CN102177438A - 蛋白筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供可用于在体外鉴定具有期望特征的多肽的方法和组合物。
Description
相关申请
本申请要求2008年7月25日提交的美国临时申请第61/083813号、2008年8月19日提交的美国临时申请第61/090111号和2009年4月16日提交的美国临时申请第61/170029号的优先权,所述临时申请的内容通过引用并入本文。
背景
充分了解的是,在展示和选择技术的应用中,较高的多样性的获得容许更有效地选择具有最高亲和力、特异性、稳定性和/或其他期望特征的分子。
过去已开发的方法包括:噬菌体展示、核糖体展示、CIS展示和mRNA展示。最近,在使用体内筛选鉴定分子方面存在增加的兴趣(J Control Release.2003 Aug 28;91(1-2):183-6)。使用噬菌体展示已使这种方法成为可能,但是这种方法具有噬菌体展示技术所提供的有限的多样性。由于RNA物质的不稳定性,核糖体展示或mRNA展示将无法用于这种应用。因此,DNA-蛋白融合体的开发由于该物质的增加的稳定性而将是高度期望的。
已经描述了三种类型的DNA-蛋白融合体。CIS展示是一种使用偶联的体外转录/翻译来在DNA被转录和翻译时产生与DNA共价结合的dsDNA结合蛋白的方法(PNAS,101(9):2806-2810)。然而,该技术的主要局限之一是在转录/翻译过程中合成的蛋白可以与附近任何邻近的DNA结合,从而导致错误标记的融合体。第二种方法是Kurz和Lohse的方法(Chembiochem.2001年9月3日;2(9):666-72)。此方法涉及使用多官能物质形成与mRNA的共价加成物,该多官能物质可以与翻译的蛋白共价键合,而在共价加成物处产生RNA上的核糖体停顿,并充当反转录的引物。这种方法的局限是使用补骨脂素与RNA的共价交联步骤是低效的。第三种方法是Yonezawa等人的方法(Nucleic Acids Res.2003年10月1日;31(19):e118.)。在此方法中,将编码链霉抗生物素和多种肽的区域的DNA生物素化,置于具有翻译机制的合成微球中并进行翻译使得链霉抗生物素(四聚体)结合在生物素化的DNA上。这种方法的局限是所得物质是四聚体,这对于亲和力选择可能是麻烦的,因为在一个粒子上会有多种结合物质(再结合作用)。
本文描述一种用于产生需要的核酸蛋白融合体的简单有效的方法,该方法可以采用核酸与蛋白之间的非共价连接并且将容许DNA-蛋白融合体形成。
发明概述
本发明提供了选择和进化蛋白和核酸的期望特性的组合物和方法。在多个实施方案中,本发明包括与核酸或修饰的核酸连接的小分子。其他实施方案包括:制备多肽的方法,所述多肽包括具有修饰的氨基酸的肽;实现选择群体中具有期望特性的个别成员的测定;和用于产生具有改良特性的多肽的新变异的方法。
在一个方面,本发明提供异双功能复合体,所述异双功能复合体包含:
(a)第一核酸分子,所述第一核酸分子包含多肽编码序列;
(b)多肽,所述多肽由所述第一核酸分子编码;和
(c)第二核酸分子,所述第二核酸分子包含与所述第一核酸分子的部分互补的核酸序列,
其中所述第一核酸分子通过互补的核酸碱基配对与所述第二核酸分子结合,并且其中所述第二核酸分子与所述多肽非共价结合。
在一些实施方案中,这种异双功能复合体还包含:
(a)高亲和力配体,所述高亲和力配体与第二核酸分子共价结合;和
(b)配体受体,所述配体受体与肽受体结合,
其中所述高亲和力配体与所述配体受体结合并且所述肽受体与多肽共价结合。在一些实施方案中,这种异双功能复合体还包含第二高亲和力配体,其中所述第二高亲和力配体与肽受体共价结合,并且其中所述第二高亲和力配体与配体受体结合。在一些实施方案中,这种异双功能复合体中的肽受体通过连接物与第二高亲和力配体结合。在一个优选的实施方案中,连接物包括聚乙二醇。在另一优选的实施方案中,连接物还包括多聚唾液酸连接物。在一些实施方案中,这种异双功能复合体中的配体受体与肽受体共价结合。
在一些实施方案中,这种异双功能复合体还包含:
(a)配体受体,所述配体受体与第二核酸分子共价结合;和
(b)高亲和力配体,所述高亲和力配体与肽受体结合,
其中所述配体受体与所述高亲和力配体结合并且所述肽受体与多肽的C端共价结合。
在其他实施方案中,这种异双功能复合体还包含第三核酸分子,所述第三核酸分子包含与第二核酸分子的部分互补的核酸序列,其中所述第三核酸分子通过互补的核酸碱基配对与所述第二核酸分子结合,其中所述第三核酸分子与肽受体共价结合,并且其中所述肽受体与多肽共价结合。
在一些实施方案中,上述复合体中的第二核酸分子是分支的核酸分子。在一些实施方案中,上述复合体中的第二核酸分子能够充当第一核酸分子反转录的引物。
在另一方面,本发明提供X-展示复合体(例如,核酸多肽复合体),该X-展示复合体包含:
(a)核酸分子,所述核酸分子包含多肽编码序列,该核酸分子与第一高亲和力配体共价结合;
(b)多肽,所述多肽由所述核酸分子编码;
(c)配体受体,所述配体受体与肽受体结合,
其中所述高亲和力配体与所述配体受体结合并且所述肽受体与所述多肽的C端共价结合。
在一些实施方案中,这种X-展示复合体中的配体受体与肽受体共价结合。在一些实施方案中,这种X-展示复合体还包含第二高亲和力配体,其中所述第二高亲和力配体与肽受体共价结合,并且其中所述第二高亲和力配体与配体受体结合。
在另一方面,本发明提供X-展示复合体,所述X-展示复合体包含:
(a)核酸分子,所述核酸分子包含多肽编码序列,该核酸分子与第一高亲和力配体共价结合;
(b)第一配体受体,所述第一配体受体与第二高亲和力配体共价结合;和
(c)多肽,所述多肽由第一核酸分子编码,其中所述多肽包含第二配体受体,
其中所述第一高亲和力配体与所述第一配体受体结合,并且所述第二高亲和力配体与所述第二配体受体结合。
在一些实施方案中,与上述复合体结合的第一高亲和力配体或第二高亲和力配体是生物素。
在一些实施方案中,与上述复合体结合的第一高亲和力配体或第二高亲和力配体选自包括下列的组:FK506、氨甲喋呤、PPI-2458、生物素、蛭素、ZFVp(O)F、荧光素-生物素、ABD(白蛋白结合结构域)、18bp DNA、RNA酶A、氯烷烃、芳基(β-氨基乙基)酮和蛋白A。
在一些实施方案中,上述复合体中的第一配体受体或第二配体受体选自包括下列的组:FKBP12、二氢叶酸还原酶、甲硫氨酸氨基肽酶、二聚链霉抗生物素、链霉抗生物素四聚体、凝血酶、羧肽酶、单价抗体、HSA(白蛋白)、锌指、hRI(RNA酶抑制剂)、突变的卤代烷烃脱卤素酶、haloTag和分选酶。
在一些实施方案中,上述复合体中的第一配体受体或第二配体受体是链霉抗生物素。
在一些实施方案中,上述多肽选自包括下列的组:抗体、VH结构域、VL结构域、Fab片段、单链抗体、纳米抗体(nanobody)、unibody、adnectin、亲和体(affibody)、DARPin、anticalin、avimer、10Fn3结构域和versabody。
在另一方面,本发明提供X-展示复合体,所述X-展示复合体包含:
(a)核酸分子,所述核酸分子包含多肽编码序列,该核酸分子与配体共价连接;和
(b)多肽,所述多肽由第一核酸分子编码,其中所述多肽包含配体受体,
其中所述配体与所述配体受体结合。
在一些实施方案中,与X-展示复合体结合的配体是FK506并且核酸-多肽复合体中的配体受体是FKBP的FK506-结合结构域。
在一些实施方案中,与上述复合体结合的第一核酸分子选自由下列组成的组:ssRNA、ssDNA、ssDNA/RNA杂交dsDNA和dsDNA/RNA杂交体。
在一些实施方案中,与上述复合体结合的第一核酸分子的多肽编码序列不含有框内终止密码子。
在一些实施方案中,上述多肽是结合蛋白。在一个优选的实施方案中,所述结合蛋白是抗体的VH结构域或VL结构域。
在一些实施方案中,上述核酸-多肽复合体不含有核糖体。
在另一方面,本发明还提供包含多种上述X-展示复合体的文库,其中所述复合体的至少一部分含有不同的多肽编码序列。
在另一方面,本发明还提供制备核酸-多肽复合体的文库的方法,所述方法包括下列步骤:
-提供mRNA序列的文库,所述mRNA序列包含与第一核酸连接物互补的序列元件;
-提供第一核酸连接物,所述第一核酸连接物与第一高亲和力配体可操作地连接以便使所述第一核酸连接物通过互补的核酸碱基配对与mRNA结合;
-提供第二高亲和力配体,所述第二高亲和力配体与肽受体可操作地连接;
-提供具有至少两个结合位点的配体受体或提供至少以便使所述配体受体与所述第一高亲和力配体和所述第二高亲和力配体结合;
-容许mRNA翻译进行以便使肽受体与翻译的蛋白结合,从而形成连接mRNA与蛋白的核酸-多肽复合体。
在一些实施方案中,所述方法还包括:
-容许使用X-展示复合体中的第一核酸连接物作为引物进行mRNA反转录以便形成DNA/RNA杂交体。
在一个优选的实施方案中,所述方法还包括:
-降解mRNA并合成互补的DNA链,从而形成核酸-多肽复合体中的DNA/DNA杂交体。
在一些实施方案中,文库中的mRNA还包含TMV增强子。
在一些实施方案中,文库中的mRNA还包含Cμ序列。
在一些实施方案中,文库中的mRNA还包含FLAG标签。
在一些实施方案中,文库中的mRNA还包含SA展示序列。
在一些实施方案中,文库中的mRNA还包含A20尾。
在另一方面,本发明还提供由本发明中所描述的方法制备的核酸-多肽复合体的文库。
在另一方面,本发明还提供选择分离的核酸分子的方法,所述分离的核酸分子编码能够与感兴趣的抗原结合的多肽,所述方法包括下列步骤:
(a)提供本发明中所述的X-展示复合体的文库;
(b)使所述文库接触感兴趣的抗原;
(c)从所述文库中选择与感兴趣的抗原结合的至少一种X-展示复合体;和
(d)分离所选择的X-展示复合体的多肽编码序列。
在另一方面,本发明还提供制备多肽的方法,所述多肽能够结合感兴趣的抗原,所述方法包括将通过本发明中所述的方法鉴定的多肽编码序列引入表达环境中以便产生所编码的多肽。
在另一方面,本发明还提供编码多肽的分离的核酸分子,所述多肽能够与感兴趣的抗原结合,所述分离的核酸分子通过本发明所述的方法选择。
在另一方面,本发明还提供X-展示复合体,所述X-展示复合体包含:
(a)第一核酸分子,所述第一核酸分子包含多肽编码序列;
(b)多肽,所述多肽由所述第一核酸分子编码;
(c)第二核酸分子,所述第二核酸分子包含与所述第一核酸分子的部分互补的核酸序列;
(d)第一高亲和力配体,所述第一高亲和力配体与所述第二核酸分子共价结合;
(e)第一配体受体;和
(f)第二高亲和力配体,所述第二高亲和力配体经由一个或多个连接分子与肽受体共价结合,
其中所述第一核酸分子通过互补的核酸碱基配对与所述第二核酸分子结合,
其中所述第一高亲和力配体与所述配体受体在第一结合位点非共价结合,
其中所述第二配体与所述配体受体在第二结合位点非共价结合,并且
其中所述一种或多种连接分子是聚乙二醇分子。
在一些实施方案中,这种复合体中的第一高亲和力配体是生物素并且配体受体选自包括下列的组:链霉抗生物素、二聚链霉抗生物素和四聚链霉抗生物素。
在一些实施方案中,这种复合体中的第二高亲和力配体是生物素并且配体受体选自包括下列的组:链霉抗生物素、二聚链霉抗生物素和四聚链霉抗生物素。
在一些实施方案中,这种复合体中的第一高亲和力配体或第二高亲和力配体选自包括下列的组:FK506、氨甲喋呤、PPI-2458、生物素、蛭素、ZFVp(O)F、荧光素-生物素、ABD(白蛋白结合结构域)、18bp DNA、RNA酶A、氯烷烃、芳基(β-氨基乙基)酮和蛋白A。
在一些实施方案中,这种复合体还包含第二配体受体。
在一些实施方案中,上述复合体中的第二配体受体选自包括下列的组:FKBP12、二氢叶酸还原酶、甲硫氨酸氨基肽酶、二聚链霉抗生物素、链霉抗生物素四聚体、凝血酶、羧肽酶、单价抗体、HSA(白蛋白)、锌指、hRI(RNA酶抑制剂)、突变的卤代烷烃脱卤素酶、haloTag和分选酶。
在一些实施方案中,这种复合体中的肽受体是嘌呤霉素。
在一些实施方案中,这种复合体中的第一核酸分子或第二核酸分子还包括补骨脂素。
在一些实施方案中,多肽选自包括下列的组:抗体、VH结构域、VL结构域、Fab片段、单链抗体、纳米抗体、unibody、adnectin、亲和体、DARPin、anticalin、avimer、10Fn3结构域和versabody。
在另一方面,本发明提供异双功能复合体,所述异双功能复合体包含:
(a)第一高亲和力配体,所述第一高亲和力配体与核酸分子共价结合;
(b)第二高亲和力配体,所述第二高亲和力配体与肽受体共价结合;和
(c)配体受体,所述配体受体包含两个或更多个配体结合位点;
其中所述第一高亲和力配体和第二高亲和力配体在不同的配体结合位点与配体受体结合。
在一些实施方案中,这种复合体中的第一高亲和力配体和第二高亲和力配体是相同的。
在一些实施方案中,这种复合体中的第一高亲和力配体和第二高亲和力配体是生物素。
在一些实施方案中,这种复合体中的核酸分子包含补骨脂素部分。
在一些实施方案中,这种复合体中的肽受体是嘌呤霉素。
在一些实施方案中,这种复合体中的配体受体是多聚蛋白。
在一些实施方案中,这种复合体中的配体受体是链霉抗生物素。
附图简述
图1图解了本文所述方法的一个实施方案。
图2图解了使用先进引物的这种实施方案,所述先进引物是具有两个3’末端的倒转极性引物(inverted polarity primer),该引物可以方便地引发cDNA并且在相对的末端携带嘌呤霉素或衍生物或小分子。
图3图解使用先进引物的这种实施方案,所述先进引物是茎环变体并且可以回折且方便地引发cDNA。
图4图解用于改善或进化抗体重链可变区的结构/功能的方法的一个实施方案,其中多肽与FK12BP蛋白融合,FK12BP蛋白可以与核酸连接的FK506小分子非共价结合,从而连接改善的(进化的)表型(多肽)与其编码基因型(核酸)。
图5图解体外展示方法的一个实施方案,该实施方案使用分支的寡核苷酸连接物和互补的寡核苷酸,该互补的寡核苷酸包含共价连接的肽受体。
图6图解体外展示方法的一个实施方案,该体外展示方法使用与肽受体共价连接的分支的寡核苷酸连接物。
图7图解体外展示方法的一个实施方案,该体外展示方法使用高亲和力配体和配体受体。
图8图解体外展示方法的一个实施方案,该体外展示方法使用高亲和力配体和配体受体,其中所述配体受体与肽受体共价连接。
图9图解体外展示方法的一个实施方案,该体外展示方法使用高亲和力配体和配体受体,其中所述配体受体与肽受体非共价连接。
图10图解体外展示方法的一个实施方案,该体外展示方法使用高亲和力配体和配体受体,其中第一配体受体分子与第二(非关联的)高亲和力配体共价连接,其中所述第一配体受体分子可以与共价连接至核酸的关联的第一高亲和力配体结合,并且其中所述第二高亲和力配体可以与关联的第二配体受体结合,所述关联的第二配体受体与所述核酸所编码的多肽融合。
图11图解用于使用高亲和力配体和配体受体的体外展示方法的一个实施方案中的单独组分的非限制性实例。
图12图解用于使用高亲和力配体和配体受体的体外展示方法的一个实施方案的核酸/蛋白复合体的非限制性装配顺序。
图13图解优选的X-展示复合体的设计。
图14图解制备VH文库、装配展示复合体、选择和纯化所述展示复合体的示例性方案。
图15图解VH文库的样品单克隆。图例显示了转录和翻译起始序列、VH序列、Cu序列、FLAG标签序列、与连接物(例如,NA连接物)互补的DNA区段。
图16图解展示方法的优选实施方案的步骤。图16A首先描绘包含mRNA分子(含有适当的连接物、标签、互补区和多聚A尾)的X-展示复合体,所述mRNA分子经由互补的链配对和补骨脂素连接而与连接物/RT引物(NA连接物)连接。NA连接物还与生物素(B)分子共价结合,生物素分子与链霉抗生物素分子缔合。链霉抗生物素与第二生物素分子缔合,该第二生物素分子本身与被连接至翻译的蛋白的嘌呤霉素共价结合。图16A描绘反转录(步骤1)和RNA降解(步骤2)。图16B描绘产生DNA/RNA杂交体的第二链合成(步骤4)。16B最后描绘的是最终的dsDNAX-展示复合体(即,X-展示复合体)。
图17描绘潜在的文库成员以及在一些实施方案中引物如何用于454测序。
图18描绘VH文库成员的示例性区段。
图19描绘展示文库成员的实例性区段并且还展示远离引物的末端序列(参见图17)。
图20描绘展示文库成员的示例性区段并且还提供远离引物的TMVUTR和C-mu区的示例性序列。
图21描绘用于扩增被选择用于测序的克隆的引物的可能排列。
图22图解从文库中选择的本发明的一个实施方案的过程,说明该方法可能是迭代的以便使在第一轮中所选择的核酸/蛋白可用于产生用于后续轮的X-展示复合体形成和选择的文库。
图23图解本发明的一个实施方案,其中采用几轮的选择而不再生文库或扩增选择产物。
图24图解由mRNA设计VH和VL文库的一种方法。
图25图解选择方法的一个示例性实施方案,其中将用于亲和力选择的靶分子固定在固体支撑物上。
图26图解选择方法的一个示例性实施方案,其中在细胞表面上表达用于亲和力选择的靶分子。在这种实施方案中,对不表达展示复合体的细胞选择所述复合体(例如,为了移除与细胞结合但是不与感兴趣的靶结合的复合体)并且然后对表达感兴趣的靶的细胞选择所述复合体(即,鉴定特异性结合物)。
图27图解DNA X-展示复合体(即,DNA-蛋白融合体),其中来源标签已被掺入到核酸中(例如,以鉴定编码DNA的来源)并且使用恒定来源编码来标签自不同轮选择的核酸(例如,在从一次测序运行的不同轮选择汇集核酸时是有用的)。
图28图解DNA X-展示复合体(即,DNA-蛋白融合体)和N6引物的添加。
