CN105039229A - 一种微生物复合菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微生物复合菌剂，其包括菌数比为（1-10）：1的丁酸梭菌和蛭弧菌，该微生物复合菌剂对家禽腹泻具有优异的防治效果。其制备方法采用双层包埋法，先用壳聚糖对蛭弧菌进行包埋后，再用含丁酸梭菌的包埋液进行二次包埋，该方法能很好地对两种菌进行固定化，且消除了存放过程中两种菌之间的相互影响，最大程度地降低了菌活损失。

Description

一种微生物复合菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物制剂领域，具体涉及一种微生物复合菌剂及其制备方法和应用，特别涉及丁酸梭菌和蛭弧菌复合菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

丁酸梭菌又称酪酸菌，是调节肠道微生态平衡的有益菌，其主要生物特性表现为：①促进肠道有益菌群(双歧杆菌，乳酸杆菌)的增殖和发育，抑制肠道内有害菌和腐败菌的生长、繁殖，纠正肠道菌群紊乱，减少肠毒素的发生；②在肠道内能产生B族维生素、维生素K等物质，对机体具有保健作用；③丁酸梭菌的主要代谢产物丁酸是肠道上皮组织细胞的再生和修复主要营养物质，提高畜禽的饲料消化吸收率；④丁酸梭菌是厌氧芽孢杆菌，稳定性好，在机体内不受胃酸、胆汁酸等影响，在体外（芽孢状态）室温下能保存三年以上。丁酸梭菌制剂作为饲料添加剂已成为目前的研究热点，用来治疗畜禽肠道菌丛紊乱，提高生产力，取得了一定的效果。

蛭弧菌是寄生于其他细菌并能导致其裂解的一类细菌，蛭弧菌不仅宿主范围广泛，加之特殊的生活方式，使之具有生态学优势。其一，蛭弧菌进入到其他细菌的周质空间，可以确保营养需要，不依赖外界的来源。因此，即使在营养物质很少的地方，诸如海洋、江河、湖泊等生态***中也能生长；其二，周质内的环境是一个无竞争的小生境。这对生长缓慢的蛭弧菌无疑是个很有利的条件；另外，周质空间被一个稳定的、坚强的细胞壁所包围，有似大分子不能通过，即使小分子也不易透过，这就为蛭弧菌提供了一个保护性环境。由于上述特性，使蛭弧菌具有很大的潜在应用价值，目前多用于水产养殖动物弧菌病的防治。目前我国商业化的蛭弧菌制剂主要是水剂，还有少量的冻干粉剂，蛭弧菌水剂因保存时间短，质量不稳定等因素影响了其使用效果，冻干粉剂也因生产成本高而在很大程度上限制了其应用。

目前还未见有丁酸梭菌和蛭弧菌复合菌剂的相关报道。中国专利ZL201110110362.2公开了一种枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂的制备方法，该专利将枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌联合使用，虽然能有效降低仔猪或蛋鸡的腹泻发生率，但其效果仍有很大的提升空间，并且该菌剂的用量较大（添加量为饲料重量的0.5%）。中国专利申请CN201410751336.1公开了一种短小芽孢杆菌和蛭弧菌的液体制剂，该制剂能有效防治弧菌引起的疾病，但该制剂是将两种菌的液体发酵液直接混合后制得，不便于保存，并且某些蛭弧菌菌株有可能对与其复合的菌种具有噬菌作用，采用不当的制备方法可能会大大降低菌剂的活性。

发明内容

基于以上技术现状，本发明的目的在于提供一种丁酸梭菌和蛭弧菌复合菌剂，并进一步提供其制备方法和应用，该复合菌剂两种菌之间具有显著的协同作用，对家禽腹泻的防治效果明显优于各自单独使用，本发明采用特殊的包埋工艺使该复合菌剂在保存时两种菌之间不会相互影响，可大大延长复合菌剂的保存时间，菌活损失小。

