CN102636641A - 胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒及其制备工艺 - Google Patents
胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒及其制备工艺 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102636641A CN102636641A CN2012100826012A CN201210082601A CN102636641A CN 102636641 A CN102636641 A CN 102636641A CN 2012100826012 A CN2012100826012 A CN 2012100826012A CN 201210082601 A CN201210082601 A CN 201210082601A CN 102636641 A CN102636641 A CN 102636641A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- helicobacter pylori
- latex
- preparation
- stomach helicobacter
- polyester film
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及乳胶法免疫层析领域,具体公开了一种胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒,包括试剂条,所述试剂条包括衬底、滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸,所述滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上,所述致敏乳胶聚酯膜上包被有彩色乳胶颗粒标记的抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体Ⅰ,免疫硝酸纤维素膜上设有包被了抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体Ⅱ的检测线和包被了羊抗兔IgG的质控线。本发明的胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒反应灵敏,检测方便、检测结果稳定,节约成本。
Description
技术领域
本发明涉及免疫层析技术领域,具体涉及一种胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒及其制备工艺。
背景技术
胃幽门螺旋杆菌Helicobacter Pylori(简称HP)是人体胃粘膜内的一种螺旋状革兰氏阴性细菌。这种细菌是导致慢性胃炎、胃溃疡以及十二指肠溃疡甚至胃癌的元凶。一般认为胃幽门螺旋杆菌感染的临床过程是这样的:胃幽门螺旋杆菌经口到达胃粘膜后定居感染,经数周或数月引发慢性、浅表性胃炎,数年或数十年后发展成为十二指肠溃疡、胃溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤、慢性萎缩性胃炎等,而后者是导致胃癌最危险的因素。专家们认为,胃幽门螺旋杆菌感染使患胃癌的危险增加了2.7-12倍,如果没有幽门螺旋杆菌感染,至少有35%-89%的胃癌不会发生。
尿素酶是一种催化尿素水解成氨和碳酸的镍离子依赖性酶,为幽门螺杆菌中表达量最丰富的蛋白质,占HP总蛋白的5-10%,尿素酶通过中和胃酸帮助细菌在胃内的定居并为细菌蛋白质合成提供氨,对HP在胃内的寄生和致病都起重要作用。尿素酶分子量为550KD左右,其单体由A、B两个亚单位组成,A、B两个亚单位的分子量分别为30KD和66KD左右;其中尿素酶B亚基是尿素酶活性亚单位,在各HP菌株中具有很好的保守性,被公认为HP疫苗的理想抗原;针对尿素酶A亚基的HP疫苗同样能取得良好的保护作用,因此,尿素酶A、B亚基都是HP抗体制备的理想抗原。
胃幽门螺旋杆菌在世界不同种族、不同地区的人群中均有感染,可以说是成年人中最广泛的慢性细菌性感染。感染率随年龄增加而上升,发展中国家约为80%,发达国家约为40%。我国20岁-40岁的感染率为45.4%-63.6%,70岁以上的感染率高达78.9%。因此,检测人血液中是否存在HP抗体对于诊断HP感染具有非常现实的临床意义。
目前检测HP的方法主要有:
(1)酶联免疫吸附试验和免疫印迹试验:通过检测血清中的HP抗体来确定人体中HP的存在,该种方法特异性高,且能进行定量分析,但是不能鉴别既往感染及现疫病人。
(2)尿素呼气试验和PCR检测试验:通过测定HP在体内产生的尿素酶的代谢物或基因的方法来确定HP的存在,该种方法灵敏度高,但操作复杂、设备昂贵,不适于基层检测工作,推广使用有局限性。
(3)细菌培养及其他病理学检测法等,这些方法也普遍具有灵敏度高、特异性强的优点,但也存在培养及病理学方法的检测条件要求严格、操作复杂、需要专业人员操作的局限性。
所以,目前急需一种快速、准确、灵敏度高、不需要任何大型设备就能检测HP的方法,该种方法的建立有利于胃幽门螺旋杆菌检测在基层的普及与推广应用,对胃幽门螺旋杆菌导致的慢性胃炎、胃溃疡以及十二指肠溃疡甚至胃癌的防治具有重大的临床意义。
