CN102630490A - 一种提高虫草素含量的蛹虫草菌丝体的人工培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高虫草素含量的蛹虫草菌丝体的人工培养方法，它包括试管斜面菌种培养、试管液体菌种培养、三角瓶液体种子培养、种子罐培养、发酵罐培养，其特征在于所述的发酵罐培养步骤中当种子罐培养至菌丝体收得率0.4-0.8%时，转入发酵罐培养，其培养基中按重量百分比含有1%—9%的硫酸锰，温度23℃~26℃，通气1∶0.5，搅拌转速120rpm~150rpm，培养至菌丝体收得率1.2-1.8%，培养基还原糖含量至多0.2%时，放罐收获，本发明通过锰离子的胁迫作用，蛹虫草菌丝体中虫草素含量比未添加硫酸锰的对照培养基增加0.8倍以上，为虫草素产品的生产提供了增加产量的有效方法，有着广阔的市场前景。
Description
技术领域：
本发明涉及一种通过锰离子胁迫提高虫草素产量的蛹虫草菌丝体的人工培养方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
虫草素（cordycepin，即3’-脱氧腺苷）是一些虫草属真菌的特征性成分，也是虫草属真菌中最重要的活性成分之一。
虫草素有免疫调节、抗肿瘤、抗疲劳、调节心肺等功能。虫草素作为一种新型的广谱抗菌素，以其特有的抗菌抗病毒活性，它能抑制病毒的RNA合成；对枯草杆菌和鸟结核杆菌均有抑制作用；对HIV-I型病毒也有杀伤作用；尤其对多种实体恶性肿瘤有很强的抑制作用。虫草素显示出极好的药学应用前景，目前虫草素的研究现正成为药物化学中一个极其活跃的领域。
虫草素在冬虫夏草中的含量极微，而一些其它的虫草属真菌如蛹虫草、九州虫草等，其虫草素要高得多。所以当前虫草素产品一般是从蛹虫草中提取获得的。
提高虫草属真菌的虫草素含量的方法有两类，一类是通过菌株的诱变育种等方式，提高原有菌种的虫草素产量水平，如“一种生产虫草素的方法及高产蛹虫草菌株BYB－08的选育与应用CN200810101715”，选育了一株高产菌株BYB－08；“一种高含量虫草素的北冬虫夏草工业化培养方法CN200610117998” 中，选育了菌株蛹虫草COB201、CGMCC No.1823，都比原来的出发菌株产量提高。另一类方法是通过培养条件优化和培养过程中添加诱导物的方式提高虫草素的产量。如“一种用于高蛹虫草生物量和高虫草素含量的发酵方法CN200910027839”中，通过培养过程中加入生物型诱导子炭角菌属银杏内生真菌提取液，和非生物型诱导子乙酸钠、硫酸铵，促进菌体中虫草素的产生。
这些方式无论是诱变育种的方式还是内生真菌诱导子的方式提高虫草素的含量，操作起来都比较麻烦，且虫草素含量不是很高。
申请人在长期从事虫草属真菌的研究工作中，发现了虫草属真菌对于锌离子、锰离子具有超强耐性和富集特性，在进一步研究虫草真菌对于锌离子和锰离子的超强耐性和富集特性的生理生化机制的时候，发现较高浓度的锰离子对于虫草素的产生具有诱导作用和促进作用。这一发现在虫草素的生产上有极好的应用前景。
目前，国内外关于通过锰离子胁迫提高虫草素产量的人工培养方法还没有报道。
发明内容：
本发明的目的在于克服上述已有技术的不足而提供了一种操作简单、虫草素含量高的一种通过锰离子胁迫提高虫草素含量的蛹虫草菌丝体的人工培养方法。
本发明的目的可以通过如下措施来达到：一种提高虫草素含量的蛹虫草菌丝体的人工培养方法，它包括以下步骤：试管斜面菌种培养、试管液体菌种培养、三角瓶液体种子培养、种子罐培养、发酵罐培养，其特征在于所述的发酵罐培养步骤中当种子罐培养至菌丝体收得率0.4-0.8%时，转入发酵罐培养，其培养基中按重量百分比含有1%—9%的硫酸锰，温度23℃~26℃，通气1∶0.5，搅拌转速120 rpm~150 rpm，培养至菌丝体收得率1.2-1.8%，培养基还原糖含量至多0.2%时，放罐收获。
为了进一步实行本发明的目的，所述的发酵罐培养基由葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、硫酸锰、水组成。
