CN104212735A - 一种禽用复合益生菌制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种禽用复合益生菌制剂及其制备方法,将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、酪酸梭菌菌液按体积比20-40:5-20:10-30:12-35:15-30混合,然后加入羧甲基纤维素制成混悬液,再将混悬液加入硫酸铝溶液中,形成凝聚囊,过滤得到凝聚囊,水洗后干燥即得;上述菌种菌液中的活菌数均不低于109CFU/ml。本发明通过将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、酪酸梭菌等好氧菌和厌氧菌合理搭配,得到具有多种生理功能的复合益生菌制剂。本发明的禽用复合益生菌制剂能够调节肠道的微生态环境,抑制肠道病原菌的生长,增强机体免疫力,提高饲料利用率。
Description
技术领域
本发明涉及一种禽用复合益生菌制剂,同时还涉及该制剂的制备方法,属于微生物制剂技术领域。
背景技术
随着集约化养殖业的发展,禽类的各种疾病不断发生,而且日益严重。目前防治禽类疾病的主要手段是使用抗生素,但抗生素的使用容易导致细菌耐药的产生及禽类产品中药物的残留。因此,预防禽类的疾病发生,解决其副产品中药物的残留是亟待解决的问题。
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物,可以改善宿主体内的微生态平衡,发挥有益作用。益生菌的作用特点是形成生物保护膜防止致病菌入侵;产生乳酸或醋酸、过氧化氢、细菌素和类似抗菌素的物质,并以此来抑制病原菌的生长,调整宿主免疫反应,改善消化道细菌代谢病降低粪中有害酶的活性;减少细菌易位的发生率等,因此益生菌具有加强肠道微生物区域的屏障功能或增进非特异性免疫功能,调节特异性免疫功能,增强抗病力和体质,防治病菌感染,提高饲料利用率和动物生长率的功能。因此对不同益生菌进行搭配,提高它们的作用成为研究热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种禽用复合益生菌制剂,能够调节肠道的微生态环境,抑制肠道病原菌的生长,增强机体免疫力,提高饲料利用率。
本发明的目的还在于提供一种禽用复合益生菌制剂的制备方法。
为了实现以上目的,本发明所采用的技术方案是提供一种禽用复合益生菌制剂,将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、酪酸梭菌菌液按体积比20-40:5-20:10-30:12-35:15-30混合,然后加入羧甲基纤维素制成混悬液,再将混悬液加入硫酸铝溶液中,形成凝聚囊,过滤得到凝聚囊,水洗后干燥即得;上述菌种菌液中的活菌数均不低于109CFU/ml。
所述禽用复合益生菌制剂中活菌总数不低于5×109CFU/g。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种禽用复合益生菌制剂的制备方法,包括以下步骤:将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、酪酸梭菌菌液按体积比混合,然后加入混合菌液质量0.5-1%的羧甲基纤维素制成混悬液,再将混悬液加入混悬液体积1-2倍的质量分数3-5%的硫酸铝溶液中,形成凝聚囊,过滤得到凝聚囊,水洗,干燥得到禽用复合益生菌制剂;上述菌种菌液中的活菌数均不低于109CFU/ml。
所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液的制备方法包括以下步骤:
(1)菌种的活化:将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接种到营养肉汤培养基中,在37℃、180-200r/min条件下培养12-14h;
(2)以3%接种量将活化的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接入液体培养基,在37℃条件下通氧发酵培养36-48h,过滤然后将发酵液3000-4000r/m离心5-10min,倒去上清液,加入无菌水制得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液,所得菌液中活菌数均不低于109CFU/ml。
所述液体培养基包括以下质量分数的组分:葡萄糖0.1%、淀粉0.2%、豆粕水解液2%、磷酸二氢钾0.3%、磷酸氢二钾0.2%,硫酸镁0.05%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%。
所述粪肠球菌菌液的制备方法包括以下步骤:
(1)菌种的活化:将粪肠球菌接种到营养肉汤培养基中,在37℃条件下静止培养12-14h;
(2)以2%接种量将活化的粪肠球菌接入MRS培养基,在37℃条件下静置发酵培养24-36h,然后将发酵液3000-4000r/m离心5-10min,倒去上清液,加入无菌水制得粪肠球菌菌液,所得菌液中活菌数均不低于109CFU/ml。
所述MRS培养基包括以下质量分数的组分:胰蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、葡萄糖1%、蔗糖0.5%、醋酸钠1.5%、柠檬酸铵0.2%、磷酸二氢钾0.4%、硫酸锰0.05%、硫酸镁0.02%、硫酸铁0.003%、吐温800.1%。
所述嗜酸乳杆菌菌液的制备方法包括以下步骤:
(1)菌种的活化:将嗜酸乳杆菌接种到营养肉汤培养基中,在37℃条件下静止培养12-14h;
(2)以2%接种量将活化的嗜酸乳杆菌接入发酵培养基,在37℃条件下静置发酵培养24-36h,然后将发酵液3000-4000r/m离心5-10min,倒去上清液,加入无菌水制得嗜酸乳杆菌菌液,所得菌液中活菌数均不低于109CFU/ml。
所述发酵培养基包括以下质量分数的组分:葡萄糖3%、乳糖1%、脱脂乳粉5%、酵母浸粉0.8%、磷酸二氢钾0.3%、磷酸氢二钠0.4%、硫酸镁0.02%、硫酸锰0.008%。
所述营养肉汤培养基包括以下质量分数的组分:蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、氯化钠0.5%。
本发明通过将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、酪酸梭菌等好氧菌和厌氧菌合理搭配,得到具有多种生理功能的复合益生菌制剂。本发明的禽用复合益生菌制剂能够调节肠道的微生态环境,抑制肠道病原菌的生长,增强机体免疫力,提高饲料利用率。
本发明的禽用复合益生菌制剂可在常温下保存一年。使用时,将禽用复合益生菌制剂以1%的重量分数添加到饲料或者饮水中即可。
具体实施方式
培养基的配制
营养肉汤培养基包括以下质量分数的组分:蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、氯化钠0.5%;pH7-7.2。
液体培养基包括以下质量分数的组分:葡萄糖0.1%、淀粉0.2%、豆粕水解液2%、磷酸二氢钾0.3%、磷酸氢二钾0.2%,硫酸镁0.05%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%;pH7-7.2。
MRS培养基包括以下质量分数的组分:胰蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、葡萄糖1%、蔗糖0.5%、醋酸钠1.5%、柠檬酸铵0.2%、磷酸二氢钾0.4%、硫酸锰0.05%、硫酸镁0.02%、硫酸铁0.003%、吐温800.1%;pH6.5-7。
发酵培养基包括以下质量分数的组分:葡萄糖3%、乳糖1%、脱脂乳粉5%、酵母浸粉0.8%、磷酸二氢钾0.3%、磷酸氢二钠0.4%、硫酸镁0.02%、硫酸锰0.008%;pH5.7-6。
实施例1
本实施例的禽用复合益生菌制剂,将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、酪酸梭菌菌液按体积比20:10:20:12:30混合,然后加入羧甲基纤维素制成混悬液,再将混悬液加入硫酸铝溶液中,形成凝聚囊,过滤得到凝聚囊,水洗后干燥即得;上述菌种菌液中的活菌数均不低于109CFU/ml;禽用复合益生菌制剂中活菌总数不低于5×109CFU/g。
本实施例的禽用复合益生菌制剂的制备方法,包括以下步骤:
1、菌液的制备
(1)枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液的制备
(a)菌种的活化:将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接种到营养肉汤培养基中,在37℃、200r/min条件下培养12h;
(b)以3%接种量将活化的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接入液体培养基,在37℃条件下通氧发酵培养36h,过滤后然后将发酵液4000r/m离心5min,倒去上清液,加入无菌水制得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液,所得菌液中活菌数均不低于109CFU/ml;
(2)粪肠球菌菌液的制备
(a)菌种的活化:将粪肠球菌接种到营养肉汤培养基中,在37℃条件下静止培养12h;