乳胶层析法是以彩色乳胶为标记物的免疫层析法,其检测原理与胶体金免疫层析法相类似,它不需要仪器,直接用肉眼判读结果,具有操作简单、快速,试剂稳定性好,易保存,单人份独立包装,试剂损耗少等优点,适合临床患者、健康体检者等标本的快速筛查。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术缺陷,从提高检测灵敏度出发,提供一种检测灵敏度高、特异性强、检测快速的胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒。
本发明一方面公开了一种胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒,包括试剂条,所述试剂条包括衬底、滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸,所述滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上,所述致敏乳胶聚酯膜上包被有彩色乳胶颗粒标记的抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I,免疫硝酸纤维素膜上设有包被了抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体II的检测线和包被了羊抗兔IgG的质控线。
较优的,所述彩色乳胶颗粒为粒径280~310nm的聚苯乙烯颗粒。
较优的,所述彩色乳胶颗粒的颜色为红色。
较优的,所述抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I是以融合蛋白Ure-BA为抗原物质,免疫动物制备获得的多克隆抗体,所述融合蛋白Ure-BA序列见SEQ ID NO:5。
较优的,所述用于制备多克隆抗体的动物为家兔。
本发明致敏乳胶聚酯膜上标记有彩色乳胶颗粒的抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I为多克隆抗体,免疫硝酸纤维素膜检测线(T线)包被的抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体II为单克隆抗体。
概括的说,本发明抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I这一多抗的制备步骤包括:
1)PCR法分别克隆UreB138和UreA65基因,并通过重叠延伸PCR法制备Ure-BA融合基因;
2)构建含有步骤1)Ure-BA融合基因核苷酸序列的重组质粒;
3)用步骤2)中制备的重组质粒转化宿主细胞;
4)宿主细胞表达重组蛋白,经分离纯化后获得纯化的重组尿素酶抗原融合蛋白;
5)用步骤4)获得的重组尿素酶抗原融合蛋白免疫动物,制备抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶多克隆抗体。
本发明融合基因的制备,融合蛋白的生产、纯化,以及多克隆抗体的制备均可以参考现有技术。
为制备高效价和高特异性的多克隆抗体,必须制备理想的免疫原。本发明通过对尿素酶B亚基、A亚基的蛋白亲水性、抗原性和结构功能域等进行分析,将尿素酶B亚基中的一特定片段和尿素酶A亚基中的一特定片段经特定连接肽连接获得融合蛋白Ure-BA,该融合蛋白Ure-BA同时具有UreB和UreA的免疫原性和反应原性,采用该融合蛋白免疫动物产生的多克隆抗体,能够与胃幽门螺旋杆菌尿素酶发生特异性结合反应,亲和力强;进一步的,采用该融合蛋白产生的多克隆抗体制备的试剂条灵敏度高。所述融合蛋白Ure-BA序列见SEQ ID NO:5。
因此本发明的重组抗原选择蛋白分子的功能性片段替代全长蛋白分子,既可特异性地诱导宿主的免疫应答,又便于融合蛋白的成功制备。
本发明的另一方面,提供了一种胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
1)致敏乳胶颗粒的制备:用羧基化的聚苯乙烯标记抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I,获得致敏乳胶颗粒;
2)致敏乳胶聚酯膜的制备:用步骤1)获得的致敏乳胶颗粒包被聚酯膜,获得致敏乳胶聚酯膜;
3)将抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体II和羊抗兔抗体分别喷在硝酸纤维素膜检测线(T线)和质控线(C线)的位置上,烘干备用,制得免疫硝酸纤维素膜;
4)将滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC片上,切裁制得试剂条;
5)将试剂条装入塑料盒,获得胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒。
较优的,所述步骤1)致敏乳胶颗粒的制备为:
a.取一定体积的羧基化的聚苯乙烯,用2~3倍体积20mM pH 6.0的碳酸缓冲溶液多次冲洗、离心、弃上清,获得羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀;
b.用1~1.5倍体积20mM pH6.0的磷酸缓冲溶液悬浮上一步获得的羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀,并加入1~1.5倍体积的水溶性炭化二亚胺,室温下搅拌15~40分钟,最后用2~3倍体积0.01M pH 8.0的硼酸缓冲溶液多次冲洗、离心、弃上清,获得待标记物;