为了进一步实行本发明的目的，所述的发酵罐培养基由蔗糖、玉米浆、硫酸锰、水组成。
为了进一步实行本发明的目的，所述的发酵罐培养基由玉米粉、豆饼粉、硫酸锰、水组成。
为了进一步实行本发明的目的，所述的发酵罐培养基由蔗糖、鱼粉、硫酸锰、水组成。
本发明同已有技术相比可产生如下积极效果：申请人基于对蛹虫草菌丝体对锰离子富集机制的研究，了解到蛹虫草菌丝体对锰离子有极强的富集能力，且发现在高浓度锰离子胁迫下，能提高菌丝体虫草素的产量，且有最佳锰离子浓度范围。采用本发明的培养方法，不仅简单易行，且虫草素产量高，比未加高浓度锰离子胁迫的菌丝体中虫草素含量高出0.8倍以上。
具体实施方式 ：下面对本发明的具体实施方式作详细说明：
实施例1：
菌种：蛹虫草菌种蛹虫草5.270，来源于广东省微生物菌种保藏中心。
试管斜面菌种培养（活化）（也可按照其他常规方法进行培养）：
配制培养基：葡萄糖10-60g，蛋白胨1-10g，酵母提取物1-10g，硫酸镁1-5g，磷酸二氢钾1-5g，琼脂粉15-20g，水890-971g，其pH值为5.0-7.0，分装于试管中；将蛹虫草菌种在无菌条件下接入试管斜面，15~30℃暗培养5—10天；
试管液体菌种培养（也可按照其他常规方法进行培养）：
配制培养基：葡萄糖10-60g，蛋白胨1-10g，酵母提取物1-10g，硫酸镁1-5g，磷酸二氢钾1-5g，水910-986g，其pH值为5.0-7.0，分装于试管中，灭菌；接入活化后斜面菌种，15~30℃，搅拌转速120rpm，培养5天~10天；
进行三角瓶液体种子培养（也可按照其他常规方法进行培养）：
配制培养基：葡萄糖10-60g，蛋白胨1-10g，酵母提取物1-10g，硫酸镁1-5g，磷酸二氢钾1-5g，水910-986 g，其pH值为5.0-7.0，将配制好的培养基分装入500ml锥形瓶中，每瓶装200ml，封口后在120~130℃条件下灭菌18~ 30分钟，取出培养基，5.0-7.0冷却至20~30℃；在无菌条件下每瓶接入10ml—20ml培养好的试管液体菌种，15~30℃，搅拌转速120rpm，培养5天~10天；
种子罐培养（也可按照其他常规方法进行培养）：
配制培养基：葡萄糖10-60g，蛋白胨1-10g，酵母提取物1-10g，硫酸镁1-5g，磷酸二氢钾1-5g，水910-986g，其pH值为5.0-7.0，分批灭菌，接入培养好的三角瓶液体菌种，投料体积60%—80%，温度15~30℃，通气1∶0.5，在100L种子罐中15~30℃培养2—5天，并逐级扩大至10吨罐中搅拌培养2—5天；
发酵罐培养：
当种子罐培养至菌丝体收得率0.4-0.8%时，转入50吨发酵罐培养，投料40吨，投料（培养基）为：葡萄糖800-2000 kg，蛋白胨160-400 kg，酵母提取物160-400 kg，硫酸锰400 kg -3600kg，水余量，其pH值为5.0-7.0，温度23℃~26℃，通气1∶0.5，搅拌转速120 rpm~150 rpm，培养至菌丝体收得率1.2-1.8%，培养基还原糖含量至多0.2%时，放罐收获。菌丝体中虫草素含量达到2.31mg/g，而未添加硫酸锰的条件下菌丝体中虫草素含量达到 0.69mg/g，添加硫酸锰之后增加2.3倍。
实施例2：
菌种：蛹虫草菌种蛹虫草5.701，来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
试管斜面菌种培养（活化）（也可按照其他常规方法进行培养）：
配制培养基：葡萄糖10-60g，蛋白胨1-10g，酵母提取物1-10g，硫酸镁1-5g，磷酸二氢钾1-5g，琼脂粉15-20g，水890-971g，其pH值为5.0-7.0，分装于试管中；将蛹虫草菌种在无菌条件下接入试管斜面，15~30℃暗培养5—10天；
试管液体菌种培养（也可按照其他常规方法进行培养）：
配制培养基：葡萄糖10-60g，蛋白胨1-10g，酵母提取物1-10g，硫酸镁1-5g，磷酸二氢钾1-5g，水910-986g，其pH值为5.0-7.0，分装于试管中，灭菌；接入活化后斜面菌种，15~30℃，搅拌转速120rpm，培养5天~10天；
