CN107001477A - 经稳定化且自主的抗体vh结构域 - Google Patents

经稳定化且自主的抗体vh结构域 Download PDF

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伊格纳西奥·琼斯·阿夏尔
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Abstract

本发明涉及单域抗体，其相对于4D5抗体支架或人种系VH3结构域包含至少一种修饰，所述修饰选自H35D、A78V、S93V、S93G和W103R，其中所述位置编号是根据Kabat编号方案。无二硫键的变体还包含至少一种另外的修饰，所述修饰选自C22S、A24I、A24L和C92T，前提条件是存在C22S和C92T中的至少一种。本发明还包括包含单域抗体的多模块抗体分子和抗体缀合物，以及生产它们的方法。特别地，本发明提供了单域抗体或多模块抗体分子的文库以及选择与抗原结合的抗体的方法。

Description

经稳定化且自主的抗体VH结构域
相关申请的交叉引用
本申请参考2014年11月5日递交的新加坡专利申请“稳定化、自主、无二硫键的抗体VH结构域”并要求其的优先权，该申请正式分配申请号10201407244P。根据PCT第4.18条，所述于2014年11月5日递交的申请的内容通过引用并入本文用于所有目的，包括并入未包含于本文中且涉及遵循PCT第20.5(a)条的说明书、权利要求书或附图的任何要素或部分。
发明领域
本发明一般地涉及单域抗体。更特别地，本发明涉及基于抗体VH结构域构建的稳定化且自主(autonomous)的单域抗体。
发明背景
制药业占约6000亿美元的市场，其中1000亿美元归因于迄今为止批准的～200种生物药品。基于抗体的产品占生物药品市场的40％左右，其中一些拳头产品(例如单克隆抗体Rituxan(用于治疗非霍普金氏淋巴瘤)、Herceptin(乳腺癌)和Avastin(多种癌症))占每年～100亿美元的销售额(Walsh.Nat Biotechnol 2010；28,917-924)。它们的应用不断扩张至包括广泛的疾病，以及许多不同的形式以用最有效的方式靶向疾病。完整的IgG仍然代表规范，但是抗体片段、抗体-药物缀合物和双特异性抗体跻身于扩张基于抗体的疗法的新领域最有希望的方法(Byrne等人Trends Biotechnol 2013；31,621-632；Zolot等人NatRev Drug Discov 2013；12,259-260；Nelson.mAbs 2010；2,77-83)。尽管有一些成功报道(Hong&Zeng.FEBS Lett 2014；588,350-355)，但抗体靶向细胞内靶标仍然是很大程度上难以到达的一个领域。
VH结构域是人免疫球蛋白重链的可变结构域。它们具有生成结合物(binder)和用于制药应用的潜能。VH结构域的小尺寸允许增强的肿瘤渗透、从血流中快速清除，并且使其成为靶向所谓的隐性表位(即，病毒表面抗原中存在的完整抗体不易接近的窄腔)的良好候选者(Barthelemy等人J Biol Chem 2008；283,3639-3654；Holliger&Hudson.NatBiotechnol 2005；23,1126-1136)。然而，这些支架(scaffold)的开发受到稳定性差的阻碍，稳定性差主要是由于与完整抗体中存在的轻链的稳定化相互作用丧失(Barthelemy等人J Biol Chem 2008；283,3639-3654；Holliger&Hudson.Nat Biotechnol 2005；23,1126-1136)。
以前的稳定化VH结构域的尝试已经取得了一些成功。Winter G.及其同事开发出了鉴定耐热并在体外呈现可逆折叠的VH结构域的方法(Jespers等人Nat Biotechnol2004；22,1161-1165)。使用这种方法，它们鉴定了结合β-内酰胺酶的结构域抗体(Christ等人Protein Eng Des Sel:PEDS 2007；20,413-416)。Dimitrov D.S.及其同事偶然鉴定出了具有有利稳定性的自主VH结构域。使用这种支架，他们能够基于来自供体的人CDR的移植生成噬菌体展示文库，并鉴定针对牛痘蛋白B5R、IGF-1和IGF-2的结合物(Chen等人J MolBiol 2008；382,779-789；Chen等人Mol Immunol 2010；47,912-921)。Sidhu S.S.及其同事尝试4D5抗体(曲妥单抗(transtuzumab))VH结构域的稳定化，鉴定允许自主折叠和稳定性的突变。当使用这种支架生成合成的噬菌体展示文库时，可以鉴定出针对VEGF的结合物。然而，该分子以非常规方式结合靶标：大部分结合归因于CDR-H3和之前的轻链相互作用表面，而不是由CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3构成的对流抗体互补位(Barthelemy等人J Biol Chem2008；283,3639-3654；Ma等人J Mol Biol 2013；425,2247-2259)。
此外，尽管生成自主稳定的VH结构域有进展，但是在生成可用于细胞内应用的稳定的无二硫键(disulfide-free)的VH结构域方面尚未获得成功。
因此，本领域仍然需要克服现有技术的缺点的稳定化抗体。
发明概述
本发明的发明人发现，通过提供本发明的单域抗体能够满足所述需要。
在第一方面，本发明涉及单域抗体，其中所述抗体是免疫球蛋白VH结构域，其相对于人种系VH结构域或VH结构域家族共有序列包含至少一种修饰，所述修饰选自H35D、A78V、S93V、S93G和W103R，其中所述位置编号是根据Kabat编号方案。
在多种实施方式中，所述抗体相对于人种系VH结构域或VH结构域家族共有序列还包含至少一种另外的修饰，所述修饰选自C22S、A24I、A24L和C92T，其中所述位置编号是根据Kabat编号方案，前提条件是存在C22S和C92T中的至少一种。
在多种实施方式中，抗体基于4D5抗体支架或人种系VH3结构域。
在多种实施方式中，抗体具有氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF-(Xaa)n-WVRQAPGKGLEWVA-(Xaa)p-ADSVKGRFTISADTSKNT-Xaa-YLQMNSLRAEDTAVYYC-Xaa-(Xaa)q-Y-Xaa-GQGTLVTVSS(SEQ ID NO：1)，其中所述抗体包含至少一种选自H35D、A78V、S93V、S93G和W103R的修饰；或具有氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS-Xaa-A-Xaa-SGF-(Xaa)n-WVRQAPGKGLEWVA-(Xaa)p-ADSVKGRFTISADTSKNT-Xaa-YLQMNSLRAEDTAVYY-Xaa-Xaa-(Xaa)q-Y-Xaa-GQGTLVTVSS(SEQ ID NO：2)，其中所述抗体包含至少一种选自H35D、A78V、S93V、S93G和W103R的修饰以及至少一种选自C22S、A24I、A24L和C92T的修饰，前提条件是存在C22S和C92T中的至少一种，其中n、p和q各自独立地为0或1-30之间的整数，并且其中所述位置编号是根据Kabat编号方案。
在多种实施方式中，抗体具有一个或不具有分子内二硫键。
在第二方面，本发明涉及包含单域抗体的多模块(multi-modular)抗体分子，其中所述分子是单特异性的、双特异性的或多特异性的，和/或是单价的、二价的或多价的。
在第三方面，本发明包括包含单域抗体或多模块抗体分子以及治疗剂、可检测标志物、任何其它有效载荷分子(payload molecule)或其组合的抗体缀合物。
在第四方面，本发明提供了本发明的单域抗体或多模块抗体分子的文库，其中每种抗体均包含具有氨基酸序列Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-T-Xaa-I-D(SEQ ID NO:3)的CDR-H1、具有氨基酸序列R-I-Xaa-P-Xaa-Xaa-G-Xaa-T-Xaa-Y(SEQ ID NO:4)的CDR-H2和具有氨基酸序列R-(Xaa)n-Xaa-Xaa-D(SEQ ID NO:5)的CDR-H3，其中n为6-20之间的整数。
在第五方面，本发明提供了选择与抗原结合的抗体分子的方法，所述方法包括：a.提供本发明的文库；b.使所述文库与抗原接触以使得文库中的一种或多种抗体分子与抗原结合；和c.选择编码与抗原结合的抗体分子的核酸。
在第六方面，本发明提供了编码本发明的抗体的核酸分子。
在多种实施方式中，核酸分子包含在运载体中。
在第七方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的单域抗体、多模块抗体分子、抗体缀合物或核酸分子，以及药学上可接受的载体。
在第八方面，本发明提供了将本发明的抗体缀合物递送至受试者的细胞、肿瘤、组织或器官的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述抗体缀合物，其中所述抗体缀合物中包含的抗体对细胞、肿瘤、组织或器官的抗原是特异性的。
在第九方面，本发明提供了诊断受试者的病症或疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗体缀合物或药物组合物，其中所述抗体与可检测标志物偶联，所述受试者是哺乳动物，优选地人。
在第十方面，本发明提供了治疗受试者的病症或疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗体、多模块抗体分子、抗体缀合物、核酸分子或药物组合物，所述受试者是哺乳动物、优选地人。
在第十一方面，本发明提供了包含本发明的核酸分子或运载体的宿主细胞。
在第十二方面，本发明提供了生产本发明的单域抗体或多模块抗体分子的方法，所述方法包括：在允许编码所述单域抗体或多模块抗体分子的核酸表达的条件下，表达所述核酸。
在多种实施方式中，在宿主细胞或无细胞***中表达单结构域抗体或多模块抗体分子。
在最后一方面，本发明涉及本发明的单域抗体、多模块抗体分子、抗体缀合物、核酸分子或药物组合物在诊断或治疗物病症或疾病的方法中的用途。
附图简介
结合非限制性示例和附图考虑时，参考详细描述能够更好地理解本发明。
图1显示了改进的VH-NTU(+)结构域(A)、VH-NTU(-)结构域(B)的序列，以及与Genentech的VH 1B1(GNE；C)的比较。展示了4D5 VH结构域的原始序列，优选的稳定化突变显示在野生型氨基酸下方，用框突出显示。位置编号是根据Kabat编号方案。白框是发生突变从而提高蛋白质稳定性的位置，灰框是发生突变从而产生无二硫键版本的蛋白质的位置，下划线是可以用任何序列替代以产生与任何给定靶标结合的VH结构域变体的CDR位置。