c.向步骤b获得的所述待标记物中加入2~3倍体积0.2M pH 7.0的硼酸缓冲液制成乳胶悬液,并向所述乳胶悬液中加入抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I;
d.充分反应过夜,加入终止剂终止反应,获得致敏乳胶颗粒。
在致敏乳胶颗粒的制备过程中,加入的水溶性炭化二亚胺、各缓冲溶液的体积均以初始所取的羧基化的聚苯乙烯的体积为基准,按本发明所述的体积倍数加入:如所取的羧基化的聚苯乙烯颗粒的体积为1ml,则需要加入的pH 6.0 20mM的磷酸缓冲溶液体积可以为1~1.5ml,pH 7.0 0.2M的硼酸缓冲液的体积为2~3ml。
更优的,所述步骤a中碳酸缓冲溶液为20mM pH 6.0含0.01%SDS的碳酸缓冲溶液。添加有SDS的碳酸缓冲溶液可以更好的洗去乳胶的表面活性物,清洗效果更好。
更优的,所述步骤a中羧基化的聚苯乙烯浓度为5~15w/v%。
更优的,所述步骤a中的离心条件为12000~14000rpm,离心10min。
更优的,所述步骤b中水溶性炭化二亚胺的浓度为8~12mg/ml。
更优的,所述步骤b中的离心条件为12000~14000rpm,离心10min。
更优的,所述步骤c中的抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I是以融合蛋白Ure-BA为抗原物质,免疫动物制备获得的多克隆抗体,所述融合蛋白Ure-BA序列见SEQ ID NO:5。
更优的,所述步骤c乳胶悬液中羧基化的聚苯乙烯颗粒偶联抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I的量为:0.5mg抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I/10mg聚苯乙烯颗粒。
更优的,所述步骤d中终止剂为50mM pH 8.2的Tris-HCl。
本发明中,v%指体积百分比;w/v%指重量体积百分比,如1w/v%即为100ml溶液中含1g物质。
较优的,所述步骤2)中致敏乳胶聚酯膜的制备具体步骤为:
A.用乳胶缓冲液稀释致敏乳胶颗粒,获得0.2~0.6w/v%的致敏乳胶溶液;
B.用步骤A制备好的致敏乳胶溶液喷涂聚酯膜,干燥,制得致敏乳胶聚酯膜。
更优的,所述步骤A中的乳胶缓冲液配方如下:8~12v%1.0M Tris液,0.2~0.4w/v%聚乙二醇20000,0.15~0.25w/v%牛血清白蛋白,0.1~0.3w/v%脱脂牛奶,0.25~0.35w/v%酪蛋白,和0.02~0.08w/v%叠氮化钠,用盐酸调节pH至8.0±0.05,余量为水。
最优的,所述步骤A中的乳胶缓冲液配方如下:10v%1.0M Tris液、0.3w/v%聚乙二醇20000、0.2w/v%牛血清白蛋白,0.2w/v%脱脂牛奶、0.3w/v%酪蛋白,和0.05w/v%叠氮化钠,用盐酸调节pH至8.0±0.05,余量为水。
更优的,步骤B中用致敏乳胶溶液喷涂聚酯膜,每261mm×220mm聚酯膜上喷涂1.28ml致敏乳胶溶液,干燥,制得致敏乳胶聚酯膜。
较优的,所述步骤3)中,喷在硝酸纤维素膜质控线(C线)上的羊抗兔IgG的浓度为1.0~2.0mg/ml,喷在硝酸纤维素膜检测线(T线)上的抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体II浓度为1.0~2.0mg/ml。
较优的,每50m长硝酸纤维素膜分别包被有6ml的羊抗兔IgG和6ml的抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体II溶液,检测线和质控线的间距为4.0~6.0mm。
本发明通过基因融合的方法制备了一种优质抗原,通过截取尿素酶B亚基和A亚基的特定片段并连接一段连接肽,制备获得胃幽门螺旋杆菌尿素酶融合蛋白。该融合蛋白具有较好的空间结构和较高的免疫原性和反应原性,将其作为抗原物质免疫动物能获得高效价、高特异性的抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶多克隆抗体;并且,本发明制备的胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒灵敏度高,特异性强,可检出血液样品中1ng/ml的尿素酶;此外本发明的试剂盒还具有操作简单,价格低,储存和运输方便等优点。
本发明胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒的使用方法:
1.样品的处理:用专用取样棒随机从病人粪便的不同部位取样,取样量以沾满专用取样棒前端的小圆环为准;准备一个样品处理管,竖直放于处理管支架上,并在样品管里加入0.6ml蒸馏水;将专用取样棒上取好的样品***样品管中的蒸馏水充分搅拌均匀,备用;建议处理好的样品及时检测,如不能立即检测处理好的样品可在2~8℃下储存48小时。
2.样品的检测:用吸管吸取样品液2-3滴加入到样品槽中,待检样品在毛细作用下向吸水纸端层析,依次通过聚酯膜、硝酸纤维素膜。到达聚酯膜后,被乳胶标记的多克隆抗体充分识别并结合,继续层析到硝酸纤维素膜上,与硝酸纤维素膜上包被的抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶单克隆抗体-II发生免疫反应,显现出相应的红色线条。
