。保藏日：2013年3月6日。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 

本发明从猪的健康粪便中筛选到了一株具有适应动物胃肠道微环境的嗜酸乳杆菌，拉丁名：Lactobacillus acidophilus，代号CPU-2（简称LA），其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.7282。保藏日：2013年3月6日。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 

试验证明，本发明的CPU-1和CPU-2具有抑制细菌性感染引起的腹泻的功效，特别是痢疾杆菌（Shigella flexneri，简称SF）、肠炎沙门菌（Salmonella enteritidis，简称SE）、致病性大肠埃希菌（Enteropathogenic Escherichia coli，简称EPEC）等细菌性感染引起的腹泻。并且 将CPU-1和CPU-2联合使用具有协同功效。将两者组成复合益生菌，具有降低由痢疾杆菌引起的Caco-2细胞的细胞毒性并抑制其粘附细胞的能力。CPU-1和CPU-2优选的重量比例：1:10～10:1，更优选1:1。 

将两个菌株制备冻干菌粉有利于生产和制备。 

丁酸梭菌CPU-1菌粉的制备：将丁酸梭菌CPU-1从甘油管接种到乳酸菌液体培养基（MRS）中，37℃恒温静置培养12h，得到活化的菌种。将种子液按5%的接种量接种到MRS培养基中37℃厌氧发酵即深层静置培养24h，最后将获得的发酵液于4℃10000rpm离心10min，收集菌体加入脱脂奶粉进行低温冷冻干燥。所述乳酸菌液体培养基优选含如下成分：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸三铵2g/L，MgSO40.58g/L，MnSO40.25g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5g/L和吐温801ml；pH6.2-6.4，115℃灭菌30min。 

嗜酸乳杆菌CPU-2菌粉的制备：将嗜酸乳杆菌CPU-2从甘油管接种到乳酸菌液体培养基（MRS）中，37℃恒温静置培养12h，得到活化的菌种。将种子液按5%的接种量接种到MRS发酵培养基中37℃厌氧发酵24h，将获得的发酵液于4℃10000rpm离心10min，收集菌体加入脱脂奶粉进行低温冷冻干燥。 

试验发现，上述复合益生菌与野生植物牛至草粉联合使用效果更佳，比较优选的配比是：复合益生菌：野生植物牛至草粉重量配比为1:10～～10:1，更优选7:3。 

牛至草粉可用下列方法制备：将新鲜的牛至草叶置烘箱中，于60℃烘干48h，然后用小型中药粉碎机粉碎后过40目筛，得到牛至草粉。 

在使用中还可以添加淀粉、果聚糖等辅料混合均匀后制成复合微生态饲料添加剂。 

CPU-1和CPU-2的两个菌株的分离纯化方法详细描述于实施例中。 

本发明提供了该微生态添加剂在断奶仔猪细菌性腹泻的应用试验，相对于传统的抗生素治疗方式具有以下优势：该添加剂为绿色生态饲料添加剂对家畜无任何毒副作用，无抗生素残留。对于常见的胃肠道致病菌具有与抗生素不相上下的抗菌活性，同时有利于其他胃肠道共生菌群的生长；该添加剂所用菌株能够在胃肠道内高效粘附，适应动物胃肠道微环境，所分泌产生的乳酸及酪酸等能够提高胃肠道内蛋白酶、淀粉酶的活性，提高饲料转化率，降低胃肠道内毒性物质的产生。 

附图说明

图1是丁酸梭菌CPU-1形态图：A平皿菌落图；B菌体显微照片（400×） 

图2是嗜酸乳杆菌CPU-2形态图：A平皿菌落图；B菌体显微照片（400×） 

图3是丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2的不同配比对痢疾杆菌的抑制作用 

图4是丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2对痢疾杆菌体外协同抑制作用 

图5是丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2对致病性大肠埃希菌体外协同抑制作用 

图6是丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2对肠炎沙门菌体外协同抑制作用 

图7是丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2对由痢疾杆菌引起的Caco-2细胞毒性的影响 

图8是丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2对痢疾杆菌的Caco-2细胞粘附性的影响 

图9是断奶仔猪腹泻率测定 

具体实施方式

实施例1 

丁酸梭菌CPU-1的分离纯化及生理生化鉴定 

1、丁酸梭菌CPU-1分离纯化 

（1）取新鲜的猪的粪便1g溶于9ml生理盐水中，放入80℃水浴10min，杀死非芽孢菌，然后放入增殖培养基，于37℃培养36h。 

（2）将上述培养液置80℃水浴10min，转入菌种梭菌选择性培养基，其成分为：胰蛋白胨15g/L，酵母浸粉10g/L，亚硫酸钠1g/L，枸橼酸铁0.5g/L，新生霉素0.02g/L，多粘菌素0.05g/L，pH7.2，121℃灭菌20min，37℃厌氧选择性富集培养48h。 