图29描绘显示序列分析方案的一个实施方案的流程图。
图30图解mRNA转录、纯化和交联过程的示例性结果。
图31图解mRNA转录、纯化和链霉抗生物素加载过程的示例性结果。
图32图解在RNA酶H处理和洗脱过程之后的示例性结果。
图33图解在RNA酶H处理和洗脱过程之后的示例性结果。
图34图解在RT-PCR和第二链合成过程之后的示例性结果。
图35图解可用于文库设计以容许将多轮选择汇集为一次测序运行的汇集物标记(pool tagging)。
图36图解用于制备VH文库的示例性供体细胞。
发明详述
本发明提供了选择和进化蛋白和核酸的期望特性的组合物和方法。所述方法在本文中可以称为“X-展示”或者在采用链霉抗生物素的一些实施方案中称为“SA展示”。在多个实施方案中,本发明包括与核酸或修饰的核酸连接的小分子。其他实施方案包括:制备多肽的方法,所述多肽包括具有修饰的氨基酸的肽;实现选择群体中具有期望特性的个别成员的测定;和用于产生具有改良特性的多肽的新变异的方法。
“选择”意指基本上将群体中的一种分子与其他分子分开。如本文所用的“选择”步骤在选择步骤之后提供与群体中不期望的分子相比至少2-倍,在一些实施方案中3-倍、5-倍、10-倍、20-倍、优选30-倍、更优选100-倍并且最优选1000-倍富集的期望分子。可以重复任何次数的选择步骤并且可以在给定的方法中组合不同类型的选择步骤。
“蛋白”意指通过一个或多个肽键连接的任何两种或多种天然存在的或修饰的氨基酸。“蛋白”和“肽”在本文中可互换使用。
“RNA”意指两种或更多种共价键合的天然存在的或修饰的核糖核苷酸的序列。此术语中所包括的修饰的RNA的一个实例是硫代磷酸RNA。
“DNA”意指两种或更多种共价键合的天然存在的或修饰的脱氧核糖核苷酸的序列。
“核酸”意指任何两种或更多种共价键合的核苷酸或核苷酸类似物或衍生物。如本文所用的这个术语包括但不限于DNA、RNA和PNA。术语“核酸”可以包括修饰的核酸并且因此核酸和修饰的核酸可以互换使用。
如本文所用的术语“核苷酸类似物”或“核苷酸衍生物”或“修饰的核酸”是指修饰的或非天然存在的核苷酸,例如5-丙炔基嘧啶(即,5-丙炔基-dTTP和5-丙炔基-dTCP)、7-脱氮嘌呤(即,7-脱氮-dATP和7-脱氮-dGTP)。核苷酸类似物包括碱基类似物并且包括修饰形式的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。
“肽受体”意指能够通过核糖体肽基转移酶功能的催化活性被添加到生长的蛋白链的C端的任何分子。通常,这种分子含有(i)核苷酸或核苷酸样部分(例如,腺苷或腺苷类似物(在N-6氨基位置的二甲基化是可接受的))、(ii)氨基酸或氨基酸样部分(例如,20种D-氨基酸或L-氨基酸的任一种或它们的任何氨基酸类似物(例如O-甲基酪氨酸或Ellman等人,Meth.Enzymol.202:301,1991所述的任何类似物)、和(iii)这两者之间的连接(例如,在3’位置的酯、酰胺或酮连接,不太优选的是在2’位置);优选地,这种连接不显著地打乱来自天然核糖核苷酸构象的环褶皱。肽受体还可以具有亲核体,该亲核体可以是但不限于:氨基、羟基或巯基。此外,肽受体可以由核苷酸模拟物、氨基酸模拟物或组合的核苷酸-氨基酸结构的模拟物构成。
如本文所用术语“X-展示复合体”、“核酸-多肽复合体”和“核酸-蛋白融合体”是可互换的,并且意思是指由核酸和该核酸所编码的蛋白(或肽或其片段)的直接或间接相互作用形成的复合体。在一些情况下,X-展示复合体可以称为“展示复合体”或“展示融合体”,并且本领域技术人员将通过这种用途的内容理解它不应与本文可能引用的其他类型的展示***混淆。在一些实施方案中,核酸是RNA,例如,mRNA。在其他优选的实施方案中,核酸是DNA或cDNA。因此,在目标是展示含有DNA的复合体的一些实施方案中,X-展示复合体可以称为“DNA-蛋白融合体”或“DNA-展示融合体”。重要的是注意术语“融合”的使用不暗示或表示核酸与肽或蛋白共价连接。在一些实施方案中,RNA或DNA可以是修饰的或改变的。在优选的实施方案中,核酸与蛋白之间的相互作用是非共价的(例如,相互作用可以通过生物素/链霉抗生物素相互作用、连接物分子和本文所述的类似物介导)。在优选的实施方案中,核酸是mRNA或修饰的mRNA。
“改变的功能”意指分子功能方面的任何质的或量的改变。
如本文所用的“结合配偶体”意指对期望的DNA-蛋白融合体的部分具有特异性的共价或非共价亲和力的任何分子。结合配偶体的实例包括但不限于下列的成员:抗原/抗体对、蛋白/抑制剂对、受体/配体对(例如细胞表面受体/配体对,如激素受体/肽激素对)、酶/底物对(例如,激酶/底物对)、凝集素/碳水化合物对、寡聚或异源寡聚蛋白聚集体、DNA结合蛋白/DNA结合位点对、RNA/蛋白对和核酸双链体、异源双链体或连接的链以及能够与X-展示复合体的任一部分形成一种或多种共价或非共价键(例如,二硫键)的任何分子。
“固体支撑物”意指但不限于亲和复合体可以直接或间接结合(例如,通过其他结合配偶中间物,如其他抗体或蛋白A)或亲和复合体可以包埋于其中(例如,通过受体或通道)的任何柱(或柱材料)、珠子、试管、微量滴定皿、固体粒子(例如,琼脂糖(agarose或sepharose))、微芯片(例如,硅、硅-玻璃或金芯片)或膜(例如,脂质体或囊泡的膜)。
介导X-展示复合体的核酸连接物或修饰的核酸连接物
在本发明的一个方面,核酸(天然mRNA或修饰的mRNA)可以通过使用在核酸3’端杂交的核酸连接物或修饰的核酸连接物(“NA连接物”)与其编码的蛋白在翻译结尾时连接。在这种实施方案中,NA连接物在连接物中具有倒转的极性使得它有效地具有两个3’端,这两个3’末端的非杂交化末端将其连接至能够与多肽蛋白以高亲和力共价或非共价结合的嘌呤霉素或相关类似物或小分子。因此,在一些实施方案中,X-展示复合体是通过蛋白和核酸与NA连接物的相互作用形成的。
在一些实施方案中,NA连接物是补骨脂素连接物。在一些优选的实施方案中,连接物是XB-PBI。在一些实施方案中,可以使用XB-DDB。在一些优选的实施方案中,连接物(例如,PBI连接物或DDB连接物)与高亲和力配体(例如,生物素)连接,即,连接物包括高亲和力配体。
在一些实施方案中,核酸(例如,天然mRNA或修饰的mRNA)可以与NA连接物交联,该NA连接物还与肽受体或高亲和力配体连接。这种交联可以通过本领域已知的任何方法来完成。例如,通过整体引用并入本文的美国专利第6416950号描述了进行这种交联的方法(参见,例如,美国专利第6416950号的图9-13)。
在又一实施方案中,本发明包括在连接物中具有倒转的5’-3’极性的双功能NA连接物以便使其能够与核酸如mRNA或修饰的mRNA模板杂交,其中所述杂交在编码区外的mRNA的3’端发生,并且其中所述核酸/修饰的连接物在其另一3’端携带肽受体,如嘌呤霉素或其功能类似物(例如,但不限于吡唑嘧啶)或能够与多肽蛋白共价结合或高亲和力地结合的小分子。
在几个实施方案中,核酸,优选mRNA或修饰的mRNA在3’端与NA连接物杂交,该NA连接物本身通过共价键或通过高亲和力非共价键与多肽(或修饰的多肽)共价结合或高亲和力地结合。
在其他实施方案中,NA连接物能够充当反转录mRNA的引物。
另一实施方案包括与NA连接物可操作地连接的编码核酸,该编码核酸在其“5’端”携带反转极性的核酸部分(在引号中,如同有效地具有指导聚合的3’极性一样),使得其除了经由茎环结构结合在NA连接物上的能力之外可以充当编码核酸模板聚合的引物,该NA连接物在其3’端携带嘌呤霉素或相关类似物或小分子(参见图2和3)。
在一些实施方案中,编码核酸与分支的NA连接物可操作地连接,其中NA连接物的部分与编码核酸的3’端互补(参见图5)。设想产生分支的NA连接物的任何本领域公认的手段。分支点可以在NA连接物内的任何位置出现。这种分支的NA连接物还可以充当它们所结合的编码核酸如mRNA反转录的引物。
在一些实施方案中,编码核酸与分支的NA连接物可操作地连接,其中所述连接物与肽受体共价连接(参见图6)。
在一些实施方案中,NA连接物包含锁核酸(LNA),例如,二环核酸,其中核糖核苷在2’-氧和4’-碳原子之间由亚甲基单元连接。在具体的实施方案中,NA连接物与编码核酸互补的区域包含至少一部分LNA以增加核酸双链体的稳定性(参见Kaur等人(2006).Biochemistry 45(23):7347-55。
配体/受体连接
在另一方面,X-展示复合体(例如,编码核酸和编码的多肽)通过高亲和力配体与其关联结合配偶体(配体受体)之间的高亲和力结合或共价结合而形成。在这种实施方案中,核酸可以与高亲和力配体共价或非共价连接,所述高亲和力配体继而与配体受体非共价或共价结合。在优选的实施方案中,相互作用是非共价的。在一些实施方案中,配体受体还与第二高亲和力配体缔合,所述第二高亲和力配体继而与肽受体连接。
高亲和力配体/配体受体对的非限制性实例包括但不限于FK506/FKBP12、氨甲喋呤/二氢叶酸还原酶、和PPI-2458/甲硫氨酸氨基肽酶2。配体/配体受体对的其他非限制性实例示于表1中。在一些实施方案中,配体/配体受体对是生物素/链霉抗生物素。被考虑用于本发明方法的任何形式的链霉抗生物素包括但不限于:单体链霉抗生物素、二聚链霉抗生物素、四聚链霉抗生物素和它们的化学修饰的或遗传修饰的变体。在一些实施方案中,配体受体是四聚链霉抗生物素。在具体的实施方案中,四聚链霉抗生物素被化学交联以增加稳定性。
表1.高亲和力配体/配体受体对的非限制性实例
在一些实施方案中,高亲和力配体与核酸共价连接(配体/核酸分子)。设想连接高亲和力配体与核酸的任何本领域公认的方法。在一个实施方案中,高亲和力配体与mRNA分子的3’端共价连接。
在一些实施方案中,高亲和力配体受体分子与肽受体共价连接,该肽受体继而可以通过核糖体的肽基转移酶活性与翻译的蛋白共价连接(参见图8)。高亲和力配体受体与肽受体的连接可以是直接的或经由连接物分子连接。设想用于本发明方法的任何本领域公认的连接分子。在一个实施方案中,使用聚乙二醇连接物分子将高亲和力配体受体与肽受体连接。
在一些实施方案中,高亲和力配体与肽受体共价连接,该肽受体继而可以通过核糖体的肽基转移酶活性与翻译的蛋白共价连接(参见图9)。在一些优选的实施方案中,这种配体/肽受体分子可以通过诸如四聚链霉抗生物素等多聚配体受体与配体/核酸分子非共价连接。高亲和力配体与肽受体的共价连接可以是直接的或经由连接物分子连接。设想用于本发明方法的任何本领域公认的连接物。在具体的实施方案中,使用聚乙二醇连接物分子将高亲和力配体与肽受体连接。
在一些实施方案中,配体受体分子与核酸所编码的多肽融合(参见图4和10)。这种融合可以使用化学交联剂以化学方式进行或者以遗传方式进行。配体受体分子可以在任何区域与编码的多肽融合。在具体的实施方案中,配体受体分子与编码的多肽的N端区域以遗传方式融合。
在一些实施方案中,第一配体受体分子与第二(非关联的)高亲和力配体共价连接。在这种实施方案中,第一配体受体分子可以与关联的第一高亲和力配体结合,该关联的第一高亲和力配体与核酸共价连接。第二高亲和力配体可以与关联的第二配体受体结合,该关联的第二配体受体与核酸所编码的多肽融合。
在优选的实施方案中,配体受体分子,优选多价配体受体(例如,多价链霉抗生物素)与第一高亲和力配体(例如,生物素)非共价结合,该第一高亲和力配体与和mRNA分子互补的核酸共价连接。所述多价配体受体还与第二高亲和力配体(例如,生物素)非共价结合,该第二高亲和力配体与肽受体(例如,嘌呤霉素)共价连接。所述第二高亲和力配体可以与肽受体直接连接或经由连接物(如下面所述,例如,聚乙二醇)连接。在优选的实施方案中,与第一高亲和力配体连接的核酸与mRNA的3’端互补。该核酸(例如,NA连接物中的核酸)应至少长至足以与X-展示复合体的蛋白编码核酸(例如,mRNA)稳定地结合。在一些实施方案中,与第一高亲和力配体连接的核酸为15至100个核苷酸长、15至80个核苷酸长、15至50个核苷酸长、5至40个核苷酸长、15至30个核苷酸长、15至20个核苷酸长、10至20个核苷酸长或15至18个核苷酸长。在一些实施方案中,与第一高亲和力配体连接的核酸是15个核苷酸长、18个核苷酸长、20个核苷酸长、30个核苷酸长、50个核苷酸长、70个核苷酸长、80个核苷酸长、或87个核苷酸长。
本发明的几个实施方案包括将mRNA或修饰的mRNA、与嘌呤霉素或类似物或小分子可操作地连接的NA连接物和所述mRNA所编码的多肽稳定地连接在一起形成连接的mRNA-多肽复合体的方法。
在优选的实施方案中,NA连接物用作聚合mRNA-多肽复合体上第二核酸链的引物以形成与多肽连接的核酸双链体。在优选的实施方案中,聚合是形成DNA(或修饰的DNA)杂交体的反转录。
本发明的几个实施方案包括如下的方法:包含多种不同的X-展示复合体,提供具有期望的结合特性的配体,使所述复合体与所述配体接触,移除未结合的复合体,和回收与配体结合的复合体。
本发明的几种方法涉及核酸分子和/或蛋白的进化。在一个实施方案中,本发明包括扩增所回收的复合体的核酸组分并将变异引入所述核酸的序列中。在其他实施方案中,该方法还包括由扩增的和变异的核酸翻译多肽,使用核酸/修饰的连接它们,并使它们与配体接触以选择结合复合体的另一新群体。本发明的几个实施方案在体外进化过程中使用选择的蛋白-mRNA复合体,尤其是其中将具有变异的选择的mRNA再造、翻译和再次与关联的蛋白连接以用于选择的迭代过程。
部分
在一些实施方案中,本发明采用一个或多个连接物部分(与上述NA连接物区分)。在一些实施方案中,可以采用连接物部分来连接核酸和肽受体。在其他实施方案中,可以使用连接物部分来连接高亲和力配体(例如,生物素)或配体受体(例如,链霉抗生物素)与肽受体。在另一实施方案中,可以使用连接物部分来连接核酸与高亲和力配体。如本文所用的术语“连接物部分”可以包括一个或多个连接物部分或亚单位。
在一些优选的实施方案中,连接物部分是聚(环氧烷烃)部分,它们是一类具有聚醚主链的化合物。用于本发明的聚(环氧烷烃)物质可以包括:例如,直链和支链物质。例如,聚(乙二醇)是由重复的环氧乙烷亚单位组成的聚(环氧烷烃),该聚(乙二醇)在其任一端可以包括或不包括其他的反应性的、可激活的或惰性部分。异双功能的直链聚(环氧烷烃)物质的衍生物也是本领域中已知的。在一些实施方案中,连接物部分可以由5至50个亚单位的聚(环氧烷烃)、10至30个亚单位的聚(环氧烷烃)、10至20个单位的聚(环氧烷烃)、15至20个单位的聚(环氧烷烃)构成,或者,在一些实施方案中,由18个亚单位的聚(环氧烷烃)构成。本领域的技术人员将了解可以使用任何数目的连接物部分,只要形成X-展示复合体仍是可能的。
聚(乙二醇)连接物是具有聚(乙二醇)(“PEG”)主链或甲氧基-PEG(“mPEG”)主链的部分,包括PEG衍生物和mPEG衍生物。大量PEG衍生物和mPEG衍生物是本领域中已知的并且可商购获得。例如,Nektar,Inc.Huntsville,Ala.提供了可用作用连接物或修饰基团的PEG和mPEG化合物,该PEG和mPEG化合物任选具有亲核的反应性基团、羧基反应性基团、亲电子激活的基团(例如,活性酯、碳酸硝基苯酯、异硫氰酸酯等)、巯基选择基团(例如,马来酰亚胺)、和异功能的(在PEG或mPEG的两个末端具有两个反应性基团)、生物素基团、乙烯基反应性基团、硅烷基团、磷脂基团和类似基团。
在其他实施方案中,连接物部分可以是核酸或本领域中公认的任何其他连接物。例如,可以采用多聚唾液酸(PSA)和PSA衍生物(参见,美国专利第5,846,951号、美国专利公布第US20080262209号和PCT申请WO2005/016973和WO-A-01879221,它们全部通过整体引用并入本文。)
尽管优选的肽受体是嘌呤霉素,但可以使用以与嘌呤霉素类似的方式起作用的其他化合物。蛋白受体的其他可能选择包括:吡唑嘧啶或任何相关的衍生物和tRNA样结构以及本领域中已知的其他化合物。这种化合物包括但不限于:具有与腺嘌呤或腺嘌呤样化合物连接的氨基酸的任何化合物,例如氨基酸核苷酸,苯丙氨酰-腺苷(A-Phe)、酪氨酰腺苷(A-Tyr)和丙氨酰腺苷(A-Ala);和酰胺连接的结构,例如苯丙氨酰3′脱氧3′氨基腺苷、丙氨酰3′脱氧3′氨基腺苷以及酪氨酰3′脱氧3′氨基腺苷;在这些化合物的任一种中,可以采用天然存在的L-氨基酸或它们的类似物的任一种。此外,组合的tRNA样3′结构-嘌呤霉素轭合物也可用于本发明中。
翻译***
本发明的几个实施方案采用其中在缺乏释放因子的体外翻译***中翻译mRNA的优选方法。因此,核糖体在终止密码子处停止,容许存在嘌呤霉素或类似物或小分子与多肽蛋白共价结合或高亲和力结合的时间。
在本发明的一些实施方案中,在体外翻译***中翻译mRNA,在该体外翻译***中至少一种释放因子的功能被释放因子抑制剂抑制。合适的抑制剂包括但不限于抗释放因子的抗体。
由于该方法优选使用体外翻译***进行,本领域中已知的是可以将修饰的氨基酸掺入到翻译机制中以产生具有化学修饰的多肽。
可以使用多种体外翻译***,例如兔网织红细胞裂解物***、麦胚提取物***或其他合适的体外转录***。在优选的实施方案中采用PURESystem(cosmobio.co.jp/export_e/products/proteins/products_PGM_20060907_06.asp)。若期望的话,可以使用Spirin等人(1988)Science 242:1162的无细胞连续流(CFCF)翻译***来增加文库成员的总产率或用于使用的便利性。可以使用静态的体外蛋白合成***。在此***中,蛋白合成一般在1h后停止,并因此限制了产生文库的时间间隔。CFCF技术的优点是蛋白的高水平和长期合成应产生显著更大并且更多样的蛋白-RNA复合体文库。Spirin及其同事将CFCF技术描述为在24h或更长的延长的时间内高水平合成蛋白的方法。此外,CFCF技术导致来自翻译器的新合成的蛋白分级分离,并因此使得快速分离蛋白-核酸复合体是可行的。CFCF技术的其他应用包括合成肽的有效方法。例如,在鉴定以高亲和力结合靶的肽-融合体之后,可以使用CFCF技术直接合成游离的肽并将其用于结合测定。