3.结果的判读:在滴加样品后8-15分钟判读结果。
阳性:在检测试剂条的检测线和质控线位置各出现一条红色线条,表示样品中有胃幽门螺旋杆菌尿素酶的存在。
阴性:只在质控线位置出现一条红色线条,表示样品中无胃幽门螺旋杆菌尿素酶的存在。
无效:质控线位置无红线出现,表示结果无效,应重试。
本发明的有益效果在于:本发明通过基因重组技术制备的融合蛋白作为抗原物质免疫动物,能够制备获得较高质量的多克隆抗体用于本发明的试剂盒,制备的胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒灵敏度高,特异性强,可检出血液样品中1ng/ml的尿素酶;此外本发明的试剂盒还具有操作简单,价格低,储存和运输方便等优点。
附图说明
图1:胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒试剂条示意图(1.滤样纸 2.致敏乳胶聚酯膜3.免疫硝酸纤维素膜 4.吸水纸 5.检测线 6.质控线)
具体实施方式
以下结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明,而非限制本发明的范围。
实施例1抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体的制备
1.抗原融合蛋白的设计
根据机体对胃幽门螺旋杆菌的免疫机制和胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗原表位的免疫性质,选择尿素酶UreB特定片段UreB138(UreB氨基酸序列GenBank:AAU21200.1)和UreA的特定片段UreA65(UreA氨基酸序列GenBank:AAK69750.1)用于Hp抗原融合蛋白的构建。UreB138和UreA65之间***有连接肽片段RWYCR,并且尿素酶UreB138片段融合在蛋白C端,UreA65片段融合在蛋白N端。
2.重组表达载体的构建
(1)引物合成
利用Primer Premier V5.0设计UreB138基因及UreA65基因的引物如下,P1的下划线部分为BamH I酶切位点,P1和P3部分包含有连接肽序列,P4的下划线部分为EcoRI酶切位点:
UreB138 上游引物P1:CGGATCCGGACACTTTGAATGAAGC
下游引物P2:CCTGCAGTACCACCTAAATTCTTTCTTG
UreA65 上游引物P3:AGGTGGTACTGCAGGTCACACTTCCATTTC
下游引物P4:GAATTCGTCATCGCTTTTAGCGCC
(2)PCR获得目的基因片段
以胃幽门螺旋杆菌的基因组DNA为模板,分别以引物P1和P2,P3和P4扩增UreB138和UreA65基因片段,于500μl微量离心管建立以下反应体系:
UreB138基因片段:
上游引物P1:CGGATCCGGACACTTTGAATGAAGC(SEQ ID NO:1)
下游引物P2:CCTGCAGTACCACCTAAATTCTTTCTTG(SEQ ID NO:2)
PCR扩增程序:94℃预变性5min;94℃30s,56℃30s,72℃1min,共30个循环;72℃延伸10min;4℃60min。
PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳,PCR产物的大小与预计的碱基对大小相符,将扩增出的DNA片段用胶回收试剂盒回收。
UreA65基因片段
上游引物P3:AGGTGGTACTGCAGGTCACACTTCCATTTC(SEQ ID NO:3)
下游引物P4:GAATTCGTCATCGCTTTTAGCGCC(SEQ ID NO:4)
PCR扩增程序:94℃预变性5min;94℃30s,56℃30s,72℃1min,共30个循环;72℃延伸10min;4℃60min。
PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳,PCR产物的大小与预计的碱基对大小相符,将扩增出的DNA片段用胶回收试剂盒回收。
Ure-BA融合基因片段
以P1和P4为引物,将前述步骤制备的UreB138和UreA65基因片段混合作为模板,进行重叠延伸PCR反应,扩增Ure-BA融合基因,PCR扩增体系和程序如下:
PCR扩增程序:94℃预变性5min;94℃30s,56℃30s,72℃2min,共30个循环;72℃延伸10min;4℃60min。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,PCR产物的大小与预计大小相符。
(3)重组质粒的构建
将回收获得的Ure-BA融合基因片段与pMD-19T连接,获得重组质粒pMU-BA,具体步骤如下:
1)使用质粒抽提试剂盒,按照试剂盒说明提取质粒DNA。
2)以常规琼脂糖凝胶电泳法分离质粒DNA,1.0%琼脂糖凝胶,1×TAE缓冲液,120-150mA,电泳20-40分钟。
3)连接反应:将回收的纯化产物(Ure-BA融合基因)用BamH I和EcoRI双酶切处理,与同样双酶切处理的的pMD-19T进行连接,连接反应体系如下,22℃连接反应16h。
3.表达融合蛋白的工程菌的构建
(1)感受态细胞的制备(CaCl2法)
