CN110791479B - DEV gB蛋白单抗以及检测DEV抗体的阻断ELISA试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了DEV gB蛋白单抗以及检测DEV抗体的阻断ELISA试剂盒。本发明首先通过原核表达***制备具有良好反应原性和免疫原性的gB蛋白，将其作为抗原通过细胞融合技术筛选得到一株微生物保藏编号号是CGMCC No.17996的杂交瘤细胞株，其分泌的单抗能与鸭病毒性肠炎病毒天然空间构象病毒蛋白反应且对DEV抗体具有强阻断能力；本发明还提供由该单抗所识别的抗原表位，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示；本发明进一步应用该单抗构建了一种检测DEV抗体的阻断ELISA试剂盒，该阻断ELISA试剂盒具有敏感度高、特异性好、重复性强等优点。

Description

DEV gB蛋白单抗以及检测DEV抗体的阻断ELISA试剂盒
技术领域
本发明涉及单抗以及阻断ELISA试剂盒，尤其涉及DEV gB蛋白单抗以及检测 DEV抗体的阻断ELISA试剂盒，属于鸭病毒性肠炎病毒的抗体检测领域。
背景技术
鸭病毒性肠炎(Duck virus enteritis,DVE),俗称鸭瘟(Duck plague,DP),是鸭、鹅、大 雁等多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病,由鸭病毒性肠炎病毒(Duckenteritis virus,DEV)引起。病毒基因组编码十几种糖蛋白,其中gB蛋白是病毒囊膜表面展示的主要蛋白之一,也是主要的免疫原蛋白。鸭病毒性肠炎是鸭科动物的疱 疹病毒性疾病,严重危害家鸭,也侵袭野鸭等多种水禽。在美国1967年首次确诊，最先 用接种鸭胚和幼鸭分离病毒,再用鸭胚原代成纤维细胞培养,作中和试验进行病毒鉴 定。
ELISA作为传统的、应用最广的血清学诊断方法，其可操作性强，特异性和敏感 性高且价格成本低，是疫苗免疫效果监测和感染动物的理想诊断方法。迄今为止尚缺 乏具有商品化应用价值的检测DEV抗体的阻断ELISA试剂盒。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种可与鸭病毒性肠炎病毒天然空间构象病毒蛋白反应且对DEV抗体具有强阻断能力的DEV gB蛋白单抗抗体；
本发明的目的之二是提供由DEV gB蛋白单抗抗体所识别的抗原表位；
本发明的目的之三是利用该DEV gB蛋白单抗抗体构建一种检测DEV抗体的阻 断ELISA试剂盒；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供了一种可与鸭病毒性肠炎病毒(DEV)天然空间构象病毒蛋白 反应且对DEV抗体具有强阻断能力的DEV gB蛋白单抗抗体：
本发明将DEV gB蛋白通过原核表达后进行纯化，将纯化后的gB蛋白进行WesternBlot分析，结果表明所表达的蛋白免疫原性较强。gB蛋白免疫反应性IFA分 析结果表明，所表达gB蛋白具有良好的免疫反应性。
本发明利用所制备的gB蛋白为抗原通过细胞融合技术最终筛选得到一株特异 性的分泌抗DEV gB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株：
本发明将纯化后DEV与DEV gB蛋白分别与弗氏佐剂混合并乳化，免疫6周龄 BALB/c小鼠，剂量为50μg/只，共免疫3次，免疫间隔为两周。5天后选择效价高 的小鼠用非乳化抗原加强免疫，再过3天取该小鼠脾脏与对数生长期的SP2/0细胞融 合。对融合孔的细胞进行3次亚克隆，间接ELISA法筛选得到阳性细胞株，细胞经 扩大培养后冻存。用建立的间接ELISA方法进行4次筛选，得到4株可稳定分泌抗 DEVMAb的杂交瘤细胞株，分别命名为2E3、7E12、9G3、10A9，得到7株可稳定 分泌抗gB蛋白MAb的杂交瘤细胞株，1A4、3C2、4H3、3E2、2B1、1E8、2G3。采 用抗体亚类鉴定试剂盒对MAb的亚类进行测定，11株MAb中，4株DEVMAb，2E3 为IgM亚类、7E12和9G3为IgG1亚类、10A9为IgG2b亚类；7株gB蛋白MAb的 重链均为IgG2b亚类。将可稳定分泌抗DEVMAb的杂交瘤细胞株进行IFA检测，倒 置荧光显微镜下观察到，3株MAb与DEV反应，分别为DEV MAb 2E3、7E12和gB 蛋白MAb 1E8，接毒细胞发出强绿色荧光，集中在胞浆和细胞膜上，对照组未见特 异性绿色荧光。
为从多株MAb中筛选可与天然空间构象病毒蛋白反应且对DEV抗体具有强阻断 能力的IgG亚类MAb，对IFA鉴定为阳性且鉴定为IgG亚类的MAb进一步筛选为建 立阻断ELISA方法筛选出特异性的MAb；筛选结果发现DEV MAb 7E12和gB蛋白 MAb 1E8为IgG亚类且与天然病毒蛋白反应，对以上两株MAb的阻断效果鉴定结果 显示，MAb 1E8阻断能力较7E12更强，因此本发明将MAb 1E8继续进行后续的鉴 定试验。
Western Blot鉴定结果显示，PAb与变性DEV蛋白在30kDa、47kDa和120kDa 条大小带处有结合，MAb1E8与变性DEV蛋白在30kDa大小条带结合，且与原核表 达的51kDa大小的蛋白有结合。
MAb1E8的特异性鉴定结果显示，阳性对照成立的条件下，MAb1E8与其它病毒 及DEFs的反应均呈阴性，说明MAb1E8特异；MAb1E8腹水效价的ELISA鉴定结 果表明当腹水稀释104倍时OD450nm值均大于1.0，以P/N≥2.1作为阳性判定标准，结 果显示抗体效价为106。
本发明将MAb 1E8进一步进行了表位鉴定。本发明按照表位鉴定截短表达示意图，将gB蛋白分3轮截短，共进行6次诱导表达；通过PCR、SDS-PAGE和Western Blot分析，第一次截短表达的gB-101扩增片段大小为600bp、蛋白大小为38kDa，gB-102扩增片段大小为441bp、蛋白大小为28kDa，Western Blot结果表明MAb与第 二段蛋白gB-102反应；第二次截短表达gB-201扩增片段大小为192bp、蛋白大小为 16kDa，gB-202扩增片段大小为288bp、蛋白大小为25kDa，Western Blot结果表明 MAb与第二段蛋白gB-202反应；第三次截短表达的gB-301扩增片段大小为171bp、 蛋白大小为15.5kDa，gB-302扩增片段大小为153bp、蛋白大小为15kDa，Western Blot结果表明MAb与两段蛋白均反应；MAb与合成的重叠多肽间接ELISA鉴定结 果显示，其与多肽反应。因此，该MAb针对的抗原表位应为第三次截短表达中，两 段蛋白所重合多肽的氨基酸序列，即579RMLGDVLAVSSC590(SEQ ID No.1)。经分 析MAb1E8抗原表位区为位于UL27全长蛋白579～590aa。
