CN102174104A - 鸭瘟病毒囊膜gI蛋白多克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术及动物免疫学领域，尤其涉及鸭瘟病毒囊膜gI蛋白多克隆抗体，所述多克隆抗体由DNA序列如SEQ ID No.1所示，多肽序列如SEQ ID No.2所示的鸭瘟病毒囊膜gI蛋白免疫动物而得；该多克隆抗体可用于制备鸭瘟病毒检测试剂；本多克隆抗体抗体效价高、特异性好，可以满足鸭瘟病毒及鸭瘟病毒囊膜gI蛋白相关检测实验，弥补了鸭瘟病毒囊膜gI蛋白的多克隆抗体的研究空白。

Description

鸭瘟病毒囊膜gI蛋白多克隆抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术及动物免疫学领域，尤其涉及鸭瘟病毒囊膜gI蛋白多克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术

鸭瘟（Duck plague,DP）又称为鸭病毒性肠炎(Duck Viral Enteritis,DVE)，是由鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）引起的鸭、鹅及多种雁行目禽类的一种急性、热性、败血性传染病，是危害世界水禽养殖的主要传染病之一。其病原体DPV为一种双链DNA疱疹病毒，在2005年的第八次病毒分类报告中，被划分为a疱疹病毒亚科中未分属病毒。疱疹病毒主要由核心 (core)、衣壳 (capsid)、间层 (tegument) 及囊膜 (envelope) 4部分组成。病毒颗粒直径约为150 nm，双股DNA与蛋白缠绕形成病毒核心。单纯疱疹病毒 1 型( Herpes simplex virus type-1, HSV-1)与伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）已有11种糖蛋白被鉴定，分别命名为 gB、gC、gD、gE 、gH、gI、gK、gL、gM、gN和 gJ。

目前，gI蛋白作为疱疹病毒的囊膜糖蛋白之一，其功能特征已被广泛研究。其中，尤以人类单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、水痘-带状疱疹病毒（VZV）和猪伪狂犬病毒（PRV）的gI蛋白研究较为深入。从已研究的疱疹病毒gI蛋白功能看，它通常与gE蛋白形成异源二聚体，促进病毒粒子在细胞间的转染；形成免疫球蛋白Fc受体组成部分，通过阻断或改变Fc受体功能，参与免疫逃避；另外，HSV-1 gI蛋白具有较好的免疫原性，可作为基因工程亚单位疫苗研究的重要对象。比较而言，鸭瘟病毒gI蛋白功能研究相对滞后，目前还未见相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鸭瘟病毒囊膜gI蛋白多克隆抗体，本多克隆抗体效价高，能特异性的检测鸭瘟病毒。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

1、基于鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的多克隆抗体，所述鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，其对应的DNA序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的另一目的在于提供所述多克隆抗体的制备方法，本方法操作简单，成本低，适用于大规模生产。

实现这一目的的技术方案为：

2、1所述的多克隆抗体的制备方法，具体包括以下步骤：

A 鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的制备

以鸭瘟病毒核酸链为模板，通过PCR方法扩增获得含有完整gI基因开放阅读框的目的片段，并克隆于表达载体中得重组表达载体, 将重组表达载体转化入宿主细胞后诱导表达并纯化，获得鸭瘟病毒囊膜gI蛋白；

B 动物免疫

用步骤A所得鸭瘟病毒囊膜gI蛋白免疫动物，取血，得抗血清；

C 多克隆抗体的获得

分离并提纯步骤B所得抗血清IgG，得多克隆抗体。

3、根据2所述的多克隆抗体的制备方法，步骤A中，提取鸭瘟病毒核酸基因组，以鸭瘟病毒核酸链为模板，以如SEQ ID No.3所示的上游引物和SEQ ID No.4所示的下游引物通过PCR方法扩增获得含有完整gI基因ORF的目的片段，并克隆于大肠杆菌原核表达载体pET-32a(+), 将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞后用IPTG诱导表达，经Ni-NTA Argarose纯化，获得鸭瘟病毒囊膜gI蛋白。