平板划线法活化大肠杆菌E.coli DH 5α,37℃LB平板培养基培养12h,挑取平板上单个大肠杆菌菌落接种于100ml LB培养基中;37℃摇床培养12h,转速为300rpm,获得大肠杆菌种子液。
无菌条件下,将获得的大肠杆菌种子液以1%的比例接种于LB培养基中,37℃震荡培养3h,8000g离心5min收集菌体。向收集的菌体中加入预冷的5mL 0.1M CaCl2悬浮沉淀,冰水浴3h;4℃8000g离心5min,弃上清。加入100μL预冷的0.1M CaCl2重悬浮沉淀,冰水浴1h,备用。
用预冷的无菌吸头吸取100μL感受态菌液,加入连接产物,冰水浴45min,42℃水浴热休克90s,迅速放置冰水浴2min。加100μL LB培养基,37℃摇床培养1h。8000g离心5min,弃去100μL上清后,混匀沉淀并涂布含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板,37℃培养16h后,挑取单菌落后摇菌,质粒抽提试剂盒提取扩增后的重组质粒,并用BamH I和EcoRI双酶切处理,结果显示酶切片段大小与设计一致,初步证明重组质粒构建成功;进一步测序确认,回收片段含有SEQ ID NO:6所示的序列,测序结果正确,证实融合基因制备成功。
(2)高效表达融合蛋白重组菌的筛选
选择测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)(天根生化科技有限公司)接种于LB培养液中,37℃培养16h,培养结束后将重组菌按1%的比例转接于LB培养液中,37℃摇床培养3h,以终浓度为0.5mM的IPTG诱导5h,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达形式和表达量,筛选高效表达菌株用于融合蛋白的表达。实验结果显示,本发明重组融合蛋白表达率最高可达31%。
4.融合蛋白的表达及纯化
收集菌体,提取包涵体:细胞沉淀与预冷的超声破碎缓冲液以1∶10(w/v)比例悬浮,在冰浴中超声破碎菌体,超声功率为280W,超声3s,间隔3s,共进行40min。将破碎后的菌体溶液500g离心30min,弃沉淀;将上清液15000g离心40min,弃上清,收集沉淀。以1∶10(w/v)的比例分别用A液和B液洗涤沉淀两次,每次洗涤条件为:4℃搅拌20min,15000g离心40min,收集沉淀;将沉淀用包涵体溶解液以1∶10(w/v)的比例混匀,4℃搅拌3h,15000g离心50min,取上清。
超声破碎缓冲液:50mmol/L NaH2PO4,300mmol/L NaCl,pH8.0;A液:5mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、1%Triton X-100,pH8.0;B液:20mmol/L Tris、2mol/L尿素,pH8.0;包涵体溶解液:20mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,2mol/L尿素,pH8.0。
金属离子螯合层析:选择亲和层析柱Chelating separose进行纯化,亲和纯化填料为Chelating Sepharose HP,采用20mmol/L Tris,5mmol/L EDTA,pH8.0对目的蛋白进行纯化,采用咪唑梯度洗脱。
阴离子柱纯化:选择阴离子柱HiTrap Q进行纯化,阴离子纯化填料为Q Sepharose FF使用20mmol/L Tris,5mmol/L EDTA,pH8.0对目的蛋白进行纯化,采用NaCl梯度洗脱。
Superdex凝胶过滤层析脱盐:对上一步获得的目标蛋白进行葡萄糖PEG透析袋内浓缩后,用凝胶过滤柱Superdex过滤脱盐,除去尿素和咪唑,凝胶过滤层析柱为Superdex 200。
纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE,鉴定其纯度大于95%,结果表明,本发明构建的融合蛋白重组菌可以高效表达融合的胃幽门螺旋杆菌尿素酶蛋白。
5.胃幽门螺旋杆菌尿素酶多克隆抗体的制备
用本实施例制备的纯化的融合蛋白Ure-BA作为免疫抗原对家兔进行免疫,首次注射150μg纯化的胃幽门螺旋杆菌尿素酶融合蛋白,随后每两周注射200μg纯化的胃幽门螺旋杆菌尿素酶融合蛋白,共注射3次进行免疫。
免疫结束后取血清,3000rpm离心15分钟后得到抗血清;纯化抗血清:使用GEHealthcare公司的Hitrap Protein A HP亲和纯化柱,先用10倍柱床体积的结合液平衡该柱,结合液成分为20mM Na3PO4,pH为7.0,经提取的抗血清通过该柱,再用5倍柱床体积的结合液冲洗该柱,然后用5倍柱床体积的洗脱液洗脱,洗脱液成分为0.1M Na3C6H5O7,pH为3.0,通过UV(254nm)检测收集洗脱峰。抗血清经过Hitrap Protein A HP亲和纯化柱纯化后得到的产物已将高丰度的血清白蛋白有效的去除,获得高纯度的胃幽门螺旋杆菌尿素酶多克隆抗体,即为抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I。
实施例2胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒的制备
一、试剂来源:
羊抗兔IgG多克隆抗体、抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体II(购自MAXMEDLABORATORIES INC.)