本发明将杂交瘤细胞株MAb1E8提交专利认可的机构进行保藏，其保藏号是 CGMCCNo.17996；分类命名是：DEV gB蛋白单克隆抗体细胞株；保藏时间是2019 年6月19日；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地 址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明进一步提供了一种检测DEV抗体的阻断ELISA检测试剂盒，包括：DEV gB蛋白，包被液，MAb 1E8抗体、酶标二抗，缓冲液，稀释液，洗涤液，封闭液， 终止液、阳性血清对照，阴性血清对照。
所述酶标二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG；
所述缓冲液优选为PBS缓冲液；所述包被液优选为0.05mol/L的pH＝9.6的碳酸 盐缓冲液；
所述封闭液的制备优选为：PBS缓冲液中加入50g脱脂乳，使其充分溶解，定容 至1000mL。
所述洗涤液的制备优选为：PBS缓冲液中加入500mL吐温20，定容至1000mL。
所述稀释液的制备优选为：PBS缓冲液中加入10g脱脂乳，使其充分溶解，定容 至1000mL。
所述终止液的制备优选为：将100mL浓硫酸缓缓加入至80mL去离子水，定容 至100mL。
作为参考，本发明提供了应用所述阻断ELISA检测试剂盒检测样品中DEV抗体 的方法，包括：
(1)用包被液稀释纯化gB蛋白至0.5μg/mL，每孔100μL，4℃包被12h；洗涤 液清洗酶标板3次，拍干；(2)每孔加300μL的5％skim milk，37℃封闭2h，洗 板3次；(3)离心除去杂质的被检样品，室温作用2h，同时设置阴阳性血清对照(1： 40)，每孔100μL，洗板3次；(4)加入MAb(1：2000)于37℃作用1h，每孔 100μL，洗板3次；(5)加入山羊抗小鼠-HRP(1：10000)，每孔100μL，37℃作 用0.75h，洗板3次；(6)加入TMB，每孔100μL，避光显色15min；终止反应，每孔50μL终止液；15min内读板。
采用本发明构建的阻断ELISA检测试剂盒测定364份阴性鸭血清样品，130份阳 性鸭血清样品，以一份SPF鸭血清作为阴性对照。SPSS绘制阴阳性样品PI值统计数 据的ROC曲线，可以看出临界值为30％时敏感性和特异性均较高。因此，本发明检 测方法的临界值取30％，即待检样品PI≥30％判为阳性，否则判为阴性。
以本发明建立的ELISA方法同步检测抗AIV、NDV、EDSV、DTMUV、GPV和 DHV-1的标准血清，以抗DEV阳性血清参考品为阳性对照，一份SPF鸭血清作为阴 性对照，结果显示本发明检测方法特异地针对DEV抗体，说明本发明阻断ELISA检 测试剂盒具有良好的特异性。
以建立的ELISA方法检测DEV阳性血清参考品，从10倍开始稀释阳性血清， 最大稀释倍数为1280倍，检验该方法的敏感性。计算不同稀释倍数下阳性血清的PI 值，PI值随血清稀释倍数的增大而减小，当血清稀释80倍时，检测结果为阳性，当 血清稀释160倍时，检测结果为阴性，该方法可检测到血清的最大稀释倍数为1：80， 说明本发明构建的阻断ELISA检测试剂盒具有高度的敏感性。
分别取同一批次的4块板和不同批次的3块板，用本发明建立的方法检测7份阳 性血清样品，测定同一样品在相同批次和不同批次下的PI值，计算结果显示批间和 批内变异系数均小于10％，其中批内最大差异6.88％，批间最大差异8.62％；试验 结果说明，本发明构建的阻断ELISA检测试剂盒重复性好。
同时用商品化试剂盒(间接ELISA)和本发明构建的阻断ELISA检测试剂盒对 41份阳性样品和53份阴性样品进行检测。对94份样品的检测结果显示，本发明检 测试剂盒的总符合率为84.04％，阳性符合率为82.5％，阴性符合率为85.19％。
临床样品检测结果显示，样品抗体总阳性率不超过20％，种鸭的抗体阳性率明 显高于商品鸭。
综合上述结果显示，本发明提供的检测DEV抗体的阻断ELISA检测试剂具有敏 感度高，特异性好，重复性强等优点，具有良好的商业化应用前景。
附图说明
图1全长gB蛋白的软件分析。
图2蛋白表达SDS-PAGE分析；M:蛋白Marker，1：诱导前全菌；2：诱导后全 菌；3：破碎后上清；4：破碎后沉淀。
图3 gB蛋白的WesternBlot鉴定结果；M：蛋白Marker；1：鸭源阳性血清。
图4 gB蛋白免疫反应性的IFA分析；A:免疫gB蛋白兔血清；B：未免疫兔血清。
图5表位鉴定截短表达示意图。
图6 MAb的亚类鉴定结果。
图7 MAb与DEV反应性的IFA分析(200×)；A：2E3；B：7E12；C：1E8；D～F： 阴性对照。
图8 MAb的WesternBlot分析；M：蛋白Marker；1：PAb与DEV反应；2：MAb 与DEV反应；2：MAb与gB蛋白反应。
图9 MAb的特异性试验。
图10 MAb 1E8效价的ELISA测定结果。
图11 gB蛋白第一次截短表达；M1：DL2000DNA Marker；M2：蛋白Marker； 1、3、5：gB-101；2、4、6：gB-102。
图12 gB蛋白第二次截短表达；M1：DL2000DNA Marker；M2：蛋白Marker； 1、3、5：gB-201；2、4、6：gB-202。
图13 gB蛋白第三次截短表达M1：DL2000DNA Marker；M2：蛋白Marker；1、 3、5：gB-301；2、4、6：gB-302。
图14 MAb与多肽间接ELISA鉴定结果。
图15 MAb1E8工作浓度优化。
图16 gB蛋白包被条件优化。
图17阴阳性血清样品PI分布。
图18阻断ELISA的特异性试验结果。
图19阻断ELISA的敏感性试验结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域 技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 DEV gB蛋白的原核表达
1.材料与方法
1.1毒株与实验动物
DEVCSC株种毒由本实验室保存；SPF鸭胚购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究 所实验动物中心；清洁级新西兰大白兔购自辽宁长生生物技术有限公司；DEV阳性 血清参考品购自中国兽医药品监察所；pET-32a载体质粒由本实验室保存。
1.2试验方法
1.2.1DEV的增殖
采用常规方法，用11日龄的SPF鸭胚制备鸭胚成纤维细胞(DEFs)，用含5％FBS 的DMEM培养制备的原代细胞，原代细胞置于5％CO2的37℃培养箱中，培养1～2d 后传代，细胞传1代后生长至铺满瓶底的80％即可接种病毒。
接种病毒，用无血清的DMEM将病毒悬液进行6倍稀释，弃去细胞培养上清，用PBS缓冲液清洗3次，吸干净PBS缓冲液，加入适量病毒悬液，以完全覆盖细胞培养瓶 底为准，置于5％CO2的37℃恒温培养箱中吸附1～2h。吸附后，弃掉病毒悬液，加 入含2％FBS的DMEM，继续维持培养3d，期间每日观察细胞病变情况，并设置不 接毒对照组。收获病毒，将DEVCSC株病毒接种于传1代后的DEFs，显微镜下观察 到90％的细胞出现病变时，将其冻融一次，收集上清，800r/min离心8min，除去细 胞碎片；细胞刮刮下瓶底细胞，冻融两次差速离心去沉淀合并于上清中。