4、根据2所述的制备方法，步骤B中，用所得鸭瘟病毒囊膜gI蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔或其它实验动物，测血清效价并取血，得抗血清。

5、根据2所述的制备方法，步骤C中，通过辛酸-硫酸氨盐析法粗提和High Q阴离子交换层析对步骤A所得抗血清IgG进行提取和纯化，得多克隆抗体。

本发明的目的之三为提供所述多克隆抗体的应用，该应用能检测鸭瘟病毒和鸭瘟病毒囊膜gI蛋白且特异性高。

实现本目的的技术方案为：

所述的多克隆抗体在制备鸭瘟病毒检测试剂中的应用。

进一步，基于鸭瘟病毒囊膜gI蛋白的多克隆抗体在制备鸭瘟病毒间接免疫荧光检测试剂中的应用。

本发明的有益效果在于：本多克隆抗体抗体效价高、特异性好，可以满足鸭瘟病毒和鸭瘟病毒囊膜gI蛋白相关检测实验，弥补了鸭瘟病毒囊膜gI蛋白的多克隆抗体的研究空白；其适用于免疫印迹（Western-blotting）及间接免疫荧光试验，特别适用于用本多克隆抗体检测DPV体外感染鸭胚成纤维细胞后gI蛋白在细胞中的表达定位情况，以阐明鸭瘟病毒gI蛋白的表达动力学，为鸭瘟病毒gI蛋白的功能的深入研究奠定了基础；本制备方法以原核表达载体pET-32a(+)为基础所构建的体外gI表达***能在大肠杆菌BL21（DE3）中能高效地表达目的蛋白，进一步纯化用于免疫动物，制得效价高特异性高的多克隆抗体，本方法操作简单，适用于工业化生产。

图1为鸭瘟病毒gI基因原核表达载体pET-32a(+)-gI结构示意图，“gI”表示***载体pET-32a(+)的gI片段；

图2为重组质粒pET-32a(+)-gI的PCR和双酶切鉴定图。M₁ 核酸标准分子量（4500、3000、2000、1200、800、500、200bp）；M₂为核酸标准分子量（15000，10000，7500，5000，2500，1000，250bp）；1为pET-32a(+)-gI PCR产物；2为pET-32a(+)-gI BamHI/XhoI双酶切产物；3为pET-32a(+)-gI BamHI单酶切产物；

图3为重组蛋白的SDS-PAGE及Western-blotting分析图，M为蛋白标准分子量（200、116、97、66、45、31、21 kDa）；1为pET-32a(+)-gI未诱导；2为pET-32a(+)-gI诱导；3为pET-32a(+)-gI诱导蛋白纯化后；4为兔抗DPV阳性血清组；5为兔阴性血清对照组；箭头所指约为61kDa；

图4为兔抗鸭瘟病毒gI蛋白IgG纯化图：M蛋白标准分子量（116，66，45，35，25，18kDa）;1为辛酸-硫酸铵粗提兔抗鸭瘟病毒gI蛋白的IgG;2为High-Q阴离子交换层析纯化兔抗鸭瘟病毒gI蛋白的IgG；

图5为间接免疫荧光检测DPV gI蛋白在体外感染细胞DEF中的定位图，A-C为未接毒对照组；D-F为阴性血清对照组；G-I为接毒24小时后gI蛋白在细胞中的表达定位图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例 1

一 鸭瘟病毒囊膜gI蛋白的制备

1. 鸭瘟病毒的增殖培养

将鸭瘟病毒 CHv株接种于刚刚长成的致密单层鸭胚成纤维细胞（DEF），   37℃吸附60分钟后弃病毒液，然后加体积分数为2％的小牛血清和100IU/mL双抗组成的MEM 维持营养液，之后37℃培养48小时。