还可以使用连接多核苷酸与多肽(即,表型)的其他无细胞技术,例如,ProfusionTM(参见,例如美国专利第6,348,315号;6,261,804号;6,258,558号和6,214,553号,它们通过引用并入本文)。
可以选择或构建含有适当的调节序列的合适的载体,所述调节序列包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它适当的序列。根据适于具体表达或体外翻译***,载体可以是质粒、病毒,例如噬菌体或噬菌粒。对于其他细节,参见,例如Molecular Cloning:a Laboratory Manual:2nd edition(分子克隆:实验室手册:第2版),Sambrook等人,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press。诸如制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达以及蛋白分析的用于操作核酸的许多已知的技术和方案详细描述于Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方案),第二版,Ausubel等人编辑,John Wiley &Sons,1992。Sambrook等人和Ausubel等人的公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中,不采用诸如质粒或病毒载体等表达载体,例如,在待表达的DNA仅存在于PCR扩增的DNA链上时。
在进一步的实施方案中,本发明的方法可以采用下列文件中所描述的方法和/或组合物:美国专利第7,078,197号、6,429,300号、5,922,545号、7,195,880号、6,416,950号、6,602,685号、6,623,926号、6,951,725号或美国专利申请第11/543,316号、10/208,357号中,它们全部通过整体引用并入本文。
在一个优选的实施方案中,在缺乏释放因子的体外翻译***中(例如,PURESystem,cosmobio.co.jp/export_e/products/proteins/products_PGM_20060907_06.asp)翻译含有完整的终止密码子和足以结合寡核苷酸引物的3’非翻译RNA区的mRNA。释放因子触发肽酰tRNA的酯键水解和新合成的蛋白从核糖体释放。在不存在释放因子的情况下,核糖体将停止在mRNA上。接着,添加DNA寡核苷酸至混合物中。这种寡核苷酸与mRNA的3’端互补并被能够递送肽受体物质到核糖体中的连接物功能化以形成具有结合的翻译蛋白的共价加成物。在一些实施方案中,添加的是NA连接物。连接物的连接位点可以是除了3’端外沿着寡核苷酸的任一处。连接物需要具有足够的长度以到达核糖体内。形成加成物的物质优选是嘌呤霉素或吡唑嘧啶或任何相关衍生物。
在连接物共价添加至新生蛋白之后,添加EDTA以释放核糖体,随后分离mRNA-寡核苷酸-蛋白物质并将其反转录以产生DNA-蛋白融合体。最后,使用任何DNA聚合酶添加第二链DNA。在这种实施方案中,尽管mRNA-寡核苷酸(例如,NA连接物)物质可能是共价连接的,但是NA连接物不需要与X-展示复合体中的任何中间物质共价连接(例如,如果使用生物素/链霉抗生物素来桥接mRNA与蛋白)。
所得的DNA-蛋白融合体可用于体内或体外筛选或用于诊断应用。
用途
本发明的方法和组合物在其中使用蛋白技术来解决治疗、诊断或工业问题的任何领域中都具有商业应用。这种X-展示技术可用于改善或改变现有的蛋白以及用于分离具有期望的功能的新蛋白。这些蛋白可以是天然存在的序列、可以是天然存在的序列的改变的形式、或者可以是部分或完全合成的序列。
本发明的方法可用于开发或改善多肽,例如免疫结合物,例如,抗体、其结合片段或类似物、单链抗体、催化抗体、VL区和/或VH区、Fab片段、Fv片段、Fab′片段、Dab和类似物。在一些实施方案中,要改善的多肽可以是具有免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白样结构域的任何多肽,例如,干扰素、蛋白A、锚蛋白、A-结构域、T-细胞受体、纤连蛋白III、γ-晶体蛋白、MHC类分子的抗原结合结构域(例如,CD8的α抗原结合结构域和β抗原结合结构域)、泛素、免疫球蛋白超家族的成员以及,如在如下文献中所综述的许多其他多肽:Binz,A.等人(2005)Nature Biotechnology 23:1257和Barclay(2003)Semin Immunol.15(4):215-223,它们通过引用并入本文。在一些实施方案中,如同源自人免疫***全部的免疫球蛋白文库一样,单个文库使用许多不同的V-区序列作为支架,但是它们全部都共有基本的免疫球蛋白折叠。在一些实施方案中,免疫球蛋白或免疫球蛋白样折叠是包含两个β片层的筒形蛋白结构,这两个β片层包含几个(例如,在IgG的轻链C-结构域的情况下是7个)由二硫键保持在一起的反平行的β链。因此,设想任何免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的改善或选择,包括它们的部分或片段。
在另一应用中,本文所述的X-展示技术可用于分离具有特定结合(例如,配体结合)特性的蛋白,该蛋白可以具有或不具有免疫球蛋白或免疫球蛋白样结构域。表现出高的特异性结合相互作用的蛋白可用作非抗体识别试剂,从而容许X-展示技术避开传统的单克隆抗体技术。通过这种方法分离的抗体型试剂可用于其中采用传统抗体的任何领域,包括诊断应用和治疗应用。
在优选的实施方案中,方法将靶向如下的免疫结合物的改善:例如,抗体分子的可变区和/或CDR区域,即由两条链的可变区构成的负责抗原结合活性的结构,所述两条链一条来自重链(VH)一条来自轻链(VL)。鉴定了期望的抗原结合特征之后,便可以将可变区工程化到适当的抗体类中,例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。应了解可以采用该方法来改善和/或选择人免疫结合物和/或来自其他物种的免疫结合物,例如,任何哺乳动物或非哺乳动物免疫结合物、骆驼抗体、鲨鱼抗体等。
本发明可用于改善用于治疗大量疾病的任一种的人抗体或人源化抗体(或它们的片段)。在这种应用中,体外开发和筛选了抗体文库,从而消除了对诸如细胞融合或噬菌体展示等技术的需要。在一个重要的应用中,本发明可用于改善单链抗体文库(Ward等人,Nature 341:544(1989);和Goulot等人,J.Mol.Biol.213:617(1990))。对于这种应用,可变区可以由人来源构建(以最小化接受者的可能的不利免疫反应)或者可以含有完全随机化的盒(以最大化文库的复杂性)。为筛选改善的抗体分子,测试了候选分子汇集物与靶分子的结合。然后,随着选择由一轮进展到下一轮,对结合步骤应用更高的严紧性水平。为增加严紧性,可以改变如下的条件:洗涤步骤数、过量竞争剂的浓度、缓冲条件、结合反应时长和固定基质的选择。单链抗体可直接用于治疗或间接用于标准抗体的设计。这种抗体具有大量潜在的应用,包括分离抗自身免疫的抗体、免疫抑制和用于诸如AIDS等病毒性疾病的疫苗的开发。
如下面所详述的,目前已经开发了大量抗体片段和抗体模拟技术并且它们是本领域中广泛已知的。尽管大量这些技术如结构域抗体、纳米抗体和UniBody使用了传统抗体结构的片段或其他修饰,但还存在采用结合结构的替代性技术,所述结合结构尽管模拟传统的抗体结合,但是经由不同的机制产生和发挥功能,所述替代性技术例如Adnectin、亲和体、DARPin、Anticalin、Avimer和Versabody。这些替代性结构的一些在通过引用并入本文的Gill和Damle(2006)17:653-658中综述。可以通过本发明的方法改善和/或选择上面所提及的所有抗体衍生物和结合物。在一些实施方案中,用于产生纳米抗体、UniBody、Adnectin、亲和体、DARPin、Anticalin、Avimer和Versabody的本领域已知方法可用于发现初始结合蛋白,该初始结合蛋白然后充当产生可以根据本发明的方法制备和选择的文库的基础。可选择地,可以将本领域中已知的结合物直接用于产生用于本文所述的方法的新文库。
在一些实施方案中,本文所述的方法将靶向结构域抗体(dAb)的改善。结构域抗体是最小的抗体功能结合单位,它对应于人抗体重链(VH)或轻链(VL)的可变区。结构域抗体具有大约13kDa的分子量。Domantis已经开发了一系列完全人VH和VL dAb的大的和高功能的文库(每个文库中大于100亿种不同的序列),并且使用这些文库来选择对治疗靶特异性的dAb。与许多常规抗体形成对比的是,结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物细胞中很好地表达。结构域抗体的进一步细节及其制备方法可以通过参考下列文献获得:美国专利6,291,158;6,582,915;6,593,081;6,172,197;6,696,245;美国系列第2004/0110941号;欧洲专利申请第1433846号以及欧洲专利0368684和0616640;WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019和WO03/002609,它们的每一个均通过整体引用并入本文。
在其他实施方案中,本文所述的方法将靶向纳米抗体的改善。纳米抗体是含有天然存在的重链抗体的独特结构特性和功能特性的抗体来源的治疗蛋白。这些重链抗体含有单个可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2和CH3)。重要地,克隆的和分离的VHH结构域是完全稳定的多肽,该多肽拥有原始重链抗体的全部抗原结合能力。纳米抗体与人抗体的VH结构域具有高的同源性并且可以进一步被人源化而无任何活性损失。重要地,纳米抗体具有低的免疫原性潜能,这已经用纳米抗体的先进化合物在灵长类研究中得到了证实。
纳米抗体结合了常规抗体的优点与小分子药物的重要特征。如同常规抗体一样,纳米抗体显示出高的靶特异性、对它们的靶的高亲和力和低的内在毒性。然而,如同小分子药物一样,它们可以抑制酶并且容易地进入受体间隙(cleft)。此外,纳米抗体是极其稳定的,可以通过注射之外的方式施用(参见,例如WO 04/041867,其通过整体引用并入本文)并且容易制造。纳米抗体的其他优点包括由于他们的较小尺寸而识别不常见的表位或隐藏表位(hidden epitope)、由于它们的独特三维结构而以高亲和力和选择性地结合到蛋白靶的腔或活性位点中、药物形式的灵活性、定制药物半衰期和药物发现的方便性和速度。
纳米抗体由单个基因编码并且在几乎所有的原核宿主和真核宿主中有效地制备,例如,大肠杆菌(E.coli)(参见,例如,U.S.6,765,087,其通过整体引用并入本文)、霉菌(例如,曲霉属(Aspergillus)或木酶属(Trichoderma))和酵母(例如,酵母菌属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉森酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属(Pichia)(参见,例如,U.S.6,838,254,通过整体引用并入本文)。制备方法是规模可放大的并且已经制备出多公斤量的纳米抗体。由于纳米抗体与常规抗体相比表现出优异的稳定性,可以将它们配制为长架存期的即用的溶液。因此,本发明的方法可用于改善纳米抗体对它们的靶分子的亲和力。
本领域中已知的方法可用于产生纳米抗体(或本文所述的其他结合物/免疫结合物)。然后,这种结合物可以充当产生可以根据本发明的方法制备和选择的文库的基础。例如,Nanoclone方法(参见,例如,WO 06/079372,其通过整体引用并入本文)是根据自动的B细胞高通量选择产生针对期望的靶的纳米抗体的专有方法,并且该方法可用于本发明的内容中。由Nanoclone方法成功选择纳米抗体可以提供初始组的纳米抗体,该初始组的纳米抗体可以通过本文所述的方法进一步改善。
在其他实施方案中,本文所述的方法将靶向UniBody的改善。Unibody是另一种抗体片段技术,然而这种抗体片段技术基于IgG4抗体铰链区的移除。铰链区的缺失产生了基本上为传统IgG4抗体大小一半并且具有单价结合区而不是IgG4抗体的二价结合区的分子。还熟知的是IgG4抗体是惰性的并且因此不与免疫***相互作用,这对于不期望免疫应答的疾病的治疗来说可能是有利的,并且这种优点传递给了Unibody。例如,UniBody可能起到抑制或沉默但不杀伤它们所结合的细胞的功能。此外,UniBody与癌细胞的结合不刺激癌细胞增殖。此外,由于UniBody为传统IgG4抗体大小的约一半,它们可能在较大的实体瘤上显示较好的分布,具有潜在的有利功效。UniBody以与完整IgG4抗体类似的速率从机体中清除并且能够以与完整抗体类似的亲和力结合它们的抗原。UniBody的进一步细节可以通过参考通过整体引用并入本文的专利申请WO2007/059782获得。
在其他实施方案中,本文所述的方法将靶向纤连蛋白或adnectin分子的改善。Adnectin分子是源自纤连蛋白的一个或多个结构域的工程化结合蛋白(参见Ward M.和Marcey,D.,callutheran.edu/Academic_Programs/Departments/BioDev/omm/fibro/fibro.htm)。通常,纤连蛋白是由I型、II型和III型组件这三个不同的蛋白模块构成的。对于纤连蛋白结构或功能的综述参见Pankov和Yamada(2002)J Cell Sci.;115(Pt20):3861-3;Hohenester和Engel(2002)21:115-128;以及Lucena等人(2007)Invest Clin.48:249-262,它们通过引用并入本文。
依据起源的组织,纤连蛋白可以含有多种III型结构域,它们可以表示为,例如,1Fn3、2Fn3、3Fn3等。10Fn3结构域含有整联蛋白结合基序并且还含有连接β链的三个环。可以认为这些环对应于IgG重链的抗原结合环,并且可通过本文中下面所讨论的方法改变这些环以选择特异性结合感兴趣的靶的纤连蛋白和adnectin分子。要改善的adnectin分子还可以源自10Fn3相关分子的聚合物,而不是简单的单体10Fn3结构。
尽管天然10Fn3结构域通常结合整联蛋白,但将适于成为adnectin分子的10Fn3蛋白改变以结合感兴趣的抗原。因此,可以使用本领域技术人员可用的方法来制造与本发明的方法相容的10Fn3变体和突变序列(从而形成文库)。例如,可以通过本领域中已知的任何方法进行10Fn3的改变,所述方法包括但不限于易错PCR、定向诱变、DNA改组或本文提到的其他类型的重组诱变。在一个实例中,可以在体外直接合成编码10Fn3序列的DNA的变体。可选择地,可以使用标准的方法(如在例如通过引用并入本文的美国专利申请第20070082365中所进行的一样)从基因组中分离或克隆天然10Fn3序列,并然后使用本领域中已知的诱变方法进行突变。
在一个实施方案中,可以将靶蛋白固定于固体支撑物上,例如柱树脂或微量滴定板中的孔。然后使靶与如本文所述的潜在的结合蛋白或X-展示复合体的文库接触。所述文库可以包含通过10Fn3序列的诱变/随机化或通过10Fn3环区域(不是β链)的诱变/随机化而由野生型10Fn3所来源的10Fn3克隆或adnectin分子。可以重复选择/诱变过程直到获得对靶具有足够亲和力的结合物。可以使用通过Briston-Myers Squibb公司Adnexus所采用的PROfusionTM技术工程化用于本发明的Adnectin分子。PROfusion技术是基于上面所提到的技术(例如,Roberts和Szostak(1997)94:12297-12302)产生的。产生改变的10Fn3结构域的文库并选择可用于本发明的适当结合物的方法充分描述于下面的美国专利和专利申请文件中并且通过引用并入本文:美国专利第7,115,396号;6,818,418号;6,537,749号;6,660,473号;7,195,880号;6,416,950号;6,214,553号;6623926号;6,312,927号;6,602,685号;6,518,018号;6,207,446号;6,258,558号;6,436,665号;6,281,344号;7,270,950号;6,951,725号;6,846,655号;7,078,197号;6,429,300号;7,125,669号;6,537,749号;6,660,473号;和美国专利申请第20070082365号;20050255548号;20050038229号;20030143616号;20020182597号;20020177158号;20040086980号;20040253612号;20030022236号;20030013160号;20030027194号;20030013110号;20040259155号;20020182687号;20060270604号;20060246059号;20030100004号;20030143616号;和20020182597号。还参见通过整体引用并入本文的下列参考文献的方法:等人(2007)Journal of Molecular Biology 368:1024-1041;Sergeeva等人(2006)Adv Drug Deliv Rev.58:1622-1654;Petty等人(2007)Trends Biotechnol.25:7-15;Rothe等人(2006)Expert Opin Biol Ther.6:177-187;以及Hoogenboom(2005)NatBiotechnol.23:1105-1116。