1.2.2 DEV DNA的提取及PCR检测
利用病毒DNA提取试剂盒提取实验室保存的DEVCSC株种毒，以及细胞传代毒 的DNA。使用国标法中的引物进行PCR检测，连接T载体测序。以DEV CSC种毒 和细胞传代毒DNA为模板，PCR检测反应体系50μL；反应程序为：94℃5min；94℃ 30s，55℃30s，72℃30s，25cycle；72℃10min。
1.2.3DEV的粗纯
收获病毒后，4℃条件下进行差速离心，4000r/min、8000r/min各离心一次，每 次15min，取第二次离心的上清合并于之前的上清中。用PBS缓冲液配制5mL 30％ (W/V)蔗糖溶液，上清加到该30％(W/V)蔗糖溶液垫底的离心管内，4℃32000r/min 离心2h，收集沉淀，沉淀用适量PBS缓冲液悬浮。将差速离心后收集的沉淀负染， 于电镜下观察病毒粒子。
1.2.4蔗糖不连续密度梯度离心法纯化DEV
配制蔗糖不连续密度梯度溶液，离心管中由下至上依次为30％、40％、50％和60％(W/V)蔗糖溶液，将收集的病毒悬液加入到最上层，4℃条件下，32000r/min离 心2h，收集病毒带并用0.5mL PBS缓冲液稀释，28000r/min离心2h进行脱糖，沉淀 用0.5mL PBS缓冲液悬浮，超低温冰箱保存。用紫外分光光度计测定蔗糖不连续密度 梯度离心法纯化的病毒悬液浓度，并将其负染后电镜下观察。
1.2.5DEV TCID50的测定
测定DEVCSC株种毒和细胞传代毒的TCID50。将病毒用DMEM基础培养基进 行10-2～10-9倍比稀释；弃去事先铺好DEFs的96孔板中的细胞培养液，并用PBS洗 一次；将稀释的病毒液依次移入1～8行，每个稀释度的病毒液加入一个纵列，作8个 重复，每孔100μL；8～12列设置为正常细胞对照。接毒后每24h观察记录一次病变 (CPE)，连续观察一周，分别记录每次观察到的CPE孔和无CPE孔数，根据 Reed-Muench方法计算病毒的TCID50。
1.2.6DEV gB蛋白重组表达***的构建
根据GenBank已公布的Duck enteritis virus UL27precursor(UL27)gene全序列(EF554401.1)，UL27基因编码的全长gB蛋白含932个aa。通过DNASTAR Lasergene 软件分析，选取表位密集区域324～628aa进行表达，该段蛋白亲水性良好，抗原密度 较高，含有松散的转角结构(图1)。设计该段序列引物并人工合成(表1)。
表1 PCR引物序列
Figure BDA0002146190530000071
根据选取的目的基因，构建pET-32a-gB质粒的BL21原核表达***。扩增目的 片段的PCR反应体系同2.2.2；反应程序为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃ 3min，30cycle；72℃10min。
用胶回收试剂盒回收目的片段后，双酶切目的片段及pET-32a载体，37℃水浴， 酶切6h，酶切体系为50μL。
连接目的片段及pET-32a载体，16℃金属浴，连接过夜，连接体系为10μL；将 连接产物转化TransT1感受态细胞，提取转化后细菌质粒，双酶切鉴定；将鉴定正确 的pET-32a-gB质粒转化BL21感受态细胞，向感受态中加入10μL连接产物，42℃ 90s，冰浴5min，加入培养基摇晃孵育1h涂Amp固体LB平板；菌落长出后转接至 5ml Amp液体LB，进行菌液PCR鉴定。
2.2.7重组gB蛋白的表达
将PCR鉴定正确的菌液，按1:50的比例接种到Amp液体LB，在37℃，220r/min 的细菌培养箱中增殖1h，至OD600＝0.4～0.6，按1:100的比例加入1mM/L的IPTG， 诱导表达4～5h。收集到的菌液2000r/min离心半小时，沉淀用PBS重悬，随后置于 冰上进行超声裂解，离心，收集上清和沉淀，以上样品-20℃保存备用。
2.2.8重组gB蛋白的纯化
采用镍柱亲和层析方法，纯化表达出的蛋白。具体操作步骤如下：
(1)处理样品：将蛋白超声破碎后，10000g离心10min，留取并用Binding buffer重悬沉淀，作为待纯化的样品。
(2)装柱：用PBS缓冲液润洗柱子及滤膜，加入1mL镍螯合亲和树脂。
(3)平衡柱子：用PBS缓冲液润洗柱子后，加入4mL Binding buffer平衡柱子。
(4)上样：关闭控流阀，每次纯化加入0.4mL样品，静置5min。
(5)洗涤：打开控流阀，同时加入4mL PBS缓冲液，冲洗掉未结合镍柱的杂蛋 白。
(6)洗脱：依次用100mM/L、250mM/L、500mM/L、800mM/L、1M/L的咪 唑溶液洗脱目的蛋白。
(7)透析浓缩：洗脱后的蛋白用PBS透析，超滤浓缩，取0.01mL蛋白制样跑 SDS-PAGE，进行纯度鉴定。
2.2.9重组gB蛋白的复性
按照GENMED蛋白复性试剂盒说明书复性重组蛋白。
2.2.10重组gB蛋白的Western Blot鉴定
将纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳后，利用转膜仪将其转印到PVDF膜上。 以鸭源DEV阳性血清参考品为一抗，山羊抗鸭IgG-HRP为二抗，进行试验，DAB 化学显色。
2.2.11重组gB蛋白的IFA鉴定
2.2.11.1制备gB蛋白多抗
将纯化复性后gB蛋白与弗氏佐剂混合并乳化，免疫新西兰大白兔，免疫途径为 背部皮下多点注射。共免疫3次，免疫间隔为两周，剂量为1mg/只，第3次免疫后5 天，耳缘静脉采血，检测血清效价，再过5天心脏采血分离血清，分离血清前用非乳 化抗原加强免疫。
间接ELISA检测血清效价，具体操作步骤如下：
(1)用包被液稀释纯化的gB蛋白为5μg/mL，每孔100μL，4℃过夜后，用PBST 清洗酶标板3次，拍干。
(2)每孔加300μL的5％脱脂乳，37℃封闭2h后洗板3次。
(3)加入10倍比稀释的免疫兔血清，设置阴性和空白对照，每孔100μL，37℃ 孵育1h，洗板3次。
(4)加入1：10000稀释的山羊抗兔-HRP，每孔100μL，37℃孵育1h，洗板3 次。
(5)加入显色液100μL，显色10min，用50μL终止液终止反应，15min内酶标 板读取OD450nm值，以P/N≥2.1作为阳性判定标准。
2.2.11.2IFA试验
具体操作步骤如下：
(1)六孔细胞培养板中均匀铺入DEFs细胞悬液，培养24h，细胞刚满单层即接 种DEV。(2)接毒后细胞开始出现病变时，移液枪吸净六孔板中培养基，加入PBS 洗涤，于水平摇床轻轻摇晃5min后弃净，反复2次，最后一次弃净PBS。(3)加 入4％多聚甲醛，4℃固定15min，洗涤同上步。(4)加入1％BSA，37℃封闭30 min，洗涤3同上步。(5)加入0.1％TritonX-100，室温(20-30℃)穿孔15min， 洗涤同上步。(6)加入用PBS稀释100倍的兔多抗阳性血清，37℃孵育2h，洗涤 同上步。(7)加入PBS稀释10000倍的山羊抗兔IgG-FITC，37℃避光孵育1h，洗 涤5次，最后一次无需弃掉PBS。(8)立即置于倒置荧光显微镜下镜检。该实验设 置3个对照，即未接毒细胞对照，不加一抗空白对照与一抗为未免疫兔血清阴性对照。