图2显示了比较表达和稳定性的支架VH-NTU(-)(A)和Genentech的VH支架1B1(B)的序列。展示了4D5VH结构域的原始序列，优选的稳定化突变显示在野生型氨基酸下方，用框突出显示。位置编号是根据Kabat编号方案。CDR-H3在第95-100a位被柔性序列SSS替代，以负责当针对不同靶标生成不同结合物时该CDR中预期的可变性。白框是发生突变从而提高蛋白质稳定性的位置，灰框是发生突变从而产生无二硫键版本的蛋白质的位置，下划线是可以用任何序列替代以产生与任何给定靶标结合的VH结构域变体的CDR位置。浅灰色序列是表达和检测所需的额外序列。
图3显示了通过western印迹比较GNE和VH-NTU(-)可溶性表达水平。将GNE可溶性级分的未稀释样品与VH-NTU(-)可溶性级分的1:2系列稀释物进行比较。
图4显示了针对GNE和VH-NTU获得的熔解温度。一式三份地进行Tm测定。绘制平均Tm和标准偏差。
图5显示了VH文库1和VH文库2的设计。(A)CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中突变的位置。请注意，在CDR-H3中，[Xaa]7-12表示文库1以频率“Xaa”引入的残基数(7-12个残基)，而[Xaa]6-20表示文库2以频率“Xaa”引入的残基数(6-20个残基)。在这些文库中，“Xaa”由简并密码子xyz编码，其中x＝0.2G+0.2A+0.5T+0.1C，y＝0.4A+0.2T+0.4C，z＝0.1G+0.9C。(B)针对显示为“Xaa”的位置设计和获得的突变频率。“X”表示琥珀密码子。
图6显示了针对Grb2(通过表面等离子体共振测量的动力学)、SHEP1(通过表面等离子体共振测量的动力学)、DHFR-TS(通过表面等离子体共振测量的动力学)、Her3(通过生物层干涉测量的动力学)和EIF4e(通过生物层干涉测量的动力学)获得的VH-NTU(-)结构域的亲和性测量。获得的亲和性(KD)如图所示。抗-Grb2 VH:固定化Grb2；从625nM开始，以1:2系列稀释抗-Grb2 VH。抗-SHEP1 VH:固定化SHEP1；从250nM开始，以1:2系列稀释抗-SHEP1VH。抗-DHFR-TS VH:固定化DHFR-TS；从125nM开始，以1:2系列稀释抗-DHFR-TS VH。抗-Her3VH:固定化VH；从200nM开始，以1:2系列稀释Her3。抗-EIF4e VH:固定化EIF4e；从125nM开始，以1:2系列稀释抗-EIF4e VH。
图7显示了表达对照VH-EGFP(顶部)和抗-Grb2 VH-EGFP(底部)的细胞的荧光图像。
发明详述
以下详细描述通过说明的方式涉及可以实施本发明的具体细节和实施方式。对这些实施方式进行了足够的详细描述，以使得本领域技术人员能够实施本发明。在不脱离本发明的范围的情况下，可以利用其它实施方式，并且可以进行结构和逻辑上的改变。多种实施方式不一定是相互排斥的，因为一些实施方式可以与一个或多个其它实施方式组合以形成新的实施方式。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。如果发生冲突，则以本文件(包括定义)为准。
本发明的目标是提供稳定化且自主的单域抗体。
为此，本发明的发明人基于抗体VH结构域通过以下产生了单域抗体：如发明人(Asial等人Nat Commun 2013；4,2901；Cornvik等人Nat Methods 2005；2,507-509)所开发地进化蛋白质溶解度(使用集落过滤印迹或CoFi)、抗聚集性和热稳定性(通过热集落过滤或Hot-CoFi)，并与定向进化方法组合。
在第一方面，本发明涉及单域抗体，其中所述抗体是免疫球蛋白重链可变(VH)结构域，其相对于人种系VH结构域或VH结构域家族共有序列包含至少一种修饰，所述修饰选自H35D(第35位的His→Asp)、A78V(第78位的Ala→Val)、S93V(第93位的Ser→Val)、S93G(第93位的Ser→Gly)和W103R(第103位的Trp→Arg)，所述位置编号是根据Kabat编号方案。
不使用数量词限定在本文中用于指代一个或多于一个(即至少一个)指代物。例如，“要素”是指至少一个要素并且可以包括多于一个要素。
在本文中使用时，术语“抗体”是指能够非共价地、可逆地并以特异性方式结合相应抗原的蛋白质性分子。抗体的典型实例是免疫球蛋白、以及仍保留结合特异性的其衍生物或功能片段。
如本领域所公知的，“免疫球蛋白”通常是指包含通过二硫键连接的至少两个重(H)链和两个轻链(L)的糖蛋白，或其抗原结合部分。每个重链具有重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区(CH)。术语“可变”是指在其序列中展示出可变性并参与决定特定抗体的特异性和结合亲和性的免疫球蛋白结构域部分(即“可变结构域”)。可变性并非均匀分布在抗体的整个可变结构域中；其集中在每个重链和轻链可变区的子结构域中。这些子结构域被称为“高变区”或“互补决定区”(CDR)。可变结构域的较保守(即，非高变)部分被称为“框架”区(FR)。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，所述四个FR区大多采用β-夹心构型，其由三个高变区连接形成环状连接，并且在某些情况下形成β片层结构的一部分。FR使得每条链的高变区与其它链的高变区靠近在一起，从而有助于抗原-结合位点的形成。通常，天然存在的免疫球蛋白包括6个CDR：VH中的3个(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和VL中的3个(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。抗体VH结构域包含四个框架区：FR1、FR2、FR3和FR4，以下列结构穿插有CDR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在天然存在的免疫球蛋白中，CDR-H3和CDR-L3展示了六种CDR中的最大的多样性，特别是CDR-H3被认为在赋予免疫球蛋白精细的特异性方面起着独特的作用。
研究抗体结构和功能的研究人员已经开发出不同的方案来鉴定存在于任何特定VH区或VL区的氨基酸序列内的重链和轻链CDR。这些方案中有许多根据与可变重链区和轻链区的周围框架相关联的不变或几乎不变的模式来鉴定CDR。然后使用对应于CDR在VH区和VL区环境中的组成残基的位置的数值范围来限定CDR。因为CDR(特别是第三CDR)的长度可以变化，所以所述方案有时还使用字母来限定组成残基。首先出现的此类方案之一被称为Kabat编号***，其基于比对当时已知的VH和VL序列，以确定可变CDR子序列在更高度保守的框架区环境中的位置。例如Handbook of Therapeutic Antibodies(2007),StefanDubel编,Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KgaA,Weinheim中更详细地描述了Kabat编号方案，该文件通过引用并入本文。
应当注意，除了序列表(见下文)之外，权利要求和整个说明书中采用的位置编号是根据Kabat方案的编号。
本申请涉及“单域抗体(single domain antibody)”，即包含单个蛋白结构域的抗体片段，所述单个蛋白结构域独立于其它可变区或结构域与抗原或表位特异性结合。单域抗体通常是抗体的最小功能性结合单元，并且对应于抗体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。单域抗体的分子量约为13kDa，或小于完整抗体大小的十分之一。根据本发明的抗体是基于VH结构域的单域抗体，所述VH结构域的氨基酸序列对应于人种系VH结构域或VH结构域家族共有序列。
术语“种系抗体”是指在不存在体细胞超突变的情况下，与由基因组DNA序列编码的抗体具有高氨基酸序列同源性的抗体。与最接近的种系基因所编码的氨基酸序列相比，种系抗体通常在可变区展示出至少60％的氨基酸序列同源性，优选地范围从60％至100％的序列同源性，或更优选地介于75％至99％的序列同源性。此类抗体经历了最低程度的体细胞超突变或没有经历体细胞超突变，这是非种系抗体的特征。
相对于本文公开的氨基酸序列的“序列同一性百分比(％)”被定义为：在比对序列并且必要时引入间隙以实现最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参照序列(即本公开的抗体分子)中的氨基酸残基两两相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的所进行的比对可以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
根据基于序列同源性的分类方法将抗体序列归类为不同的家族(Tomlinson等人JMol Biol 1992；227(3):776-798；Williams和Winter.Eur J Immunol 1993；23(7):1456-1461)；Cox等人Eur J Immunol 1994；24(4):827-36)。在本文中使用时，术语“VH结构域家族共有序列”是指通过对具有至少70％序列同源性的VH结构域序列进行比对和分组而产生的共有序列。不同VH结构域家族的共有序列是本领域公知的，可以在例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Departmentof Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242中找到。
例如，4D5框架是源自人共有序列的人工框架，其基本上对应于种系序列IGVH 3-66和IGVK 1-39(IMGT命名法)(Carter等人Proc Natl Acad Sci U S A.1992；89(10):4285-9)且最初用于抗-c-erbB2(p185HER2-ECD)mAb4D5的人源化。
值得注意的是，本发明的单域抗体相对于人种系VH结构域或VH结构域家族共有序列包含至少一种修饰，所述修饰选自H35D、A78V、S93V、S93G和W103R，其中所述位置编号是根据Kabat编号方案。发明人通过广泛的实验鉴定出了这些修饰，并引入其以提高蛋白质的稳定性。在4D5抗体支架中，VH结构域的第78、93和103位处于框架区内，而第35位处于CDR-H1内。应当注意，虽然可以用任何氨基酸残基替代CDR序列以产生与任何给定靶标结合的VH结构域变体，但发明人发现使用CDR-H1内第35位的Asp残基提高4D5支架的稳定性。这与下述最近的发现相一致：可变结构域中的一些残基也是保守的(Hsu等人Structure.2014Jan7；22(1):22-34)。