三角瓶液体种子培养（也可按照其他常规方法进行培养）：
配制培养基：葡萄糖10-60g，蛋白胨1-10g，酵母提取物1-10g，硫酸镁1-5g，磷酸二氢钾1-5g，水910-986 g，其pH值为5.0-7.0，将配制好的培养基分装入500ml锥形瓶中，每瓶装200ml，封口后在120~130℃条件下灭菌18~ 30分钟，取出培养基，5.0-7.0冷却至20~30℃；在无菌条件下每瓶接入10ml—20ml培养好的试管液体菌种，15~30℃，搅拌转速120rpm，培养5天~10天；
种子罐培养（也可按照其他常规方法进行培养）：
配制培养基：葡萄糖10-60g，蛋白胨1-10g，酵母提取物1-10g，硫酸镁1-5g，磷酸二氢钾1-5g，水910-986g，其pH值为5.0-7.0，分批灭菌，接入培养好的三角瓶液体菌种，投料体积60%—80%，温度15~30℃，通气1∶0.5，在100L种子罐中15~30℃培养2—5天，并逐级扩大至10吨罐中搅拌培养2—5天；
发酵罐培养：
当种子罐培养至菌丝体收得率0.4-0.8%时，转入50吨发酵罐培养。投料40吨，投料（培养基）为：蔗糖800-2000 kg，鱼粉 200-400 kg，硫酸锰400 kg -3600kg，水余量，其pH值为5.0-7.0，温度23℃~26℃，通气1∶0.5，搅拌转速120 rpm~150 rpm，培养至菌丝体收得率1.2-1.8%，培养基还原糖含量至多0.2%时，放罐收获。菌丝体中虫草素含量达到1.17mg/g，而未添加硫酸锰的条件下菌丝体中虫草素含量达到0.65mg/g，添加硫酸锰之后增加了 0.8倍。
实施例3：
菌种：蛹虫草菌种蛹虫草5.270，来源于广东省微生物菌种保藏中心。
试管斜面菌种培养（活化）（也可按照其他常规方法进行培养）：
配制培养基：葡萄糖20g，蛋白胨6g，酵母提取物5g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾1g，琼脂粉15g，水952g，其pH值为5.0-7.0，分装于试管中；将蛹虫草菌种在无菌条件下接入试管斜面，15~30℃暗培养5—10天；
试管液体菌种培养（也可按照其他常规方法进行培养）：
配制培养基：葡萄糖10-60g，蛋白胨1-10g，酵母提取物1-10g，硫酸镁1-5g，磷酸二氢钾1-5g，水910-986g，其pH值为5.0-7.0，分装于试管中，灭菌；接入活化后斜面菌种，15~30℃，搅拌转速120rpm，培养5天~10天；
三角瓶液体种子培养（也可按照其他常规方法进行培养）：
配制培养基：葡萄糖10-60g，蛋白胨1-10g，酵母提取物1-10g，硫酸镁1-5g，磷酸二氢钾1-5g，水910-986g，其pH值为5.0-7.0，将配制好的培养基分装入500ml锥形瓶中，每瓶装200ml，封口后在120~130℃条件下灭菌18~ 30分钟，取出培养基，5.0-7.0冷却至20~30℃；在无菌条件下每瓶接入10ml—20ml培养好的试管液体菌种，15~30℃，搅拌转速120rpm，培养5天~10天；
种子罐培养（也可按照其他常规方法进行培养）：
配制培养基：葡萄糖10-60g，蛋白胨1-10g，酵母提取物1-10g，硫酸镁1-5g，磷酸二氢钾1-5g，水910-986g，其pH值为5.0-7.0，分批灭菌，接入培养好的三角瓶液体菌种，投料体积60%—80%，温度15~30℃，通气1∶0.5，在100L种子罐中15~30℃培养2—5天，并逐级扩大至10吨罐中搅拌培养2—5天；
发酵罐培养：
当种子罐培养至菌丝体收得率0.4-0.8%时，转入50吨发酵罐培养。投料40吨，投料（培养基）为：蔗糖 800-2000 kg，玉米浆200-1000 kg，硫酸锰400 kg -3600kg，水余量，其pH值为5.0-7.0，温度23℃~26℃，通气1∶0.5，搅拌转速120 rpm~150 rpm，，培养至菌丝体收得率1.2-1.8%，培养基还原糖含量至多0.2%时，放罐收获。菌丝体中虫草素含量达到 1.92mg/g ，而未添加硫酸锰的条件下菌丝体中虫草素含量达到0.55mg/g，添加硫酸锰之后增加了2.50倍。