2.3试验结果
2.3.1染毒细胞观察结果
DEFs感染DEV后，每日于显微镜下观察其病变状态。结果细胞在24h开始出现 空泡化，随着时间推移，小空泡逐渐增多、融合为较大空泡，空泡进一步扩大至占据 细胞一半以上面积后，细胞开始变圆脱落；72h脱落细胞数相较总细胞占比90％以上。
细胞脱落后崩解，细胞膜破损，病毒从其中释放出来，上清中的病毒含量较高， 此时收获的病毒存在于液体里，利于离心等下一步试验。
分别提取种毒和细胞中病毒的基因组，使用国标法中的引物进行PCR检测；测 序与参照序列符合率为100％。
2.3.2纯化病毒的电镜观察结果
采用差速离心与蔗糖不连续密度梯度离心法纯化病毒粒子，纯化后病毒悬液浓度为29.8mg/mL，浊度接近0.0。病毒纯度越高，作为免疫原免疫动物获得的分泌抗体 细胞类型符合需求的概率将越大，可以简化后期的筛选过程。
将病毒进一步负染后电镜下观察，可见病毒粒子整体呈球形，直径约为180nm， 由内部核衣壳、外部囊膜组成，形态完整，大小较为一致；电镜视野下，密度梯度离 心纯化的病毒粒子周围的细胞碎片等杂质，明显少于差速离心后收集的病毒粒子周 围。
2.3.3TCID50的测定结果
采用细胞滴定法测定组织毒和细胞毒的TCID50，统计种毒和传代细胞毒的CPE 结果(表2、2)。依据Reed-Muench法计算DEVCSC种毒的TCID50为10-5.14/0.1mL， 细胞毒的TCID50为10-6.61/0.1mL。表明病毒在细胞上繁殖后病毒滴度增强，约为种 毒的10倍，说明DEFs适合作为DEV的寄生宿主，在组织上繁殖的病毒可用于下一 步实验。
表2 DEV种毒CPE统计结果
Figure BDA0002146190530000091
表3 DEV细胞毒CPE统计结果
Figure BDA0002146190530000092
2.3.4重组质粒的PCR鉴定
根据抗原性分析，选取UL27基因部分区域，构建pET-32a-gB质粒，将该质粒 转化TransT1感受态细胞，双酶切鉴定提取的质粒，结果显示酶切后包括两个片段， 大小分别接近于915bp和5900bp，结果表明目的片段以正确的方式***了载体中。
将双酶切鉴定正确的pET-32a-gB质粒转化BL21感受态细胞，挑取菌落，进行 菌液PCR扩增，结果显示选择的7个菌落均扩增出1566bp的目的片段。
2.3.5gB蛋白表达的SDS-PAGE鉴定
蛋白电泳结果显示，IPTG诱导后，gB蛋白表达量同诱导前相比明显增多；分别 取样细菌沉淀(包涵体)及上清进行电泳，沉淀中含大量诱导表达的目的蛋白，而上 清中几乎不含目的蛋白(图2)，说明目的蛋白主要以包涵体形式存在于细菌中。 SDS-PAGE鉴定纯化的蛋白约为51kDa，与理论预期相符。
2.3.6 gB蛋白纯化的SDS-PAGE鉴定
将纯化前样品、上样流出液和各个洗脱浓度下洗脱的样品制样，进行SDS-PAGE 鉴定，结果显示在咪唑浓度为800mM/L、1M/L时，目的蛋白均可被洗脱下来，另外 100mM/L洗脱样品中也出现了目的条带，结果表明蛋白洗脱的浓度范围应为800 mM/L～1M/L，100mM/L洗脱样品中出现目的条带可能原因为上样浓度过高，有一部 分未结合的目的蛋白在洗脱最初流下来。纯化后的目的条带清晰单一，说明纯化效果 较好。
2.3.7gB蛋白复性的SDS-PAGE鉴定
复性浓缩后gB蛋白大小约为51kDa，经紫外分光光度计测定浓度为1mg/mL。2.3.8gB蛋白免疫原性的WesternBlot分析
以鸭源DEV阳性血清参考品为一抗，山羊抗鸭IgG-HRP为二抗，DAB化学显 色。结果在目的蛋白位置出现清晰的褐色条带，表明蛋白免疫原性较强(图3)。
2.3.9gB蛋白免疫反应性IFA分析
第三次将gB蛋白免疫兔后，间接ELISA检测血清抗体效价为1：106；以该阳性 血清为一抗山羊抗兔IgG-FITC为二抗，进行IFA，结果显示，接毒细胞发出强绿色 荧光，集中在胞浆和细胞膜上，对照组未见特异性绿色荧光(图4)，即gB蛋白免 疫兔后分离的血清中，存在与DEV结合的抗体，表明gB蛋白具有良好的免疫反应 性。
实施例2 DEV与DEV gB蛋白单抗的制备与选择
1.试验材料
1.1毒株及细胞
H5、H7及H9亚型禽流感病毒(AIV)HI试验抗原购自哈尔滨维科生物技术开 发公司，新城疫病毒(NDV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、 Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHVⅠ)均由本实验室保存。SP2/0骨髓瘤细胞由实验室保存。
1.2实验动物及血清样品
11日龄SPF鸭胚购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心。6周龄SPF级雌性BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。6份阳性血清样品由实验室免疫SPF 鸭制备并用中和试验鉴定；6份阴性血清样品由实验室采集自未免疫SPF鸭并用中和 试验鉴定。
1.3主要试剂
弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(IFCA)、HAT、HT和PEG/DMSO 均购自Sigma公司。DMEM、胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司。ProteinG亲和层 析柱购自GEhealthcare公司。Glycine、Tris、蔗糖均购自美国AMRESCO公司；液体 石蜡购自购自天津市天大化学试剂公司。IRDye680LT山羊抗小鼠抗体购自LI-COR 公司；山羊抗鼠IgG-HRP、IgG-FITC，山羊抗兔IgG-HRP、IgG-FITC，DAB显色试 剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。SBAClonotypingSystem-HRP抗体亚类 鉴定试剂盒购自SouthernBiotech公司。
2试验方法
2.1动物免疫
纯化后DEV与DEV gB蛋白分别与弗氏佐剂混合并乳化，免疫6周龄BALB/c 小鼠，剂量为50μg/只。共免疫3次，免疫间隔为两周。第一次免疫途径为腹部皮下 多点注射，乳化佐剂为弗氏完全佐剂；后两次免疫途径为腹腔注射，乳化佐剂为弗氏 不完全佐剂；第3次免疫后5d，断尾采血，10000r/min离心10min，分离血清，检 测血清抗体效价；5天后选择效价高的小鼠用非乳化抗原加强免疫，再过3天取该小 鼠脾脏与对数生长期的SP2/0细胞融合。
2.2细胞融合
加强免疫后，在超净台中取小鼠脾脏与对数生长期的SP2/0细胞融合。具体操作步骤如下：
(1)饲养层细胞的制备：将阴性BALB/c小鼠固定于托盘上，用酒精棉球擦拭其 腹部，随后用镊子提起腹部皮肤，将皮肤逐步剪开，完全暴露腹膜，注射器吸入5 mLHAT培养液注入腹腔，用酒精棉球匀速按摩腹部若干次，力度需适中，再用注射 器回抽腹腔内液体，将回抽的液体补充至50mL，约分装至5块96孔培养板。