可以使用本发明的方法改善的其他分子包括但不限于:人纤连蛋白模块1Fn3-9Fn3和11Fn3-17Fn3以及来自非人的动物和原核生物的相关Fn3模块。此外,还可以使用来自与10Fn3具有序列同源性的其他蛋白的Fn3模块,例如,生腱蛋白和粗纤维调节素(undulin)。具有免疫球蛋白样折叠的其他示例性蛋白(但具有与VH结构域不相关的序列)包括N-钙粘蛋白、ICAM-2、肌联蛋白、GCSF受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制蛋白、E-钙粘蛋白和抗生的色素蛋白。具有相关结构的其他结构域可以源自:髓磷脂膜黏附分子P0、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T细胞抗原受体、CD1、C2和VCAM-1的I-set结构域、肌球蛋白结合蛋白C的I-set免疫球蛋白折叠、肌球蛋白结合蛋白H的I-set免疫球蛋白折叠、端蛋白的I-set免疫球蛋白折叠、telikin、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、***受体、催乳素受体、GC-SF受体、干扰素-γ受体、β-半乳糖苷酶/葡糖醛酸糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶和转谷氨酰胺酶。可选择地,可以采用包含一个或多个免疫球蛋白样折叠的任何其他蛋白来制造可以通过本文所述的方法改善的adnectin样结合部分。这种蛋白可以使用例如程序SCOP(Murzin等人,J.Mol.Biol.247:536(1995);Lo Conte等人,Nucleic Acids Res.25:257(2000))来鉴定。
在其他实施方案中,可以采用本发明的方法来改善亲和体分子。亲和体分子代表源自葡萄球菌蛋白A的一个IgG结合结构域的基于58个氨基酸残基的蛋白结构域的新亲和蛋白种类。这种三螺旋束结构域已被用作构建组合噬菌粒文库的支架,使用噬菌体展示技术可以从该文库中选择靶向期望的分子的亲和体变体(Nord K,Gunneriusson E,Ringdahl J,Stahl S,Uhlen M,Nygren PA,Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain(选自α-螺旋细菌受体结构域的组合文库的结合蛋白),Nat Biotechnol 1997;15:772-7;Ronmark J,Gronlund H,Uhlen M,Nygren PA,Human immunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A(来自蛋白A组合工程化的人免疫球蛋白A(IgA)特异性配体),Eur J Biochem 2002;269:2647-55)。可以通过本领域已知的方法制备的类似文库可以使用本文所述的X-展示技术来选择。亲和体分子的简单的、稳固的结构与它们的低分子量(6kDa)的组合使得它们适于广泛的应用,例如,作为检测试剂(Ronmark J,Hansson M,Nguyen T,等人,Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli(大肠杆菌中产生的亲和体-Fc嵌合体的构建和表征),J Immunol Methods 2002;261:199-211)以及抑制受体相互作用(Sandstorm K,Xu Z,Forsberg G,Nygren PA,Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering(通过组合的蛋白工程化开发的CD28结合亲和体配体抑制CD28-CD80共刺激信号),Protein Eng 2003;16:691-7)。亲和体及其制备方法的进一步细节可以通过参考通过整体引用并入本文的美国专利第5,831,012号来获得。
在其他实施方案中,可以采用本发明的方法来改善DARPin。DARPin(设计的锚蛋白重复蛋白)是已开发的采用非抗体肽的结合能力的抗体模拟DRP(设计的重复蛋白)技术的一个实例。诸如锚蛋白或富亮氨酸重复蛋白等重复蛋白是普遍存在的结合分子,它们与抗体不同,在细胞内和细胞外存在。它们的独特的模块结构的特征是重复的结构单元(重复子(repeat)),该重复的结构单元堆叠在一起形成延长的重复结构域,该延长的重复结构域展示出可变的和模块式的靶结合表面。基于这种模块性,可以产生具有高变的结合特异性的组合多肽文库。这种策略包括展示可变表面残基的自容性重复子的共有序列设计和将它们随机装配成重复结构域。
可以在细菌表达***中以极高的产率产生DARPin并且它们属于已知的最稳定的蛋白。已选择了对广泛范围的靶蛋白高特异性高亲和力的DARPin,所述靶蛋白包括:人受体、细胞因子、激酶、人蛋白酶、病毒和膜蛋白。可以获得具有一位数纳摩尔至皮摩尔范围的亲和力的DARPin。
DARPin已用于广泛的应用中,包括ELISA、夹心ELISA、流式细胞术分析(FACS)、免疫组化(IHC)、芯片应用、亲和纯化或蛋白质印迹。还证明DARPin在胞内区室中是高活性的,例如,与绿色荧光蛋白(GFP)融合的胞内标记蛋白。DARPin还被用于以pM范围的IC50抑制病毒进入。DARPin不仅对于阻断蛋白与蛋白的相互作用是理想的,而且对于抑制酶也是理想的。已成功地抑制了蛋白酶、激酶和转运蛋白,最常见的是变构抑制模式。肿瘤上极快的和特异性的富集以及极有利的肿瘤血液比使得DARP很好地适于体内诊断或治疗方法。
关于DAPRPin和其他DRP技术的其他信息可见于美国专利申请公布第2004/0132028号和国际专利申请公布第WO 02/20565号中,二者均通过整体引用并入本文。
在其他实施方案中,可以采用本发明的方法来改善anticalin。Anticalin是另一种抗体模拟技术,然而在这种情况下,结合特异性源自脂质运载蛋白,这是在人组织和体液中天然地且丰富地表达的低分子量蛋白家族。脂质运载蛋白已被进化为实行与化学敏感性化合物或不溶性化合物的生理运输和储存相关的一系列体内功能。脂质运载蛋白具有稳固的内在结构,包括在蛋白的一个末端支撑四个环的高度保守的β-筒。这些环形成了结合袋(binding pocket)的入口并且分子的这部分的构象差异导致了单独的脂质运载蛋白之间结合特异性的变化。
尽管保守的β片层框架所支撑的高变环总体结构会使人想起免疫球蛋白,但脂质运载蛋白与抗体在大小方面相当不同,脂质运载蛋白由略大于单个免疫球蛋白结构域的160-180个氨基酸的单个多肽链构成。
克隆脂质运载蛋白并将它们的环进行工程化以产生Anticalin。已产生了结构上多样的Anticalin文库并且Anticalin展示容许选择和筛选结合功能,随后表达和产生可溶性蛋白以供在原核***或真核***中的进一步分析。可以根据本发明的X-展示技术采用这种Anticalin文库。研究已成功证明了可以开发出可分离的对事实上任何人靶蛋白特异性的Anticalin,并且可获得纳摩尔或更高范围的结合亲和力。
还可以将Anticalin设计成双靶蛋白形式,即所谓的Duocalin。Duocalin以一种使用标准制造方法容易制备的单体蛋白结合两个单独的治疗靶,而保留靶特异性和亲和力,但与其两个结合结构域的结构定向无关。通过本发明的方法选择的Anticalin可以被装配成Duocalin分子。
通过单个分子调控多个靶在已知牵涉了多于单个病原体的疾病中尤其有利。此外,诸如Duocalin的二价或多价结合形式在下列方面具有显著的潜能:靶向疾病中的细胞表面分子、经由结合和群集细胞表面受体而介导对信号转导途径的拮抗作用或诱导增强的内化作用。此外,Duocalin的高的内在稳定性与单体Anticalin相当,这提供了Duocalin的灵活形成和递送潜能。关于Anticalin的其他信息可见于美国专利第7,250,297号和国际专利申请公布第WO 99/16873号中,二者均通过整体引用并入本文。
在其他实施方案中,可以采用本发明的方法来改善Avimer。可用于本发明内容中的另一种抗体模拟技术是Avimer。Avimer是通过体外外显子改组和噬菌体展示而由一大家族的人胞外受体结构域产生具有结合特性和抑制特性的多结构域蛋白而进化来的。已显示连接多个独立的结合结构域制作出了亲合力(avidity)并且产生了与常规的单表位结合蛋白相比改善的亲和力和特异性。其他潜在的优点包括大肠杆菌(Escherichia coli)中多靶特异性分子的简单和有效制备、改良的热稳定性和蛋白酶抗性。已经获得了针对多种靶具有亚纳摩尔亲和力的Avimer,并且这些Avimer可以通过本文所述的方法进一步改善。
关于Avimer的其他信息可见于美国专利申请公布第2006/0286603号、2006/0234299号、2006/0223114号、2006/0177831号、2006/0008844号、2005/0221384号、2005/0164301号、2005/0089932号、2005/0053973号、2005/0048512号、2004/0175756号,它们全部都通过整体引用并入。
在其他实施方案中,可以采用本发明的方法来改善Versabody。Versabody是可用于本发明内容中的另一种抗体模拟技术。Versabody是具有大于15%的半胱氨酸的3-5kDa的小蛋白,半胱氨酸形成高二硫化物密度的支架而代替了通常的蛋白所具有的疏水核心。用少量的二硫化物替代构成疏水核心的大量疏水氨基酸产生了更小、更亲水(较少的聚集和非特异性结合)、对蛋白酶和热更加有抗性的蛋白,并且该蛋白具有较低密度的T细胞表位,因为对MHC呈递贡献最大的残基是疏水性的。所有这四种特性均是影响免疫原性的熟知特性,并且预计它们在一起会引起免疫原性的大大降低。
Versabody的启发来自于由水蛭、蛇、蜘蛛、蝎子、蜗牛和海葵所产生的天然的注射型生物药物,已知它们表现出意想不到的低免疫原性。通过设计并通过筛选大小、疏水性、蛋白水解抗原加工由选择的天然蛋白家族开始,并且将表位密度最小化至远低于天然注射蛋白的平均值的水平。
由于Versabody的结构,这些抗体模拟物提供了多功能的形式,包括多价性、多特异性、半衰期机制的多样性、组织靶向模块和抗体Fc区的缺乏。此外,Versabody可以在大肠杆菌中高产率的制造,并且由于它们的亲水性和小尺寸,Versabody是高度可溶的并且可以被配制成高浓度。Versabody是异常地热稳定的(它们可以被煮沸)并且提供延长的半衰期。本文所描述的结合物的所有品质(例如,热稳定性、盐稳定性、架存期、免疫原性、靶亲和力等)可以通过本文所述的展示和选择方法(X-展示方法)来改善。
关于Versabody的其他信息可见于美国专利申请公布第2007/0191272号,其通过整体引用并入本文。
在其他实施方案中,可以采用本发明的方法来改善SMIPTM分子。工程化SMIPTM(小模块免疫药物-Trubion药物)以维持并优化靶结合、效应子功能、体内半衰期和表达水平。SMIP由三个不同的模块结构域组成。首先,它们含有可以由赋予特异性的任何蛋白组成(例如,细胞表面受体、单链抗体、可溶性蛋白等)的结合结构域。其次,它们含有铰链结构域,该铰链结构域充当结合结构域和效应子结构域之间的挠性连接物,并且还有助于控制SMIP药物的多聚化。最后,SMIP含有可以源自多种分子的效应子结构域,包括Fc结构域或其他特别设计的蛋白。设计的模块性容许简单地构建具有多种不同的结合结构域、铰链结构域和效应子结构域的SMIP,这种设计的模块性提供了快速和可定制的药物设计。SMIPTM分子的结合结构域还可以充当适于根据本文所述的方法(例如,X-展示方法)展示和选择的文库的基础。
关于SMIP的更多信息,包括如何设计它们的实例可见于Zhao等人(2007)Blood 110:2569-77以及下列美国专利申请号中:20050238646;20050202534;20050202028;20050202023;20050202012;20050186216;20050180970;和20050175614。
上面所提供的抗体片段和抗体模拟技术的详细说明不旨在是可用于本说明书内容的所有技术的详尽名单。例如,但是也不旨在限制,在本发明的内容中可以使用许多其他技术,包括替代的基于多肽的技术,例如通过整体引用并入本文的Qui等人,Nature Biotechnology,25(8)921-929(2007)中所列出的互补决定区的融合。
本文所述的X-展示复合体(例如,核酸-蛋白融合体或DNA-蛋白融合体)可用于之前所描述的任何应用或关于RNA-蛋白复合体所预想的任何应用。商业用途包括:通过体外进化技术分离具有期望特性的多肽(参见,例如,Szostak等人,美国系列第09/007,005号和美国系列第09/247,190号;Szostak等人,WO98/31700;Roberts & Szostak,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)第94卷,第12297-12302页)),筛选源自细胞mRNA的cDNA文库(参见,例如Lipovsek等人,1998年8月17日提交的美国系列第60/096,818号)和基于蛋白-蛋白相互作用而克隆新基因(Szostak等人,美国系列第09/007,005号和美国系列第09,247,190号;Szostak等人,WO98/31700),以及这些融合体在蛋白展示实验中的用途(Kuimelis等人美国系列第60/080,686号和美国系列第09/282,734号)。本发明的X-展示复合体(例如,DNA-蛋白融合体)可用于之前所述的任何应用或关于之前所述的展示技术所预想的任何应用,例如在下列专利中所公开的那些应用:美国专利第6,416,950号;6,429,300号;6,194,550号;6,207,446号和6,214,553,它们全部通过整体引用并入本文。这些X-展示复合体(例如,DNA-蛋白融合体)可用于任何适当的治疗目的、诊断目的或研究目的,尤其在制药和农业领域。
新催化剂的分离
本发明还可用于选择新的催化蛋白。之前已使用体外选择和进化来分离新颖的催化RNA和DNA,并且在本发明中,使用体外选择和进化来分离新颖的蛋白酶(仅为示例而提供的非限制性实例是适于实施将输入聚合物的代谢物转化成较小的且更即时有用的副产物,例如用于将多糖转化为更有用的生物燃料)。在这种方法的一个具体实例中,可以通过对与催化剂过渡态的化学类似物的结合进行选择来间接分离催化剂。在另一具体的实例中,可通过对与底物的共价键形成进行选择(例如,使用与亲和标签连接的底物)或通过裂解(例如,通过对破坏特定键并从而从固体支持物释放文库的催化成员的能力进行选择)进行直接分离。
分离新催化剂的这种方法与催化抗体技术相比具有至少两个重要的优点(在Schultz等人,J.Chem.Engng.News 68:26(1990)中综述)。首先,在催化抗体技术中,初始的汇集物一般限于免疫球蛋白折叠;相反,X-展示复合体(DNA-蛋白融合体)的起始文库可以是完全随机的或可以但不限于由已知酶结构或蛋白支架的变体组成。此外,催化抗体的分离一般依赖于与过渡态反应类似物结合的初始选择,随后费力地筛选活性抗体;同样相反地,如之前使用RNA文库所证明的,使用X-展示文库方法,进行催化的直接选择是可能的。在分离蛋白酶的替代性方法中,可以组合过渡态类似物和直接选择方法。
通过这种方法所获得的酶是高度有价值的。例如,目前存在对容许开发改良的化学过程的新颖的和有效的工业催化剂的迫切需要。本发明的主要优点是可以在任意条件下实施选择,并且不限于例如体内条件。因此,本发明促进了如下新颖的酶或现有酶的改良变体的分离:其可以实施高度特异性的转化(并从而将不期望的副产物的形成最小化),同时在预定的环境如升高的温度环境、压力或溶剂浓度下发挥功能。
体外相互作用诱捕
X-展示技术还可用于基于蛋白-蛋白相互作用来筛选cDNA文库和克隆新基因。通过这种方法,cDNA文库由期望的来源产生(例如,通过Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方案),John Wiley & Sons and Greene Publishing Company,1994;尤其参见第5章的方法)。可以使用本文所述的技术将各种候选cDNA形成为X-展示复合体(例如,DNA-蛋白融合体),并且然后测试这些复合体(或融合体的改良形式)与具体分子的相互作用。
在体外发生相互作用步骤的事实容许使用非特异性竞争剂、温度和离子条件仔细地控制反应的严紧性。用非水解类似物改变常见的小分子(例如,ATP对ATPgS)提供了辨别小分子的不同构象异构体的选择。这种方法可用于许多蛋白的克隆和功能鉴定,因为缔合了所选择的结合配偶体的核酸序列并且因此可能易于分离。此外,该技术可用于鉴定任何人基因的功能和相互作用。