(b)以2%接种量将活化的粪肠球菌接入MRS培养基,在37℃条件下静置发酵培养24h,然后将发酵液4000r/m离心5min,倒去上清液,加入无菌水制得粪肠球菌菌液,所得菌液中活菌数均不低于109CFU/ml;
(3)嗜酸乳杆菌菌液的制备
(a)菌种的活化:将嗜酸乳杆菌接种到营养肉汤培养基中,在37℃条件下静止培养12h;
(b)以2%接种量将活化的嗜酸乳杆菌接入发酵培养基,在37℃条件下静置发酵培养24h,然后将发酵液4000r/m离心5min,倒去上清液,加入无菌水制得嗜酸乳杆菌菌液,所得菌液中活菌数均不低于109CFU/ml;
2、将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、酪酸梭菌按比例混合,然后加入混合菌液质量1%的羧甲基纤维素制成混悬液,再将混悬液加入混悬液体积1倍的质量分数5%的硫酸铝溶液中,形成凝聚囊,过滤得到凝聚囊,水洗,42℃干燥得到禽用复合益生菌制剂。
实施例2
本实施例的禽用复合益生菌制剂,将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、酪酸梭菌菌液按体积比30:20:10:20:15混合,然后加入羧甲基纤维素制成混悬液,再将混悬液加入硫酸铝溶液中,形成凝聚囊,过滤得到凝聚囊,水洗后干燥即得;上述菌种菌液中的活菌数均不低于109CFU/ml;禽用复合益生菌制剂中活菌总数不低于5×109CFU/g。
本实施例的禽用复合益生菌制剂的制备方法,包括以下步骤:
1、菌液的制备
(1)枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液的制备
(a)菌种的活化:将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接种到营养肉汤培养基中,在37℃、180r/min条件下培养14h;
(b)以3%接种量将活化的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接入液体培养基,在37℃条件下通氧发酵培养48h,过滤后然后将发酵液3000r/m离心10min,倒去上清液,加入无菌水制得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液,所得菌液中活菌数均不低于109CFU/ml;
(2)粪肠球菌菌液的制备
(a)菌种的活化:将粪肠球菌接种到营养肉汤培养基中,在37℃条件下静止培养14h;
(b)以2%接种量将活化的粪肠球菌接入MRS培养基,在37℃条件下静置发酵培养36h,然后将发酵液3000r/m离心10min,倒去上清液,加入无菌水制得粪肠球菌菌液,所得菌液中活菌数均不低于109CFU/ml;
(3)嗜酸乳杆菌菌液的制备
(a)菌种的活化:将嗜酸乳杆菌接种到营养肉汤培养基中,在37℃条件下静止培养14h;
(b)以2%接种量将活化的嗜酸乳杆菌接入发酵培养基,在37℃条件下静置发酵培养36h,然后将发酵液3000r/m离心10min,倒去上清液,加入无菌水制得嗜酸乳杆菌菌液,所得菌液中活菌数均不低于109CFU/ml;
2、将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、酪酸梭菌按比例混合,然后加入混合菌液质量0.5%的羧甲基纤维素制成混悬液,再将混悬液加入混悬液体积1.5倍的质量分数4%的硫酸铝溶液中,形成凝聚囊,过滤得到凝聚囊,水洗,60℃干燥得到禽用复合益生菌制剂。
实施例3
本实施例的禽用复合益生菌制剂,将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、酪酸梭菌菌液按体积比40:5:30:35:25混合,然后加入羧甲基纤维素制成混悬液,再将混悬液加入硫酸铝溶液中,形成凝聚囊,过滤得到凝聚囊,水洗后干燥即得;上述菌种菌液中的活菌数均不低于109CFU/ml;禽用复合益生菌制剂中活菌总数不低于5×109CFU/g。
本实施例的禽用复合益生菌制剂的制备方法,包括以下步骤:
1、菌液的制备
(1)枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液的制备
(a)菌种的活化:将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接种到营养肉汤培养基中,在37℃、190r/min条件下培养13h;
(b)以3%接种量将活化的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接入液体培养基,在37℃条件下通氧发酵培养42h,过滤后然后将发酵液3500r/m离心8min,倒去上清液,加入无菌水制得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液,所得菌液中活菌数均不低于109CFU/ml;