(2)脾细胞悬液的制备：将阳性BALB/c小鼠固定于托盘上，用酒精棉球擦拭其 左侧腹部，取出脾脏，其间注意无菌操作；同时，留取该小鼠血清作为鼠源多克隆抗 体(PAb)；用DMEM基础培养基清洗脾脏，剔除与脾脏粘连的其他组织，随后将 其转入至盛有20mLDMEM基础培养基的平皿，用注射器刺穿脾脏数十下，再用注 射器内芯于40μm滤网上研磨脾脏，将脾细胞悬液移入离心管。
(3)细胞融合：取生长状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞，弃去培养基并用PBS缓 冲液冲洗3次，加入20mL DMEM基础培养基吹下细胞，移入盛有脾细胞的离心管； 1000r/min水平离心10min；弃尽上清，加入20mL DMEM基础培养基重悬细胞，800 r/min水平离心8min；弃尽上清，用移液器轻轻混匀细胞，将离心管放进装有37℃温 水的蓝盖瓶中，以保证融合的效率，1min内缓缓加入1mL PEG，静置1min；随后终 止融合，于4个1min内依次加入1mL、2mL、3mL、4mL DMEM基础培养基；融 合后的细胞铺入前一天制备的饲养层细胞之上。
2.3阳性杂交瘤细胞株的筛选
对融合孔的细胞进行3次亚克隆，间接ELISA法筛选得到阳性细胞株，细胞经 扩大培养后冻存。亚克隆与细胞冻存步骤如下：
(1)融合细胞的亚克隆：第一次亚克隆，分别以5μg/mL的纯化DEV与DEV gB 蛋白包被酶标板，间接ELISA检测有融合细胞孔的细胞培养上清，操作同2.2.11.1， 挑取阳性孔细胞的单克隆，细胞计数调整细胞浓度为10个/mL，分装到预先铺好饲养 层的96孔细胞培养板；第二次亚克隆，检测每孔细胞培养上清，挑取阳性孔细胞的 单克隆，调整细胞浓度为1个/孔，分装到预先铺好饲养层的96孔细胞培养板；第三 次亚克隆，检测每孔细胞培养上清，挑取阳性反应孔细胞的单克隆，扩大培养以用于 进一步鉴定。
(2)杂交瘤细胞株的冻存：每一次亚克隆筛选得到的阳性反应细胞，扩大培养后均需进行冻存；冻存时，弃去旧液，清洗3次，用5mL DMEM基础培养基轻轻吹下 细胞，800r/min离心8min，弃尽培养基，加入1mL细胞冻存液重悬细胞，将细胞悬 液移入冻存管，再将冻存管放入冻存盒，超低温冰箱冻存过夜后将冻存管置于液氮中， 可长期保存细胞。
2.4MAb的亚类鉴定
按照SBAClonotypingSystem-HRP抗体亚类鉴定试剂盒说明书，对筛选出的MAb 亚类进行测定。
2.5MAb的IFA鉴定
以MAb为一抗，山羊抗小鼠IgG-FITC为二抗，同时设置3个对照，即未接毒细 胞对照，不加一抗空白对照与一抗为未免疫鼠阴性血清对照，进行IFA。操作方法同 上。
2.6最佳阻断率MAb的筛选
为从多株MAb中筛选可与天然空间构象病毒蛋白反应，且对DEV抗体具有强阻 断能力的IgG亚类MAb，对IFA中鉴定为阳性且2.4中鉴定为IgG亚类的MAb进一 步筛选，从超低温冰箱中取实验室保存的DEV阴阳性血清各6份，通过阻断ELISA 测定MAb对各血清抗体的竞争阻断能力，根据阳性血清抑制率(PI)/阴性血清抑制 率(PI)的值，选择合适的MAb。其中，阳性血清PI值＝(PBS OD450nm值-阳性OD450nm值)/PBS OD450nm值，阴性血清PI值＝(PBSOD450nm值-阴性OD450nm值)/PBS OD450nm值。
分别以纯化DEV和gB蛋白两种抗原包被酶标板，进行阻断ELISA，测定各MAb 阻断能力，包被浓度和方法，及封闭方法同上述间接ELISA；封闭后，加入阴阳性血 清37℃孵育1h，同时设置PBS对照，每孔100μL，洗板3次；加入MAb于37℃ 孵育1h，每孔100μL，洗板3次；加入1：10000稀释的山羊抗小鼠-HRP，每孔100 μL，37℃孵育0.75h，洗板3次；显色、终止和读数方法同间接ELISA。
2.7MAb1E8的Western Blot鉴定
将DEV接种于DEFs，显微镜下观察到90％的细胞出现病变时，收集上清和瓶 底细胞，差速离心去沉淀合，4℃32000r/min超离2h；将超离纯化的DEV经SDS-PAGE，转印到PVDF膜；分别以上述鼠源PAb以及选择出的一株MAb为一抗 (1:1000)，以IRDye680LT山羊抗小鼠抗体为二抗(1:10000)，进行Western Blot用红外 荧光成像***扫描进行结果观测。以鉴定鼠源PAb及该MAb与DEV的反应性。同 时，将纯化的gB蛋白经SDS-PAGE，转印到PVDF膜；以上述MAb为一抗进行Western Blot，方法同上，以鉴定该MAb与原核表达的gB蛋白的反应性。
2.8 MAb1E8的特异性鉴定
分别将AIV(H5、H7及H9)、NDV、EDSV、DTMUV、DHV-Ⅰ及DEFs进行 10倍稀释，作为抗原包被酶标板，同时设置DEV阳性对照；以选择出的MAb为一 抗，进行间接ELISA。操作方法同上。
2.9制备腹水与MAb1E8的纯化
10周龄小鼠腹腔注射高压灭菌的石蜡油，500μL/只，一周后按同样方法注射3.2.6中选择出的杂交瘤细胞和SP2/0骨髓瘤细胞，106/只，再过一周可采集腹水；用Protein G亲和纯化小鼠杂交瘤腹水中的抗体。具体操作步骤如下：
(1)将腹水10000r/min离心10min，除去杂质；装置好柱子，用5mL PBS平衡。 (2)关闭控流阀，400μL腹水与等量PBS混合后，将混合液加入至柱子中，静置5min， 使腹水中抗体充分吸附。(3)打开控流阀，加入4mL PBS冲洗，洗脱未结合的杂蛋 白及结合不稳固的抗体。(4)加入Glycine(0.1M，PH＝3.0)洗脱，为保持抗体结 构稳定，用盛有Tris-HCL(1M，PH＝8.8)的收集管收集流下来的液体，每收集1mL 洗脱抗体，需用0.1mL Tris-HCL中和。
(5)SDS-PAGE电泳，鉴定样品纯度。
纯化后，需依次用10倍柱体积的PBS和20％乙醇冲洗Protein G柱子，最后用5 倍柱体积的20％乙醇于4℃保存柱子。
2.10MAb1E8腹水效价的ELISA鉴定
以浓度为5μg/mL的gB蛋白包被酶标板，将MAb 1E8腹水按10～108依次进行 10倍比稀释，以SP2/0腹水为阴性对照，间接法测定腹水的抗体效价。操作方法同上。
2.11MAb 1E8的表位鉴定
按照表位鉴定截短表达示意图(图5)将gB蛋白分3轮截短，共进行6次诱导 表达，设计的引物人工合成(表4)。
表4 PCR引物序列
Figure BDA0002146190530000131
Figure BDA0002146190530000141
6段截短蛋白的重组质粒构建及原核表达。PCR扩增体系同上，各自PCR扩增 程序如下：
第一轮扩增程序为95℃5min；95℃30s，65℃30s，72℃1min，30cycle； 72℃10min。第二轮扩增程序为95℃5min；95℃30s，65℃30s，72℃40s，30 cycle；72℃10min。第三轮扩增程序为95℃5min；95℃30s，65℃30s，72℃30 s，30cycle；72℃10min。