硝酸纤维素薄膜、聚酯膜、聚苯乙烯颗粒(购自德国赛多利斯公司SARTORIUS)聚苯乙烯颗粒(购自WHATMAN公司)
二、制备步骤:
方法1:
1.致敏乳胶颗粒的制备:
a.取0.4ml 10%羧基化的聚苯乙烯乳胶放入离心管中,加入1ml pH 6.0含0.01%SDS 20mM的碳酸缓冲液冲洗两次,14000g/min离心10min,弃上清,获得羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀。
b.用0.5ml pH 6.0 20mM的磷酸缓冲溶液悬浮上一步获得的羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀,并加入0.5ml 10%水溶性炭化二亚胺,室温下搅拌30分钟,最后用0.8ml 0.01M pH 8.0的硼酸缓冲溶液冲洗三次、离心、弃上清,获得待标记物。
c.向步骤b获得的待标记物中加入1ml 0.2M pH 7.0的硼酸缓冲液制成乳胶悬液,并向该乳胶悬液中加入2mg抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I。
d.充分反应12小时后,加入50mM pH8.2的Tris-HCl作为终止剂终止反应,获得致敏乳胶颗粒。
2.致敏乳胶聚酯膜的制备:
(1)乳胶缓冲液的制备:取800ml纯化水,往里加入100ml 1.0M Tris液,准确称取3.0g聚乙二醇20000、2.0g牛血清白蛋白,2.0g脱脂牛奶,3.0g酪蛋白溶液和0.5g叠氮化钠加入溶液中,充分溶解,混合均匀,用盐酸调节pH至8.0,加纯化水至总体积1000ml。
(2)用上一步的乳胶缓冲液稀释致敏乳胶颗粒,获得0.4w/v%的致敏乳胶溶液。
(3)取1.28ml致敏乳胶溶液用点乳胶机喷点在预处理后的聚酯膜上,置于37℃的温度下烘干2小时,密封4-30℃下避光保存,制得致敏乳胶聚酯膜。
3.免疫硝酸纤维素膜的制备:
将2.0mg/ml羊抗兔抗体和1.5mg/ml抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体II分别喷在硝酸纤维素膜质控线和检测线的位置上,37℃下烘干2小时,密封4-30℃下避光保存,制得免疫硝酸纤维素膜。每50m长硝酸纤维素膜分别包被有6ml的羊抗兔IgG和抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体II溶液,检测线和质控线的间距为5mm。
4.将滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC片上,切裁制得试剂条;将试剂条装入塑料盒制得检测试剂盒,获得胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒。(如图1所示)。
本发明设计的胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒的阈值为1ng/ml。
方法2:
1.致敏乳胶颗粒的制备:
a.取1ml 5%羧基化的聚苯乙烯乳胶放入离心管中,加入2ml pH 6.0碳酸缓冲液冲洗三次,12000g/min离心10min,弃上清,获得羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀。
b.用1.5ml pH 6.020mM的磷酸缓冲溶液悬浮上一步获得的羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀,并加入1.5ml%水溶性炭化二亚胺,室温下搅拌40分钟,最后用3ml 0.01M pH 8.0的硼酸缓冲溶液冲洗三次、离心、弃上清,获得待标记物。
c.向步骤b获得的待标记物中加入2ml pH 7.0 0.2M的硼酸缓冲液制成乳胶悬液,并向该乳胶悬液中加入2.5mg抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I。
d.充分反应过夜后,加入终止剂终止反应,获得致敏乳胶颗粒。
2.致敏乳胶聚酯膜的制备:
(1)乳胶缓冲液的制备:取800ml纯化水,往里加入80ml 1.0M Tris液,准确称取4.0g聚乙二醇20000、2.5g牛血清白蛋白,1.0g脱脂牛奶,3.5g酪蛋白溶液和0.2g叠氮化钠加入溶液中,充分溶解,混合均匀,用盐酸调节pH至8.0,加纯化水至总体积1000ml。
(2)用上一步的乳胶缓冲液稀释致敏乳胶颗粒,获得0.2w/v%的致敏乳胶溶液。
(3)取1.28ml致敏乳胶溶液用点乳胶机喷点在预处理后的聚酯膜上,置于37℃的温度下烘干2小时,密封4-30℃下避光保存,制得致敏乳胶聚酯膜。
3.免疫硝酸纤维素膜的制备:
将1.5mg/ml羊抗兔抗体和2.0mg/ml抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体II分别喷在硝酸纤维素膜质控线和检测线的位置上,37℃下烘干2小时,密封4-30℃下避光保存,制得免疫硝酸纤维素膜。每50m长硝酸纤维素膜分别包被有6ml的羊抗兔IgG和抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体II溶液,检测线和质控线的间距为5mm。
4.同方法1。
本发明设计的胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒的阈值为1ng/ml。
方法3:
1.致敏乳胶颗粒的制备:
a.取0.5ml 15%羧基化的聚苯乙烯乳胶放入离心管中,加入1.5ml pH 6.0含0.01%SDS20mM的碳酸缓冲液冲洗两次,13000g/min离心10min,弃上清,获得羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀。