实施例4：
菌种：蛹虫草菌种蛹虫草5.270，来源于广东省微生物菌种保藏中心。
试管斜面菌种培养（活化）（也可按照其他常规方法进行培养）：
配制培养基：葡萄糖10-60g，蛋白胨1-10g，酵母提取物1-10g，硫酸镁1-5g，磷酸二氢钾1-5g，琼脂粉15-20g，水890-971g，其pH值为5.0-7.0，分装于试管中；将蛹虫草菌种在无菌条件下接入试管斜面，15~30℃暗培养5—10天；
试管液体菌种培养（也可按照其他常规方法进行培养）：
配制培养基：葡萄糖10-60g，蛋白胨1-10g，酵母提取物1-10g，硫酸镁1-5g，磷酸二氢钾1-5g，水910-986g，其pH值为5.0-7.0，分装于试管中，灭菌；接入活化后斜面菌种，15~30℃，搅拌转速120rpm，培养5天~10天；
三角瓶液体种子培养（也可按照其他常规方法进行培养）：
配制培养基：葡萄糖10-60g，蛋白胨1-10g，酵母提取物1-10g，硫酸镁1-5g，磷酸二氢钾1-5g，水910-986 g，其pH值为5.0-7.0，将配制好的培养基分装入500ml锥形瓶中，每瓶装200ml，封口后在120~130℃条件下灭菌18~ 30分钟，取出培养基，5.0-7.0冷却至20~30℃；在无菌条件下每瓶接入10ml—20ml培养好的试管液体菌种，15~30℃，搅拌转速120rpm，培养5天~10天；
种子罐培养（也可按照其他常规方法进行培养）：
配制培养基：葡萄糖10-60g，蛋白胨1-10g，酵母提取物1-10g，硫酸镁1-5g，磷酸二氢钾1-5g，水910-986g，其pH值为5.0-7.0，分批灭菌，接入培养好的三角瓶液体菌种，投料体积60%—80%，温度15~30℃，通气1∶0.5，在100L种子罐中15~30℃培养2—5天，并逐级扩大至10吨罐中搅拌培养2—5天；
发酵罐培养：
当种子罐培养至菌丝体收得率0.4-0.8%时，转入50吨发酵罐培养，投料40吨，投料（培养基）为：玉米粉800-2000 kg，豆饼粉 200-400 kg，硫酸锰400 kg -3600kg，水余量，其pH值为5.0-7.0，温度23℃~26℃，通气1∶0.5，搅拌转速120 rpm~150 rpm，培养至菌丝体收得率1.2-1.8%，培养基还原糖含量至多0.2%时，放罐收获。菌丝体中虫草素含量达到2.32mg/g，而未添加硫酸锰的条件下菌丝体中虫草素含量达到 0.67mg/g，添加硫酸锰之后增加了2.46倍。
Claims (5)
1.一种提高虫草素含量的蛹虫草菌丝体的人工培养方法，它包括以下步骤：试管斜面菌种培养、试管液体菌种培养、三角瓶液体种子培养、种子罐培养、发酵罐培养，其特征在于所述的发酵罐培养步骤中当种子罐培养至菌丝体收得率0.4-0.8%时，转入发酵罐培养，其培养基中按重量百分比含有1%—9%的硫酸锰，温度23℃~26℃，通气1∶0.5，搅拌转速120 rpm~150 rpm，培养至菌丝体收得率1.2-1.8%，培养基还原糖含量至多0.2%时，放罐收获。
2.根据权利要求1所述的一种提高虫草素含量的蛹虫草菌丝体的人工培养方法，其特征在于所述的发酵罐培养基由葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、硫酸锰、水组成。
3.根据权利要求1所述的一种提高虫草素含量的蛹虫草菌丝体的人工培养方法，其特征在于所述的发酵罐培养基由蔗糖、玉米浆、硫酸锰、水组成。
4.根据权利要求1所述的一种提高虫草素含量的蛹虫草菌丝体的人工培养方法，其特征在于所述的发酵罐培养基由玉米粉、豆饼粉、硫酸锰、水组成。
5.根据权利要求1所述的一种提高虫草素含量的蛹虫草菌丝体的人工培养方法，其特征在于所述的发酵罐培养基由蔗糖、鱼粉、硫酸锰、水组成。
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