将每一轮表达的一对截短蛋白同时进行SDS-PAGE，转印至PVDF膜，以MAb 1E8为一抗，山羊抗小鼠-HRP为二抗进行Western Blot。根据以上结果人工合成初步 鉴定出的表位多肽，间接ELISA鉴定单抗与多肽反应性。合成多肽浓度为10mg/mL， 用包被液将多肽稀释至浓度为5μg/mL，4℃包被过夜；以MAb 1E8为一抗，山羊抗 小鼠-HRP为二抗，进行间接ELISA；封闭及抗体孵育方法等均同上。gB蛋白包被酶 标板，MAb 1E8为一抗，作为阳性对照，并设置阴性及空白对照。
3试验结果
3.1杂交瘤细胞的筛选结果
用建立的间接ELISA方法进行4次筛选，得到4株可稳定分泌抗DEVMAb的杂 交瘤细胞株，分别命名为2E3、7E12、9G3、10A9，得到7株可稳定分泌抗gB蛋白 MAb的杂交瘤细胞株，1A4、3C2、4H3、3E2、2B1、1E8、2G3。
3.2MAb亚类的鉴定
采用抗体亚类鉴定试剂盒对MAb的亚类进行测定，11株MAb中，4株DEVMAb 中2E3为IgM亚类、7E12和9G3为IgG1亚类、10A9为IgG2b亚类；7株gB蛋白 MAb的重链均为IgG2b亚类(图6)。
3.3MAb与DEV反应性的IFA分析
DEFs感染DEV后，待细胞开始出现病变，进行IFA，倒置荧光显微镜下观察到， 3株MAb与DEV反应，分别为DEV MAb 2E3、7E12和gB蛋白MAb 1E8，接毒细 胞发出强绿色荧光，集中在胞浆和细胞膜上，对照组未见特异性绿色荧光(图7)。
3.4为建立阻断ELISA方法筛选MAb
结合3.3和3.4中的试验结果，DEV MAb 7E12和gB蛋白MAb 1E8为IgG亚类 且与天然病毒蛋白反应，对以上两株MAb的阻断效果鉴定结果显示，MAb 1E8阻断 能力较7E12更强(表5)，因此MAb 1E8可用于后续试验。
表5两株单抗对6份DEV阳性血清样品阻断效果比较
Figure BDA0002146190530000142
Figure BDA0002146190530000151
3.5MAb 1E8的WesternBlot分析
DEFs感染DEV后收获病毒，将超离纯化后DEV转印到PVDF膜上，分别以鼠 源PAb和MAb 1E8为一抗，进行Western Blot。同时，转印纯化的gB蛋白，MAb 为一抗，进行试验。结果显示PAb与变性DEV蛋白在30kDa、47kDa和120kDa条 大小带处有结合，MAb与变性DEV蛋白在30kDa大小条带结合，且与原核表达的 51kDa大小的蛋白有结合(图8)。
3.6MAb 1E8特异性的鉴定
分别将AIV(H5、H7及H9)、NDV、EDSV、DTMUV、DHV-Ⅰ及DEFs包被 酶标板，进行间接ELISA，以P/N≥2.1作为阳性判定标准。结果显示，阳性对照成立 的条件下，MAb与其他病毒及DEFs的反应均呈阴性(图9)，说明MAb特异。
3.7MAb 1E8腹水纯化的SDS-PAGE鉴定
用Protein G亲和纯化MAb，分光光度法测定其浓度约1.6mg/mL；SDS-PAGE 鉴定纯化的MAb重链55kDa，轻链约25kDa。
3.8腹水中抗体效价的ELISA测定
以gB蛋白包被酶标板，以SP2/0腹水为阴性对照，间接法测定MAb 1E8腹水的 抗体效价，当腹水稀释104倍时OD450nm值均大于1.0(图10)，以P/N≥2.1作为阳性判 定标准，结果显示抗体效价为106(图10)。
3.9MAb 1E8的抗原表位鉴定
PCR扩增，构建表达截短蛋白的原核表达***，将每一轮表达的一对截短蛋白同时进行SDS-PAGE，转印后以MAb 1E8为一抗，山羊抗小鼠-HRP为二抗，进行Western Blot。通过PCR、SDS-PAGE和Western Blot分析，第一次截短表达的gB-101扩增 片段大小为600bp、蛋白大小为38kDa，gB-102扩增片段大小为441bp、蛋白大小为 28kDa，Western Blot结果表明MAb与第二段蛋白gB-102反应(图11)；第二次截短 表达gB-201扩增片段大小为192bp、蛋白大小为16kDa，gB-202扩增片段大小为 288bp、蛋白大小为25kDa，Western Blot结果表明MAb与第二段蛋白gB-202反应(图 12)；第三次截短表达的gB-301扩增片段大小为171bp、蛋白大小为15.5kDa，gB-302 扩增片段大小为153bp、蛋白大小为15kDa，Western Blot结果表明MAb与两段蛋 白均反应(图13)。
MAb与合成的重叠多肽间接ELISA鉴定结果显示，其与多肽反应(图14)。因此， 该MAb针对的抗原表位应为第三次截短表达中，两段蛋白所重合多肽的氨基酸序列， 即579RMLGDVLAVSSC590。经分析MAb 1E8抗原表位区为位于UL27全长蛋白 579～590aa。
试验例1检测DEV抗体的阻断ELISA方法的建立与应用
1材料
1.1样品来源
H5、H7及H9亚型禽流感病毒(AIV)HI试验抗血清购自哈尔滨维科生物技术 开发公司，新城疫病毒(NDV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、 小鹅瘟病毒(GPV)、Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHVⅠ)阳性血清均由本实验室保存。DEV 阳性血清参考品(鸭源，中和效价1：100)购自中国兽医药品监察所；DEV阴性血 清参考品(鸭源，中和试验阴性)由实验室保存；130份阳性血清样品和364份阴性 血清样品来源同上。
565份鸭源临床血清样品采集自山东潍坊，318份采集自山东菏泽，27份采集自 吉林松原；27份鹅源临床血清样品采集自吉林松原。
1.2主要试剂及试剂盒
山羊抗小鼠IgG-HRP和TMB显色液均购自sigma公司；Tween20购自BioSharp 公司；PBS缓冲液(干粉)购自北京来搏科技有限公司；国内生产的鸭瘟病毒ELISA 抗体检测试剂盒(TSZ品牌)购自上海邦景生物试剂有限公司。重要试剂的配制如下：
(1)PBS缓冲液：按照说明书，用去离子水溶解50×PBS缓冲液(干粉)，定 容至1000mL，高压灭菌后，可室温保存。
(2)包被液(0.05mol/L的pH＝9.6的碳酸盐缓冲液)：用去离子水稀释无水碳酸 钠1.50g，碳酸氢钠2.98g后，定容至1000mL，高压灭菌后，可室温保存。
(3)封闭液：PBS缓冲液中加入50g脱脂乳，使其充分溶解，定容至1000mL， 现配现用。
(4)洗涤液：PBS缓冲液中加入500mL吐温20，定容至1000mL，现配现用。
(5)稀释液：PBS缓冲液中加入10g脱脂乳，使其充分溶解，定容至1000mL， 现配现用。
(6)终止液：将100mL浓硫酸缓缓加入至80mL去离子水，定容至100mL。
2试验方法
2.1确定工作浓度
以DEV阴性血清参考品作为阴性对照，将DEV阳性血清参考品由1.25～10μg/mL 进行2倍比稀释，抗原包被浓度由20～160μg/mL进行2倍比稀释，进行阻断ELISA， 方阵滴定法选择阴性值0.8～1.2，包被抗原、阳性血清参考品浓度综合较低，抑制率 (PI)值较大孔对应的条件为包被抗原和阳性血清参考品工作浓度；随后固定包被抗 原、阳性血清参考品的浓度，按常规方法进行后续试验，选择PI>40％、MAb 1E8浓 度低的孔对应的条件为其工作浓度。