本发明采用如下技术方案：

一种微生物复合菌剂，其特征在于其有效成分为丁酸梭菌和蛭弧菌。

优选地，所述的微生物复合菌剂，其特征在于其包括菌数比为（1-10）：1的丁酸梭菌和蛭弧菌。

具体地，所述蛭弧菌为噬菌蛭弧菌、斯托普蛭弧菌和斯塔尔蛭弧菌中的一种或多种。

所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于其步骤如下：

（1）在LB液体培养基中接种大肠杆菌，培养，离心，收集菌体，100ml大肠杆菌培养液中的菌体重新混悬在5-10ml的LB液体培养基中，接入蛭弧菌，于25-37℃、pH6.0-8.5下培养36-48h，蛭弧菌培养液于4℃、6000rpm下离心20min，弃沉淀，取上清液于4℃、16000rpm离心20min，取沉淀，混悬于LB液体培养基中，制成浓度≥10¹¹cfu/ml的蛭弧菌浓缩液；

（2）将壳聚糖溶解于体积浓度1%的醋酸中，配制成浓度为5-10mg/ml的壳聚糖溶液，取等体积的蛭弧菌浓缩液，与壳聚糖溶液混合均匀，得蛭弧菌混合液；

（3）在所述蛭弧菌混合液中逐滴加入三聚磷酸钠水溶液，充分搅拌，制成蛭弧菌包埋液，将该包埋液离心，取沉淀备用；

（4）将斜面培养的丁酸梭菌在RCM液体培养基中，于30-38℃、pH6.5-7.5下厌氧培养24-48h，再接种于RCM液体培养基中，于30-38℃、pH6.5-7.5的环境下厌氧培养24-48h，得丁酸梭菌培养液；

（5）将壳聚糖溶解于稀醋酸中，配制成壳聚糖溶液，按比例取丁酸梭菌培养液，与等体积的壳聚糖溶液混合均匀，得丁酸梭菌混合液；

（6）将步骤（3）所得的沉淀加入所述丁酸梭菌混合液中，然后逐滴加入三聚磷酸钠水溶液，充分搅拌，制成复合菌液。

优选地，所述稀醋酸的体积浓度为1%，壳聚糖溶液的浓度为5-10mg/ml，壳聚糖粘均分子量为500-1800kd，三聚磷酸钠水溶液的浓度为1mg/ml，步骤（3）中三聚磷酸钠水溶液用量为蛭弧菌混合液体积的1-2倍，步骤（6）中三聚磷酸钠水溶液用量为丁酸梭菌混合液体积的2-5倍。

优选地，所述复合菌液经离心、干燥制成复合菌颗粒剂。

上述微生物复合菌剂在治疗家禽腹泻中的应用。

本发明的积极效果在于：本发明将丁酸梭菌和蛭弧菌联合使用，二者之间产生显著的协同作用，对家禽腹泻具有优异的防治效果，且具有菌剂用量少、见效快、无任何毒副作用等优点。本发明选择的双层包埋的制备方法能很好地对两种菌进行固定化，且消除了存放过程中两种菌之间的相互影响，最大程度地降低了菌活损失。

具体实施方式

下面以具体实施例来对本发明技术方案进行详细说明，显然，以下实施例仅作为本发明的优选方案，而不是对保护范围的限制。

以下实施例中，丁酸梭菌来自中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC，其保藏编号是：丁酸梭菌NO.10350，蛭弧菌来自中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，保藏编号为CGMCCNO.1045，但本发明的保护范围并不仅限于这两种菌株，发明人在实验过程中选用了多种菌株进行试验，其效果相当，这里仅用上述两种菌株对技术方案进行详细说明，其他不再赘述。

实施例1

（1）在LB液体培养基中接种大肠杆菌，培养，离心，收集菌体，100ml大肠杆菌培养液中的菌体重新混悬在10ml的LB液体培养基中，接入噬菌蛭弧菌，于25℃、pH6.0下培养48h，蛭弧菌培养液于4℃、6000rpm下离心20min，弃沉淀，取上清液于4℃、16000rpm离心20min，取沉淀，混悬于LB液体培养基中，制成浓度1.3×10¹¹cfu/ml的蛭弧菌浓缩液；

