发明内容
本发明所要解决的技术问题是,克服现有技术中埃博霉素表达效率低的不足,提供一种诱导纤维堆囊菌表达制备埃博霉素的方法。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现:
一种诱导纤维堆囊菌表达制备埃博霉素的方法,包括如下步骤:
S1. 发酵菌种的制备:将纤维堆囊菌菌种培养至纤维堆囊菌生物量为0.8~1.2×109cfu/mL时,作为发酵菌种备用;
S2. 发酵培养:将S1中的发酵菌种加入发酵培养基中进行培养,当发酵液中纤维堆囊菌生物量大于等于1010cfu/mL时进行停止发酵培养,得发酵培养物;
S3. 诱导发酵培养:在S2中的发酵培养物中加入诱导组合物进行诱导发酵培养,得诱导发酵培养物;
S4. 分离诱导发酵培养物中的埃博霉素;
其中,S3中所述的诱导组合物包含如下重量百分比的组分:
5~15%甘油、1~10%色氨酸、1~10%半胱氨酸、1~5%酪氨酸、1~10%2,3~二氢吡喃和1~10%酵母提取物;
S3中所述的诱导组合物的添加量为发酵液的1~10(体积)%;
S3中所述的诱导发酵培养条件为:控制温度32~35℃,PH7.2~7.5,在搅拌、通气、光照条件下培养12~36h。
本发明通过在S3中添加上述配比的诱导组合物和在S3中所述的发酵培养条件结合,从多方面诱导调控纤维堆囊菌表达,使得纤维堆囊菌能够高效表达埃博霉素。
作为一种优选方案,S3中所述的诱导组合物包含如下重量百分比的组分:
8~12%甘油、4~8%色氨酸、3~7%半胱氨酸、1~3%酪氨酸、3~7%2,3~二氢吡喃和4%酵母提取物;
所述的诱导组合物的添加量为发酵培养物的3~7(体积)%。
作为一种进一步优选方案,所述的诱导组合物包含如下重量百分比的组分:
10%甘油、5%色氨酸、5%半胱氨酸、2%酪氨酸、 5%2,3~二氢吡喃、4%酵母提取物;
所述的诱导组合物的添加量为发酵培养物的5(体积)%。
作为一种优选方案,S3中所述的诱导发酵培养条件为:控制温度32~35℃,PH7.2~7.5,在搅拌速度为150~180rpm,通气量为0.5~0.8 V/ V·min,800~1000Lux光照条件下培养12~36h。
作为一种最优选方案,S3中所述的诱导发酵培养条件为:控制温度32℃,PH7.5,在搅拌速度为150rpm,通气量为0.8 V/ V·min,1000Lux光照条件下培养24h。
作为一种优选方案,S2中的发酵培养方法为:将S1中制备得到的发酵菌种按5~10(体积)%的接种量加入发酵培养基中,控制温度在25~30℃、PH6.8~7.0,搅拌,通气,培养至发酵液中纤维堆囊菌生物量大于等于1010cfu/mL。
作为一种进一步优选方案,S2中的发酵培养方法为:将S1中制备得到的发酵菌种按5~10(体积)%的接种量加入发酵培养基中,控制温度在25~30℃、PH6.8~7.0,搅拌速度为200~250rpm,通气量为0.8~1.2V/ V·min,,培养至发酵液中纤维堆囊菌生物量大于等于1010cfu/mL。
作为一种最优选方案,S2中的发酵培养方法为:将S1中制备得到的发酵菌种按10(体积)%的接种量加入发酵培养基中,控制温度在28℃、PH6.8,搅拌速度为200rpm,通气量为1.0V/ V·min,,培养至发酵液中纤维堆囊菌生物量等于1010cfu/mL。
作为一种优选方案,S2发酵培养方法中所述的发酵培养基包含如下重量百分比的组分:
1~5%纸浆液、1~2%马铃薯淀粉、1~2%蛋白胨、1~2%玉米浆、1~2%葡萄糖、0.1~0.2%磷酸氢二钾、0.1~0.2%CaCl2。
作为一种进一步优选方案,上述发酵培养基包含如下重量百分比的组分:
2%纸浆液、2%马铃薯淀粉 1%蛋白胨、2%玉米浆、1%葡萄糖、0.2%磷酸氢二钾、0.2% CaCl2。