2. DNA提取

1)选取用DPV种毒感染后细胞病变（CPE）达60％～70％的DEF（100mL细胞瓶）；

2)倾去细胞培养液，加入500μL的细胞裂解液，同时加蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为200μg/mL，轻轻混匀后，37℃孵育10分钟；

3)将细胞悬浮液倒入EP离心管中，并用500μL的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物，倒入离心管中；

4)用饱和酚：氯仿及氯仿抽提2次，再用水饱和***处理2次；

5)加1/10倍体积3mol/L NaAC，混匀后，加入2倍体积冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟；

6)以转速为13000转/分钟离心20分钟，沉淀用预冷的体积分数为70%的乙醇洗涤两次；

7)真空抽干后，溶于适量TE缓冲液中，加入1μL RNA酶，37℃作用30分钟，-20℃保存备用。

3. DPV CHv株 gI基因的PCR扩增

应用Oligo软件设计引物，为了便于基因的克隆及构建表达载体，同时参照pMD18-T 载体、原核表达载体pET -32a(+)的多克隆位点序列，分析gI基因序列内的酶切位点，设计一对引物(下划线标注为酶切位点)：

P1：5’- ggatccatagaaatgggaacgacac-3’

P2：5’- ctcgagcatagcctattacctcatgtac-3’

P1、P2分别上游引物和下游引物，P1、P2的5’端分别引入与质粒载体相同的BamHⅠ（ggatcc）和XhoⅠ（ctcgag）酶切位点，经Primer软件检测，所设计的引物不含有自身互补序列，不形成发夹结构，两引物间不形成引物二聚体。P1、P2引物的跨幅为1221bp，包含了完整的gI基因片段（1116bp）；引物由宝生生物技术有限公司合成。合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20 mmol/L，-20℃保存备用。

PCR20mL反应体系如下：                                                

PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃ 60s, 58.5℃ 60s, 72℃ 60s,进行30个循环，72℃延伸10分钟结束。

4.pET-32a(+)-gI 表达载体的构建

1)PCR产物纯化试剂盒回收目的片段，利用T-A克隆直接连接于pMD-18T载体，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取单克隆，进行PCR、酶切和测序鉴定。

2)以PCR、酶切和测序鉴定正确的阳性克隆进行扩大培养，抽提含有gI基因的T克隆质粒，经BamHI、XhoI双酶切，回收目的片段克隆于表达质粒pET-32a(+)的BamHI、XhoI的酶切位点之间,构建重组表达质粒pET-32a(+)-gI（见图1），连接体系如下：

3)将连接产物转化感受态宿主菌BL21(DE3)，在Amp平板上挑取阳性克隆进行LB液体扩大培养，抽取重组质粒进行PCR、双酶切、单酶切和测序鉴定。酶切体系如下：

鉴定结果表明目的片段已被成功***表达载体（图2）。

5.DPV gI蛋白抗原基因的诱导表达

将鉴定正确的重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌，挑取单克隆接种到含有

50μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃培养过夜，按照1：100的比例将培养物接种于含有Amp的液体LB培养基中，150转/分钟振荡培养2小时左右，当OD600≈0.5时，按终浓度0.2mM加入IPTG诱导表达5小时，离心收集菌体。沉淀中加入80μL超纯水和20μL 5×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10分钟，进行质量分数为12%的SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，观察表达结果。由图3所示，重组质粒经诱导后表达了约61kDa的融合蛋白。对照组没有相应条带。

二、    重组蛋白的鉴定

Western-blotting分析：表达蛋白经SDS-PAGE电泳分离后转移至硝酸纤维素膜（NC）上，用含有5%(w/v)脱脂奶粉的PBST 37℃缓慢摇动温育1.5小时封闭NC膜；然后加入含5%(w/v)脱脂奶粉的PBST稀释的兔抗DPV血清，同时设兔阴性血清对照组，37℃缓慢摇动温育1小时；PBST洗涤膜3次，每次10分钟；再加入含5%脱脂奶粉的PBST稀释的HRP标记的羊抗兔IgG二抗，37℃缓慢摇动温育1小时；PBST洗涤膜3次，每次10分钟后，加入DAB显色液进行显色，结果能观察到特异性的反应条带，详见图3。