在多种实施方式中，抗体相对于人种系VH结构域或VH结构域家族共有序列还包含至少一种另外的修饰，所述修饰选自C22S(第22位的Cys→Ser)、A24I(第24位的Ala→Ile)、A24L(第24位的Ala→Leu)和C92T(第92位的Cys→Thr)，所述位置编号是根据Kabat编号方案，前提条件是存在C22S和C92T中的至少一种。引入这些修饰以产生无二硫键版本的蛋白质。
通过提供在E.coli细胞质中重组表达可溶形式的VH结构域的可能性，去除二硫键是有利的。大多数治疗性抗体目前在哺乳动物细胞系中以分泌形式表达，这是因为它们需要形成二硫键和翻译后修饰(Walsh.Nat Biotechnol 2010；28,917-924)。一些抗体片段可以在细菌中产生，但是它们通常以不溶性形式产生，随后再在体外重新折叠(Huang等人JInd Microbiol Biotechnol 2012；39,383-399)。这是一个繁琐的过程，从而减缓开发时间。有时可以在E.coli周质中生产，但这需要显著优化表达条件，而且产量通常较低(Huang等人J Ind Microbiol Biotechnol 2012；39,383-399；Kwong&Rader.Curr ProtocProtein Sci/editorial board,John E.Coligan...[等]2009；第六章,第6 10单元)。VH结构域不需要用于折叠、结合或稳定性的翻译后修饰，因此可以在细菌中以可溶性折叠形式以高产率表达无二硫键的VH。细菌相较于哺乳动物细胞的高生长速率、简单的培养条件以及通过以可溶形式生产这些分子能够获得的流水线型纯化方法减少了生产和纯化与其它免疫球蛋白形式相比的这些分子所需的时间和成本。
在多种实施方式中，抗体基于4D5抗体支架或人种系VH3结构域。以下出版物中明确定义了VH3种系：Tomlinson等人JMB 1992；227,776-798和Matsuda等人Nat Genet 1993；3(1),88-94，其通过引用并入本文。
应当注意，所有上述修饰均是在4D5支架序列的环境中通过广泛的实验得到的。然而，本领域技术人员容易理解，这些修饰可转移到其它VH结构域，特别是与4D5VH结构域具有显著同源性的VH3种系的VH结构域。
为了确定这些修饰是否可以转移到另一VH结构域，通常基于两个VH结构域的序列之间的序列或结构同源性来确定两个序列之间等同或相应的对等残基。为了确定同源性，将第一VH结构域(即，4D5抗体的VH结构域)的氨基酸序列与第二VH结构域的序列直接比较。比对序列之后，使用一种或多种本领域众所周知的同源性比对程序，例如CLUSTALW(例如使用物种之间的保守残基)，允许必要的***和缺失以维持比对(即，通过任意缺失和***避免消除保守残基)，确定与第一VH结构域的一级序列中的特定氨基酸残基等同或相应的残基。保守残基的比对优选地应保留至少20％、优选地至少30％、优选地至少40％、优选地至少50％、优选地至少60％、优选地至少70％、优选地至少80％、优选地至少90％、优选地至少95％、更优选地至少96％、甚至更优选地至少98％、甚至更优选地至少99％、最优选地100％的残基。也可以通过确定第一VH结构域和第二VH结构域之间的结构同源性(即，在结构已确定的VH结构域的三级结构的水平上)来确定等同或相应的对等残基。在这种情况下，等同或相应的残基被确定为：比对之后，第一VH结构域或前体的特定氨基酸残基的两个或更多个主链原子(N对N，CA对CA，C对C，O对O)的原子坐标在0.13nm以内，优选地为0.1nm。在最佳模型已被定向和定位以给出蛋白质的非氢蛋白原子的原子坐标的最大重叠之后实现比对。不管如何确定等同或相应的残基，也不管其中引入替代突变的第一VH结构域的同一性如何，旨在传达的是根据本发明的VH结构域多肽均可被构建成与第一VH结构域具有显著的序列同源性或结构同源性的任何第二VH结构域。
在多种实施方式中，抗体基于4D5支架，并具有氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF-(Xaa)n-WVRQAPGKGLEWVA-(Xaa)p-ADSVKGRFTISADTSKNT-Xaa-YLQMNSLRAEDTAVYYC-Xaa-(Xaa)q-Y-Xaa-GQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1)，其中所述抗体包含至少一种选自H35D、A78V、S93V、S93G和W103R的修饰，其中n、p和q各自独立地为0或1-30之间的整数，并且其中所述位置编号是根据Kabat编号方案。这种抗体具有分子内二硫键。它具有高稳定性和低聚集倾向，即便在高浓度下亦是如此。
本文所限定的n、p和q中的每一个独立地为0或1-30之间的整数，并且CDR内的每个残基均可以是任何氨基酸残基或不存在。然而，在某些实施方式中，独立折叠的分子(例如，100-200个氨基酸的完整额外结构域)也可以接枝到CDR-H3。这意味着CDR可以具有不同的长度。然而，使用Kabat编号方案来指定位置编号确保了CDR长度的变化不会影响VH结构域位置(特别是框架位置)的编号。
在多种实施方式中，抗体基于4D5支架并具有氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS-Xaa-A-Xaa-SGF-(Xaa)n-WVRQAPGKGLEWVA-(Xaa)p-ADSVKGRFTISADTSKNT-Xaa-YLQMNSLRAEDTAVYY-Xaa-Xaa-(Xaa)q-Y-Xaa-GQGTLVTVSS(SEQID NO:2)，其中所述抗体包含至少一种选自H35D、A78V、S93V、S93G和W103R的修饰，以及至少一种选自C22S、A24I、A24L和C92T的修饰，前提条件是存在C22S和C92T中的至少一种，其中n、p和q各自独立地为0或1-30之间的整数，并且其中所述位置编号是根据Kabat编号方案。通过发现可以取代上述版本的分子内二硫键中涉及的半胱氨酸的突变，获得了这种抗体。
其是首次描述的在没有二硫键的情况下稳定，且对于靶向细胞内分子展示出独特优点的VH支架。另一个优点是可以在细菌细胞质中以可溶形式表达该支架，这提高了产率，减少了生产和纯化时间，并因此降低了生产成本。一个或几个游离半胱氨酸也可被重新引入表面，并用作化学交联毒性有效载荷、荧光团、放射性同位素等的锚点。
本发明的单域抗体，无论是否具有分子内二硫键，无论是否基于4D5支架，均被设计为具有较高的热稳定性和较高的抗聚集性。
在第二方面，本发明涉及包含单域抗体的多模块抗体分子，其中所述分子是单特异性的、双特异性的或多特异性的，和/或是单价的、二价的或多价的。
术语“特异性”是指特定抗体可以结合的不同类型的表位的数目。如果抗体仅与一种类型的表位结合，则该抗体是单特异性的。如果抗体与不同类型的表位结合，则抗体是多特异性的。例如，双特异性多模块抗体允许识别两种不同类型的表位。表位是给定抗体结合的抗原上的位点。
术语“效价”是指抗体具有的针对特定表位的抗原结合位点的数目。例如，单价抗体具有一个针对特定表位的结合位点。
根据本发明的单域抗体是自主结合分子。因此，它表现为独立结合模块。若干此类抗体的组装(例如凭借通过肽接头的遗传融合)允许产生多特异性的多价结合分子。例如，通过肽接头融合两个与不同靶标结合的单域抗体产生双特异性分子，融合三个与不同靶标结合的此类单域抗体产生三特异性分子，以此类推。通过融合与单个靶标结合的相同的单域抗体，可以产生多价分子。
也可以融合其它模块以增加新功能。例如，添加Fc抗体片段允许产生具有延长的血液半衰期的分子以及抗体效应子功能(例如补体激活)。这种Fc融合物可以在本发明的单特异性单域抗体上产生，也可以在由融合几个单域抗体产生的多特异性分子或多价分子上产生。作为另一个实例，这种单域抗体可以与标准IgG融合以向IgG添加一种或几种结合功能。
产生多模块分子的技术在本领域普通技术人员的知识范围内。
在第三方面，本发明包括包含单域抗体或多模块抗体分子以及治疗剂、可检测标志物、任何其它有效载荷分子或其组合的抗体缀合物。
在本文中使用时，术语“治疗剂”是指能够在受试者中产生治疗效果的任何试剂；在本文中使用时，术语“可检测标记物”是指能够在受试者中产生通过任何方法可检测的诊断信号的任何试剂。
本发明的治疗剂或可检测标记物可以是具有适合实施本发明的期望特性的蛋白质、核酸分子、化合物、小分子、有机化合物、无机化合物或任何其它分子。
在一些实施方式中，根据本发明的可检测标记物可以是成像剂。成像剂可以是本领域技术人员已知的可用于对细胞、组织或生物膜成像的任何试剂，优选地是医学成像剂。医学成像剂的实例包括但不限于磁共振成像(MRI)剂、核磁共振成像(NMR)剂、正电子发射断层摄影(PET)剂、x射线剂、光学剂、超声剂和中子捕获治疗剂。
在一些实施方式中，可检测标记物可以是荧光化合物，例如荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等；或可检测的酶，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等等。当抗体与可检测的酶缀合时，通过添加这样的额外试剂来对其进行检测，酶使用所述额外试剂来产生可检测的反应产物。也可以用生物素衍生化抗体，然后通过间接测定亲和素或链霉亲和素结合来检测。
在本文中使用时，“任何其它有效载荷分子”是指可以与本发明的抗体直接或间接缀合的任何分子。例如，抗体缀合物在血清中的半衰期取决于许多因素，但较小的抗体片段倾向于从循环中迅速消除。因此，较小的构建体(例如包含单域抗体和小肽毒素)有利地与增加血清半衰期的多肽偶联。例如，它们可以与HSA偶联。优选地，与HSA之间的键不稳定，例如具有确定的半衰期，以使得当与细胞结合时，构建体从HSA释放，并且在没有HSA的情况下被内化。可用的方法是使用多特异性配体构建体，以使得配体也结合HSA，从而将其保持在循环中。
在一些实施方式中，治疗剂或可检测标记物可以通过共价、静电或疏水相互作用与抗体直接或间接偶联。