作为一种优选方案,S1中发酵菌种的制备方法为:将纤维堆囊菌菌种在25~30℃温度范围内,置于固体培养基上进行培养,40~50h后,挑选生长均匀、呈橙色的菌落苔,转移至液体培养基中,在25~30℃温度范围内、振荡培养至纤维堆囊菌生物量为1×109cfu/mL。
作为一种优选方案,上述发酵菌种的制备方法中所述的固体培养基包含15~30mg/L卡那霉素B以及如下重量百分比的组分:
1~5%纸浆液、1~2%马铃薯淀粉、1~2%蛋白胨、1~2%玉米浆、0.1~0.2%磷酸氢二钾、琼脂粉1.5~2.0%。
作为一种进一步优选方案,所述的固体培养基包含20mg/L卡那霉素B以及如下重量百分比的组分:
2%纸浆液、2%马铃薯淀粉 1%蛋白胨、2%玉米浆、0.2%磷酸氢二钾、琼脂粉2%。
作为一种优选方案,上述发酵菌种的制备方法中所述的液体培养基包含如下重量百分比的组分:
1~5%纸浆液、1~2%马铃薯淀粉、1~2%蛋白胨、1~2%玉米浆、0.1~0.2%磷酸氢二钾。
作为一种进一步优选方案,所述的液体培养基包含如下重量百分比的组分:
2%纸浆液、2%马铃薯淀粉 1%蛋白胨、2%玉米浆、0.2%磷酸氢二钾。
作为一种优选方案,所述的纤维堆囊菌菌种为从美国模式培养物集存库(American type culture collection)购买获得的菌株ATCC25532,或从自然界中分离获得的产埃博霉素的纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)菌株。
作为一种优选方案,S4中所述的分离诱导发酵培养产物中的埃博霉素,分离方法如下:
S41. 在诱导发酵培养物中添加大孔吸附树脂组合物进行吸附埃博霉素,继续培养8~16h;
S42. 培养结束后用水清洗大孔吸附树脂,上柱,先用1~5倍柱体积的10~30(质量)%的乙醇清洗杂质,再用80~100(质量)%的乙醇洗脱,浓缩干燥的埃博霉素结晶粗品。
作为一种优选方案,所述的大孔吸附树脂为MD-301大孔吸附树脂、D4020大孔吸附树脂和XD-5大孔吸附树脂中的一种或其混合。
作为一种进一步优选方案,所述的大孔吸附树脂为MD-301大孔吸附树脂、D4020大孔吸附树脂和XD-5大孔吸附树脂中的混合,三者的质量比为1~2:2~3:2~4。
作为一种优选方案,所述的大孔吸附树脂组合物为大孔吸附树脂与水混合,大孔树脂与水的质量比为1:1~2;所述的大孔树脂组合物的加入量为诱导发酵培养物的2~5(体积)%。
作为一种优选方案,上述大孔树脂组合物的添加方式为通过蠕动泵添加。
本发明所述纸浆液是由如下方法制备得到:取滤纸,捣碎,放入水中浸泡,然后搅拌成纸浆液。
作为一种优选方案,所述的纸浆液是由如下方法制备得到:取滤纸10~30g,捣碎,放入10~100ml水中浸泡,然后搅拌成纸浆液。
作为一种进一步优选方案,所述的纸浆液是由如下方法制备得到:取滤纸20克,捣碎放入80ml水中浸泡24小时,在用强力搅拌机搅拌成浆即成纸浆液。
本发明与现有技术相比,具有如下有益效果:(1)本发明采用的多因素诱导纤维堆囊菌高效表达埃博霉素,埃博霉素的单位表达量明显提高;(2)本发明采用包含纸浆液的培养基更适合产埃博霉素的纤维堆囊菌的生长,明显缩短了发酵培养时间,发酵培养72小时左右发酵液细胞密度即可达到1010cfu/mL以上,提高了发酵效率;(3)本发明采用的大孔树脂组合能高效吸附埃博霉素,并且解析洗脱方法简单,回收率高。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明,但实施例本身对发明不做任何形式的限定。
实施例1