三、    重组蛋白的纯化

1.包涵体的洗涤

1）诱导表达200mL菌液，4℃、10000转/分钟 离心10分钟，沉淀（菌体）用40mL的20mM Tris-Cl（pH8.0）悬浮；

2）冰浴超声波破碎菌体，150瓦破菌1分钟，间歇进行3次；

3）将破碎后的菌体于4℃、10000转/分钟离心10分钟，沉淀用40mL 20mM Tris-Cl（pH8.0）悬浮；

4）重复步骤2）；

5）4℃、10000转/分钟 离心10分钟，用40mL浓度为 20mmol/L的 Tris-Cl（pH8.0）悬浮，加入新鲜配制的溶菌酶至终浓度为1mg/mL，置冰浴上30分钟，不断搅拌；

6）再次超声波破碎，离心，沉淀加入40mL含8M尿素的缓冲液；

7）将制备的溶液用0.45μm孔径的滤膜进行过滤。

2.镍NTA琼脂凝胶FF过柱纯化gI重组蛋白

样品经过超声波破碎，溶菌酶裂解处理，初步纯化包涵体后利用融合蛋白的6×His标签对镍离子特殊的亲和作用，使带有标签的经过洗涤的初步提纯的重组蛋白gI能够结合于镍胶上，然后将其洗脱，而达到进一步纯化的目的。具体操作步骤为：

1) 镍琼脂凝胶 FF装柱，柱床体积为40mL；

2) 用缓冲液平衡2～5个床体积，流速为1mL/分钟；

3) 将滤膜过滤后的细胞破碎液上样，流速为0.5mL/分钟；

4) 用缓冲液再洗2-5个床体积，流速为1mL/分钟；

5) 用分别含50、300、500mM咪唑的缓冲液进行阶段洗脱，流速为       1mL/分钟，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；

6) 用纯水流洗5个柱床体积，再用体积分数为20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为1mL/分钟，柱子置于4～8℃环境中保存。

结果表明目的蛋白能够高效表达，快速纯化，可以用于后续多克隆抗体的制备。

实施例2 制备基于鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的多克隆抗体

一.重组蛋白疫苗的制备

将石蜡油和羊毛脂按3:1的比例混合，加热溶解，高温灭菌，制成不完全弗氏佐剂，每毫升不完全佐剂中加入1mg卡介苗制成弗氏完全佐剂。用前将弗氏完全佐剂或不完全佐剂与抗原液体等体积混合，冰浴超声波乳化，检查乳化效果标准：以将乳化的佐剂乳化抗原滴于冷水表面出现完整又不扩散的圆形油滴即为乳化完全。

2．免疫程序如下

免疫前一天对家兔进行抽血，分离血清作为阴性对照，四免后颈动脉放血，收集血液。37℃放置30分钟，4℃冰箱过夜。第二天析出血清，血凝块以转速为5000转/分钟离心15分钟，再次收集血清，-20℃保存。