将药物或其它小分子药物连接到抗体片段的方法是众所周知的。本领域中确立了各种肽缀合化学物质，包括双功能化学连接剂，例如N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯；磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯；4-琥珀酰亚胺基-氧羰基-[α]-(2-吡啶基二硫代)甲苯；磺基琥珀酰亚胺基-6-[[α]-甲基-[α]-(吡啶基二硫醇)-甲苯酰氨基]己酸酯；N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫代)-丙酸酯；琥珀酰亚胺基-6-[3(-(-2-吡啶基二硫代)-丙酰氨基]己酸酯；磺基琥珀酰亚胺基-6-[3(-(-2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸酯；3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰肼、Ellman试剂、二氯三嗪酸(dichlorotriazinicacid)、S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸等。美国专利Nos.5,349,066；5,618,528；4,569,789；4,952,394和5,137,877以及Corson等人ACS Chem Biol 2008；3(11):677-692中公开了其它双官能连接分子。
在一些实施方式中，抗体包括用于释放有效载荷的可切割接头。当抗体缀合物到达预期作用位点时，某些有效载荷分子通过逃避抑制(诸如由抗体分子施加的空间位阻)正常发挥功能可需要这种构型。在一个实施方式中，接头可以是酸不稳定接头，例如腙键。酸不稳定接头的其它实例包括通过使用顺式乌头酸、顺式羧酸亚烷基三烯、聚马来酸酐和其它酸不稳定接头而形成的接头，例如美国专利Nos.5,563,250和5,505,931中所述的接头。在一个实施方式中，接头是光不稳定接头。光不稳定接头的实例包括美国专利Nos.5,767,288和4,469,774中所述的接头，所述专利文献的全部内容通过引用并入本文。
多肽试剂和多肽配体(包括抗体)可以通过一个(或两个)多肽上的官能团或反应性基团缀合。它们通常由在多肽聚合物中存在的特定氨基酸的侧链形成。这些反应性基团可以是半胱氨酸侧链、赖氨酸侧链或N-末端胺基或任何其它合适的反应性基团。反应性基团能够与待连接的配体形成共价键。官能团是形成官能团的天然或非天然氨基酸中的特定原子的组。
天然氨基酸的合适官能团是半胱氨酸的硫醇基、赖氨酸的氨基、天冬氨酸或谷氨酸的羧基、精氨酸的胍基、酪氨酸的酚基或丝氨酸的羟基。非天然氨基酸可以提供宽范围的官能团，包括叠氮化物、酮-羰基、炔、乙烯基或芳基卤基。多肽末端的氨基和羧基也可以用作与期望的配体形成共价键的官能团。可以使用巯基介导的缀合的替代物，通过共价相互作用使配体与多肽连接。这些方法可以代替巯基介导的方法(或与巯基介导的方法组合)使用：通过产生具有必需化学官能团的带有非天然氨基酸的多肽，结合带有互补官能团的小分子；或者当在选择/分离阶段之后制造分子时，通过将非天然氨基酸掺入化学或重组合成的多肽中。
Carter&Senter.Cancer J 2008；14(3):154-69以及Ducry和Stump.BioconjugChem 2010；21(1):5-13中也描述了将抗体缀合到药物和其它化合物的技术。
在第四方面，本发明提供了本发明的单域抗体或多模块抗体分子的文库，其中每种抗体均包含具有氨基酸序列Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-T-Xaa-I-D(SEQ ID NO:3)的CDR-H1、具有氨基酸序列R-I-Xaa-P-Xaa-Xaa-G-Xaa-T-Xaa-Y(SEQ ID NO:4)的CDR-H2和具有氨基酸序列R-(Xaa)n-Xaa-Xaa-D(SEQ ID NO:5)的CDR-H3，其中n为6-20之间的整数。
根据本发明的文库是基于与本文所述的CDR缀合的本发明的单域抗体或多模块抗体分子设计的，其中文库中包含的每种单域抗体均基于4D5支架或另一种VH结构域，并含有或不含分子内二硫键。作为说明性实例，本说明书的实施例4描述了本发明的无二硫键单域抗体的文库。
可以使用本领域中的多种已确立的标准方法来生成本发明的文库。作为优选的实例，可以使用噬菌粒载体，其包含(从5'-3')周质信号序列，随后是与噬菌体基因III(编码pIII)或基因VIII(编码pVIII)融合的VH结构域。寡核苷酸被设计为包含期望的随机化CDR序列，并通过使用适当设计的限制性位点进行克隆，通过基于PCR的定点诱变或通过Kunkel诱变(Kunkel.Proc Natl Acad Sci U S A 1985；82(2):488-92)被并入运载体中。将DNA文库转化到可被辅助噬菌体感染的E.coli菌株(例如TG1或XL1-blue MRF')中。辅助噬菌体包含噬菌体基因组，并允许产生含有展示在表面的抗体且在核心包装相应DNA的噬菌体颗粒。
多种文库格式是已知的并且在本发明的范围内，包括但不限于下文在本发明的第五方面描述的那些。
在多种实施方式中，文库是噬菌体展示文库。
在第五方面，本发明提供了选择与抗原结合的抗体分子的方法，所述方法包括：a.提供根据第四方面的文库；b.使所述文库与抗原接触以使得文库中的一种或多种抗体分子与抗原结合；和c.选择编码与抗原结合的抗体分子的核酸。
选择步骤可以包括分离与抗原结合的抗体分子，例如抗原可以连接到可以回收的磁珠或其它分子上，从而也回收抗体。抗体分子可以连接到其编码核酸，例如，它可以是包含核酸的颗粒或可复制遗传包的一部分。或者，选择步骤可以包括分离表达抗体分子的细菌，例如通过如下所述的迭代集落滤器筛选(iterative colony filter screening)技术。如果期望，之后可以分离编码与抗原结合的抗体分子的核酸。
多种文库形式和合适的筛选方法是已知的。
抗体分子文库可以是细菌文库，例如E.coli。因此，可以在细菌中表达抗体分子。这可以通过下述来实现：提供含有编码文库的抗体分子的核酸分子的细菌，并培养细菌以使其表达所述抗体分子。编码抗体分子文库的核酸分子是本发明的一个方面，含有所述核酸的细菌也是本发明的一个方面。细菌可以作为甘油储液方便地储存。
抗体分子可以由细菌分泌。这允许使用迭代集落滤器筛选(ICFS)技术，该技术是一种双滤器夹心试验，其中可以筛选数亿个表达抗体的细菌集落(Giovannoni等人,Nucleic Acids Res 2001；1；29(5):E27)。在ICFS中，表达文库的细菌细胞(通常为E.coli)在多孔主滤器上生长，该滤器与包被有感兴趣抗原的第二滤器接触。抗体分子由细菌分泌并扩散到第二滤器上，从而与抗原接触。检测结合在第二滤器上的抗原允许回收一些细菌细胞，包括表达感兴趣的结合特异性的细菌细胞。接下来，可使这些细菌经受第二轮筛选以分离特异性抗体分子。步骤的迭代优化(refine)所选抗体分子的群体。通过使用该方法，可以回收一些不同氨基酸序列的特异性结合抗体。
或者，文库的抗体分子可以展示在颗粒或分子复合物上，而不是被分泌。合适的可复制遗传包(genetic package)包括酵母、细菌或噬菌体(例如T7)颗粒、病毒、细胞或共价、核糖体或其它体外显示***，每种颗粒或分子复合物含有编码其上展示的抗体VH可变结构域的核酸。
使用细胞或蛋白质混合物的选择也已经在文献中有记载(Liu等人Cancer Res2004；64,704-710；Mutuberria等人J Immunol Methods 2004；287,31-47；Rubinstein等人Anal Biochem 2003；314,294-300)，这些技术可用于本发明中。
噬菌体展示是用于选择具有期望特异性的抗体分子的已知技术，其中抗体分子文库展示在丝状噬菌体上(Marks等人J Mol Biol 1991；222,581-597；Winter等人Annu RevImmunol 1994；12,433-455)。丝状噬菌体是感染细菌的病毒，因此噬菌体文库可以保持在细菌文库中。通过将编码肽的合成DNA分别***噬菌体基因III或基因VIII中，抗体分子可以与噬菌体的内部外壳蛋白pIII或主要外壳蛋白pVIII融合。认为三个(或可能是五个)pIII拷贝位于噬菌体颗粒的顶部，并且认为每个噬菌体中存在约2500个pVIII拷贝。pIII负责噬菌体与细菌F-菌毛的附着和感染，pVIII负责包被单链噬菌体DNA。pIII蛋白具有三个结构域：N1、N2和CT。可以对pIII的N末端进行融合，或者可以去除N末端结构域N1和N2，并对C端CT结构域进行融合。可以将编码单域抗体的基因***基因III中，导致融合到pIII的N末端并且并入噬菌体中的抗体分子的表达，从而允许噬菌体结合抗原。
本文所述的核酸分子可以包含编码融合到丝状噬菌体的外壳蛋白(例如，pIII或pVIII)的抗体分子的核苷酸序列。这种核酸分子可用于表达感染细菌的噬菌体上展示的抗体分子文库或获得由细菌分泌的可溶性抗体。通过在抗体分子基因和外壳蛋白基因之间***琥珀终止密码子，当噬菌体在E.coli的琥珀抑制因子菌株中生长时，琥珀密码子被读取为氨基酸，且与外壳蛋白融合的抗体被展示在噬菌体表面。当噬菌体在非抑制因子菌株中生长时，琥珀密码子被读取为终止密码子，且细菌分泌可溶性蛋白质。
选择能够结合抗原并展示在噬菌体或其它文库颗粒或分子复合物上的抗体分子之后，可以从展示所述选择的抗体分子的噬菌体或其它颗粒或分子复合物中获取核酸。所述核酸可用于随后通过由核酸表达而产生单域抗体，其中所述核酸的序列取自展示所述选择的抗体分子的噬菌体或其它颗粒或分子复合物。
因此，选择之后，可以表达编码与抗原结合的抗体分子的核酸以产生抗体分子。
从文库中选择一种或多种抗体之后，可以进一步表征抗体分子以根据抗体分子的预期目的在各种检测中测定其性质。检测可以包括测定抗体分子与感兴趣的抗原结合的亲和性、与其它抗原的交叉反应性、表位作图以确定抗原的哪个区域与抗体分子结合、免疫组织化学和其它体外试验或体内试验。
需要时，可以使用本领域众所周知的技术，使所鉴定的抗体进一步成熟或优化以获得用于特定应用中的改善的性质。抗体分子也可以被改造为不同的形式或包含附加特征。
在第六方面，本发明提供了编码本发明的抗体的核酸分子。
编码根据本发明的抗体的一条或多条链的核酸分子可以是任何可能构型(例如单链、双链或其组合)的任何核酸。核酸包括例如DNA分子、RNA分子、使用核苷酸类似物或使用核酸化学产生的DNA类似物或RNA类似物、锁核酸分子(LNA)和蛋白质核酸分子(PNA)。DNA或RNA可以是基因组来源或合成来源的，并且可以是单链或双链的。这种核酸可以是例如mRNA、cRNA、合成RNA、基因组DNA、cDNA合成DNA、DNA与RNA的共聚物、寡核苷酸等。单独的核酸还可以含有非天然核苷酸类似物或与亲和标记物或标签连接。术语“运载体”是指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。在一个实施方式中，运载体是“质粒”，其是指额外的DNA区段可以连接到其中的环状双链DNA环。在另一个实施方式中，运载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。本文公开的运载体可以能够在其被引入的宿主细胞中(例如，具有细菌复制起点和附加体型哺乳动物载体的细菌载体)自主复制，或者可以在引入宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组(例如，非附加体型哺乳动物载体)一起复制。