(2)粪肠球菌菌液的制备
(a)菌种的活化:将粪肠球菌接种到营养肉汤培养基中,在37℃条件下静止培养13h;
(b)以2%接种量将活化的粪肠球菌接入MRS培养基,在37℃条件下静置发酵培养30h,然后将发酵液3500r/m离心8min,倒去上清液,加入无菌水制得粪肠球菌菌液,所得菌液中活菌数均不低于109CFU/ml;
(3)嗜酸乳杆菌菌液的制备
(a)菌种的活化:将嗜酸乳杆菌接种到营养肉汤培养基中,在37℃条件下静止培养13h;
(b)以2%接种量将活化的嗜酸乳杆菌接入发酵培养基,在37℃条件下静置发酵培养30h,然后将发酵液3500r/m离心8min,倒去上清液,加入无菌水制得嗜酸乳杆菌菌液,所得菌液中活菌数均不低于109CFU/ml;
2、将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、酪酸梭菌按比例混合,然后加入混合菌液质量0.8%的羧甲基纤维素制成混悬液,再将混悬液加入混悬液体积2倍的质量分数3%的硫酸铝溶液中,形成凝聚囊,过滤得到凝聚囊,水洗,50℃干燥得到禽用复合益生菌制剂。
对比例
本对比例的禽用复合益生菌制剂,将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液按体积比40:5:30:35混合,然后加入羧甲基纤维素制成混悬液,再将混悬液加入硫酸铝溶液中,形成凝聚囊,过滤得到凝聚囊,水洗后干燥即得;上述菌种菌液中的活菌数均不低于109CFU/ml;禽用复合益生菌制剂中活菌总数不低于5×109CFU/g。
实验例1
本发明禽用复合益生菌制剂的保存期试验
将本发明的禽用复合益生菌制剂在25℃条件下放置12个月,并在0、1、2、4、8、12个月时分别观察外观并测定活菌数,结果如表1所示。
表1 本发明禽用复合益生菌制剂的保存期试验
试验结果表明,本发明复合益生菌制剂在常温下活性基本稳定。
实验例2
本发明的禽用复合益生菌制剂的效果分析
本实验例所用鸡基础日粮为市售常规饲料。
试验动物:选取健康状况良好的雏鸡200只,随机分为5组,每组40只。
试验组别:试验组1-3组分别饲喂添加量为1%实施例1-3的复合益生菌制剂的鸡基础日粮,对比组饲喂添加量为1%对比例的复合益生菌制剂的鸡基础日粮,空白组饲喂鸡基础日粮。
试验方法:采取舍内笼养,自由采食、饮水,每次喂量以鸡吃饱后料槽内略有余料为度,连续饲喂30天。试验期间,每天准确记录鸡重、饲料的给料量和撒料量,并于试验第30天上午,每个重复选择10只健康鸡进行粪样收集,用50ml灭菌离心管采集新鲜无污染粪便,放入-20℃冰箱保存待测。
观察本发明畜禽用复合益生菌制剂对肉仔鸡生长性能及免疫器官指数的影响,试验结果详见下表2、表3、表4。
表2 各处理组对鸡生长性能的影响
组别 | 日增重(g/d) | 日采食量(g/d) | 料重比 |
试验组1 | 39.45±0.68 | 83.26±3.48 | 2.11±0.02 |
试验组2 | 39.17±0.82 | 82.67±10.39 | 2.12±0.03 |
试验组3 | 40.54±0.51 | 83.09±2.27 | 2.04±0.07 |
对比组 | 36.12±0.86 | 81.95±2.29 | 2.26±0.05 |
空白组 | 35.85±0.76 | 81.15±5.36 | 2.30±0.08 |
表3 各处理组对鸡免疫器官的影响
组别 | 胸腺指数(mg/g) | 脾指数(mg/g) | 法氏囊指数(mg/g) |
试验组1 | 6.98±1.45 | 2.19±0.56 | 5.98±1.75 |
试验组2 | 7.12±1.63 | 2.21±0.69 | 5.89±1.58 |
试验组3 | 7.34±2.00 | 2.31±0.76 | 6.12±1.34 |
对比组 | 6.81±1.66 | 1.98±0.36 | 5.58±1.27 |
空白组 | 6.40±1.50 | 1.84±0.27 | 4.76±1.20 |
表4 各处理组对鸡粪便中微生物的影响(log10CFU/g鲜内容物)
项目 | 试验组1 | 试验组2 | 试验组3 | 对比组 | 空白组 |
大肠杆菌 | 3.45±1.65 | 4.12±0.98 | 3.24±0.76 | 4.51±1.23 | 6.73±0.85 |
沙门氏菌 | 0.75±2.01 | 0.63±1.68 | 0.58±1.29 | 0.88±1.56 | 1.72±2.00 |
由表2、3和4看出,实施例1-3的复合益生菌制剂在调节鸡生长性能、增强免疫功能及抗病能力方面均强于对比组的复合益生菌制剂。