3．Western-blotting检测抗体特异性

步骤如上重组蛋白的Western-blotting鉴定，以兔抗gI重组蛋白血清代替兔抗DPV血清作为一抗。结果显示在NC膜上约61kDa处有特异条带，详见图3。

4．ELISA方法测定抗血清的效价

步骤包括：将纯化的重组蛋白6×His-gI用0.05M pH9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释，包被酶标反应板，37℃孵育1小时，转入4℃过夜。次日用洗涤液PBST加满孔进行摇床振荡洗涤5次，每次5分钟。用含有质量分数为5%脱脂奶粉的PBST封闭37℃，2小时，同上洗涤。将制备的多克隆抗血清和兔阴性血清分别用PBST作2倍倍比连续稀释后加入孔中，37℃孵育1小时，同上洗涤。加入1：3000的体积比稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG二抗，37℃孵育1小时，同上洗涤。加入缓冲液稀释的显色液TMB，避光显色10分钟。最后加浓度为2M终止液H₂SO_4，每孔50mL，终止反应。酶标检测仪在450nm波长下读取各孔的OD值，OD₄₅₀在1左右且P/N比值＞2.0，判定为阳性。结果表明所制备的多克隆抗体效价为1:12800。

兔抗gI重组蛋白IgG的纯化及鉴定

1) 辛酸-硫酸铵粗提兔抗gI重组蛋白的IgG

具体操作如下：

a. 用4倍体积的醋酸钠缓冲液(60mmol/L，pH 4.0)稀释兔抗gI重组蛋白血清，调pH4.5(通常用0.1 M NaOH调)。

b. 将辛酸(33μl/mL样品)逐滴慢慢加入血清样品中，边加边搅拌，加完后继续搅拌30分钟，4℃静置2小时，10000g离心30分钟，除去白蛋白等其它非IgG蛋白沉淀。

c. 每10体积的上清加1体积的10×PBS（pH 7.4)，用5M NaoH调pH至7.4。

d. 上清冷至4℃，加硫酸铵(0.277g/mL，使最终饱和度为45%)。搅拌30分钟，静置4小时，5000转/15分钟，弃上清，将沉淀悬浮于少量PBS中(通常大约是原体积的1/10)。

e. 悬浮液用100倍体积的PBS于 4℃透析过夜,每3小时换液一次，直至0.1%的奈氏试剂检测透析液中无棕红色沉淀产生为止。

2) High-Q阴离子交换层析纯化兔抗gI重组蛋白的IgG

取阴离子交换填料High-Q处理后装柱平衡，用20mmol/L的Tris-Cl缓冲液平衡直至柱床pH和体积不变为止。根椐考马斯亮蓝法测出粗提抗体的浓度，将粗提抗体的浓度稀释到60mg/mL，加样后在中高压蛋白质层析***上平衡三倍的柱体积，然后用0.5mol/L的NaCl按照梯度洗脱程序，分离纯化IgG。

洗脱完毕后，参考洗脱曲线，收集IgG 蛋白峰，用聚乙二醇进行浓缩至需要体积，4℃或-20℃保存备用。

3) IgG纯度的鉴定

将提取的IgG进行SDS-PAGE电泳分析。结果（见图4）显示纯化的IgG经过SDS-PAGE检测为两条带，第一条带分子量大约55kDa，第二条带大约为25kDa，分别为IgG的重链和轻链，证明IgG的纯化效果较好。