2.2确定gB蛋白包被条件
以0.5μg/mL蛋白包板，设置4种不同的包被条件，37℃、1h，37℃、2h，37℃、 2h后4℃、12h，4℃、12h。按常规方法进行后续试验，选取PI值大且费时较少的 条件为最佳包被条件。
2.3确定封闭液种类
以最佳条件包被gB蛋白后，设置四种封闭液种类：5％BSA，5％skimmilk(脱 脂乳)，0.5％gelatin(明胶)，5％FBS。37℃条件下，每种封闭液均封闭2h，纵 向加入封闭液，每组4个平行。按常规方法进行后续试验，综合PI值大小、包被液 价格因素，选择经济实惠、效果较好的封闭液。
2.4确定被检样品孵育条件
设置3种不同的孵育条件，37℃、0.5h，37℃、1h，室温、2h。按常规方法进 行后续试验，选取PI值较大对应的条件为被检样品孵育条件。
2.5确定MAb孵育时间
37℃条件下，将工作浓度MAb 1E8分别孵育0.5h、1h、1.5h、2h。按常规方法 进行后续试验，选取PI值大且费时较少的时间为MAb最佳孵育时间。
2.6确定山羊抗小鼠IgG-HRP孵育时间
37℃条件下，将工作浓度山羊抗小鼠IgG-HRP抗体分别孵育30min、45min、 1h。按常规方法进行后续试验，选取PI值大且费时较少的条件为其最佳孵育时间。
2.7确定显色时间
37℃条件下，设置4个显色时间，依次为5min、10min、15min、20min。按常 规方法进行后续试验，选取PI值大且费时较少的条件为最佳显色时间。
2.8确定判定标准
从超低温冰箱中取出经中和试验确定的阴阳性血清样品，测定364份阴性鸭血清样品和130份阳性鸭血清样品的OD450nm值，以DEV阴性血清参考品为阴性对照。 根据公式PI值＝(阴性对照OD450nm值-被检血清OD450nm值/)阴性对照OD450nm值计 算，用GraphPad Prism6作散点分布图，用IBM SPSS Statistics软件绘制ROC曲线， 选择敏感性和特异性均合适的点对应的PI值作为临界值。
2.9特异性试验
以确定好的抗原浓度包被酶标板，同步检测流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、减蛋综合症病毒(EDSV)、坦布苏病毒(DTMUV)、小鹅瘟病毒(GPV)、鸭肝炎I 型病毒(DHVⅠ)的标准血清，以最适浓度的DEV阳性血清参考品作为阳性对照， 以DEV阴性血清参考品为阴性对照。在最适条件下，孵育标准血清和阴阳性对照血 清，手动洗板后加入MAb进行孵育，充分洗板后孵育山羊抗小鼠-HRP，测定各孔吸 光度以判断该检测方法针对DEV抗体的特异性。
2.10敏感性试验
用确定好浓度的抗原包被酶标板，将DEV阳性血清参考品按1：10～1：1280依 次进行2倍比稀释，在最适条件下，孵育稀释的DEV阳性血清，洗板后加入MAb 进行孵育，充分洗板后孵育酶标二抗，设置DEV阴性血清参考品为阴性对照，计算 各稀释倍数下阳性血清的PI值，确定能检出阳性血清的最大稀释倍数，验证该方法 的敏感性。
2.11重复性试验
2.11.1批内重复
取出4块同一批次包被的板子，取实验室保存的7份阳性的样品，以确定好的抗 原浓度包被酶标板，在最适条件下，孵育上述阳性血清样品，每块板均设置阴性对照； 手动洗板后加入MAb进行孵育，充分洗板后孵育酶标二抗，测定同一样品在相同批 次下的PI值，计算变异系数。
2.11.2批间重复
取出4块不同批次包被的板子，取实验室保存的7份阳性的样品，以确定好的抗 原浓度包被酶标板，在最适条件下，孵育上述阴阳性血清样品，每块板均设置阴性对 照；手动洗板后加入MAb进行孵育，充分洗板后孵育酶标二抗，测定同一样品在不 同批次下的PI值，计算变异系数。
2.12符合率试验
从实验室保存的阴阳性血清样品中，随机抽取经中和试验确定的41份DEV阳性 血清样品和53份阴性血清样品，从超低温冰箱中取出以上血清样品，按照商品化试 剂盒说明书中描述的间接ELISA方法进行检测，同时用本研究建立的阻断ELISA方 法，在96孔酶标板上进行试验，分析两者结果的符合率。
2.13临床样品检测
先后于山东潍坊与菏泽、吉林松原的养殖场进行采样，共采集937份临床血清样品。其中潍坊采集种鸭血清565份，菏泽采集商品鸭血清318份，松原采集商品鸭血 清27份，商品鹅血清27份。以确定好的抗原浓度包被酶标板，在最适条件下，孵育 临床血清样品，洗板后加入MAb进行孵育，充分洗板后孵育酶标二抗，测定各孔吸 光度，以DEV阴性血清参考品为阴性对照，计算统计各批样品的抗体阳性率。
3试验结果
3.1最佳工作浓度的确定
以gB蛋白为包被抗原，MAb1E8为竞争抗体，初步组合建立阻断ELISA方法。 抗原0.5μg/mL时PI值较大，阴性对照OD450nm值在0.8～1.2范围内，实验的灵敏度 较高，所以确定抗原的最佳包被量为0.5μg/mL，DEV阳性血清参考品工作浓度为1:40 (图15和表6)；固定包被抗原和阳性血清浓度，计算不同稀释倍数下MAb1E8检 测阳性血清的PI值，PI值随MAb1E8稀释倍数的增大而减小，当稀释2000倍时， PI值较大，与稀释1000倍时几乎相同，且相比稀释1000倍更加节约抗体，在此基础 上确定MAb1E8工作浓度为1：2000(图15)。
表6包被gB蛋白和DEV标准阳性抗血清工作浓度优化
Figure BDA0002146190530000181
3.2gB蛋白包被条件的优化
以0.5μg/mL gB蛋白包板，从4种不同的包被时间和温度中，选取PI值较大且 费时较少的条件为最佳包被条件，因此，确定gB蛋白包被条件为4℃孵育12h(图 16)。
3.3封闭液种类的选择
测验4种不同封闭液的封闭效果，从中选择效果最好的材料，结果显示5％skimmilk封闭效果较好，且从原料成本考虑其较为经济实惠，因此，选择5％skim milk 作为阻断ELISA的封闭液。
3.4被检样品孵育条件的优化
设置3种不同的条件，从中选择效果最佳的条件作为被检样品孵育条件，结果显示被检样品室温(25℃)孵育2h条件下PI值较大，因此，确定被检样品孵育条件为 室温孵育2h。
3.5MAb孵育时间的优化
设置4种不同的时间，从中选择效果最佳的MAb孵育时间，结果显示，MAb 37℃ 孵育1h，PI值较大，因此，确定MAb孵育时间1h。
3.6山羊抗小鼠IgG-HRP孵育时间的优化
设置3种不同的时间，从中选择效果最佳的山羊抗小鼠IgG-HRP孵育时间，结 果显示，山羊抗小鼠IgG-HRP抗体37℃孵育45min，PI值较大，因此，确定其孵育 时间为45min。
3.7显色时间的优化
设置4种不同的时间，从中选择效果最佳的显色时间，结果显示37℃显色15min 后显色效果几乎不再随时间变化，因此，确定显色时间为15min。
综上，通过最佳工作浓度的确定和反应条件的优化，确立最佳操作流程如下：
(1)用包被液稀释纯化gB蛋白至0.5μg/mL，每孔100μL，4℃包被12h；洗涤 液清洗酶标板3次，拍干。