该方法还可用于为了改善的半衰期、亲和力或溶解性而开发或改良多肽配体。本文所述的X-展示复合体(例如,DNA-蛋白融合体)可用于期望蛋白的任何选择方法,包括分子进化和识别方法。在下列文献中描述了示例性选择方法:例如Szostak等人,美国系列第09/007,005号和美国系列第09/247,190号;Szostak等人,WO98/31700号;Roberts & Szostak,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)第94卷,第12297-12302页;Lipovsek等人,美国系列第60/096,818号和美国系列第09/374,962号;以及Kuimelis等人美国系列第60/080,686号和美国系列第09/282,734号,全部通过引用并入本文。
文库产生、筛选和亲和力成熟
在一些实施方案中,可以筛选肽文库或基因文库以鉴定具有期望品质(例如,与特定抗原结合)或根据本发明的方法改良或修饰的肽。在相关的实施方案中,可通过亲和力成熟或诱变进一步改变通过本文所述的方法制备或选择的具体肽,从而产生相关肽或核酸的文库。如此,本发明的一个方面可能牵涉筛选大的文库以鉴定具有诸如与抗原结合的能力、较高的结合亲和力等期望品质的潜在肽(或编码所述肽的核酸)。根据本发明,可以使用本领域中已知或本文所述的用于文库产生和靶选择的任何方法。
可以采用本领域中已知的、根据本文所述的方法的文库产生方法(例如,对于添加适当的标签、互补序列等)来制造适合用于本文所述的方法的文库。用于文库产生的一些方法描述于:美国系列第09/007,005号和09/247,190号;Szostak等人,WO989/31700;Roberts & Szostak(1997)94:12297-12302;美国系列第60/110,549号、美国系列第09/459,190号和WO 00/32823,它们通过引用并入本文。
在一个实施方案中,文库将包含VH结构域,优选人VH结构域。任何细胞均可用作文库的来源。在一些优选的实施方案中,文库的细胞来源可以是外周血单核细胞(PBMC)、脾细胞或骨髓细胞(例如,参见图36,其描述了可以从某些类型的供体细胞的文库中获得的VH文库的多样性)。
本领域的技术人员将理解本发明的方法可以迭代的形式采用。例如,通过本文所述的方法之一选择的核酸或蛋白可以充当产生新文库的基础,该过程可以再次由该新文库开始。这种方案的实例在图22中图解,其中将一轮选择的产物用于再产生新的文库。
本文所述的X-展示方法可以在使得选择期间肽中存在分子内二硫键的条件下实施。在其他实施方案中,若期望,可以阻止二硫键形成。起始文库可以通过例如经由体外或体内诱变直接DNA合成获得,或者可以使用本领域中已知的任何可用的起始文库。例如,可以根据本发明使用描述于本文所引用的参考文献中和下列参考文献中(它们全部通过整体引用并入本文)的文库和制备所述文库的方法:美国专利第5,922,545号、7,074,557号。
在优选的实施方案中,文库是VH文库或VL文库。表2提供了可用于扩增VH结构域的一组非限制性的实例性引物。
表2.用于VH结构域X-展示文库产生的示例性引物。R=A/G,Y=C/T,K=G/T,M=A/C,S=G/C,W=A/
在优选的实施方案中,文库的核酸构建体含有T7启动子。文库中的核酸可以通过本领域中已知的任何方式操作以添加可用于制备、选择或纯化核酸、其翻译产物或X-展示复合体的适当启动子、增强子、间隔子(spacer)或标签。例如,在一些实施方案中,文库中的序列可以包括TMV增强子、编码FLAG标签的序列、SA展示序列或多聚腺苷酸化序列或信号。在一些实施方案中,核酸文库序列还可以包括独特的来源标签以鉴定RNA或DNA序列的来源。在一些实施方案中,核酸文库序列可以包括汇集物标签(pool tag)。汇集物标签可用于鉴定在特定轮的选择期间所选择的那些序列。这将容许,例如汇集来自多轮选择的序列并在单次运行中测序而不丧失它们所起源的选择轮的示踪。
然后体外转录双链DNA文库并如本文所述将其与肽受体缔合。在一个优选的实施方案中,然后使NA连接物或与高亲和力配体连接的NA连接物(例如,生物素化的NA连接物)退火(例如,DDB-1)。在一些实施方案中,NA连接物是与mRNA光交联的。在具体的实施方案中,然后加载配体受体,例如,链霉抗生物素。在进一步的实施方案中,与肽受体连接的第二高亲和力配体与链霉抗生物素结合。在一些实施方案中,第二高亲和力配体/肽受体是生物素-嘌呤霉素连接物,例如,BPP。
然后可以实施体外翻译,其中肽受体与新生翻译产物反应。
纯化后,所得物是肽-核酸X-展示复合体的文库。在优选的实施方案中,这种X-展示复合体在纯化之后可以进行反转录。可以通过本领域中已知的任何方法纯化X-展示复合体,例如,通过亲和色谱、柱色谱、密度梯度离心、亲和标签捕获等。在优选的实施方案中,采用寡聚-dT纤维素纯化,其中将X-展示复合体设计成包含具有多聚-A尾的mRNA。在这种实施方案中,寡聚-dT与柱或纯化装置中的纤维素共价结合。寡聚-dT参与与X-展示复合体中mRNA的多聚-A尾的互补碱基配对,从而阻止其通过纯化装置的进程。可以稍后用水或缓冲液洗脱X-展示复合体。
反转录产生了cDNA/RNA杂交体,在优选的实施方案中,该杂交体通过与NA连接物、高亲和力配体、配体受体、肽受体(可能与第二高亲和力配体连接)或它们的一些可操作的组合缔合而与转录的肽非共价连接。
然后可以用RNA酶处理所得的纯化的X-展示复合体以降解剩余mRNA,随后进行第二链DNA合成以产生完整的cDNA。注意,在优选的实施方案中,NA连接物中的核酸可以充当反转录的引物。因此,cDNA仍然与高亲和力配体和X-展示复合体的部分连接。
如果,如所设想的一样,将X-展示复合体工程化为含有标签,则可以进一步纯化X-展示复合体。可以使用本领域中已知的任何标签来纯化X-展示复合体。例如,有可能使用FLAG标签、myc tac、组氨酸标签(His标签)或HA标签以及其他。在优选的实施方案中,将编码FLAG的序列工程化到原始DNA序列中以便使最终转录的蛋白含有FLAG标签。
然后通过本领域中已知的任何选择方法选择所得的X-展示复合体。在优选的实施方案中,使用亲和力选择。例如,可以将期望的结合靶或抗原固定在固体支持物上以用于亲和柱中。可用于亲和色谱的方法的实例描述于美国专利第4,431,546号、4,431,544号、4,385,991号、4,213,860号、4,175,182号、3,983,001号、5,043,062号,它们全部通过整体引用并入本文。可以通过标准的免疫测定和/或亲和色谱来评定结合活性。X-展示复合体催化功能如蛋白水解功能的筛选可以使用如例如在美国专利第5,798,208号中所述的标准血红蛋白噬菌斑测定来完成。确定候选肽(例如,抗体、单链抗体等)结合治疗靶的能力可以在体外使用例如测量抗体与给定靶或抗原的结合速率的Biacore仪器来测定。
在优选的实施方案中,可以通过DNA组分的测序来鉴定选择的X-展示复合体。可以采用本领域中已知的任何测序技术,例如,454测序、Sanger测序、通过合成测序或在下列专利中所述的方法:美国专利第5547835号、5171534号、5622824号、5674743号、4811218号、5846727号、5075216号、5405746号、5858671号、5374527号、5409811号、5707804号、5821058号、6087095号、5876934号、6258533号、5149625号,它们全部通过整体引用并入本文。
在一些实施方案中,可以进行多次选择以鉴定较高亲和力的结合物,并且还可以用竞争性结合物或更严格的洗涤条件来执行。本领域技术人员将了解可以采用本文所述的程序的变化形式。
在优选的实施方案中,本发明的方法如图14所描绘地实施。
在其他优选的实施方案中,如图13或图16中所描绘的来设计X-展示复合体。
含有本发明的肽或其模拟物的药物组合物
在另一方面,本发明提供组合物,例如药物组合物,该组合物含有通过本发明的方法产生的肽的一种或组合(例如,两种或更多种不同肽),它们与药物上可接受的载体一起配制。本发明的药物组合物还可以在组合治疗中施用,即与其他剂组合。例如,组合治疗可以包括本发明的肽或其模拟物与可用于治疗特定疾病或适应症的适当药剂的组合。
如本文所用,“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何的和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂以及类似物。优选地,载体适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如,通过注射或输注)。依据施用途径,可以将活性化合物,即本发明的肽或其模拟物包被在材料中,以保护该化合物免受酸和可能灭活化合物的其他天然条件的作用。
本发明的药物化合物可以包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的期望生物学活性并不赋予任何不期望的毒性作用的盐(参见,例如,Berge,S.M.,等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。这种盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括源自无毒的无机酸的那些,例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸以及类似物;以及源自无毒的有机酸的那些,例如,脂肪族一羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂肪族和芳族磺酸以及类似物。碱加成盐包括源自碱土金属的那些,例如钠、钾、镁、钙以及类似物;以及源自无毒的有机胺的那些,例如,N,N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因以及类似物。
在具体的实施方案中,通过本发明的方法选择的肽或其模拟物可以与氯化钠一起溶解于水中以达成生理上等渗的盐条件。
可以用于本发明的药物组合物中的合适的含水和不含水载体的实例包括:水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇、聚乙二醇以及类似物)及其合适的混合物、植物油如橄榄油以及注射型有机酯如油酸乙酯。可以通过例如使用诸如卵磷脂的包衣材料、在分散液的情况下通过维持所需的粒度、和通过使用表面活性剂来维持恰当的流动性。
这些组合物还可以含有佐剂,例如,防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌程序和通过加入如下的多种抗菌剂和抗真菌剂来确保防止微生物的存在:例如,对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸以及类似物。还可能期望的是在组合物中包含等渗剂,如糖、氯化钠以及类似物。此外,可以通过加入延迟吸收的剂如单硬脂酸铝和明胶来实现注射药物形式的延长吸收。
药学上可接受的载体包括:无菌水溶液或分散液或无菌注射溶液或分散液的临时制剂的无菌粉末。用于药物活性物质的这种介质和剂的用途是本领域内已知的。除非任何常规介质或剂与活性化合物不相容,否则预期任何常规介质或剂与活性化合物在本发明的药物组合物中的用途。还可以将补充活性的化合物掺入到组合物中。
可以将片剂、锭剂、胶囊、丸剂和粒剂的固体剂型制备为具有包衣和外壳,例如肠道包衣和药物配制领域中熟知的其他包衣。它们可以任选地包含遮光剂并且还可以为这样的组合物:仅在或优先在肠道的某个部分释放活性成分,任选以延迟的方式进行。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。肽还可以呈微胶囊化形式,若适当,则具有一种或多种赋形剂。
治疗组合物通常必须是无菌的并且在制造和储存条件下是稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳状液、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可以为含有下列的溶剂或分散介质,例如水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇和液体聚乙二醇以及类似物)以及它们的合适混合物。可以通过例如使用诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过维持所需的粒度、和通过使用表面活性剂来维持恰当的流动性。在许多情况下,优选的是组合物中包含等渗剂,例如糖;多元醇,如甘露醇、山梨醇;或氯化钠。可以通过在组合物中加入延迟吸收的剂如单硬脂酸盐和明胶来实现注射组合物的延长吸收。
可以将被配制为溶液的组合物制备为适于通过滴入眼睛来施用,例如,通过将溶液制备为含有适当量的盐。
含有通过本发明的方法选择的肽或其模拟物的脂质体可以根据任何熟知的方法制备,诸如下列文献中所描述的:Epstein等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688-3692(1985));Hwang等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030-4034(1980))、EP 52,322、EP 36,676;EP 88,046;EP 143,949;EP142,641;日本专利申请83-118008和EP 102,324以及美国专利第4,485,045号和第4,544,545号,它们的内容通过整体引用并入本文。脂质体可以是小的(约200-800埃)单层形式,其中脂质含量大于约10摩尔百分比的胆固醇,优选在10至40摩尔百分比的胆固醇的范围内,调节所选择的比例以为了最佳的肽治疗。然而,如本领域的那些技术人员在阅读本公开内容后将理解的,还可以使用磷脂囊泡而不是脂质体。
可以通过按需要将所需量的活性化合物掺入具有上文所列的一种成分或成分组合的适当溶剂中,然后微孔过滤灭菌来制备无菌注射溶液。一般来讲,分散液通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备,所述无菌媒介物含有基本分散介质和所需的来自上文所列那些成分的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下,制备的优选方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干),真空干燥和冷冻干燥会产生活性成分加上来自其之前的无菌过滤溶液的任何额外的所需成分的粉末。
可以与载体材料组合来制备单一剂型的活性成分的量将依据被治疗的受治疗者和具体的施用模式而变化。可以与载体材料组合来制备单一剂型的活性成分的量一般将为产生治疗效果的组合物的量。一般地,以百分比计,这个量将介于约0.01%至约99%的活性成分的范围内,优选约0.1%至约70%,最优选约1%至约30%的活性成分与药学上可接受的载体组合。
调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如,治疗反应)。例如,可以施用单次推注、可以在一段时间内施用几个分开的剂量、或可以按治疗情况的紧迫性的指示而成比例地降低或增加剂量。尤其有利的是配制呈易于施用和剂量均匀的剂量单元形式的肠胃外组合物。如本文所用的剂量单元形式是指适于用作待治疗的受治疗者的单元剂型的物理上离散的单元;各单元含有经计算与所需的药物载体组合产生所需的治疗作用的预定量的活性化合物。本发明的剂量单元形式的规范受控于并直接取决于(a)活性化合物的独特特征和要达到的具体治疗效果、以及(b)混合用于治疗个体敏感性的这种活性化合物的领域内所固有的局限。
对于本发明的肽或其模拟物的施用,剂量介于约0.0001至100mg/kg宿主体重的范围内,并且更通常0.01至5mg/kg。例如,剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性的治疗方案需要每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、每月一次、每3个月一次或每3至6个月一次。本发明一部分的优选剂量方案包括使用下列给药日程之一经由静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重来给予抗体:(i)每四周一次,六个剂量,然后每三个月一次;(ii)每三周一次;(iii)每三周中3mg/kg体重一次,随后1mg/kg体重一次。
可选择地,通过本发明的方法选择的肽或其模拟物可以作为持续释放制剂施用,在这种情况下,需要较低频率的施用。剂量和频率依据施用的药物在患者中的半衰期而变化。施用的剂量和频率可以依据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中,在长时间内以相对较不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者在他们的余生中持续接受治疗。在治疗应用中,有时需要以相对较短间隔的相对较高剂量,直到疾病进展减少或终止,优选直到患者显示出疾病症状的部分改善或完全改善。此后,可以对患者施用预防性方案。
本发明药物组合物中的活性成分和小分子的实际剂量水平可以变化以便获得有效地达成对特定患者、组合物和施用模式的期望治疗反应而对患者无毒的活性成分的量。所选择的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素,包括所采用的本发明具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性;施用途径;施用时间;所采用的具体化合物排出的速率;治疗的持续时间;与所采用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料;所治疗的患者的年龄、性别、体重、条件、总体健康状况和先前的医疗史;以及在医学领域内所熟知的类似因素。