b.用0.5ml pH 6.0 20mM的磷酸缓冲溶液悬浮上一步获得的羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀,并加入0.5ml%水溶性炭化二亚胺,室温下搅拌15分钟,最后用1.5ml 0.01M pH8.0的硼酸缓冲溶液冲洗两次、离心、弃上清,获得待标记物。
c.向步骤b获得的待标记物中加入1.5ml pH 7.0 0.2M的硼酸缓冲液制成乳胶悬液,并向该乳胶悬液中加入3.75mg抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I。
d.充分反应过夜后,加入终止剂终止反应,获得致敏乳胶颗粒。
2.致敏乳胶聚酯膜的制备:
(1)乳胶缓冲液的制备:取800ml纯化水,往里加入120ml 1.0M Tris液,准确称取2.0g聚乙二醇20000、1.5g牛血清白蛋白,3.0g脱脂牛奶,2.5g酪蛋白溶液和0.8g叠氮化钠加入溶液中,充分溶解,混合均匀,用盐酸调节pH至8.0,加纯化水至总体积1000ml。
(2)用上一步的乳胶缓冲液稀释致敏乳胶颗粒,获得0.6w/v%的致敏乳胶溶液。
(3)取1.28ml致敏乳胶溶液用点乳胶机喷点在预处理后的聚酯膜上,置于37℃的温度下烘干2小时,密封4-30℃下避光保存,制得致敏乳胶聚酯膜。
3.免疫硝酸纤维素膜的制备:
将1.0mg/ml羊抗兔抗体和1.0mg/ml抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体II分别喷在硝酸纤维素膜质控线和检测线的位置上,37℃下烘干2小时,密封4-30℃下避光保存,制得免疫硝酸纤维素膜。每50m长硝酸纤维素膜分别包被有6ml的羊抗兔IgG和抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体II溶液,检测线和质控线的间距为4mm。
4.同方法1。
本发明设计的胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒的阈值为1ng/ml。
实施例3胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒的特异性实验
检测方法:
1.取实施例2制备的胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒,将试剂盒放置在水平台面上。
2.待测样品的制备:按表1的四类实验对象,用专用取样棒随机从检测者粪便的不同部位取样,取样量以沾满专用取样棒前端的小圆环为准;准备一个样品处理管,竖直放于处理管支架上,并在样品管里加入0.6ml蒸馏水;将专用取样棒上取好的样品***样品管中的蒸馏水充分搅拌均匀作为待测样品。
3.每类实验对象为100人,检测结果如表1:
表1胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒特异性试验结果
由上表可知,本发明的胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒对大肠杆菌及痢疾杆菌均无交叉反应,特异性良好。
实施例4胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒的灵敏度实验
检测方法:
1、取实施例2制得的胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒,将试剂盒放置在水平台面上。
2、检测样品:配置胃幽门螺旋杆菌尿素酶浓度为0.6ng/ml、0.8ng/ml、1.0ng/ml、1.2ng/ml、1.4ng/ml的质控参考品作为标准品。
3、观察结果:用吸管吸取样品液2-3滴加入到样品槽中,在滴加样品后8-15分钟判读结果。
表2试剂盒灵敏度结果
表1结果证实,本发明制得的胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒灵敏度为1ng/ml,符合检测要求。
实施例5胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒的重复性和稳定性实验
一、试剂盒的批内和批间重复性实验
1.实验方法:
将同批和不同批次的胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒分别检测0.8ng/ml、1.0ng/ml、1.2ng/ml、1.4ng/ml的胃幽门螺旋杆菌尿素酶标准品,每个浓度重复5次,观察试剂盒的重复性。
2.实验结果:经验证,胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒的批内和批间重复性为100%,假阳性率和假阴性率均为0。
二、试剂盒的稳定性实验
1.实验目的:
将胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒密封保存,并存放于4℃及室温(25℃左右)下,观察不同存放温度对试剂盒稳定性的影响。
2.实验方法:
保存于4℃的试剂盒每周取出4盒,分别检测0.8ng/ml、1.0ng/ml、1.2ng/ml、1.4ng/ml的胃幽门螺旋杆菌尿素酶标准品;保存于室温(25℃)的试剂盒每3天取出4盒,分别检测0.8ng/ml、1.0ng/ml、1.2ng/ml、1.4ng/ml的胃幽门螺旋杆菌尿素酶标准品。
3.实验结果:
经验证,试纸盒在4℃下可保存24个月,在室温下可保存18个月;在可保存的期限内,试剂盒均可达到1.0ng/ml的检测灵敏度。
实施例6胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒的临床试验
通过专用取样棒对病人粪便进行取样,共采集302份病人的粪便样本,其中171份为感染了胃幽门螺旋杆菌的样本,131份为正常人的粪便样本,使用本发明的胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒分别对样本进行检测。分别在试剂盒加样孔滴加2-3滴尿样,滴加样品后8-15分钟判读结果。结果显示166份患者的粪便样本呈阳性,131份正常人的检测结果全部为阴性,未出现无显色的试剂盒。