在多种实施方式中，编码根据本发明的单域抗体或多模块抗体分子的核酸序列包含在运载体(例如，质粒)中。
在第七方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的单域抗体、多模块抗体分子、抗体缀合物或核酸分子，以及药学上可接受的载体。
术语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激性、***反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些材料、组合物或剂型。
在本文中使用时，术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或载剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料，其涉及将主题提取物从一个器官或身体的一部分运送或运输到另一个器官或身体的一部分。每种载体必须是“可接受的”，意思是与制剂的其它成分兼容，并且不会对患者造成伤害。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无菌蒸馏水；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯或聚酐；和药物制剂中使用的其它无毒相容物质。参见Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第19版(Easton,Pa.:Mack Publishing Co.,1995)，其公开了制备药物制剂的典型载体和常规方法。
本领域技术人员还将意识到，适当的制剂取决于针对特定应用选择的施用途径，且向受试者施用本发明的单域抗体、多模块抗体分子、抗体缀合物或核酸的适当途径和模式应当根据具体情况来确定。
本发明的单域抗体、多模块抗体分子、抗体缀合物或核酸分子可以通过对基于蛋白质性或核酸的药物具有治疗有效性的任何肠胃外或非肠胃外(肠内)途径施用。肠胃外应用方法包括例如皮内、皮下、肌内、气管内、鼻内、玻璃体内或静脉内注射和输注技术，例如以注射溶液、输注溶液或酊剂的形式，以及气雾剂装置和吸入剂，例如，以气雾剂混合物、喷雾剂或粉末的形式。例如Patton等人Proc Amer Thoracic Soc 2004；第1卷第338-344页给出了关于肺部药物递送的概述，即通过气雾剂吸入(其也可以用于鼻内施用)或气管内滴注。非肠胃外递送模式为，例如，经口，例如以丸剂、片剂、胶囊、溶液或混悬剂的形式，或经直肠，例如以栓剂的形式。根据需要，本发明的抗体分子可以在含有常规无毒的药学上可接受的赋形剂或载体、添加剂和载体的制剂中全身或局部施用。
在本发明的一个实施方式中，将药物将肠胃外施用于哺乳动物，特别是人。相应的施用方法包括但不限于例如皮内、皮下、肌内、气管内或静脉内注射和输注技术，例如，以注射溶液、输注溶液或酊剂的形式，以及气雾剂装置和吸入剂，例如，以气雾剂混合物、喷雾剂或粉末的形式。在具有相对短的血清半衰期的化合物的情况下，静脉内和皮下输注和/或注射的组合可能是最方便的。药物组合物可以是水性溶液、水包油乳剂或油包水乳剂。
如Meidan VM和Michniak BB.Am J Ther 2004；1 1(4):312-316中所述的经皮递送技术(例如离子电渗、超声波导入或微针增强递送)也可以用于经皮递送本文所述的本发明的单域抗体、多模块抗体分子、抗体缀合物或核酸分子。非胃肠外递送模式为例如经口，例如以丸剂、片剂、胶囊、溶液或混悬剂的形式，或经直肠施用，例如以栓剂的形式。本发明的抗体分子可以在含有多种常规无毒的药学上可接受的赋形剂或载体、添加剂和载体的制剂中全身或局部施用。
所应用的本发明的单域抗体、多模块抗体分子、抗体缀合物或核酸分子的剂量可以在宽范围内变化以实现期望的预防作用或治疗反应。例如，其取决于抗体分子对所选靶标的亲和性以及抗体分子与配体之间的复合物在体内的半衰期。此外，最佳剂量取决于抗体分子或其缀合物的生物分布、施用模式、所治疗的疾病/病症的严重程度以及患者的医疗状况。例如，当用在用于局部应用的药膏中时，可以使用高浓度的抗体分子。然而，如果期望，也可以在持续释放制剂中给予抗体分子，所述持续释放制剂例如脂质体分散体或水凝胶基聚合物微球，如PolyActiveTM或OctoDEXTM(参见Bos等人,Business Briefing:Pharmatech 2003:1-6)。可用的其它持续释放制剂有例如基于PLGA的聚合物(PRpharmaceuticals)、基于PLA-PEG的水凝胶(Medincell)和基于PEA的聚合物(Medivas)。
因此，可以使用药学上可接受的成分以及已确立的制备方法将本发明的单域抗体、多模块抗体分子、抗体缀合物或核酸分子配制成组合物(Gennaro,A.L.和Gennaro,A.R.(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,PA)。为了制备药物组合物，可以使用药学惰性的无机或有机赋形剂。为了制备例如丸剂、粉末、明胶胶囊或栓剂，可以使用例如乳糖、滑石粉、硬脂酸及其盐、脂肪、蜡、固体或液体多元醇、天然油和硬化油。用于生产在使用前重构成溶液或气雾剂混合物的溶液、悬浮液、乳剂、气雾剂混合物或粉末的合适的赋形剂包括水、醇、甘油、多元醇及其合适的混合物以及植物油。
可以通过许多方式对制剂进行灭菌，包括通过细菌保留滤器的过滤，或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂，可以在使用前不久将所述无菌固体组合物溶解或分散在无菌水或其它无菌介质中。
在第八方面，本发明提供了将根据第三方面的抗体缀合物递送至受试者的细胞、肿瘤、组织或器官的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述抗体缀合物，其中所述抗体缀合物中包含的抗体对所述细胞、肿瘤、组织或器官的抗原是特异性的。
术语“有效量”的本发明的抗体缀合物是指提供期望效果的无毒但足量的缀合物。
在第九方面，本发明提供了诊断受试者的病症或疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗体缀合物，其中所述抗体与可检测标志物偶联，所述受试者是哺乳动物、优选地人。
术语“疾病”或“病症”在本文中可互换使用，其是指身体或一些器官的状态的任何变化，中断或干扰功能的表现或引起患病的人或与人接触者诸如不适、机能障碍、痛苦或甚至死亡等症状。疾病或病症也可以涉及瘟热(distemper)、生病(ailing)、微恙(ailment)、痼疾(malady)、病症(disorder)、疾恙(sickness)、病患(illness)、病痛(complaint)、不适(inderdisposion)或疾患(affectation)。
在一些实施方式中，本发明的抗体对于分子成像应用是有利的，这是因为相对于常规抗体其血浆半衰期较短，从而更快地实现了成像所需的对比度噪声比(contrast-to-noise ratio)。
在第十方面，本发明提供了治疗受试者的病症或疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的单域抗体、多模块抗体分子、抗体缀合物、核酸分子或药物组合物，所述受试者是哺乳动物、优选地人。
在本文中使用时，术语“治疗”是指降低症状的严重性或频率、消除症状或基本病因、预防症状或其基本病因的发生以及改善或修复损伤。例如，通过施用本发明的抗癌剂来治疗患者包括化学预防易于发生癌症的患者(例如，由于遗传易感性、环境因素等而具有较高的风险)或具有癌症复发风险的癌症幸存者，以及通过抑制病症或疾病或引起病症或疾病消退来双重治疗癌症患者。
根据本发明的抗体分子可以针对任何期望的靶标表位/抗原。取决于所选择的表位/抗原，抗体可适用于治疗病症或疾病且应该根据具体情况确定。
虽然IgG形式的单克隆抗体和Fab(利用目前的技术)仅允许靶向用于治疗应用的细胞外分子，但是其无二硫键版本的单域抗体允许靶向细胞内靶标。细胞内的还原环境导致二硫键解离以及随后的IgG和Fab聚集。由于本发明的单结构域支架已针对不存在二硫键时的稳定性进化，因此其细胞内稳定性不受影响。因此，本文所述的单域抗体可用于靶向细胞内分子，或在细胞内递送毒性有效载荷。其最有力的竞争对手是Genentech的稳定VH结构域1B1(GNE，图1C)，它仍含有二硫键，当二硫键被去除时，其稳定性显著低于本发明的支架，从而使得该分子与细胞内应用不相容。
此外，本发明的小尺寸抗体有益于微环境(niche)治疗应用例如眼科治疗(例如湿性老年黄斑变性，其中药物被注射到眼睛中，而较小的分子允许每体积包装更多分子)、肺部递送(较小的尺寸可以允许药物较深地渗透到肺)以及实体瘤治疗(较小的尺寸允许快速组织渗透)。较小的尺寸可导致药物施用频率降低。
应当理解，使用编码本发明的抗体的核酸分子的基因疗法也在本发明的范围内。通过这种方法，可以重组改变细胞以在其中***一个或多个感兴趣的基因，例如编码单域抗体或多模块抗体分子、特别是可用于抵抗微生物的抗体的基因，所述微生物例如病毒或其它病原体，包括呼吸道微生物例如细菌、真菌和寄生虫。通过递送其它抗体、特别是可用于治疗不同类型眼科疾病的那些抗体，这种方法也可用于其它疾病。也可将这种细胞(例如肌肉和呼吸细胞)***接受患者的给定器官的组织中，其中细胞表达外源DNA，合成抗体蛋白质并将其分泌到细胞周围的空间中以递送至血流或局部组织，这取决于抗体在哪儿实现其临床效果。这种施用方式允许***的工程化细胞产生恒定(可能甚至可诱导的)水平的抗体蛋白质，而没有产生大批抗体(其然后必须被储存直至使用)的商业成本和问题。此外，根据需要，可以对细胞进行工程改造以响应患者在产生不同量抗体蛋白质方面的需要。
在一些实施方式中，本发明的抗体可以分泌形式使用，而本发明的无二硫键抗体也可以在细胞内表达以调节感兴趣的生物学过程用于治疗目的。
在第十一方面，本发明提供了包含本发明的核酸分子或运载体的宿主细胞。