（2）将壳聚糖（500kd）溶解于体积浓度1%的醋酸中，配制成浓度为5mg/ml的壳聚糖溶液，取等体积的蛭弧菌浓缩液，与壳聚糖溶液混合均匀，得蛭弧菌混合液；

（3）取与所述蛭弧菌混合液等体积的1mg/ml的三聚磷酸钠水溶液，逐滴加入到蛭弧菌混合液中，充分搅拌，制成蛭弧菌包埋液，将该包埋液离心，取沉淀备用；

（4）将斜面培养的丁酸梭菌NO.10350在RCM液体培养基（上海酶联检测技术有限公司生产的RCM培养基原粉按照23g原粉加入1000ml水的比例，121℃高压灭菌15min制成）中，于30℃、pH6.5下厌氧培养48h，再接种于RCM液体培养基中，于30℃、pH6.5的环境下厌氧培养48h，得丁酸梭菌培养液；该培养液中含菌量为5.6×10⁸cfu/ml。

（5）将壳聚糖（500kd）溶解于体积浓度1%的醋酸中，配制成浓度为5-10mg/ml的壳聚糖溶液，按丁酸梭菌与蛭弧菌菌数比1:1取丁酸梭菌培养液，与等体积壳聚糖溶液混合均匀，得丁酸梭菌混合液；

（6）将步骤（3）所得的沉淀加入所述丁酸梭菌混合液中，然后取相当于所述丁酸梭菌混合液2倍体积的1mg/ml的三聚磷酸钠水溶液，充分搅拌，制成复合菌液，将该复合菌液离心，沉淀经-40℃冷冻干燥后得复合菌颗粒剂。

室温下储藏12个月，该复合菌颗粒剂中丁酸梭菌的菌活损失率为4.3%，蛭弧菌的菌活损失率为3.5%。

对比例1

（1）在LB液体培养基中接种大肠杆菌，培养，离心，收集菌体，100ml大肠杆菌培养液中的菌体重新混悬在5-10ml的LB液体培养基中，接入蛭弧菌，于25-37℃、pH6.0-8.5下培养36-48h，蛭弧菌培养液于4℃、6000rpm下离心20min，弃沉淀，取上清液于4℃、16000rpm离心20min，取沉淀，混悬于LB液体培养基中，制成浓度≥10¹¹cfu/ml的蛭弧菌浓缩液；

（2）将斜面培养的丁酸梭菌在RCM液体培养基中，于30-38℃、pH6.5-7.5下厌氧培养24-48h，再接种于RCM液体培养基中，于30-38℃、pH6.5-7.5的环境下厌氧培养24-48h，得丁酸梭菌培养液，该培养液中含菌量为5.6×10⁸cfu/ml；

（3）按菌数比1:1取所述丁酸梭菌培养液和蛭弧菌浓缩液，其中蛭弧菌浓缩液离心后取菌体，加入所述丁酸梭菌培养液中，取等体积的壳聚糖溶液（与实施例1中浓度及配制方法相同），混合均匀，得混合液；

（4）向步骤（3）的混合液中逐滴加入相当于所述混合液2倍体积的1mg/ml的三聚磷酸钠水溶液，充分搅拌，得复合菌液，沉淀经-40℃冷冻干燥后得复合菌颗粒剂。

室温下储藏12个月，该复合菌颗粒剂中丁酸梭菌的菌活损失率为36.8%，蛭弧菌的菌活损失率为13.1%。

可见，采用本发明的方法能有效降低菌活的损失率。

实施例2

（1）在LB液体培养基中接种大肠杆菌，培养，离心，收集菌体，100ml大肠杆菌培养液中的菌体重新混悬在5ml的LB液体培养基中，接入噬菌蛭弧菌，于30℃、pH8.5下培养42h，蛭弧菌培养液于4℃、6000rpm下离心20min，弃沉淀，取上清液于4℃、16000rpm离心20min，取沉淀，混悬于LB液体培养基中，制成浓度1.0×10¹¹cfu/ml的蛭弧菌浓缩液；