结果表明获得的多克隆抗体能有效识别菌体表达的重组蛋白6×His-gI,具有较好的反应原性；效价高、特异性好。

实施例3基于鸭瘟病毒囊膜gI蛋白的多克隆抗体在制备鸭瘟病毒和鸭瘟病毒囊膜gI蛋白间接免疫荧光检测试剂中的应用

DPV gI蛋白的多克隆抗体在间接免疫荧光方法中的应用，步骤如下：

1）常规方法制备鸭胚成纤维细胞飞片，待24小时后DEF长成典型梭状细胞后接种DPV，接毒后24小时收获细胞飞片；

2）以灭菌的预冷PBS洗涤表面残留的营养液；

3）体积分数为4%的多聚甲醛室温下固定、灭菌的PBS洗涤3×10分钟；

4）质量分数为0.2％Triton 的 PBS透化15分钟,0.1% Tween-20 PBS(PBST)洗涤(同上)；

5）用含体积分数为5％牛血清白蛋白(BSA)的PBST 37℃封闭1小时；

6）含1% BSA的PBST适当稀释兔抗DPV-gI重组蛋白IgG湿盒孵育一定时间，PBST 洗涤(同上)；

7）适当稀释的FITC标记的羊抗兔IgG 37℃避光湿盒孵育一定时间、PBST洗涤(同上)；

8）DAPI染色液复染细胞核室温避光感作10分钟，PBST 洗涤(同上)；

9）甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察；

试验同时设置不接毒的细胞飞片组和兔阴性血清组作为对照。

结果显示试验组细胞质中有特异性荧光，荧光靠近细胞核，呈集中分布；而对照组均无特异性荧光（图5）。说明DPV gI蛋白主要集中分布于细胞质，与其他疱疹病毒gI同源蛋白定位类似。蛋白的定位往往与其功能相关，该结果不但检测出了DPVgI蛋白在感染细胞中的表达及定位情况，也为gI功能研究提供了依据。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

 

<110>  四川农业大学

<120>  鸭瘟病毒囊膜gI蛋白多克隆抗体及其制备方法与应用

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<212>  DNA

<213> 鸭瘟病毒CHv株(Duck plague virus strain Chv)

<220> 

<223>  鸭瘟病毒CHv株DNA

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atgggaacga cacgacatat actgatactt gtttcggcga ttaactgtat aacaacgatc               60

aatgcaatcg tgtatgctgg gacgtccgta agcttatatc tacaggaacc tgcttctgcg               120

tcaataccgg ccgtggaaga cagacacgca gtttatggaa aactactttt tcttggatca               180

caggccgaac taccgccagt atacaatgga actgtcgagc tactagtata taatatttct               240

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actgccttca aggcctgcag acatgctaca cgctatttcg acccggcgcg accacacctg               360

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tgctctcctc ttaaacgcaa attatgtcgt tgttgtacga aacgacgtgt ttatacaggt               960

tctaccacaa gcgtgatcaa ccaatcggca ctggataatc ctccttctca agacgctctg               1020

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gcgtatgaca gctctgggga tcataaaaca gaataa                                         1116

 

 

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<213> 鸭瘟病毒CHv株(Duck plague virus strain Chv)

<220> 

<223>  鸭瘟病毒CHv株氨基酸

<400>  2

 

Met Gly Thr Thr Arg  His Ile Leu Ile Leu   Val Ger Ala Ile Asn

1             5                10                 15 

Cys Iie Thr Thr Iie    Asn Ala Iie Val Tyr  Ala Gly Thr Ser Val

             20                 25                 30

Ser Leu Tyr Leu Gln   Glu Pro Ala Ser Ala  Ser Iie Pro Ala Val

              35                 40                45

Glu Asp Arg His Ala   Val Tyr Gly Lys Leu  Leu Phe Leu Gly Ser  

50                  55                  60          

Gln Ala Glu Leu Pro   Pro Val Tyr Asn Gly  Thr Val Glu Leu Leu

              65                  70                 75

Val Tyr Asn Iie Ser    Arg His Cys Tyr Ser   Val Ala Tyr Ala Ala

              80                  85                 90      

Iie Tyr Asp Asp Cys    Pro Arg Leu Gly Ala   Thr Ala Phe Lys Ala

              95                   100                105

Cys Arg His Ala Thr    Arg Tyr Phe Asp Pro   Ala Arg Pro His Leu

110                  115                120            

Lys Asp Val Leu Ser   Ser Thr Ala Ile Phe    Val Leu Asp Ser Pro

             125               130                  135

Ser Iie His Asp Ser    Gly Iie Tyr Tyr Iie   Arg Val Ser Val Asn

             140                145                150  

Asp Ala Val Val Pro   Asp Val Phe Lys Thr   Thr Val Iie Iie Thr

              155                 160               165

Asp Lys Iie Asn Ala   Val Val Pro Pro Asp   Asp Asn Ala Tyr Glu

170                175                 180             

Lys Val Thr Glu Arg  Pro Pro Val Gly Glu  Asp Phe Gly Val Val

             185                190                195

Ala Asp Val Gly Ser  Iie Cys His His Tyr   Asp Phe Tyr Ser Gly

              200               205                 210

Val Pro Leu Asp Tyr  His Leu Met Gly Iie   Ser Gly Pro Leu Glu

              215               220                 225

Asp Asp Lys His Leu  Lys Glu Glu Val Ser   Thr Glu Gly Phe Ser  

              230                235                  240

          