Claims (10)
1.一种禽用复合益生菌制剂,其特征在于,将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、酪酸梭菌菌液按体积比20-40:5-20:10-30:12-35:15-30混合,然后加入羧甲基纤维素制成混悬液,再将混悬液加入硫酸铝溶液中,形成凝聚囊,过滤得到凝聚囊,水洗后干燥即得;上述菌种菌液中的活菌数均不低于109CFU/ml。
2.根据权利要求1所述的禽用复合益生菌制剂,其特征在于,所述禽用复合益生菌制剂中活菌总数不低于5×109CFU/g。
3.一种如权利要求1所述的禽用复合益生菌制剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:将枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、酪酸梭菌菌液按体积比混合,然后加入混合菌液质量0.5-1%的羧甲基纤维素制成混悬液,再将混悬液加入混悬液体积1-2倍的质量分数3-5%的硫酸铝溶液中,形成凝聚囊,过滤得到凝聚囊,水洗,干燥得到禽用复合益生菌制剂;上述菌种菌液中的活菌数均不低于109CFU/ml。
4.根据权利要求3所述的禽用复合益生菌制剂的制备方法,其特征在于,所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液的制备方法包括以下步骤:
(1)菌种的活化:将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接种到营养肉汤培养基中,在37℃、180-200r/min条件下培养12-14h;
(2)以3%接种量将活化的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌分别接入液体培养基,在37℃条件下通氧发酵培养36-48h,过滤然后将发酵液3000-4000r/m离心5-10min,倒去上清液,加入无菌水制得枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酪酸梭菌菌液,所得菌液中活菌数均不低于109CFU/ml。
5.根据权利要求4所述的禽用复合益生菌制剂的制备方法,其特征在于,所述液体培养基包括以下质量分数的组分:葡萄糖0.1%、淀粉0.2%、豆粕水解液2%、磷酸二氢钾0.3%、磷酸氢二钾0.2%,硫酸镁0.05%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%。
6.根据权利要求3所述的禽用复合益生菌制剂的制备方法,其特征在于,所述粪肠球菌菌液的制备方法包括以下步骤:
(1)菌种的活化:将粪肠球菌接种到营养肉汤培养基中,在37℃条件下静止培养12-14h;
(2)以2%接种量将活化的粪肠球菌接入MRS培养基,在37℃条件下静置发酵培养24-36h,然后将发酵液3000-4000r/m离心5-10min,倒去上清液,加入无菌水制得粪肠球菌菌液,所得菌液中活菌数均不低于109CFU/ml。
7.根据权利要求6所述的禽用复合益生菌制剂的制备方法,其特征在于,所述MRS培养基包括以下质量分数的组分:胰蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、葡萄糖1%、蔗糖0.5%、醋酸钠1.5%、柠檬酸铵0.2%、磷酸二氢钾0.4%、硫酸锰0.05%、硫酸镁0.02%、硫酸铁0.003%、吐温800.1%。
8.根据权利要求3所述的禽用复合益生菌制剂的制备方法,其特征在于,所述嗜酸乳杆菌菌液的制备方法包括以下步骤:
(1)菌种的活化:将嗜酸乳杆菌接种到营养肉汤培养基中,在37℃条件下静止培养12-14h;
(2)以2%接种量将活化的嗜酸乳杆菌接入发酵培养基,在37℃条件下静置发酵培养24-36h,然后将发酵液3000-4000r/m离心5-10min,倒去上清液,加入无菌水制得嗜酸乳杆菌菌液,所得菌液中活菌数均不低于109CFU/ml。
9.根据权利要求8所述的禽用复合益生菌制剂的制备方法,其特征在于,所述发酵培养基包括以下质量分数的组分:葡萄糖3%、乳糖1%、脱脂乳粉5%、酵母浸粉0.8%、磷酸二氢钾0.3%、磷酸氢二钠0.4%、硫酸镁0.02%、硫酸锰0.008%。
10.根据权利要求4、6或8所述的禽用复合益生菌制剂的制备方法,其特征在于,所述营养肉汤培养基包括以下质量分数的组分:蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、氯化钠0.5%。
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