术语“宿主细胞”是指已经引入了表达运载体的细胞。宿主细胞包括细菌、微生物、植物或动物细胞，优选Escherichia coli、Bacillus subtilis；Saccharomycescerevisiae、Pichia pastoris、CHO(中国仓鼠卵巢系)或NSO细胞。
在第十二方面，本发明提供了生产本发明的单域抗体或多模块抗体分子的方法，所述方法包括：在允许编码所述单域抗体或多模块抗体分子的核酸表达的条件下，表达所述核酸。
在多种实施方式中，在宿主细胞或无细胞***中表达本发明的单域抗体或多模块抗体分子。
可以使用任何已知且完善的表达***和重组细胞培养技术来生产本发明的抗体分子，例如通过在细菌宿主(原核***)或真核***(例如酵母、真菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞)中表达。可以在转基因生物(例如，山羊、植物或XENOMOUSE转基因小鼠、具有人免疫球蛋白基因座的大片段且小鼠抗体产生有缺陷的工程化小鼠品系)中生产本发明的抗体分子。也可以通过化学合成来生产抗体。
为了重组生产本发明的抗体分子，通常分离编码抗体的多核苷酸并将其***可复制运载体(例如质粒)中用于进一步克隆(扩增)或表达。合适表达***的说明性实例有谷氨酸合成酶***(例如由Lonza Biologies出售)，其中宿主细胞是例如CHO或NS0。编码抗体的多核苷酸易于使用常规程序进行分离和测序。可以使用的运载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、微染色体，其中质粒是一个典型的实施方式。通常，这种运载体还包括与单域抗体多核苷酸可操作性连接的信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列以便于表达。
使用重组技术时，抗体分子可以在细胞内、在周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果抗体是在细胞内产生的，则作为第一步，通过例如离心或超滤除去颗粒碎片(宿主细胞或裂解片段)。Carter等人,Bio/Technology 1992；10:163-167描述了分离分泌到Ecoli周质空间的抗体的程序。多肽可以以可溶和折叠状态直接获得或以包涵体的形式回收，然后在体外复性。对于含有分子内二硫键的抗体，另外的选择是使用具有氧化性细胞内环境的特定宿主菌株，因此可以在细胞质中形成二硫键(Venturi M,Seifert C,Hunte C.JMol Biol 2002；315,1-8)。
可以使用任何常规纯化技术来纯化细胞所产生的抗体分子，例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析，其中亲和层析是一种优选的纯化技术。用于本发明的特定抗体分子的纯化方法的选择在本领域普通技术人员的知识范围内。
在最后一方面，本发明涉及本发明的单域抗体、多模块抗体分子、抗体缀合物、核酸分子或药物组合物在诊断或治疗物病症或疾病的方法中的用途。
通过以下实施例进一步阐释本发明。但应当理解，本发明不限于示例性实施方式。
实施例
方法
用于稳定性改善的文库生成。使用Genemorph II诱变试剂盒(Stratagene)通过易错PCR产生随机诱变文库。将克隆的野生型基因(用于第一文库)或改良的变体(用于随后的文库)用作模板，并根据制造商的方案进行反应。使用的引物与待产生突变的开放阅读框(ORF)侧翼的序列退火。在使用磷酸化引物的30个循环的PCR反应中，使用平均50ng***模板，从而导致最终质粒文库中每个基因平均～2-3个氨基酸突变。对易错PCR产物进行凝胶纯化(Qiagen凝胶纯化试剂盒)。
使用本文所述的经优化方案，通过全质粒的大引物PCR(MEGAWHOP)反应(Miyazaki.Methods Mol Biol 2003；231,23)来产生质粒文库。通常，使用1-10ng含有野生型(WT)基因的质粒作为模板，并使用～1ng***物/bp***长度的纯化的epPCR***物作为大引物(例如，对于500bp***物为500ng)，在利用KOD Xtreme聚合酶(Merck)的PCR反应中进行扩增。缓冲组合物是制造商推荐的标准品，添加1mM NAD+和40U Taq DNA连接酶，并使用0.5U KOD Xtreme聚合酶。PCR条件如下：94℃持续2分钟，(98℃持续10秒，65℃持续30秒，68℃持续6分钟)持续30个循环，保持4℃。PCR后，将20U DpnI(NEB)加入PCR反应中，并在37℃下孵育3小时。
为了生成允许鉴定无二硫键版本的VH36的文库，首先通过定点诱变去除stII信号序列，从而产生克隆VH36i。然后，通过MEGAWHOP生产定点诱变文库，其中残基第C22、A24和C96位被随机化。根据制造商的方案，使用VH36i作为模板和KOD HotStart聚合酶(Merck)，使用磷酸化正向引物(5’-GGCTCACTCCGTTTGTCCNNKGCANNK TCTGGCTTCAACATTAAAGAC-3’)和反向引物(5’-CCTCCCCAGCGGCCMNN ATAATAGACGGCAGTG-3’)进行PCR。凝胶纯化PCR产物，并如前所述进行MEGAWHOP反应，然后进行DpnI处理。用经DpnI处理的纯化的MEGAWHOP产物电穿孔DH10B细胞，从而产生～105个独特成员的文库。
溶解性和稳定性筛选。用诱变文库转化Rosetta2细胞，然后涂布在补充有50μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素的直径为24.5cm的方形LB-琼脂平板上。这些被视为母平板(master plate)。将集落转移到Durapore 0.45μm滤膜(Millipore)上，然后置于补充有抗生素和30μM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB-琼脂平板(集落面向上)上。在室温(RT)下过夜诱导用于蛋白质表达。
蛋白质产生后，使诱导板经受期望的温度(用于溶解度筛选的RT，或用于稳定性筛选的较高温度)持续30分钟。将durapore膜转移到由浸在CoFi裂解缓冲液[20mM Tris,pH8.0,100mM NaCl,0.2mg/ml溶菌酶,11.2U/mL Benzonase核酸内切酶(Merck)和1:1000稀释的不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物集合III(Merck)]中的Whatman纸和硝酸纤维素膜(Millipore)构成的裂解夹层结构中，并在筛选温度下孵育另外30分钟。
通过三个分别在-80℃和RT下的冻融循环(每次30分钟)进一步改善细胞裂解。弃去Durapore膜和Whatman纸，将硝酸纤维素膜在封闭缓冲液[TBS-T缓冲液(20mM Tris,pH7.5,500mM NaCl,0.05％(体积/体积)Tween20)和1％牛血清白蛋白(BSA)]在室温下孵育1小时。
封闭之后，将硝酸纤维素膜在TBS-T中洗涤三次，在室温下10分钟，并以70转/分钟(rpm)振摇。通过下述方法来检测可溶性蛋白质的存在：在含有1:5000稀释的HisProbe-HRP(Thermo Scientific)的TBS-T中孵育膜，或者在含1％BSA的TBS-T中将膜与1:10000稀释的蛋白质A-HRP探针(Life Technologies)一起孵育，在室温下持续1小时，以30rpm振摇。然后如上所述进行三次洗涤步骤。
利用CCD相机(Fujifilm LAS-4000)，使用Super Signal West Dura化学发光试剂盒(Thermo Scientific)使硝酸纤维素膜显影。
实施例1：通过定向进化和Hot-CoFi产生稳定的VH结构域
选择4D5VH结构域作为我们用于稳定化的亲本支架，这是因为其亲本IgG曲妥单抗是具有有利免疫原性特征的经批准FDA药物，且其稳定性已得到广泛研究(Barthelemy等人J Biol Chem 2008；283,3639-3654)。产生了4D5VH开放阅读框(ORF)的随机诱变文库，并且在80℃下通过热集落过滤(Hot-CoFi)筛选了约40000个克隆，鉴定出了22个独特的阳性克隆。
将这些变体合并在一起，并用作新的随机诱变文库的模板。第二轮筛选在90℃进行，鉴定出了31个额外的独特的阳性克隆，并对其进行进一步表征。这些克隆的生物物理学表征是通过以修改的版本测定细胞聚集温度(Tcagg)(Asial等人Nature communications2013；4,2901)进行的。在这种情况下，使用40℃-95℃的梯度，在PCR仪器中对全蛋白裂解物进行热应激，然后离心并过滤以除去聚集体。然后将可溶性级分点在硝酸纤维素膜上并显影。针对WT估计的Tcagg为～50℃，而最佳突变体VH36的Tcagg为～73℃。这相当于比WT的聚集温度提高23℃。
通过该工作鉴定的最好的两个突变体VH33和VH36分别含有突变R50S、A78V、S93G，A100bP和H35D、S93G、A100bP、W103R。有趣的是，在所选择的所有克隆中，R50和H35D的突变是相互排斥的。
实施例2：用于去除VH分子内二硫键的进一步进化
选择VH36作为无二硫键版本进化的热稳定起始模板。去除将VH36导向周质的信号肽stII，从而产生了聚集在E.coli细胞质中的模板VH36i。通过Kunkel诱变，使用NNK密码子，利用所有20个氨基酸将三个位置C22、A24和C92随机化。通过CoFi印迹从这个库筛选大致～20000个克隆，并通过蛋白质A-HRP探针使硝酸纤维素膜显影以鉴定可溶性的折叠的VH36i变体。鉴定出了五种不同的变体，VH36i.1是最稳定的，Tm＝58℃。该克隆含有突变C22S、A24C和C96T。
为了使VH36i.1可用于生成结合物，其稳定性不应该依赖于其CDR，特别是CDR-H3。此外，突变A100bP在CDR-H3中产生向下的扭结，这降低了CDR-H3的柔韧性，因此降低了CDR-H3的可塑性。由于该原因，移除了CDR-H3，并用从第W95位到第P100b位序列SSSA替代，从而产生了构建体VH37i。VH37i具有降低的稳定性，Tm＝46℃。为了进一步稳定VH37i，利用在室温下的筛选步骤和在50℃下的更严格的阳性确认，通过CoFi筛选新的随机诱变文库并通过蛋白质A-HRP探针显影。鉴定出了四个稳定的克隆，VH37i.1和VH37.2是最稳定的，具有Tm～56℃的稳定性。VH37i.1包含核心突变A78V，而VH37i.2包含位于CDR-H3附近的突变G93V。组合来自两个克隆的突变以产生最终克隆VH38i，其稳定性为Tm～57℃。该变体接受对第C24位(分子中唯一的半胱氨酸)的几种取代：原始野生型Ala，以及朝向Ile、Val、Tyr、Ser和Trp的突变。C24I和C24L是最稳定的变体，Tm～58℃。在整个研究中获得的所有知识的组合导致鉴定出了允许在存在或不存在二硫键的情况下VH结构域的稳定性较高的突变。这些优选的突变分别突出显示在图1A和1B中，其对应于本发明的最终支架，即分别为VH-NTU(+)和VH-NTU(-)。