通过本发明的方法选择的肽或其模拟物的“治疗有效剂量”优选导致疾病症状严重程度降低、无疾病症状阶段的频率和持续时间增加、或由于疾病折磨所致的病损或残疾被阻止。例如,对于肿瘤治疗,“治疗有效剂量”优选相对于未治疗的受试者抑制细胞生长或肿瘤生长至少约10%或20%,更优选至少约40%,甚至更优选至少约60%并且仍然更优选至少约80%。可以在预示在人肿瘤中的功效的动物模型***中评定化合物抑制肿瘤生长的能力。可选地,组合物的这种特性可以通过熟悉的从业医生已知的测定检查化合物抑制、诸如体外抑制的能力来评定。治疗化合物的治疗有效量可以降低肿瘤大小,或者以其它方式改善受治疗者的症状。本领域的普通技术人员将能够基于如下的因素来确定这种量:受治疗者的尺寸、受治疗者症状的严重程度以及所选择的具体组合物或施用途径。
本发明的组合物可以使用本领域中已知的多种方法的一种或多种经由一种或多种施用途径来施用。如本领域技术人员将了解的,施用途径和/或方式将依据期望的结果而变化。用于本发明的结合部分的优选施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径,例如通过注射或输注。如本文所用的术语“肠胃外施用”意指非肠内和局部施用的施用方式,通常通过注射进行,并且包括但不限于:静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼内、心内、皮内、腹膜内、经气管、真皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
可选择地,本发明的肽或其模拟物可以经由非肠胃外途径施用,诸如局部、表皮或粘膜施用途径,例如,鼻内、口服、***、经直肠、舌下或局部。
活性化合物可以与将保护化合物免于快速释放的载体一起制备,如受控释放制剂,所述载体包括植入物、透皮贴剂和微胶囊化的递送***。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物,如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种制剂的许多方法已被授予专利权或者一般是本领域的那些技术人员已知的。参见,例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(持续释放和受控释放药物递送***),J.R.Robinson,编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
治疗组合物可以与本领域中已知的医疗装置一起施用。例如,在优选的实施方案中,本发明的治疗组合物可以与无针的皮下注射装置一起施用,如在下列专利中所公开的:美国专利第5,399,163号;5,383,851号;5,312,335号;5,064,413号;4,941,880号;4,790,824号;或4,596,556号。可用于本发明的熟知的植入物和模块的实例包括:美国专利第4,487,603号,其公开了用于以受控的速率分散药品的可植入的微输注泵;美国专利第4,486,194号,其公开了用于穿过皮肤施用药品的治疗装置;美国专利第4,447,233号,其公开了用于以精确的输注速率递送药品的药品输注泵;美国专利第4,447,224号,其公开了用于连续药物递送的可变流植入式输注设备;美国专利第4,439,196号,其公开了具有多室的隔室的渗透性药物递送***;以及美国专利第4,475,196号,其公开了渗透性药物递送***。这些专利通过引用并入本文。许多其他的这种植入物、递送***和模块是本领域技术人员已知的。
本发明还在下列实施例中示例,下列实施例不应理解为限制性的。
示例
在整个实施例中,除非另外说明,否则使用下列材料和方法。
材料和方法
一般地,除非另外指明,否则本发明的实践采用下列方面的常规技术:化学、分子生物学、重组DNA技术、PCR技术、免疫学(尤其是,例如,抗体技术)、表达***(例如,无细胞表达、噬菌体展示、核糖体展示和Profusion)以及本领域技术内的和在文献中所解释的任何必须的细胞培养。参见,例如,Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning:(分子克隆:)Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);DNA Cloning(DNA克隆),第1卷和第2卷,(D.N.Glover,编辑1985);Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(M.J.Gait,编辑1984);PCR Handbook Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry(PCR手册核酸化学的最新实验方案),Beaucage,编辑John Wiley & Sons(1999)(编辑);Oxford Handbook of Nucleic Acid Structure(牛津大学核酸结构手册),Neidle,编辑,Oxford Univ Press(1999);PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(PCR实验方案:方法和应用指南),Innis等人,Academic Press(1990);PCR Essential Techniques:Essential Techniques(PCR基本技术:基本技术),Burke,编辑,John Wiley &Son Ltd(1996);Ike PCR Technique:RT-PCR(Ike PCR技术:RT-PCR),Siebert,编辑,Eaton Pub.Co.(1998);Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Bioogy)(抗体工程实验方案(分子生物学中的方法)),510,Paul,S.,Humana Pr(1996);Antibody Engineering:A Practical Approach (Practical Approach Series,169)(抗体工程:实践方法(实践方法系列,169),McCafferty,编辑,Irl Pr(1996);Antibodies:A Laboratory Manual(抗体:实验室手册),Harlow等人,C.S.H.L.Press,出版.(1999);Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方案),编辑Ausubel等人,JohnWiley & Sons(1992);Large-Scale Mammalian Cell;Culture Technology(大规模哺乳动物细胞培养技术),Lubiniecki,A.,编辑,Marcel Dekker,出版,(1990)。
在一些实施方案中,本发明的组合物和方法可以与任何其它领域公认的体外展示***中的那些组合物和方法结合,例如在下列专利中所描述的那些:美国专利第7,195,880号;6,951,725号;7,078,197号;7,022,479;6,518,018号;7,125,669号;6,846,655号;6,281,344号;6,207,446号;6,214,553号;6,258,558号;6,261,804号;6,429,300号;6,489,116号;6,436,665号;6,537,749号;6,602,685号;6,623,926号;6,416,950号;6,660,473号;6,312,927号;5,922,545号;6,194,550号;6,207,446号;6,214,553号;和6,348,315号,它们通过引用并入本文。
实施例
本公开内容还在下列实施例中示例,下列实施例不应理解为进一步的限制。
实施例1
天然抗体文库的设计与构建
细胞来源
从共624个不同的健康个体的整个骨髓(10个供体)、脾细胞(13个供体)和外周单核细胞(601个供体)获得mRNA以确保文库的多样性。VH文库的计算的多样性为109-1010并且VL文库的计算的多样性为106-107。
文库构建
使用RT-PCR进行VH和VL文库构建。
使用来自IgM、IgG和IgA的H链恒定区(C□1、C□1和C□1)和κ和λ的L链恒定区(C□1和C□1)的特异性引物来合成第一链cDNA。
对于可变的H链文库构建,由VH1-7家族成员的FR1区设计具有上游UTR序列的多个有义引物(简并引物)(VH1-7UTR)。由嵌套至cDNA合成引物的恒定区(C□2、C□2和C□2)设计VH的反义引物。对于可变的轻链文库构建,由各家族的V□和V□FR1区设计具有上游12个氨基酸的连接序列的多种有义引物以容许单链Fv改组。由嵌套至C□1(C□2)或J□的恒定区设计具有相同的C□2下游的□和□基因扩增的反义引物(J□C□2)。如果需要,所有IgM和IgG家族的装配的scFv将在下游末端具有相同的C□2序列。
对于VH文库构建,用C□2、C□2、C□2和VH1-7UTR作为所有三种B细胞来源各自的引物对来进行PCR并进行凝胶纯化。纯化后,分别汇集自3个来源扩增的家族并产生7个(VH1-7)IgM文库、7个(VH1-7)IgG文库和7个IgA文库(VH1-7)。对于VL文库构建,用C□2和V□或J□C□2混合物和V□进行3种B细胞来源的PCR。在凝胶纯化后,汇集来自不同来源的V□和V□文库以产生V□和V□文库。
文库修饰
还对IgM、IgG、IgA VH文库和VL文库进行修饰以在5′端携带体外转录、翻译信号序列并在3′端携带标签序列。这些VH文库易于掺入链霉抗生物素展示文库中。
文库构建的寡聚物序列
使用表2中所列的寡核苷酸引物来产生VH和VL X-展示文库。
实施例2
链霉抗生物素展示文库的制备和使用
此实施例描述了本发明的链霉抗生物素展示文库的制备和使用。
材料和方法
一般地,除非另外说明,否则本发明的实践可以采用常规的化学技术、分子生物学、重组DNA技术、免疫学(尤其是,例如抗体技术)以及多肽制备的标准技术。参见,例如,Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning:(分子克隆:)Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology)(抗体工程实验方案(分子生物学中的方法)),510,Paul,S.,Humana Pr(1996);Antibody Engineering:A Practical Approach(Practical Approach Series,169)(抗体工程:实践方法(实践方法系列,169),McCafferty,编辑,Irl Pr(1996);Antibodies:A Laboratory Manual(抗体,实验室手册),Harlow等人,C.S.H.L.Press,Pub.(1999);以及Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方案),编辑Ausubel等人,John Wiley & Sons(1992)。
缓冲液
10×化学连接缓冲液:250mM Tris pH7和1M NaCl
1×寡聚dT结合缓冲液:100mM Tris pH8、1M NaCl和0.05% TritonX-100
2×寡聚dT结合缓冲液:200mM Tris pH8、2M NaCl和0.1% TritonX-100
1×flag结合缓冲液:50mM HEPES、150mM NaCl和0.025% TritonX-100或者
1×PBS和0.025% Triton X-100
5×flag结合缓冲液:250mM HEPES、750mM NaCl和0.125% TritonX-100或者5×PBS和0.125% Triton X-100
使用的试剂的来源
Megascript T7:Ambion(Austin,TX)PH 1334
网织红细胞裂解物IVT:Ambion(Austin,TX)PH1200
UC Master混合液-met:Ambion(Austin,TX)PH 1223G
Superscript II RNA酶H-RT:Invitrogen(Carlsbad,CA)#18064-014
NAP-25柱:Amersham Pharmacia Biotech(Sunnyvale,CA)#17-0852-01
7型寡聚dT纤维素:Amersham Pharmacia Biotech(Sunnyvale,CA)#27-5543-03
抗-flag M2琼脂糖亲和凝胶:Sigma(St.Louis,MO)#A2220
Flag肽:Sigma(St.Louis,MO)#F3290
dNTP:Amersham Pharmacia Biotech(Sunnyvale,CA)#27-2035-01
Herculase Hotstart DNA聚合酶:Stratagene(La Jolla,CA)600312-51
小型离心柱:Biorad(Hercules,CA)#732-6204
超纯BSA:Ambion(Foster City,CA)#2616
剪切的鲑精DNA:Ambion(Foster City,CA)#9680
连接物:PBI、DDB、BPP:Trilink BioTechnologies,Inc.(San Diego,CA)
H2O:OmniPur(Gibbstown,NJ)#9610
2M KCl:Usb(Cleveland,OH)#75896
1M MgCl2:Usb(Cleveland,OH)#78641
0.5M EDTA:Usb(Cleveland,OH)#15694
1M Tris pH8:Usb(Cleveland,OH)#22638
1M Tris pH7:Usb(Cleveland,OH)#22637
5M NaCl:Usb(Cleveland,OH)#75888
1M HEPES:Usb(Cleveland,OH)#16924
Qiaquick凝胶提取试剂盒:Qiagen(Valencia,CA)#28706
6%TBE-尿素凝胶:Invitrogen(Carlsbad,CA)EC6865BOX
4-16%NativePAGE凝胶:Invitrogen(Carlsbad,CA)
特定试剂制备
寡聚dT纤维素(终浓度:100mg/ml)
将2.5g寡聚dT纤维素与25ml 0.1N NaOH在50ml管中混合。以1500rpm旋转混合物3分钟,然后弃去所得的上清液。用25ml 1×寡聚dT结合缓冲液洗涤所得的含有寡聚dT纤维素的团粒,并然后以1500rpm旋转3分钟再次沉淀。再次将所得上清液与团粒分离并弃去上清液。重复此洗涤步骤3次以上。在最后一次洗涤之后,测量所得上清液的pH。pH应与洗涤缓冲液相同(约pH 8.5)。然后将含有寡聚dT纤维素的团粒与上清液分离并重悬在25ml 1×寡聚dT结合缓冲液中,然后在4℃下储存。
M2琼脂糖制备
将25ml M2琼脂糖浆液转移到50ml的管中。在Beckman离心机中以1000RPM旋转5分钟,之后分离上清液并将其弃去。用1倍柱体积的甘氨酸10mM pH 3.5重悬所得的含有M2琼脂糖的团粒并以1000RPM旋转5分钟。再次弃去所得的上清液。然后用1倍柱体积的1×flag结合缓冲液重悬琼脂糖团粒。以1000RPM旋转混合物5分钟并弃去所得的上清液。重复该洗涤步骤3次并然后用1倍柱体积的1×结合缓冲液(具有1mg/ml的BSA和100μg/ml的sssDNA)重悬团粒。振荡混合物1小时或在4℃下过夜,然后将其以2ml部分的等份试样分离并在4℃下储存。
VH文库的扩增
扩增VH文库的示例性方法如下给出:
引物:
5’引物:S7(T7TMVUTR)
5’-TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACA-3’(SEQ ID No:52)
5’引物:S7a(T7TMVUTRAUG)
5’-TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAATG-3’(SEQ ID No:53)
3’引物:XB-S5-1(Cμ2flagA20+SA展示添加序列)
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAT AGC GGA TGC TAA GGA CGACTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTC GGTTGGGGCGGATGCACTCCC-3’(SEQ ID No:54)
反向框1(与引物互补的编码链的翻译):
1 G S A S A P T D Y K D D D D KS S L A S A I(终止)K K K K K K(SEQ ID No:55)
反应设置:
温度循环程序:
50℃的Tm是适当的并且Tm取决于PCR引物的选择。
文库纯化:
在2%琼脂糖凝胶上分离扩增的VH文库DNA。在紫外光下切下400bp的条带以用于使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen#28706,Valencia,CA)从凝胶片中进行DNA提取,并在300μl H2O中重构。在2% E-凝胶上施加5μL纯化的DNA进行电泳。预期回收率为约80%。