（2）将壳聚糖（1800kd）溶解于体积浓度1%的醋酸中，配制成浓度为10mg/ml的壳聚糖溶液，取等体积的蛭弧菌浓缩液，与壳聚糖溶液混合均匀，得蛭弧菌混合液；

（3）取相当于所述蛭弧菌混合液2倍体积的1mg/ml的三聚磷酸钠水溶液，逐滴加入到蛭弧菌混合液中，充分搅拌，制成蛭弧菌包埋液，将该包埋液离心，取沉淀备用；

（4）将斜面培养的丁酸梭菌NO.10350在RCM液体培养基（上海酶联检测技术有限公司生产的RCM培养基原粉按照23g原粉加入1000ml水的比例，121℃高压灭菌15min制成）中，于38℃、pH7.0下厌氧培养24h，再接种于RCM液体培养基中，于38℃、pH7.0的环境下厌氧培养24h，得丁酸梭菌发酵液；该发酵液中含菌量为5.7×10⁸cfu/ml。

（5）将壳聚糖（1800kd）溶解于体积浓度1%的醋酸中，配制成浓度为10mg/ml的壳聚糖溶液，按丁酸梭菌与蛭弧菌菌数比5:1取丁酸梭菌培养液，与等体积壳聚糖溶液混合均匀，得丁酸梭菌混合液；

（6）将步骤（3）所得的沉淀加入所述丁酸梭菌混合液中，然后取相当于所述丁酸梭菌混合液3倍体积的1mg/ml的三聚磷酸钠水溶液，充分搅拌，制成复合菌液。

室温下储藏12个月，该复合菌液中丁酸梭菌的菌活损失率为6.8%，蛭弧菌的菌活损失率为4.7%。

实施例3

（1）在LB液体培养基中接种大肠杆菌，培养，离心，收集菌体，100ml大肠杆菌培养液中的菌体重新混悬在10ml的LB液体培养基中，接入噬菌蛭弧菌，于37℃、pH8.5下培养36h，蛭弧菌培养液于4℃、6000rpm下离心20min，弃沉淀，取上清液于4℃、16000rpm离心20min，取沉淀，混悬于LB液体培养基中，制成浓度1.1×10¹¹cfu/ml的蛭弧菌浓缩液；

（2）将壳聚糖（1000kd）溶解于体积浓度1%的醋酸中，配制成浓度为8mg/ml的壳聚糖溶液，取等体积的蛭弧菌浓缩液，与壳聚糖溶液混合均匀，得蛭弧菌混合液；

（3）取与所述蛭弧菌混合液等体积的1mg/ml的三聚磷酸钠水溶液，逐滴加入到蛭弧菌混合液中，充分搅拌，制成蛭弧菌包埋液，将该包埋液离心，取沉淀备用；

（4）将斜面培养的丁酸梭菌NO.10350在RCM液体培养基（上海酶联检测技术有限公司生产的RCM培养基原粉按照23g原粉加入1000ml水的比例，121℃高压灭菌15min制成）中，于35℃、pH7.5下厌氧培养36h，再接种于RCM液体培养基中，于35℃、pH7.5的环境下厌氧培养36h，得丁酸梭菌发酵液；该发酵液中含菌量为5.6×10⁸cfu/ml；

（5）将壳聚糖（1000kd）溶解于体积浓度1%的醋酸中，配制成浓度为8mg/ml的壳聚糖溶液，按丁酸梭菌与蛭弧菌菌数比10:1取丁酸梭菌培养液，与等体积壳聚糖溶液混合均匀，得丁酸梭菌混合液；

（6）将步骤（3）所得的沉淀加入所述丁酸梭菌混合液中，然后取相当于所述丁酸梭菌混合液5倍体积的1mg/ml的三聚磷酸钠水溶液，充分搅拌，制成复合菌液，将该复合菌液离心，沉淀经-40℃冷冻干燥后得复合菌颗粒剂。