实施例3：VH-NTU(-)和Genentech的VH 1B1在不存在二硫键时的表达和稳定性的 比较
为了比较VH支架与Genentech的VH支架1B1在不存在二硫键时的稳定性，生成待在E.coli的细胞质中表达两个蛋白质构建体(图2)。
将Genentech的支架(GNE)和具有氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSSAISGFNIKDTYIDWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYTGRSSSAMDYRGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：6)的支架VH-NTU(-)克隆到基于PET的表达运载体中，并将质粒转化到Rosetta2表达菌株中。在800mL TB培养基中于18℃下进行表达过夜。本文所述的VH-NTU(-)抗体基于4D5VH结构域，其中其CDR-H3在第95-100a位被柔性序列SSS替代，以赋予当针对多种靶标生成不同结合物时该CDR中预期的可变性。
针对GNE和VH-NTU(-)获得的细胞沉淀分别为18g和20g。将其重悬于30mL裂解缓冲液中并通过超声处理裂解。
将裂解物在4℃下以35000g离心15分钟，并保留上清液(可溶性级分)。将来自GNE和VH-NTU(-)的可溶级分的等份式样装载到SDS-PAGE凝胶上。电泳后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并用抗-myc抗体探测以比较GNE和VH-NTU(-)的可溶性表达的相对水平。
通过差示扫描荧光测定法(Ericsson等人Anal Biochem 2006；357,289-298)测定熔解温度(Tm)(图4)。GNE和VH-NTU(-)的熔解温度分别为Tm＝40.6℃和Tm＝56.1℃。因此，在不存在二硫键的情况下，VH-NTU(-)支架比Genentech的支架稳定16℃。
数据显示：在不存在二硫键的情况下，支架VH-NTU(-)优于Genentech的1B1。VH-NTU(-)在E.coli中的可溶性表达产率为128倍，且稳定性更优(提高16℃)。这些优点使得本发明的支架成为生成针对细胞内靶标的抗体的理想选择。这明显应用于靶向细胞内分子以用于治疗，但也用于研究和成像目的。较高的表达产率可以简化和加快生产和纯化过程。
实施例4：使用VH-NTU支架生成针对不同靶标的结合物
为了验证我们的支架的有用性，使用图2A中所述的序列作为模板以生成噬菌体展示抗体文库。该文库1在所有三个CDR H1、CDR H2和CDR H3中都含有突变，其中氨基酸组成偏向Tyr和Ser(图5)。
通过使用文库1，鉴定出了针对三种不同靶标：人生长因子受体结合蛋白2(Grb2)、含人SH2结构域的蛋白质3C(SHEP1)和P.falciparum双功能二氢叶酸还原酶-胸苷酸合酶(DHFR-TS)的结合物。所获得的亲和性在180nM至17nM之间(图6)。
通过对先前的设计增加改进，生成了第二代文库(文库2)：更宽的CDR-H3长度范围；CDR-H1中优选的残基T32；和取代同一CDR-H1中的残基I29以及CDR-H3中的残基M100c的疏水残基(图5)。从该文库中鉴定出了针对真核翻译起始因子4E(EIF4E)和受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-3(Her3)的结合物。使用文库2获得的亲和性范围在48nM和8nM之间(图6)。
实施例5：在人类癌细胞中表达结合物
为了证明这些VH结构域在人细胞内是稳定的，生成融合构建体，其中VH与增强的绿色荧光蛋白(EGFP)融合，从而在以可溶形式产生VH时给出绿色荧光读出。图7显示了用抗Grb2 VH-EGFP或对照VH-EGFP转染的人乳腺癌细胞MCF-7的结果。来自转染细胞的荧光信号证实了VH能够在细胞内表达并在人细胞中维持稳定性(如实施例3所述，在本发明的VH-NTU与Genentech的GNE之间的比较中，已经针对在E.coli细胞质中的表达证明了这一点)。
本文已经广泛且一般性地描述了本发明。落入一般公开内容内的每一个较窄种类和亚组都形成本发明的一部分。这包括本发明的具有前提条件或负面限制(从类别中去除任何主题)的一般描述，而无论去除的物质是否在本文中具体提及。其它实施方式也入所附权利要求内。此外，在本发明的特征或方面以马库什组进行描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明由此还以该马库什组的任何单独成员或成员亚组的形式进行了描述。
本领域的技术人员容易认识到，本发明非常适于实现目标并获得所提及的目的和优点以及其中固有的目的和优点。此外，对于本领域技术人员来说明显的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的本发明进行各种替换和修改。本文描述的组合物、方法、程序、处理、分子和具体化合物目前代表优选的实施方式，其是示例性的，并不意图限制本发明的范围。本发明的精神内所包含的本领域技术人员能够想到其中的变化和其它用途由权利要求的范围限定。在本说明书中列出或讨论先前公开的文件不应必然理解为承认所述文件是现有技术的一部分或者是公知常识。
本文说明性地描述的本发明可以适当地在不存在本文未具体公开的任何要素、限制的情况下实施。因此，例如，术语“包括”、“包括”、“含有”等应被广泛且非限制性地理解。因此，术语“包括”、“包括”、“含有”等应被理解为表示包括所述整数或整数组，而不排除任何其它整数或整数组。此外，本文使用的术语和表述作为说明性而非限制性术语使用，并且不旨在使用这些术语和表述来排除所示出和描述的特征的任何等同物或其部分，但是应该认识到，可以在所要求保护的本发明的范围内进行各种修改。因此，应当理解，虽然通过示例性实施方式和任选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以进行本文所公开的其中实施的本发明的修改和变化，并且这些修改和变化是被认为在本发明的范围内。
本文引用的所有文件和专利文件的内容通过引用整体并入本文。
序列表
<110> 南洋理工大学
<120> 经稳定化且自主的抗体VH结构域
<130> P110041
<150> 新加坡专利申请号10201407244P
<151> 2014-11-05
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工修饰的抗体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(56)
<223> Xaa是任何氨基酸或不存在。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (57)..(57)
<223> Xaa是任何氨基酸（优选地H）或D。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (72)..(101)
<223> Xaa是任何氨基酸或不存在。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (120)..(120)
<223> Xaa是A或V.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (138)..(138)
<223> Xaa是S、V或G.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (139)..(168)
<223> Xaa是任何氨基酸或不存在。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (170)..(170)
<223> Xaa是W或R。
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
100 105 110
Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Xaa Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
115 120 125
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
130 135 140
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
145 150 155 160
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Gly Gln Gly Thr Leu Val
165 170 175
Thr Val Ser Ser
180
<210> 2
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工修饰的抗体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> Xaa是C或S.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> Xaa是A、I或L.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(56)
<223> Xaa是任何氨基酸或不存在。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (57)..(57)
<223> Xaa是任何氨基酸（优选地H）或者是D。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (72)..(101)
<223> Xaa是任何氨基酸或不存在。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (120)..(120)
<223> Xaa是A或V.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (137)..(137)
<223> Xaa是C或T.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (138)..(138)