S1. 发酵菌种的制备:将纤维堆囊菌菌种ATCC25532冻干菌种加入至盛有3mL生理盐水试管中,震荡均匀,分别取1mL溶液加到盛有固体培养基的培养皿上涂布均匀。固体培养基配方(各组分均为重量百分比):2%纸浆液、2%马铃薯淀粉 1%蛋白胨、2%玉米浆、0.2%磷酸氢二钾、琼脂粉2%,pH7.0,培养基于121℃灭菌20min后在超净工作台上加入按每升培养基加入20mg卡那霉素B混匀后倒入培养皿。置于28℃培养箱培养48小时后。挑选生长均匀、呈橙色的菌落苔刮下种于盛有100mL液体培养基的500mL三角瓶中,置于温度为28℃、转速为220rpm的恒温气浴摇床中培养72小时,当生物量达到109CFU/mL作为发酵菌种备用。液体培养基配方为(各组分均为重量百分比):2%纸浆液、2%马铃薯淀粉 1%蛋白胨、2%玉米浆、0.2%磷酸氢二钾、pH6.8,分装于500mL三角瓶,每瓶装100mL培养基,于121℃灭菌20min。
S2. 发酵培养:50L全自动发酵罐121℃空消30min后,加入由2%纸浆液、2%马铃薯淀粉 1%蛋白胨、2%玉米浆、1%葡萄糖、0.2%磷酸氢二钾、0.2% CaCl2组成的35L培养基(培养基中各组分均为重量百分比),调为pH6.8,121℃实消20min,培养基冷却到28℃后按10(体积)%的接种量接入S1中制备得到的发酵菌种。培养条件为:培养温度为:28℃,搅拌速度:200rpm,通气量为: 1.0V/ V·min,pH6.8~7.0,培养72小时,发酵液细胞密度达到6.2×1010cfu/mL。
S3. 诱导发酵培养:当发酵培养72小时后添加1.75L诱导组合物,诱导组合物由如下重量百分比的组分组成:10%甘油、5%色氨酸、5%半胱氨酸、2%酪氨酸、 5% 2,3~二氢吡喃、4%酵母提取物,使用前115℃灭菌20分钟。诱导发酵条件为:培养温度为:32℃,搅拌速度:150rpm,通气量为:0.8V/ V·min,pH7.5,通过发酵罐的***进行1000Lux光照,诱导培养24小时,每升发酵液的埃博霉素含量达到86.3mg。
S4. 分离诱导发酵培养产物中的埃博霉素。
当诱导培养24小时后,通过蠕动泵添加0.7L大孔吸附树脂组合物进行吸附埃博霉素,吸附培养12小时。大孔吸附树脂组合物为大孔吸附树脂(MD-301大孔吸附树脂、D4020大孔吸附树脂和XD-5大孔吸附树脂中的混合,三者的质量比为1:2:2。)与同质量的水混合,115℃灭菌15min。吸附完后离心取上清液检测埃博霉素含量为8.1 mg/L,吸附率达90%以上。
离心后的将下层纤维堆囊菌菌体与树脂混合物用水冲洗除去纤维堆囊菌菌体杂质,将清洗干净的树脂填装于直径8cm ,高为20 cm的层析柱,用1L20%乙醇清洗杂质,流速20ml/min,然后用3L无水乙醇进行解析洗脱,洗脱液用200ml玻璃瓶分装,检测保留有合并含有埃博霉素的溶液共有800mL,浓缩干燥的埃博霉素结晶粗品4.27克,纯度为76%。
实施例2
S1. 发酵菌种的制备:将纤维堆囊菌菌种ATCC25532冻干菌种加入至盛有3mL生理盐水试管中,震荡均匀,分别取1mL溶液加到盛有固体培养基的培养皿上涂布均匀。固体培养基配方(各组分均为重量百分比):1%纸浆液、1%马铃薯淀粉 1%蛋白胨、1%玉米浆、0.1%磷酸氢二钾、琼脂粉1.5%,pH7.0,培养基于121℃灭菌20min后在超净工作台上加入按每升培养基加入15mg卡那霉素B混匀后倒入培养皿。置于25℃培养箱培养40小时后。挑选生长均匀、呈橙色的菌落苔刮下种于盛有100mL液体培养基的500mL三角瓶中,置于温度为25℃、转速为240rpm的恒温气浴摇床中培养60小时,当生物量达到109CFU/mL作为发酵菌种备用。液体培养基配方为(各组分均为重量百分比):1%纸浆液、1%马铃薯淀粉 1%蛋白胨、1%玉米浆、0.1%磷酸氢二钾、pH6.8~7.0,分装于500mL三角瓶,每瓶装100mL培养基,于121℃灭菌20min。