室温下储藏12个月，该复合菌颗粒剂中丁酸梭菌的菌活损失率为3.9%，蛭弧菌的菌活损失率为3.1%。

对比例2

步骤（1）-（3）与实施例1相同，省去步骤（4），步骤（5）-（6）为：

（5）将壳聚糖溶解于体积浓度1%的醋酸中，配制成浓度为5-10mg/ml的壳聚糖溶液，按与步骤（3）中蛭弧菌包埋液相同菌数另取蛭弧菌培养液，并浓缩至与实施例1步骤（5）中丁酸梭菌培养液相同的体积，再与等体积壳聚糖溶液混合均匀，得混合液；

（6）将步骤（3）所得的沉淀加入步骤（5）的混合液中，然后取相当于该混合液2倍体积的1mg/ml的三聚磷酸钠水溶液，充分搅拌，制成菌液，将该菌液离心，沉淀经-40℃冷冻干燥后得蛭弧菌颗粒剂。

对比例3

（1）按与实施例1步骤（4）相同的方法制备丁酸梭菌培养液，并浓缩至含菌量1.3×10¹¹cfu/ml，得丁酸梭菌浓缩液；

（2）将壳聚糖溶解于体积浓度1%的醋酸中，配制成浓度为5mg/ml的壳聚糖溶液，取等体积的丁酸梭菌浓缩液，与壳聚糖溶液混合均匀，得第一丁酸梭菌混合液；

（3）取与所述第一丁酸梭菌混合液等体积的1mg/ml的三聚磷酸钠水溶液，逐滴加入到第一丁酸梭菌混合液中，充分搅拌，制成丁酸梭菌包埋液，将该包埋液离心，取沉淀备用；

（4）与实施例1相同，制得丁酸梭菌培养液；

（5）将壳聚糖溶解于体积浓度1%的醋酸中，配制成浓度为5-10mg/ml的壳聚糖溶液，按与步骤（3）中丁酸梭菌包埋液相同菌数取丁酸梭菌培养液，与等体积壳聚糖溶液混合均匀，得第二丁酸梭菌混合液；

（6）将步骤（3）所得的沉淀加入所述第二丁酸梭菌混合液中，然后取相当于所述第二丁酸梭菌混合液2倍体积的1mg/ml的三聚磷酸钠水溶液，充分搅拌，制成菌液，将该菌液离心，沉淀经-40℃冷冻干燥后得丁酸梭菌颗粒剂。

对比例4

与实施例1的不同之处在于：用枯草芽孢杆菌浓缩液替换实施例1中的蛭弧菌浓缩液，具体如下：将斜面培养的枯草芽孢杆菌CGMCCNO.1.1731在LB液体培养基中培养得种子液，再将种子液接种于LB液体培养基中得发酵液，浓缩发酵液，制成含菌量为1.3×10¹¹cfu/ml的枯草芽孢杆菌浓缩液。

预防效果例1

选取健康状况良好的20日龄雏鸡200只，随机分成五组，每组40只，1-4组分别饲喂实施例1、对比例1、对比例2和对比例3的颗粒剂，每日取颗粒剂0.1g，加水搅拌均匀后灌服，第5组加等量生理盐水作为对照，分别饲喂10天后，给各组雏鸡接种鸡白痢沙门氏菌，5天后统计感染雏鸡数量，以出现如下症状作为感染标准：雏鸡精神萎顿，缩头，翅下垂，拉白色浆糊状稀粪，排粪时发出“吱、吱”叫声，结果见表1。

表1

。

预防效果例2

选取健康状况良好的50日龄种鸭250只，随机分成五组，每组50只，1-4组分别饲喂掺有实施例1、对比例1、对比例2和对比例3菌液的颗粒剂，每日取颗粒剂0.1g，加水搅拌均匀后灌服，第5组加等量生理盐水作为对照，分别饲喂10天后，给各组种鸭接种葡萄球菌，5天后统计感染种鸭数量，以出现如下症状作为感染标准：精神萎靡，食欲不振，拉白色或淡绿色水样便，结果见表2。

表2

。

治疗效果例1

选取已感染鸡白痢的20日龄雏鸡200只，随机分成五组，每组40只，1-4组分别饲喂掺有实施例1、对比例1、对比例2和对比例3菌液的颗粒剂，每日取颗粒剂0.2g，加水搅拌均匀后灌服，第5组加等量生理盐水作为对照，3天后统计治疗效果，疗效标准如下：