转录
反应设置(MEGAscript kitTM,Ambion PH 1334,Foster City,CA)
对于第一轮文库制备,推荐进行全规模的RNA转录(500μl)。在后面的轮中可以按比例减少反应体积。
孵育
将如上的反应混合物在37℃下孵育1-2小时或优选直至过夜。
纯化
示例性的纯化方法是在NAP-25柱上分级分离,该方法在下面给出。NAP 10和NAP 5柱可用于纯化小规模的产品,在这种情况下应相应地改变级分体积。
对于使用NAP-25柱的纯化过程,可以添加25μL DNA酶I到各500μl的转录反应中。将混合物在37℃下孵育15分钟然后进行苯酚提取,此时添加500μL苯酚-氯仿-异戊醇至混合物中。然后将混合物漩涡30秒。在微离心混合物5分钟后,可以回收水相。在加载这种水相之前,可以通过滴入10mL dH2O经过NAP-25柱来预洗该柱。然后可以加载提取的转录混合物到洗涤过的柱并使其流入柱中。之后可以添加800μL dH2O至柱中并收集流出物。可以重复该洗脱过程5次(E1-E5)并可通过在分光光度计上的A260测量所收集的样品中的RNA浓度。在2%E-凝胶上施加2μL的样品进行电泳以进行QC。可使用含有大部分RNA的级分进行连接(E3含有少量,E4是峰级分,E5含有RNA和游离NTP的混合物)。
为计算RNA的浓度,可以将5μl的每种洗脱物与995μl的H2O混合,然后测量混合物的OD。
下面示例替代性的RNA纯化程序(LiCl沉淀):
将500μL 10M LiCl添加至各500μl转录反应中,然后将混合物在-20℃下冷冻30分钟至1小时。然后可以施加混合物进行最大速度的离心20分钟。弃去所得的上清液,而团粒可重悬于50μl的3M NaOAc和50μL的dH2O中。可以进行标准的EtOH沉淀。可将所得团粒溶解于100μL的dH2O中并然后使用Qubit测量RNA浓度。
光交联
使用两种类型的补骨脂素连接物:使用含有生物素部分的2’O-MeRNA连接物PBI和DNA连接物DDB-1进行链霉抗生物素装配。
XB-PBI(SA/DNA展示连接物OMe RNA/DNA):
5′-(补骨脂素C6)u agc gga(生物素-dT)gc uaa ggA CGA-3′
XB-DDB-1(DNA展示连接物):
5′-(补骨脂素C6)(C7-NH2-EZ生物素)T AGC GGA TGC TAA GGACGA-3′
补骨脂素C6
u、a、g、c=2-MeO-RNA
A、C、G=标准的脱氧亚胺酯(amidite)
C7-NH2-氨基间隔物7
EZ-生物素,Pierce EZ-连接TFP-间隔物-生物素
反向框1(如编码链中出现的一样的连接区翻译):S S L A S A
**连接物是光敏性的并且需要用铝箔等避光)
在反应设置中,连接物/RNA比率可以为1.5∶1(最大)至1.1∶1(充足的)。
在第1轮反应中,推荐进行大规模的制备(1-2nmol的RNA)以覆盖足够的多样性。在后面的轮中,可以将RNA输入降至100-600pmol。
(连接反应中RNA的终浓度在3-15pmol/ul内有效。连接反应体积可以变化。)
对于PCR热循环仪中的退火,可以将样品在85℃下孵育30秒并以0.3℃/秒的速率降至4℃。
对于辐照,可将1μL的100mM DTT添加至退火的连接混合物中。可以将混合物转移到0.5ml的薄壁eppendorf管中或将其保持在同一PCR管中。辐照过程可以在室温下使用手握式多波长紫外灯(Uvp.com(Upland,CA)以6分钟的‘长波’(365nm)进行。根据纯化需要将预期连接约50-90%RNA。
对于连接的RNA的QC,可以将样品施加在6%TBU凝胶上进行电泳以检查连接效率。具体地,可将6%TBU凝胶在300V下预跑胶15分钟,然后移去梳子并彻底冲洗各孔。然后,对于每个孔,可混合约10-15pmol的游离的或连接的RNA与2×上样缓冲液(来自转录试剂盒)并一起在90℃下加热3分钟,随后在冰上冷却。可将预热的游离的和连接的RNA均加载到预热的凝胶的孔中用于在300V下进行电泳,直至蓝色染料达到底部。
示例性的实验如图30中进行。具体地,在体外转录KDR mRNA并通过LiCl沉淀将其从反应中纯化。通过加热至85℃将1当量的PBI连接物退火为mRNA样品,随后在1×X-连接缓冲液中缓慢冷却至4℃。添加DTT至终浓度为1mM。将样品在365nm波长下孵育不同的时间,然后在6%TBU变性凝胶上分辨。图像是凝胶的紫外光阴影。如在图30中所显示的,在5分钟辐照后观察到交联(泳道7)。进一步使用6分钟的辐照进行光交联。
链霉抗生物素的加载
链霉抗生物素是以异常高的亲和力结合其配体生物素的非常稳定的四聚蛋白,其Kd为10-15M。
A.对于PBI连接物
由于RNA的PBI连接物的O-Me RNA部分的高Tm,推荐将原始100mM NaCl缓冲液(如在1×X-连接缓冲液中)稀释至10-20mM的盐,这是用水进行的5-10×稀释。可以将1/2至1/4当量的链霉抗生物素(Prozyme,San Leandro,CA)溶液添加至PBS或1×X-连接缓冲液中,例如,4μM X-连接的RNA的链霉抗生物素终浓度为1-2μM。然后可添加1μL RNAsine并在加热模块中于48℃下孵育混合物1小时。
B.对于DDB连接物
由于DDB连接物是完全的DNA分子,因此不需要稀释1×X-连接缓冲液(100mM NaCl)。DDB连接物可以提供更好的SA加载,并且有可能仅使用对链霉抗生物素1.5-2×过量的交联的mRNA。可以将1/2或1∶1.5当量的链霉抗生物素(Prozyme,San Leandro,CA)溶液添加至PBS或1×X-连接缓冲液中,例如,4μM X-连接的RNA的链霉抗生物素终浓度为2-2.5μM。然后可添加1μL RNAsine并在加热模块中于48℃下孵育混合物1小时。
在每种情况下(A或B),可以预期加载至少超过50%并且最多80%的链霉抗生物素。
嘌呤霉素连接物BPP的加载
BPP:5′生物素-BB Cy3-(间隔物18)4-CC Pu
BPP-8:5′生物素-BB Cy3-(间隔物18)8-CC Pu
Cy3染料
4或8单位的间隔物18
Pu=嘌呤霉素-CPG
BPP连接物在3’端含有肽受体分子嘌呤霉素(肽受体进入核糖体的A位置并与新生多肽链的COOH端共价偶联)。连接物在5’端具有生物素,生物素与加载到各X-连接的mRNA分子上的链霉抗生物素分子结合。这种肽受体最终将使得mRNA(基因型)与该mRNA所编码的蛋白(表型)非共价地紧密缔合。每种形式的BPP连接物(具有较短的4×间隔物-18或具有较长的8×间隔物-18)含有Cy-3荧光染料部分(激发550,发射570nm)以便显像。可以替代Cy-3使用其他荧光染料,例如荧光素、BODIPY、Cy-5、罗丹明等。
具体地,可将1当量的相应BPP连接物(相对于链霉抗生物素的量)添加至加载的链霉抗生物素-mRNA装配体上。可在室温下将混合物孵育15分钟。可以预期几乎100%的BPP连接物与链霉抗生物素结合。
示例性的实验如图31中进行。具体地,在体外转录KDR mRNA并通过LiCl沉淀将其从反应中纯化。通过加热至85℃将1当量的PBI连接物或DDB连接物退火为mRNA样品,随后在含有100mM NaCl的1×X-连接缓冲液中缓慢冷却至4℃。然后将PBI-x-连接的mRNA的样品稀释5倍至NaCl终浓度为20mM。不稀释而使用DDB-x-连接的mRNA的样品。对于链霉抗生物素加载,将约1/2当量的链霉抗生物素添加至各样品中,随后在室温下或在50℃孵育1小时。然后以等价于链霉抗生物素的量添加BPP-Cy3连接物至各样品中。在室温下孵育15分钟后,将所得装配体在4-16%NativePage上分辨。
任选的步骤:在寡聚dT柱上纯化SA装配体
由于mRNA含有20A尾,可以在此步骤中将其在寡聚dT柱上纯化。这个纯化不是绝对必需的,但是可以多少改善下一步的融合体产率。
装配体纯化
可将等体积的2×寡聚dT结合缓冲液(200mM Tris,pH 8、2M NaCl、20mM EDTA、0.1% Triton)添加至制备的mRNA-SA装配体中。然后可将寡聚-dT纤维素添加至混合物(100mg处理的/洗涤的寡聚dT纤维素(1mL的浆液)足以捕获多达1nmol的RNA输入物)中,然后在4℃下震荡30-60分钟。然后在台式离心机中于4℃下以1500rpm旋转混合物3分钟。弃去所得的上清液。可以将所得团粒重悬于700μL的寡聚dT洗涤缓冲液(100mM Tris pH 8、1M NaCl、无EDTA、0.05% Triton x-100)中,加载至滴注/离心柱(drip/spin column)(BioRad#732-6204,Hercules,CA)上并然后在微型离心机中以1000rpm旋转10秒。可以用700μL寡聚dT洗涤缓冲液洗涤柱并以1000rpm旋转10秒以上。可重复洗涤步骤8次(在每次洗涤期间,如果变得难以旋转通过洗涤缓冲液,则可增加离心rpm和时间,但是不超过1500rpm)。可以收集5μL的最后一次洗涤液以供计数。然后可用dH2O洗脱mRNA-SA装配体。对于E1使用60μL dH2O,随后以1500rpm旋转10秒(5μL用于计数)。对于E2,可添加500μL dH2O至柱中。在室温下孵育5分钟之后,可以4000rpm旋转20秒然后收集E2(5μL用于计数)。对于E3,可以添加300μL dH2O至柱中并在室温下与柱一起孵育5分钟。然后以4000rpm旋转20秒,之后可以收集E3(5μL用于计数)。在此实施例中,E2含有80%的mRNA-SA装配体。
翻译
翻译体积可以根据RNA输入物的量而变化。示例性条件在下面给出:
翻译设置(300μL)
可以在水浴或培养箱(在水箱中)中于30℃孵育混合物45分钟至1小时。
融合体形成
可将100μL 2M KCl(终浓度500mM)与20μL 1M MgCl2(终浓度50mM)混合并在室温下孵育1小时。可以任选将所得混合物在-20℃下冷冻和储存最多几天。而且,冷冻多少会改善融合体产率。
然后可将50μL 0.5M EDTA添加至此混合物中以分解核糖体并产生无核糖体的融合体(留下10μL用于QC)。
作为用于选择的示例性翻译规模,1.2nmol RNA(10×300μL)用于第1轮,600pmol RNA(5×300μL)用于第2轮并且120-600pmol RNA(1-5×300μL)用于第3轮,等等。
通过寡聚dT纤维素进行的融合体纯化:PBI连接物
寡聚dT纯化容许RNA融合体分子(以及RNA)纯化并移除由体外翻译所产生的游离的蛋白质分子。当翻译PBI连接物装配体时,应使用这种程序和随后的反转录步骤。在DDB-连接物装配体的情况下,推荐使用不同的程序。
融合体纯化
可将等体积的2×寡聚dT结合缓冲液(200mM Tris,pH 8、2M NaCl、20mM EDTA、0.1% Triton)添加至翻译/融合体混合物中。然后可将寡聚-dT纤维素(100mg处理的/洗涤的寡聚dT纤维素(1mL的浆液)足以捕获多达1nmol的RNA输入物的翻译/融合体)添加至混合物中,然后在4℃下震荡30-60分钟。在台式离心机中于4℃下以1500rpm旋转3分钟,弃去所得的上清液。可以将所得团粒重悬于700μL的寡聚dT洗涤缓冲液(100mM Tris pH 8、1M NaCl、无EDTA、0.05% Triton x-100)中,并加载至滴注/离心柱(BioRad #732-6204,Hercules,CA)上,随后在微型离心机中以1000rpm旋转10秒。可以将所得团粒重悬于700μL寡聚dT洗涤缓冲液中,然后以1000rpm旋转10秒以再沉淀团粒。可重复此洗涤步骤8次(在每次洗涤期间,如果变得难以旋转通过洗涤缓冲液,则可增加离心rpm和时间,但是不超过1500rpm)。可以收集5μL的最后一次洗涤液以供计数。洗涤后,可使用dH2O进行洗脱。例如,对于E1可使用60μL dH2O,随后以1500rpm旋转10秒(5μL用于计数)。对于E2,可添加500μL dH2O至柱中。在室温下孵育5分钟之后,可以4000rpm旋转20秒然后收集E2(5μL用于计数)。对于E3,可以添加300μL dH2O至柱中并在室温下与柱一起孵育5分钟。然后以4000rpm旋转20秒,之后可以收集E3(5μL用于计数)。在此实施例中,E2含有80%的mRNA-SA装配体。
融合体产量的估计:
可以通过本领域中已知的方法进一步分析来自寡聚dT纤维素的融合体洗脱物,所述方法例如,凝胶电泳、荧光密度测定或放射性标记计数等。
反转录:PBI连接物
制备RNA-cDNA杂交体以稳定和降低RNA的二级结构并在选择后充当PCR的模板。在PBI连接物的情况下,优选由外部引物(S6)进行反转录,但是可能由PBI连接物自身以较低的效率进行,因为连接物的四个3’核苷酸是DNA。这可能可以将装配体转换成DNA展示的融合体,尽管我们为此目的使用了不同的全DNA连接物DDB。
外部RT引物:
XB-S6-1:5’-TTAAAT AGC GGA TGC TAA GGA CGACTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTC GGTTGGGGCGGATGCACTCCC-3’(SEQ ID No:56)
反向框1:G S A S A P T D Y K D D D D K SS L A S A I(终止)(SEQ ID No:57)
反应设置:(Invitrogen反转录试剂盒)
可以10000rpm旋转寡聚-dT洗脱物30秒来移除残余纤维素。
来自旋转的E2+E3上清液:800μl(共计小于1000pmol)
(收集10-20μL E2用于在凝胶上电泳)
在37℃孵育45-60分钟(移出10μL在凝胶上电泳)。
QC:可以通过使用NativePage的凝胶电泳监测cDNA合成并通过Cy-3染料的荧光来检测。
通过寡聚dT纤维素进行的融合体纯化,带有反转录和RNA酶H消化:
DDB连接物
通过在具有DDB连接物的mRNA-SA装配体中在柱上进行寡聚dT纯化和反转录,我们产生了DNA展示的融合体。DDB在此情况下充当RT引物。可将相同的程序应用于PBI连接物,PBI连接物也被设计为充当内部RT引物,但是与DDB相比表现出较低的效率。
DNA展示的融合体显示了对核酸酶消化很高的稳定性并且被用于基于细胞的选择和体内选择。
寡聚dT纤维素上的融合体固定
可将等体积的2×寡聚dT结合缓冲液(200mM Tris,pH 8、2M NaCl、20mM EDTA、0.1% Triton)添加至翻译/融合体混合物中。然后可再添加寡聚-dT纤维素(100mg处理的/洗涤的寡聚dT纤维素(1mL的浆液)足以捕获多达1nmol的RNA输入物的翻译/融合体),然后在4℃下震荡30-60分钟。在台式离心机中于4℃下以1500rpm旋转3分钟,弃去所得的上清液。可以将所得团粒重悬于700μL的寡聚dT洗涤缓冲液(100mM Tris pH8、1M NaCl、无EDTA、0.05% Triton x-100)中,并加载至滴注/离心柱(BioRad #732-6204,Hercules,CA)上,随后在微型离心机中以1000rpm旋转10秒。可以用700μL寡聚dT洗涤缓冲液洗涤柱,随后以1000rpm旋转10秒。可重复洗涤所得团粒8次(在每次洗涤期间,如果变得难以旋转通过洗涤缓冲液,则可增加离心rpm和时间,但是不超过1500rpm)。收集5μL的最后一次洗涤液以供计数。
寡聚dT纤维素上的反转录
可以将具有固定的融合体的寡聚dT树脂在1×第一链缓冲液(单独制备)中平衡。缓冲液含有75mM KCl和3mM MgCl2,它防止融合体从树脂上洗脱。
可以如下制备用于反转录的混合物并然后在37-39℃下孵育60-75分钟。
(此实施例中没有添加外部RT引物。具有增加的量的dNTP和SSII反转录酶。)
在此步骤中,建立了与生物素部分共价结合并继而与链霉抗生物素-BPP-融合体夹心物紧密地非共价连接的cDNA链,从而形成DNA展示融合体的前体。
RNA链的RNA酶H消化和从寡聚dT纤维素的洗脱
在反转录步骤之后,可向同一柱中添加相应量的RNA酶H(10μL RNA酶H(2U/μL,Invitrogen,Carlsbad,CA))用于上述的1000μL反应)。在37℃下再孵育1小时。
单链DNA-融合体可以通过以2000rpm离心寡聚dT柱1分钟来洗脱,并然后用500μL 1×第一链缓冲液洗涤。在此实施例中,可以从柱上洗脱出大约80-95%的材料。
示例性实验如图32和图33进行。如图32所示,在30℃下RRL中以200mM的mRNA浓度翻译DNA展示装配体(与DDB连接物x连接的mRNA)1小时。将产物加载到寡聚dT柱上(泳道2-3)。用1×寡聚dT缓冲液洗涤柱几次并然后用1×RT缓冲液洗涤两次,随后添加dNTP并在37℃下进行SSII RT 1小时。在37℃下再进行1小时的RNA酶H处理。通过离心(旋转滤器)洗脱柱。在泳道4和5中,具有PBI连接物的mRNA装配体与上述类似地被翻译,随后用寡聚dT树脂处理并用5mM Tris pH 7.0洗脱。
在图33中,在30℃下RRL中以200mM的mRNA浓度翻译DNA展示装配体(与DDB连接物x连接的mRNA,泳道1、2和3;或与BPP连接物x连接的mRNA,泳道4和5(BPP-8连接物)1小时。将产物加载到寡聚dT柱上。用1×寡聚dT缓冲液洗涤柱几次并然后用1×RT缓冲液洗涤两次,随后添加dNTP并在37℃下进行SSII RT 1小时。在37℃下再进行1小时的RNA酶H处理。通过离心(旋转滤器)洗脱柱。然后在抗FlagM2琼脂糖上纯化融合体(泳道2、3和5)。
第2链合成和DNA展示融合体装配的完成。