（3）将样品分别从10^-1到10^-7倍比稀释，涂布于GAM培养基平板上，其培养基组成成分为：月示胨15g/L，胰酪蛋白胨10g/L，大豆胨3g/L，酵母浸粉5g/L，牛肉粉2g/L，消化血清粉13.5g/L，牛肝浸粉1.2g/L，葡萄糖3g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，氯化钠3g/L，可溶性淀粉0.3g/L，L-半胱氨酸0.3g/L，硫乙醇酸钠0.15g/L，琼脂粉20g/L，pH7.2，115℃灭菌30min。放入7.5L装有厌氧产气袋厌氧盒中，37℃厌氧培养36～48h。 

（4）采用影印平板法分离菌种，分别进行好氧和厌氧培养，选取厌氧生长良好的菌株，镜检。 

2、丁酸梭菌CPU-1的生理生化鉴定 

菌体形态特征见图1：丁酸梭菌菌株是典型的厌氧菌，直或微弯的杆菌，产芽孢，孢子卵圆，偏心到次端生，无孢子外壁和附属丝，端圆，单个或成对，短链，偶见长丝状菌体，以周生鞭毛运动，革兰氏阳性菌。 

以模式菌株枯草芽孢杆菌为对照，考察丁酸梭菌CPU-1的生理生化特征，为其菌种鉴定提供依据。按《伯杰氏细菌鉴定手册》和《细菌属的鉴定指导》对分离到的纯菌株进行属的 相关试验，以及群、种的相关生理生化实验，分别包括：明胶液化试验、蜜二糖、松三糖、淀粉水解试验。 

表1丁酸梭菌菌株CPU-1的生理生化特征 

注：“+”表示阳性反应或能利用；“—”表示阴性反应或不能利用。 

参照伯杰氏细菌鉴定手册第九版的分类鉴定，该菌株是丁酸梭菌，其培养特征和个体形态特征见图1。 

实施例2 

嗜酸乳杆菌CPU-2的分离纯化及生理生化鉴定 

嗜酸乳杆菌CPU-2的分离纯化方法参见丁酸梭菌的分离纯化，选择培养基为加有3%CaCO₃的MRS培养基；嗜酸乳杆菌菌体形态特征见图2，嗜酸乳杆菌为兼性厌氧菌，革兰氏染色为阳性、两端钝圆、中等大小、无芽孢、不运动的杆菌，以单个、成双或短链状出现。 

表2嗜酸乳杆菌的生理生化特征 

注：“+”表示阳性反应或能利用；“—”表示阴性反应或不能利用。 

参照伯杰氏细菌鉴定手册第九版的分类鉴定，该菌株是嗜酸乳杆菌，其培养特征和个体形态特征见图2。 

实施例3 

丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2的优选配比研究 

分别活化丁酸梭菌CPU-1和嗜酸乳杆菌CPU-2，用MRS培养基将其菌浓调整为10⁸CFU/ml，按下表接种模式分别接种丁酸梭菌CPU-1和嗜酸乳杆菌CPU-2于5ml MRS培养基中培养24h，细菌培养液冷冻离心机12000rpm离心5min，再用0.22μm的滤膜进行过滤，放在-20℃冰箱中保存。分别以痢疾杆菌为指示菌，采用双层琼脂扩散法测上清液抑菌圈。 

由图3可知，不同的两菌株配比对以痢疾杆菌为指示菌所产生的抑菌圈的大小不同，丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2以1:1配比时达到最大抑菌圈，所以1:1为两菌的最佳配比模式。 

实施例4 

双层琼脂扩散法测益生菌对肠道致病菌的抑菌圈 

（1）将痢疾杆菌、肠炎沙门菌、致病性大肠杆菌、从营养琼脂斜面上接种于5ml营养肉汤中，37℃静置培养8h。 

（2）倒营养琼脂平板：在无菌培养平板中，倒入20ml营养琼脂培养基作下层平板，凝固后待用。 

（3）益生菌液制备：将培养24h的嗜酸乳杆菌CPU-2、丁酸梭菌CPU-1以及二者1:1共培养的细菌培养液冷冻离心机12000rpm离心5min，再用0.22μm的滤膜进行过滤，放在-20 ℃冰箱中保存。 