(2)每孔加300μL的5％skim milk，37℃封闭2h，洗板3次。
(3)加入低速离心除去杂质的被检样品，室温作用2h，同时设置阴阳性血清对 照(1：40)，每孔100μL，洗板3次。
(4)加入MAb(1：2000)于37℃作用1h，每孔100μL，洗板3次。
(5)加入山羊抗小鼠-HRP(1：10000)，每孔100μL，37℃作用0.75h，洗板3 次。
(6)加入TMB，每孔100μL，避光显色15min；终止反应，每孔50μL终止液； 15min内读板。
3.8判定标准的确立
用建立的方法测定364份阴性鸭血清样品，130份阳性鸭血清样品，以一份SPF 鸭血清作为阴性对照。SPSS绘制阴阳性样品PI值统计数据的ROC曲线，可以看出 临界值为30％时本方法敏感性和特异性均较高(表7)。因此，该方法的临界值应取 30％，即待检样品PI≥30％判为阳性，否则判为阴性。
表7阴性样品PI的统计结果
Figure BDA0002146190530000191
Figure BDA0002146190530000201
进一步绘制494份阴阳性血清样品PI值统计结果的散点分布图(图17)，结果 显示绝大多数阴性样品PI分布于30％以下，阳性样品分布于30％以上。本试验的主 要目的是建立用于淘汰抗体阳性个体的检测方法，从结果中可以看出，以30％为临 界值可以保证群体水平上较高的阴性率。
3.9特异性试验结果
以建立的ELISA方法同步检测抗AIV、NDV、EDSV、DTMUV、GPV和DHV-1 的标准血清，以抗DEV阳性血清参考品为阳性对照，一份SPF鸭血清作为阴性对照， 结果显示该方法特异地针对DEV抗体(图18)。
3.10敏感性试验结果
以建立的ELISA方法检测DEV阳性血清参考品，从10倍开始稀释阳性血清， 最大稀释倍数为1280倍，检验该方法的敏感性。计算不同稀释倍数下阳性血清的PI 值，PI值随血清稀释倍数的增大而减小，当血清稀释80倍时，检测结果为阳性，当 血清稀释160倍时，检测结果为阴性，该方法可检测到血清的最大稀释倍数为1：80 (图19)。
3.11重复性试验结果
分别取同一批次的4块板和不同批次的3块板，用建立的方法检测7份阳性血清 样品，测定同一样品在相同批次和不同批次下的PI值，计算结果显示批间和批内变 异系数均小于10％，其中批内最大差异6.88％，批间最大差异8.62％(表8、9)。
表8批内差异检测结果
Figure BDA0002146190530000202
表9批间差异检测结果
Figure BDA0002146190530000211
3.12符合率试验结果
商品化试剂盒采用的检测方法为间接ELISA，同时用该试剂盒和本研究建立的阻断ELISA方法对41份阳性样品和53份阴性样品进行检测。对94份样品的检测结果 显示总符合率为84.04％，阳性符合率为82.5％，阴性符合率为85.19％。
3.13临床样品检测结果
共4个采样地点，采集4批样品，共937份临床样品。结果显示山东种鸭阳性率23％，山东商品鸭阳性率1.25％，松原商品鸭和鹅未检测出抗体阳性个体(表10)。 从检测结果来看，样品抗体总阳性率不超过20％，种鸭的抗体阳性率明显高于商品 鸭。
表10临床样品的检测结果
Figure BDA0002146190530000212
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120> DEV gB蛋白单抗以及检测DEV抗体的阻断ELISA试剂盒
<130> HLJ-2001-190409A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Duckenteritis virus
<400> 1
Arg Met Leu Gly Asp Val Leu Ala Val Ser Ser Cys
1               5                   10

Claims (10)

1.一种分泌鸭病毒性肠炎病毒gB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏编号是CGMCC No.17996。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备诊断或防治鸭病毒性肠炎病毒试剂或药物中的用途。
4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备诊断或防治鸭病毒性肠炎病毒的试剂或药物中的用途。
5.权利要求2所述的单克隆抗体所识别的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。
6.权利要求5所述的抗原表位肽在制备诊断或防治鸭病毒性肠炎病毒的试剂或药物中的用途。
7.一种检测DEV抗体的阻断ELISA检测试剂盒，包括：DEV gB蛋白，包被液，一抗、酶标二抗，缓冲液，稀释液，洗涤液，封闭液，终止液、阳性血清对照和阴性血清对照；其特征在于，所述的一抗是权利要求2所述的单克隆抗体。
8.按照权利要求7所述的阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG。
9.按照权利要求7所述的阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液。
10.按照权利要求7所述的阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述包被液为0.05mol/L的pH＝9.6的碳酸盐缓冲液。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2010119112A1 (en) * 2009-04-15 2010-10-21 Ceva Sante Animale Recombinant avian herpes virus vectors and vaccine for immunizing waterfowl species
CN102174104A (zh) * 2011-01-25 2011-09-07 四川农业大学 鸭瘟病毒囊膜gI蛋白多克隆抗体及其制备方法与应用

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"鸭肠炎病毒囊膜蛋白gB和gC主要抗原域的原核表达和单克隆抗体的研制";董广阔;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20130715(第7期);参见第2.1.1-2.3.3节、第3.3.4节 *
鸭瘟病毒gB蛋白单克隆抗体的制备;赵丹丹等;《西北农林科技大学学报(自然科学版)》;20160907;第44卷(第10期);第7-11页 *
鸭瘟病毒单抗的制备及胶体金试纸条检测方法的建立;赵丹丹等;《中国农业科学》;20161231;第49卷(第14期);第2796-2804页 *

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