Thr Met Lys Pro Val   Thr Val Pro Thr Thr    Asn Asn Tyr Thr Thr

              245                 250                  255

Leu Ser Asp Asp Met   Gln Pro Thr His Asn   Asp Thr Asn Ser Gly

             260                 265                 270

Leu Asn Iie Phe Asp    Lys Iie Pro Asn Iie     Tyr Leu Iie Pro Ala

             275                 280                 285

Val Met Phe Val Val    Leu Pro Leu Thr Iie    Phe Iie Val Leu Met  

             290                  295                300

Cys Ser Pro Leu Lys    Arg Lys Leu Cys Arg   Cys Cys Thr Lys Arg

              305                  310                  315

Arg Val Tyr Thr Gly    Ser Thr Thr Ser Val     Iie Asn Gln Ser Ala

              320                 325                  330

Leu Asp Asn Pro Pro    Ser Gln Asp Ala Leu    Glu Ser Lys His Pro

              335                  340                  345

Glu Leu Asp Gly Thr    Leu Met Arg Lys Leu   Glu Glu Lys Leu Ala

              350                   355                 360

Ala Tyr Asp Ser Ser    Gly Asp His Lys Thr     Glu     

            365                   370                 371

                                                            

 

<210>  3

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  鸭瘟病毒CHv株引物F

<400>  3

 

ggatccatag aaatgggaac gacac                                                       25

 

<210>  4

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  鸭瘟病毒CHv株引物F

<400>  4

 

ctcgagcata gcctattacc tcatgtac                                                    28

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Claims (7)

1.基于鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的多克隆抗体，其特征在于：所述鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，其对应的DNA序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的基于鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

A 鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的制备

以鸭瘟病毒核酸链为模板，通过PCR方法扩增获得含有完整gI基因开放阅读框的目的片段，并克隆于表达载体中得重组表达载体, 将重组表达载体转化入宿主细胞后诱导表达并纯化，获得鸭瘟病毒囊膜gI蛋白；

B 动物免疫

用步骤A所得鸭瘟病毒囊膜gI蛋白免疫动物，取血，得抗血清；

C 多克隆抗体的获得

分离并提纯步骤B所得抗血清IgG，得多克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤A中，提取鸭瘟病毒核酸基因组，以鸭瘟病毒核酸链为模板，以如SEQ ID No.3所示的上游引物和SEQ ID No.4所示的下游引物通过PCR方法扩增获得含有完整gI基因ORF的目的片段，并克隆于大肠杆菌原核表达载体pET-32a(+), 将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞后用IPTG诱导表达，经Ni-NTA Argarose纯化，获得鸭瘟病毒囊膜gI蛋白。

4.根据权利要求2所述的基于鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤B中，用所得鸭瘟病毒囊膜gI蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔或其它实验动物，测血清效价并取血，得抗血清。

5.根据权利要求2所述的基于鸭瘟病毒重组囊膜gI蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤C中，通过辛酸-硫酸氨盐析法粗提和High Q阴离子交换层析对步骤A所得抗血清IgG进行提取和纯化，得多克隆抗体。

6.权利要求1所述的多克隆抗体在制备鸭瘟病毒检测试剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的多克隆抗体在制备鸭瘟病毒检测试剂中的应用，其特征在于：基于鸭瘟病毒囊膜gI蛋白的多克隆抗体在制备鸭瘟病毒间接免疫荧光检测试剂中的应用。

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