<223> Xaa是S、V或G.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (139)..(168)
<223> Xaa是任何氨基酸或不存在。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (170)..(170)
<223> Xaa是W或R.
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Xaa Ala Xaa Ser Gly Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
100 105 110
Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Xaa Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
115 120 125
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
130 135 140
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
145 150 155 160
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Gly Gln Gly Thr Leu Val
165 170 175
Thr Val Ser Ser
180
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工修饰的抗体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是任何氨基酸或不存在。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是F、L、I或V.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(4)
<223> Xaa是任何氨基酸或不存在。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是任何氨基酸或不存在。
<400> 3
Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Ile Asp
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工修饰的抗体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是任何氨基酸或不存在。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Xaa是任何氨基酸或不存在。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是任何氨基酸或不存在。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是任何氨基酸或不存在。
<400> 4
Arg Ile Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工修饰的抗体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(7)
<223> Xaa是任何氨基酸.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(21)
<223> Xaa是任何氨基酸或不存在。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> Xaa是A或G.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> Xaa是M、F、L、I或V.
<400> 5
Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp
20
<210> 6
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工修饰的抗体
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Ser Ala Ile Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Thr
85 90 95
Gly Arg Ser Ser Ser Ala Met Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115

Claims (20)

1.单域抗体，其中所述抗体是相对于人种系VH结构域或VH结构域家族共有序列包含至少一种修饰的免疫球蛋白VH结构域，所述修饰选自H35D、A78V、S93V、S93G和W103R，其中所述位置编号是根据Kabat编号方案。
2.权利要求1所述的抗体，其中所述抗体相对于人种系VH结构域或VH结构域家族共有序列还包含至少一种另外的修饰，所述修饰选自C22S、A24I、A24L和C92T，其中所述位置编号是根据Kabat编号方案，前提条件是存在C22S和C92T中的至少一种。
3.权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体基于4D5抗体支架或人种系VH3结构域。
4.权利要求1-3中任一项所述的抗体，其中所述抗体
a.具有氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF-(Xaa)n-WVRQAPGKGLEWVA-(Xaa)p-ADSVKGRFTISADTSKNT-Xaa-YLQMNSLRAEDTAVYYC-Xaa-(Xaa)q-Y-Xaa-GQGTLVTVSS(SEQ IDNO：1)，其中所述抗体包含至少一种选自H35D、A78V、S93V、S93G和W103R的修饰；或
b.具有氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS-Xaa-A-Xaa-SGF-(Xaa)n-WVRQAPGKGLEWVA-(Xaa)p-ADSVKGRFTISADTSKNT-Xaa-YLQMNSLRAEDTAVYY-Xaa-Xaa-(Xaa)q-Y-Xaa-GQGTLVTVSS(SEQ ID NO：2)，其中所述抗体包含至少一种选自H35D、A78V、S93V、S93G和W103R的修饰以及至少一种选自C22S、A24I、A24L和C92T的修饰，前提条件是存在C22S和C92T中的至少一种，
其中n、p和q各自独立地为0或1-30之间的整数，并且其中所述位置编号是根据Kabat编号方案。
5.权利要求4所述的抗体，其中根据a.的抗体具有分子内二硫键，以及根据b.的抗体没有分子内二硫键。
6.多模块抗体分子，其包含根据权利要求1-5中任一项所述的单域抗体，其中所述分子是单特异性的、双特异性的或多特异性的和/或是单价的、二价的或多价的。
7.抗体缀合物，其包含根据权利要求1-5中任一项所述的单域抗体或权利要求6所述的多模块抗体分子，以及治疗剂、可检测标志物、任何其它有效载荷分子或其组合。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的单域抗体或根据权利要求6所述的多模块抗体分子的文库，其中每种抗体均包含具有氨基酸序列Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-T-Xaa-I-D(SEQ ID NO:3)的CDR-H1、具有氨基酸序列R-I-Xaa-P-Xaa-Xaa-G-Xaa-T-Xaa-Y(SEQ ID NO:4)的CDR-H2和具有氨基酸序列R-(Xaa)n-Xaa-Xaa-D(SEQ ID NO:5)的CDR-H3，其中n为6-20之间的整数。
9.根据权利要求8所述的文库，其中所述文库是噬菌体展示文库。
10.一种选择与抗原结合的抗体分子的方法，所述方法包括：
a.提供根据权利要求8-9中任一项所述的文库；
b.使所述文库与所述抗原接触以使得所述文库中的一种或多种抗体分子与所述抗原结合；和
c.选择编码与所述抗原结合的抗体分子的核酸。
11.编码权利要求1-10中任一项所限定的抗体分子的核酸分子。
12.权利要求11所述的核酸分子，其包含在运载体中。
13.药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的单域抗体、权利要求6所述的多模块抗体分子、权利要求7所述的抗体缀合物或权利要求11-12中任一项所述的核酸分子，以及药学上可接受的载体。
14.一种将根据权利要求7所述的抗体缀合物递送至受试者的细胞、肿瘤、组织或器官的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述抗体缀合物，其中所述抗体缀合物中包含的抗体对所述细胞、肿瘤、组织或器官的抗原是特异性的。
15.一种诊断受试者的病症或疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求7所述的抗体缀合物或权利要求13所述的药物组合物，其中所述抗体与可检测标志物偶联，所述受试者是哺乳动物、优选地人。
16.一种治疗受试者的病症或疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-5中任一项所述的单域抗体、权利要求6所述的多模块抗体分子、权利要求7所述的抗体缀合物、权利要求11-12所述的核酸分子或权利要求13所述的药物组合物，所述受试者是哺乳动物、优选地人。
17.宿主细胞，其包含权利要求11所述的核酸分子或权利要求12所述的运载体。
18.一种生产权利要求1-5中任一项所述的单域抗体或权利要求6所述的多模块抗体分子的方法，所述方法包括：在允许编码所述单域抗体或多模块抗体分子的核酸表达的条件下，表达所述核酸。
19.权利要求18所述的方法，其中在宿主细胞或无细胞***中表达所述单域抗体或多模块抗体分子。
20.权利要求1-5中任一项所述的单域抗体、权利要求6所述的多模块抗体分子、权利要求7所述的抗体缀合物、权利要求11-12所述的核酸分子或权利要求13所述的药物组合物在诊断或治疗物病症或疾病的方法中的用途。
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