治愈：症状完全消失，回复病前状态。

有效：症状减轻，排粪次数减少。

无效：症状无明显减轻或加重。

统计结果见表3。

表3

。

治疗效果例2

选取已感染葡萄球菌的50日龄种鸭250只，随机分成五组，每组50只，1-4组分别饲喂掺有实施例1、对比例1、对比例2和对比例3菌液的颗粒剂，每日取颗粒剂0.2g，加水搅拌均匀后灌服，第5组加等量生理盐水作为对照，3天后统计治疗效果，疗效标准如下：

治愈：症状完全消失，回复病前状态。

有效：症状减轻，排粪次数减少。

无效：症状无明显减轻或加重。

统计结果见表4。

表4

。

实施例2和实施例3制备的复合菌剂在防治家禽腹泻中的效果与实施例1相当。

由以上效果例可以看出，丁酸梭菌和蛭弧菌联用时，能产生显著的协同作用，对家禽腹泻的防治效果明显优于二者单独使用效果之和，且用量少，每日0.1-0.2g即可达到较好的防治家禽腹泻的效果。用于治疗时，一般用药8小时内即可明显见效，24小时后治愈率即可达到50%以上，3天后基本上可全部治愈。

Claims (7)

1.一种微生物复合菌剂，其特征在于其有效成分为丁酸梭菌和蛭弧菌。

2.根据权利要求1所述的微生物复合菌剂，其特征在于其包括菌数比为（1-10）：1的丁酸梭菌和蛭弧菌。

3.根据权利要求1所述的微生物复合菌剂，其特征在于所述蛭弧菌为噬菌蛭弧菌、斯托普蛭弧菌和斯塔尔蛭弧菌中的一种或多种。

4.权利要求1-3任一项所述的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于其步骤如下：

（1）在LB液体培养基中接种大肠杆菌，培养，离心，收集菌体，100ml大肠杆菌培养液中的菌体重新混悬在5-10ml的LB液体培养基中，接入蛭弧菌，于25-37℃、pH6.0-8.5下培养36-48h，蛭弧菌培养液于4℃、6000rpm下离心20min，弃沉淀，取上清液于4℃、16000rpm离心20min，取沉淀，混悬于LB液体培养基中，制成浓度≥10¹¹cfu/ml的蛭弧菌浓缩液；

（2）将壳聚糖溶解于稀醋酸中，配制成壳聚糖溶液，取等体积的蛭弧菌浓缩液，与壳聚糖溶液混合均匀，得蛭弧菌混合液；

（3）在所述蛭弧菌混合液中逐滴加入三聚磷酸钠水溶液，充分搅拌，制成蛭弧菌包埋液，将该包埋液离心，取沉淀备用；

（4）将斜面培养的丁酸梭菌在RCM液体培养基中，于30-38℃、pH6.5-7.5下厌氧培养24-48h，再接种于RCM液体培养基中，于30-38℃、pH6.5-7.5的环境下厌氧培养24-48h，得丁酸梭菌培养液；

（5）将壳聚糖溶解于稀醋酸中，配制成壳聚糖溶液，按所述菌数比取丁酸梭菌培养液，与等体积的壳聚糖溶液混合均匀，得丁酸梭菌混合液；

（6）将步骤（3）所得的沉淀加入所述丁酸梭菌混合液中，然后逐滴加入三聚磷酸钠水溶液，充分搅拌，制成复合菌液。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）和步骤（5）中，所述稀醋酸的体积浓度为1%，壳聚糖溶液的浓度为5-10mg/ml，壳聚糖粘均分子量为500-1800kd，三聚磷酸钠水溶液的浓度为1mg/ml，步骤（3）中三聚磷酸钠水溶液用量为蛭弧菌混合液体积的1-2倍，步骤（6）中三聚磷酸钠水溶液用量为丁酸梭菌混合液体积的2-5倍。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于所述复合菌液经离心、干燥制成复合菌颗粒剂。

7.权利要求1-3任一项所述的复合菌剂在治疗家禽腹泻中的应用。