（4）取0.5ml痢疾杆菌、肠炎沙门菌、致病性大肠杆菌培养液加入到5ml50～60℃琼脂粉含量0.8%的营养肉汤中，倒上层平板。 

（5）打孔器打孔，每个孔加入200μl不同处理的益生菌培养液。 

（6）将平板放入37℃恒温培养箱中过夜培养，十字交叉法测抑菌圈直径比较抑菌圈大小。 

丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2共培养后对常见胃肠道致病菌的抑制效果见附图5、附图6、附图7，图中1、2、3、4分别代表空白MRS培养基、丁酸梭菌CPU-1培养液、嗜酸乳杆菌CPU-2培养液、丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2共培养培养液，由三图可知，本发明的丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2对痢疾杆菌、致病性大肠杆菌和肠炎沙门菌具有很好的协同抑制作用，两菌株可以复合用于这些致病菌所引起的动物胃肠道感染性腹泻。 

实施例5 

MTT法测丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2对由痢疾杆菌引起的Caco-2细胞毒性的影响 

实验分为5组：Caco-2细胞空白组，福式痢疾杆菌感染组（Caco-2+SF）、丁酸梭菌CPU-1治疗组（Caco-2+SF+CB）、嗜酸乳杆菌CPU-2治疗组（Caco-2+SF+LA）、复合菌治疗组（Caco-2+SF+CB+LA）。 

（1）细菌菌液制备：1×10⁸CFU/ml（SF、LA、CB，血清含量0.5%的DMEM培养液重悬）。 

（2）Caco-2细胞铺板（10⁶CFU/ml，100μl，96孔板，血清含量0.5%的DMEM培养液）。 

（3）细胞与上述菌液共孵育8h。 

（4）孵育完毕后，吸去上清液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗2遍，600μg/ml的庆大霉素处理2h。再重新加入新鲜的细胞培养液100μl，96孔板拍照。 

（5）每孔加入10μl MTT，继续培养4h。 

（6）终止培养，小心吸去培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO），置摇床上低速震荡10min，结晶物充分溶解，酶标仪490nm处扫板。 

实施例6 

平板计数法测丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2对痢疾杆菌的Caco-2细胞粘附性的影响 

实验分4组：福式痢疾杆菌感染组（Caco-2+SF）、丁酸梭菌CPU-1治疗组（Caco-2+SF+CB）、嗜酸乳杆菌CPU-2治疗组（Caco-2+SF+LA）、复合菌治疗组（Caco-2+SF+CB+LA）。 

（1）Caco-2细胞铺板（10⁶CFU/ml，100μl，96孔板，血清含量0.5%的DMEM培养液） 

（2）菌液制备（SF、LA、CB，10⁸CFU/ml） 

（3）细胞与SF、SF+CB、SF+LA、SF+CB+LA孵育8h。 

（4）8h后吸取上清液，PBS洗2遍。 

（5）含0.1%tritonX-100PBS处理5min。 

（6）细胞裂解液稀释倒平板计数（沙门、志贺菌属琼脂培养基）。 

丁酸梭菌CPU-1与嗜酸乳杆菌CPU-2对由痢疾杆菌引起的Caco-2细胞毒性的影响见图7。由图7可知，丁酸梭菌与嗜酸乳杆菌降低了痢疾杆菌感染引起的Caco-2细胞的毒性，分别降低了7%和8%，两菌株复合后具有更好地协同作用，使Caco-2细胞的相对细胞毒性降低了15%；由图8可知，丁酸梭菌与嗜酸乳杆菌对痢疾杆菌Caco-2细胞粘附能力具有很好的抑制作用，使痢疾杆菌的相对粘附率分别降低了75%和81%，两菌株复合后使痢疾杆菌的相对粘附率降低了84%。 