XB_S7(T7TMVUTR242-mer;VH IgM、IgG文库的5’PCR引物):
5’-TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACA-3’(SEQ ID No:52)
XB_S7a(具有额外的ATG的T7TMV引物45mer,将Tm改善了3℃):
5’-TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACAATG-3’(SEQ ID No:58)
可向来自前一步骤的洗脱物中添加额外的dNTP和SSII RT以及1-1.5当量的TMV-T7引物S7或S7a。
示例性的反应包括按1500μL的反应混合如上所述的试剂:
S7或S7a 1-1.5当量
SSII RT 10μL
dNTP 10μL
可将混合物在37-39℃下再孵育1小时。在第2链合成之后,完成了DNA展示融合体装配,并随后在抗FLAG抗体树脂上进行额外的纯化,融合体可用于基于细胞的选择或体内选择。
示例性的实验如图34所示。如下进行mRNA装配:将4μM RNA和4μM连接物(DDB或PBI)在1×X-连接缓冲液中于85℃至4℃退火;然后添加DTT至1mM并用UV 365处理6分钟。然后,以1∶2比率(mRNA终浓度为2μM并且SA终浓度为1μM)将SA加载到48℃的0.67×X-连接缓冲液中持续1小时。在RT(室温)下添加1μM的嘌呤霉素Cy3连接物(BPP-4×C18间隔物)至装配体中持续10分钟。不进行寡聚dT纯化。如下进行以下RT反应:使用以下3个条件采用superscript II(SSII)在42℃进行标准RT:
DDB作为RT引物,PBI作为RT引物并且S6(外部引物)仅在PBI装配体中。
在37℃下用RNA酶H(2U)处理各RT反应1小时。此外,通过在42℃下添加Y7引物(T7-TMV)1∶1和额外的SSII RT酶以及额外的dNTP持续1小时(条件得自Kurtz,Chembiochem 2001)来合成第二链。
FLAG-标签纯化
Flag纯化仅回收全长蛋白分子并移除任何游离的RNA和体外翻译所产生的截断的蛋白分子。
结合和洗涤:
可将500μL M2琼脂糖(在1×结合缓冲液中预剥离和预封闭的10mMGly pH 3.5)悬浮液转移到2ml的管中。在微型离心机中以1500rpm旋转1分钟,弃去所得的上清液。可用1mL flag结合缓冲液进一步洗涤琼脂糖2次。然后可将洗涤的M2-琼脂糖与制备的化学修饰的文库(5μl用于计数)和1/4文库体积的5×flag结合缓冲液混合在一起并在4℃下震荡1小时至过夜。在微型离心机中以1500rpm旋转1分钟,然后将所得上清液转移到新管中,而将所得的M2琼脂糖团粒重悬于0.7mL flag结合缓冲液中并加载到滴注离心柱上。可将加载过的柱在微型离心机中以1000rpm旋转10秒并用0.7ml flag结合缓冲液进一步洗涤6次,随后以1000rpm旋转10秒。然后可用0.7ml 1×结合缓冲液洗涤柱两次,随后以1000rpm旋转10秒。(可以收集5μL的最后一次洗涤液以供计数)。
洗脱:
可将在1×结合缓冲液中的500μL 100μg/mL FLAG肽添加到柱中。孵育5分钟之后,可将柱以3000rpm旋转,然后收集洗脱物。可以用300μlflag肽重复洗脱过程(可以收集5μL的每种洗脱物以供计算)。
回收估计:
常规上的回收率可以在大约10-30%。可以通过荧光或本领域中已知的其他方法来测量回收率。
PCR
根据目的,可以使用Taq聚合酶或高保真聚合酶进行扩增。推荐用小规模PCR检验PCR循环以防止通常由过度扩增所引起的假PCR产物。
反应设置:
注意:在前一步骤中所收集的级分如流出物、最后一次洗涤液、洗脱1和洗脱2可用作PCR的模板。具体地,可在此PCR反应中使用2.5-5μL的模板,尤其用于早期的选择轮(例如,第1-3轮)。然而,使用较少的量可能是有益的。示例性PCR条件在下面列出:
关于Tm的注意:Tm是对引物计算的。在此实施例中,引物可具有高于50℃或52℃至65℃的Tm。
在PCR反应之后,可使用5μL反应混合物在2%E-凝胶上进行电泳。预期在凝胶上可具有大小为约400bp的主条带。如果小规模PCR的品质是可以接受的,则剩余的洗脱物可用作相似条件下大规模PCR的模板。
DNA纯化:
有时可能必需纯化PCR产物。电泳后,可以在紫外光下切下2%琼脂糖凝胶上含有PCR产物(400bp条带)的胶片。然后可以使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen #28706,Valencia,CA)从胶片中提取DNA。可使用5μL的纯化的DNA在2% E-凝胶上进行电泳。通常可以预期约80%的回收率。
454测序的标记:DNA展示
对于非扩增选择步骤的单个分子的标记,使用以下的第2链引物:
GCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNGGGACAATTACTATTTACA ATTACA ATG(SEQ ID No:59)
此引物含有TMV序列和N6随机标签,TMV序列是一种454接头序列。3’端的相应PCR引物(含有第二454接头,基因特异性部分的Tm为50.4℃)
GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTAGCGGATGCTAAGCACGA(SEQ ID No:60)
仅使用接头引物进行扩增子制备:
正向:Tm 64.7℃
GCCTCCCTCGCGCCATCAG(SEQ ID No:61)
反向:Tm 65.7℃
GCCTTGCCAGCCCGCTCAG(SEQ ID No:62)
两者的Tm均为大约65℃,因此RACE型的PCR对于3’引物是可能的。
等同物
考虑了上面的说明之后,本发明的大量修改和替代性实施方案对于本领域技术人员将是明显的。因此,本说明书应被理解为仅是示例性的,并且目的是教导本领域技术人员实施本发明的最佳方式。在不背离本发明主旨的条件下可以充分改变结构的细节,并且保留了所附权利要求书范围内出现的所有修改的排他性用途。本发明旨在仅受随附权利要求书所要求的程度和适用的法律条文的限制。
本申请中所引物的所有文献和类似材料,包括专利、专利申请、论文、书、专著、专论、网页、图和/或附录,无论这些文献和类似材料的格式如何,均通过整体引用清楚地并入。在并入的文献和类似材料(包括定义的术语、术语使用、描述的技术或类似物)的一个或多个与本申请不同或相矛盾的情况下,以本申请为准。这些等同物旨在由下列权利要求所涵盖。
Claims (56)
1.一种X-展示复合体,所述X-展示复合体包含:
(a)第一核酸分子,所述第一核酸分子包含多肽编码序列;
(b)多肽,所述多肽由所述第一核酸分子编码;和
(c)第二核酸分子,所述第二核酸分子包含与所述第一核酸分子的部分互补的核酸序列,
其中所述第一核酸分子通过互补的核酸碱基配对与所述第二核酸分子结合,并且其中所述第二核酸分子与所述多肽非共价结合。
2.如权利要求1所述的复合体,所述复合体还包含:
(a)高亲和力配体,所述高亲和力配体与所述第二核酸分子共价结合;和
(b)配体受体,所述配体受体与肽受体结合,
其中所述高亲和力配体与所述配体受体结合并且所述肽受体与所述多肽共价结合。
3.如权利要求2所述的复合体,所述复合体还包含第二高亲和力配体,其中所述第二高亲和力配体与所述肽受体共价结合,并且其中所述第二高亲和力配体与所述配体受体结合。
4.如权利要求3所述的复合体,其中所述肽受体通过连接物与所述第二高亲和力配体结合。
5.如权利要求4所述的复合体,其中所述连接物包括聚乙二醇。
6.如权利要求4所述的复合体,其中所述连接物包括多聚唾液酸连接物。
7.如权利要求2所述的复合体,其中所述配体受体与所述肽受体共价结合。
8.如权利要求1所述的复合体,所述复合体还包含:
(a)配体受体,所述配体受体与所述第二核酸分子共价结合;和
(b)高亲和力配体,所述高亲和力配体与肽受体结合,
其中所述配体受体与所述高亲和力配体结合并且所述肽受体与所述多肽的C端共价结合。
9.如权利要求1所述的复合体,所述复合体还包含第三核酸分子,所述第三核酸分子包含与所述第二核酸分子的部分互补的核酸序列,其中所述第三核酸分子通过互补的核酸碱基配对与所述第二核酸分子结合,其中所述第三核酸分子与肽受体共价结合,并且其中所述肽受体与所述多肽共价结合。
10.如权利要求1-9任一项所述的复合体,其中所述第二核酸分子是分支的核酸分子。
11.如权利要求1-9任一项所述的复合体,其中所述第二核酸分子能够充当所述第一核酸分子反转录的引物。
12.一种X-展示复合体,所述X-展示复合体包含:
(a)核酸分子,所述核酸分子包含多肽编码序列,所述核酸分子与第一高亲和力配体共价结合;
(b)多肽,所述多肽由所述核酸分子编码;
(c)配体受体,所述配体受体与肽受体结合,
其中所述高亲和力配体与所述配体受体结合并且所述肽受体与所述多肽的C端共价结合。
13.如权利要求12所述的复合体,其中所述配体受体与所述肽受体共价结合。
14.如权利要求12所述的复合体,所述复合体还包含第二高亲和力配体,其中所述第二高亲和力配体与所述肽受体共价结合,并且其中所述第二高亲和力配体与所述配体受体结合。
15.一种X-展示复合体,所述X-展示复合体包含:
(a)核酸分子,所述核酸分子包含多肽编码序列,所述核酸分子与第一高亲和力配体共价结合;
(b)第一配体受体,所述第一配体受体与第二高亲和力配体共价结合;和
(c)多肽,所述多肽由第一核酸分子编码,其中所述多肽包含第二配体受体,
其中所述第一高亲和力配体与所述第一配体受体结合,并且所述第二高亲和力配体与所述第二配体受体结合。
16.如前述权利要求任一项所述的复合体,其中所述第一高亲和力配体或所述第二高亲和力配体是生物素。
17.如前述权利要求任一项所述的复合体,其中所述第一高亲和力配体或所述第二高亲和力配体选自包括下列的组:FK506、氨甲喋呤、PPI-2458、生物素、蛭素、ZFVp(O)F、荧光素-生物素、ABD(白蛋白结合结构域)、18bp DNA、RNA酶A、氯烷烃、芳基(β-氨基乙基)酮和蛋白A。
18.如前述权利要求任一项所述的复合体,其中所述第一配体受体或所述第二配体受体选自包括下列的组:FKBP12、二氢叶酸还原酶、甲硫氨酸氨基肽酶、二聚链霉抗生物素、链霉抗生物素四聚体、凝血酶、羧肽酶、单价抗体、HSA(白蛋白)、锌指、hRI(RNA酶抑制剂)、突变的卤代烷烃脱卤素酶、haloTag和分选酶。
19.如前述权利要求任一项所述的复合体,其中所述第一配体受体或所述第二配体受体是链霉抗生物素。
20.如前述权利要求任一项所述的复合体,其中所述多肽选自包括下列的组:抗体、VH结构域、VL结构域、Fab片段、单链抗体、纳米抗体、unibody、adnectin、亲和体、DARPin、anticalin、avimer、10Fn3结构域和versabody。
21.一种X-展示复合体,所述X-展示复合体包含:
(a)核酸分子,所述核酸分子包含多肽编码序列,所述核酸分子与高亲和力配体共价连接;和
(b)多肽,所述多肽由所述第一核酸分子编码,其中所述多肽包含配体受体,
其中所述配体与所述配体受体结合。
22.如权利要求21所述的复合体,其中所述配体是FK506并且所述配体受体是FKBP的FK506结合结构域。
23.如权利要求1-22任一项所述的复合体,其中所述第一核酸分子选自由下列组成的组:ssRNA、ssDNA、ssDNA/RNA杂交dsDNA和dsDNA/RNA杂交体。
24.如权利要求1-22任一项所述的复合体,其中所述第一核酸分子的所述多肽编码序列不含有框内终止密码子。
25.如权利要求1-22任一项所述的复合体,其中所述多肽是结合蛋白。
26.如权利要求1-25任一项所述的复合体,其中所述结合蛋白是抗体的VH结构域或VL结构域。
27.如权利要求1-22任一项所述的复合体,其中所述复合体不含有核糖体。
28.一种文库,所述文库包含多种前述权利要求任一项所述的X-展示复合体,其中所述复合体的至少一部分含有不同的多肽编码序列。
29.一种制备X-展示复合体的文库的方法,所述方法包括下列步骤:
(a)提供mRNA序列的文库,所述mRNA序列包含与第一核酸连接物互补的序列元件;
(b)提供第一核酸连接物,所述第一核酸连接物与第一高亲和力配体可操作地连接以便使所述第一核酸连接物通过互补的核酸碱基配对与所述mRNA结合;
(c)提供第二高亲和力配体,所述第二高亲和力配体与肽受体可操作地连接;
(d)提供具有至少两个结合位点的配体受体或提供至少以便使所述配体受体与所述第一高亲和力配体和所述第二高亲和力配体结合;
(e)容许mRNA翻译进行以便使所述肽受体与翻译的蛋白结合,从而形成连接所述mRNA与所述蛋白的核酸-多肽复合体。
30.如权利要求29所述的方法,所述方法还包括容许使用所述核酸-多肽复合体中的所述第一核酸连接物作为引物进行mRNA反转录以便形成DNA/RNA杂交体。
31.如权利要求30所述的方法,所述方法还包括降解所述mRNA并合成互补的DNA链,从而形成所述核酸-多肽复合体中的DNA/DNA杂交体。
32.如权利要求29所述的方法,其中所述mRNA还包含TMV增强子。
33.如权利要求29所述的方法,其中所述mRNA还包含Cμ序列。
34.如权利要求29所述的方法,其中所述mRNA还包含FLAG标签。
35.如权利要求29所述的方法,其中所述mRNA还包含SA展示序列。
36.如权利要求29所述的方法,其中所述mRNA还包含A20尾。
37.一种核酸-多肽复合体的文库,所述核酸-多肽复合体的文库通过权利要求29-35任一项所述的方法制备。
38.一种选择分离的核酸分子的方法,所述分离的核酸分子编码能够与感兴趣的抗原结合的多肽,所述方法包括下列步骤:
(a)提供权利要求29所述的核酸-多肽复合体的文库;
(b)使所述文库与感兴趣的抗原接触;
(c)从所述文库中选择与所述感兴趣的抗原结合的至少一种核酸-多肽复合体;和
(d)分离所选择的核酸-多肽复合体的多肽编码序列。
39.一种制备能够与感兴趣的抗原结合的多肽的方法,所述方法包括:
(a)提供使用权利要求38所述的方法选择的多肽编码序列;和
(b)表达所述多肽编码序列所编码的多肽。
40.一种分离的核酸分子,所述分离的核酸分子编码通过权利要求29所述的方法选择的能够与感兴趣的抗原结合的多肽。
41.一种X-展示复合体,所述X-展示复合体包含:
(a)第一核酸分子,所述第一核酸分子包含多肽编码序列;
(b)多肽,所述多肽由所述第一核酸分子编码;和
(c)第二核酸分子,所述第二核酸分子包含与所述第一核酸分子的部分互补的核酸序列;
(d)第一高亲和力配体,所述第一高亲和力配体与所述第二核酸分子共价结合;
(e)第一配体受体;
(f)第二高亲和力配体,所述第二高亲和力配体经由一个或多个连接分子与肽受体共价结合,
其中所述第一核酸分子通过互补的核酸碱基配对与所述第二核酸分子结合,其中所述第一高亲和力配体与所述配体受体在第一结合位点非共价结合,其中所述第二配体与所述配体受体在第二结合位点非共价结合,并且其中所述一个或多个连接分子是聚乙二醇分子。
42.如权利要求41所述的复合体,其中所述第一高亲和力配体是生物素并且所述配体受体选自包括下列的组:链霉抗生物素、二聚链霉抗生物素和四聚链霉抗生物素。
43.如权利要求41所述的复合体,其中所述第二高亲和力配体是生物素并且所述配体受体选自包括下列的组:链霉抗生物素、二聚链霉抗生物素和四聚链霉抗生物素。
44.如权利要求41所述的复合体,其中所述第一高亲和力配体或所述第二高亲和力配体选自包括下列的组:FK506、氨甲喋呤、PPI-2458、生物素、蛭素、ZFVp(O)F、荧光素-生物素、ABD(白蛋白结合结构域)、18bp DNA、RNA酶A、氯烷烃、芳基(β-氨基乙基)酮和蛋白A。
45.如权利要求41所述的复合体,所述复合体还包含第二配体受体。
46.如权利要求45所述的复合体,其中所述第二配体受体选自包括下列的组:FKBP12、二氢叶酸还原酶、甲硫氨酸氨基肽酶、二聚链霉抗生物素、链霉抗生物素四聚体、凝血酶、羧肽酶、单价抗体、HSA(白蛋白)、锌指、hRI(RNA酶抑制剂)、突变的卤代烷烃脱卤素酶、haloTag和分选酶。
47.如权利要求41所述的复合体,其中所述肽受体是嘌呤霉素。
48.如权利要求41所述的复合体,其中所述第一核酸分子或所述第二核酸分子还包括补骨脂素。
49.如权利要求41所述的复合体,其中所述多肽选自包括下列的组:抗体、VH结构域、VL结构域、Fab片段、单链抗体、纳米抗体、unibody、adnectin、亲和体、DARPin、anticalin、avimer、10Fn3结构域和versabody。
50.一种异双功能复合体,所述异双功能复合体包含:
(a)第一高亲和力配体,所述第一高亲和力配体与核酸分子共价结合;
(b)第二高亲和力配体,所述第二高亲和力配体与肽受体共价结合;和
(c)配体受体,所述配体受体包含两个或更多个配体结合位点;
其中所述第一高亲和力配体和所述第二高亲和力配体在不同的配体结合位点与所述配体受体结合。
51.如权利要求50所述的复合体,其中所述第一高亲和力配体与所述第二高亲和力配体是相同的。
52.如权利要求50所述的复合体,其中所述第一高亲和力配体与所述第二高亲和力配体是生物素。
53.如权利要求50所述的复合体,其中所述核酸分子包含补骨脂素部分。
54.如权利要求50所述的复合体,其中所述肽受体是嘌呤霉素。
55.如权利要求50所述的复合体,其中所述配体受体是多聚蛋白。
56.如权利要求50所述的复合体,其中所述配体受体是链霉抗生物素。
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