S2. 发酵培养:50L全自动发酵罐121℃空消30min后,加入由1%纸浆液、1%马铃薯淀粉 1%蛋白胨、1%玉米浆、1%葡萄糖、0.1%磷酸氢二钾、0.1% CaCl2组成的35L培养基(培养基中各组分均为重量百分比),调为pH6.8,121℃实消20min,培养基冷却到25℃后按5(体积)%的接种量接入S1中制备得到的发酵菌种。培养条件为:培养温度为:25℃,搅拌速度:220rpm,通气量为: 0.8V/ V·min,pH6.8,培养60小时,发酵液细胞密度达到3.8×1010cfu/mL。
S3. 诱导发酵培养:当发酵培养60小时后添加1.75L诱导组合物,诱导组合物由如下重量百分比的组分组成:8%甘油、4%色氨酸、3%半胱氨酸、1%酪氨酸、 3%2,3~二氢吡喃、2%酵母提取物,使用前115℃灭菌20分钟。诱导发酵条件为:培养温度为:33℃,搅拌速度:160rpm,通气量为:0.5V/ V·min,pH7.2,通过发酵罐的***进行800Lux光照,诱导培养24小时,每升发酵液的埃博霉素含量达到82.7mg。
S4. 分离诱导发酵培养产物中的埃博霉素。
当诱导培养24小时后,通过蠕动泵添加12.5L大孔吸附树脂组合物进行吸附埃博霉素,吸附培养12小时。大孔吸附树脂组合物为大孔吸附树脂(MD-301大孔吸附树脂、D4020大孔吸附树脂和XD-5大孔吸附树脂中的混合,三者的质量比为1:3:4。)与同质量的水混合,115℃灭菌15min。吸附完后离心取上清液检测埃博霉素含量为7.4 mg/L,吸附率达90%以上。
离心后的将下层纤维堆囊菌菌体与树脂混合物用水冲洗除去纤维堆囊菌菌体杂质,将清洗干净的树脂填装于直径8cm ,高为20 cm的层析柱,用1L10%乙醇清洗杂质,流速20ml/min,然后用3L80(体积)%乙醇进行解析洗脱,洗脱液用200ml玻璃瓶分装,检测保留有合并含有埃博霉素的溶液共有800mL,浓缩干燥的埃博霉素结晶粗品4.13克,纯度为72%。
实施例3
S1. 发酵菌种的制备:将纤维堆囊菌菌种ATCC25532冻干菌种加入至盛有3mL生理盐水试管中,震荡均匀,分别取1mL溶液加到盛有固体培养基的培养皿上涂布均匀。固体培养基配方(各组分均为重量百分比):5%纸浆液、2%马铃薯淀粉 5%蛋白胨、2%玉米浆、0.2%磷酸氢二钾、琼脂粉2%,pH7.0,培养基于121℃灭菌20min后在超净工作台上加入按每升培养基加入30mg卡那霉素B混匀后倒入培养皿。置于30℃培养箱培养50小时后。挑选生长均匀、呈橙色的菌落苔刮下种于盛有100mL液体培养基的500mL三角瓶中,置于温度为28℃、转速为260rpm的恒温气浴摇床中培养80小时,当生物量达到109CFU/mL作为发酵菌种备用。液体培养基配方为(各组分均为重量百分比):5%纸浆液、2%马铃薯淀粉 2%蛋白胨、2%玉米浆、0.2%磷酸氢二钾、pH7.0,分装于500mL三角瓶,每瓶装100mL培养基,于121℃灭菌20min。
S2. 发酵培养:50L全自动发酵罐121℃空消30min后,加入由5%纸浆液、2%马铃薯淀粉 5%蛋白胨、2%玉米浆、5%葡萄糖、0.2%磷酸氢二钾、0.2% CaCl2组成的35L培养基(培养基中各组分均为重量百分比),调为pH6.8,121℃实消20min,培养基冷却到28℃后按1(体积)%的接种量接入S1中制备得到的发酵菌种。培养条件为:培养温度为:28℃,搅拌速度:200rpm,通气量为:.2V/ V·min,pH6.85,培养80小时,发酵液细胞密度达到2.4×1010cfu/mL。