实施例7 

复合微生态饲料添加剂的制备 

一、嗜酸乳杆菌CPU-2、丁酸梭菌CPU-1菌粉制备 

1、菌种活化 

（1）种子斜面：种子培养基基础添加2%琼脂，121℃灭菌20min。 

（2）用接种环从甘油管（或冻干管）挑取菌落至复苏斜面（种子斜面），恒温培养箱中37℃培养48～72h。 

（3）从复苏斜面挑取细菌至种子斜面，37℃培养24h，完成第二次活化。 

2、种子液制备 

（1）接种环从种子斜面挑取两环细菌接种至种子培养基，37℃静置培养12h。 

（2）种子培养基（5%接种量）至摇瓶培养基，37℃静置培养12h。 

发酵生产丁酸梭菌CPU-1和嗜酸乳杆菌CPU-2，摇瓶（种子）培养基5%接种量至MRS培养基（10L发酵罐），37℃、50rpm、不通气搅拌培养24h。 

3、细菌冻干 

8000rpm4℃离心10min，最终离心产物添加发酵液至400ml，添加15%脱脂奶粉，-40℃预冻4～6h，冻干机真空干燥，第一段-30℃240min，第二段-10℃600min，第三段0℃960min，第四段4℃360min。 

4、细菌计数 

（1）配制99ml0.9%生理盐水及一系列装有9ml的0.9%生理盐水的试管，121℃灭菌20min。 

（2）精确称取1g冻干粉，研钵研磨粉碎，至99ml灭菌生理盐水，搅拌20min混匀。 

（3）取1ml混匀后的菌液，加入装有9ml生理盐水的试管中，震荡混匀，将待测样品经一系列10倍梯度稀释，将稀释的菌液取0.2ml加到已制备好的平板上，然后用涂布棒将菌液涂布整个平板表面，37℃下培养，计算菌落数，再按上公式计算出每克冻干粉所含活菌总数。每克原菌液活菌数＝同一稀释度三个以上重复平板菌落平均数×稀释倍数×5。 

二、牛至草粉制备 

将新鲜的牛至草叶放置烘箱里，60℃烘48h脱水干燥，然后用小型中药粉碎机粉碎后过40目筛，得到牛至草粉。 

三、复合微生态制剂制备 

由丁酸梭菌CPU-1和嗜酸乳杆菌CPU-2的冻干菌粉按1:1的比例混合，再与野生植物牛至草粉按7:3的重量百分比进行混合，上述混合物按0.5:1～2:1的比例与淀粉、果聚糖辅料混合均匀后即制成该复合微生态饲料添加剂。 

实施例8 

断奶仔猪细菌性腹泻的应用试验 

将供试猪仔按体重、性别随机分为3组，即对照组，土霉素组，复合益生菌添加剂组。每组30头仔猪，组内设3个重复，每个重复10头仔猪。以组内、组间无显著差异（P>0.05）为原则。试验期为20d，对照组饲喂基础日粮，土霉素组在基础日粮中添加土霉素（65mg/kg），复合益生菌添加剂组为在基础日粮基础上添加2%～5%复合益生菌制剂。试验期采取自由饮水，自由采食的方法。每日饲喂两次，计量不限量，并随时观察并记录猪的健康及腹泻等情况。 

复合益生菌添加剂、常用抗生素对断奶仔猪腹泻率的影响见图9。由图9可知，本发明的复合益生菌添加剂、土霉素相比对照都有减轻仔猪腹泻的作用，而且两者的作用无显著性差异，相比对照的腹泻率分别下降了10%和13%。由此可见，复合益生菌添加剂可以有效的降低断奶仔猪的腹泻率。 

Claims (9)

1.一种丁酸梭菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物生物中心的保藏号为：CGMCC No.7281。

2.一种嗜酸乳杆菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物生物中心的保藏号为：CGMCC No.7282。

3.一种复合微生态制剂饲料添加剂，其活性成分由权利要求1的丁酸梭菌和权利要求2的嗜酸乳杆菌组成。

4.权利要求3的复合微生态制剂饲料添加剂，其中权利要求1的丁酸梭菌和权利要求2的嗜酸乳杆菌的重量比为1:10～～10:1。

5.权利要求4的复合微生态制剂饲料添加剂，其中权利要求1的丁酸梭菌和权利要求2的嗜酸乳杆菌的重量比为1:4～～4:1。

6.权利要求5的复合微生态制剂饲料添加剂，其中权利要求1的丁酸梭菌和权利要求2的嗜酸乳杆菌的重量比为1:1。

7.权利要求3的复合微生态饲料添加剂，还含有牛至草粉。

8.权利要求3或7的复合微生态饲料添加剂用于制备治疗家畜细菌性感染引起的腹泻的药物的用途。

9.权利要求8的用途，其中细菌性感染是痢疾杆菌、致病性大肠埃希菌或肠炎沙门菌引起的感染。

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