S3. 诱导发酵培养:当发酵培养80小时后添加1.75L诱导组合物,诱导组合物由如下重量百分比的组分组成:15%甘油、10%色氨酸、10%半胱氨酸、5%酪氨酸、10%2,3~二氢吡喃、10%酵母提取物,使用前115℃灭菌20分钟。诱导发酵条件为:培养温度为:32℃,搅拌速度:150rpm,通气量为:0.8V/ V·min,pH7.5,通过发酵罐的***进行1000Lux光照,诱导培养36小时,每升发酵液的埃博霉素含量达到84.4mg。
S4. 分离诱导发酵培养产物中的埃博霉素。
当诱导培养36小时后,通过蠕动泵添加17.5L大孔吸附树脂组合物进行吸附埃博霉素,吸附培养12小时。大孔吸附树脂组合物为大孔吸附树脂(MD-301大孔吸附树脂、D4020大孔吸附树脂和XD-5大孔吸附树脂中的混合,三者的质量比为1:2:4。)与同质量的水混合,115℃灭菌15min。吸附完后离心取上清液检测埃博霉素含量为7.1 mg/L,吸附率达90%以上。
离心后的将下层纤维堆囊菌菌体与树脂混合物用水冲洗除去纤维堆囊菌菌体杂质,将清洗干净的树脂填装于直径8cm ,高为20 cm的层析柱,用1L20%乙醇清洗杂质,流速20ml/min,然后用3L 95(体积)%进行解析洗脱,洗脱液用200ml玻璃瓶分装,检测保留有合并含有埃博霉素的溶液共有800mL,浓缩干燥的埃博霉素结晶粗品4.01克,纯度为73%。
对比例1
S1. 发酵菌种的制备:将纤维堆囊菌菌种ATCC25532冻干菌种加入至盛有3mL生理盐水试管中,震荡均匀,分别取1mL溶液加到盛有固体培养基的培养皿上涂布均匀。固体培养基配方(各组分均为重量百分比):2%纸浆液、2%马铃薯淀粉 1%蛋白胨、2%玉米浆、0.2%磷酸氢二钾、琼脂粉2%,pH7.0,培养基于121℃灭菌20min后在超净工作台上加入按每升培养基加入20mg卡那霉素B混匀后倒入培养皿。置于28℃培养箱培养48小时后。挑选生长均匀、呈橙色的菌落苔刮下种于盛有100mL液体培养基的500mL三角瓶中,置于温度为28℃、转速为220rpm的恒温气浴摇床中培养72小时,当生物量达到109CFU/mL作为发酵菌种备用。液体培养基配方为(各组分均为重量百分比):2%纸浆液、2%马铃薯淀粉 1%蛋白胨、2%玉米浆、0.2%磷酸氢二钾、pH6.8,分装于500mL三角瓶,每瓶装100mL培养基,于121℃灭菌20min。
S2. 发酵培养:50L全自动发酵罐121℃空消30min后,加入由2%纸浆液、2%马铃薯淀粉 1%蛋白胨、2%玉米浆、1%葡萄糖、0.2%磷酸氢二钾、0.2% CaCl2组成的35L培养基(培养基中各组分均为重量百分比),调为pH6.8,121℃实消20min,培养基冷却到28℃后按10(体积)%的接种量接入S1中制备得到的发酵菌种。培养条件为:培养温度为:28℃,搅拌速度:200rpm,通气量为: 1.0V/ V·min,pH6.8~7.0,培养72小时,发酵液细胞密度达到6.2×1010cfu/mL。继续培养24小时,每升发酵液的埃博霉素含量为50.44mg。
对比例2
发酵培养:50L全自动发酵罐121℃空消30min后,加入由2%马铃薯淀粉 1%蛋白胨、2%玉米浆、1%葡萄糖、0.2%磷酸氢二钾、0.2% CaCl2组成的35L培养基(培养基中各组分均为重量百分比),调为pH6.8,121℃实消20min,培养基冷却到28℃后按10(体积)%的接种量接入生物量为109CFU/mL的纤维堆囊菌菌种发酵菌种。培养条件为:培养温度为:28℃,搅拌速度:200rpm,通气量为: 1.0V/ V·min,pH6.8~7.0,培养96小时,发酵液细胞密度达到0.9×1010cfu/mL。
上述实施例中使用的玉米浆干物质占总重量的50%,其中蛋白质占总重量的45%;优选购自武汉百奥科技发展有限公司(规格:生化试剂 玉米浆CAS号码:66071-94-1 包装:500ml;1000ml )。