以尿素呼气试验的检测结果为参照对临床试验结果进行统计,统计数据见表3:
表3临床试验结果汇总表
尿素呼气试实验检测试剂为参照,本发明的胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒的临床试验结果如下:
灵敏度=166/(166+5)×100%=97.1%
特异度=131/131×100%=100%
阳性试验的预示值=166/166×100%=100%
阴性试验的预示值=131/(131+5)×100%=96.3%
符合率(粗一致性)=(166+126)/(166+5+5+126)%=96.7%
在已考察的302份样品中,灵敏度为为97.1%,特异度为100%,阳性试验预示值100%,阴性试验预示值96.3%,符合率为96.7%。
由此可见,依据本发明制备的“胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒”和现有成熟的胃幽门螺旋杆菌检测技术在灵敏度、特异性方面具有很好的一致性,其操作简单,检测迅速,适合于医疗机构或个人用于诊断是否感染胃幽门螺旋杆菌。
Claims (12)
1.一种胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒,包括试剂条,所述试剂条包括衬底、滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸,所述滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上,其特征在于,所述致敏乳胶聚酯膜上包被有彩色乳胶颗粒标记的抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I,免疫硝酸纤维素膜上设有包被了抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体II的检测线和包被了羊抗兔IgG的质控线。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述彩色乳胶颗粒为粒径280~310nm的聚苯乙烯颗粒。
3.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I是以融合蛋白Ure-BA为抗原物质,免疫动物制备获得的多克隆抗体,所述融合蛋白Ure-BA序列见SEQ ID NO:5。
4.权利要求1-3任一权利要求所述的胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
1)致敏乳胶颗粒的制备:用羧基化的聚苯乙烯标记抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I,获得致敏乳胶颗粒;
2)致敏乳胶聚酯膜的制备:用步骤1)获得的致敏乳胶颗粒包被聚酯膜,获得致敏乳胶聚酯膜;
3)将抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体II和羊抗兔抗体分别喷在硝酸纤维素膜检测线和质控线的位置上,烘干备用,制得免疫硝酸纤维素膜;
4)将滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC片上,切裁制得试剂条;
5)将试剂条装入塑料盒,获得胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒。
5.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述步骤1)致敏乳胶颗粒的制备为:
a.取一定体积的羧基化的聚苯乙烯,用2~3倍体积20mM pH 6.0的碳酸缓冲溶液多次冲洗、离心、弃上清,获得羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀;
b.用1~1.5倍体积20mM pH6.0的磷酸缓冲溶液悬浮上一步获得的羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀,并加入1~1.5倍体积的水溶性炭化二亚胺,室温下搅拌15~40分钟,最后用2~3倍体积0.01M pH 8.0的硼酸缓冲溶液多次冲洗、离心、弃上清,获得待标记物;
c.向步骤b获得的所述待标记物中加入2~3倍体积0.2M pH 7.0的硼酸缓冲液制成乳胶悬液,并向所述乳胶悬液中加入抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I;
d.充分反应过夜,加入终止剂终止反应,获得致敏乳胶颗粒。
6.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述步骤a中碳酸缓冲溶液为20mM pH 6.0含0.01%SDS的碳酸缓冲溶液。
7.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述步骤a中羧基化的聚苯乙烯浓度为5~15w/v%,所述步骤b中水溶性炭化二亚胺的浓度为8~12mg/ml。
8.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述步骤c中的抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I是以融合蛋白Ure-BA为抗原物质,免疫动物制备获得的多克隆抗体,所述融合蛋白Ure-BA序列见SEQ ID NO:5。
9.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述步骤c乳胶悬液中羧基化的聚苯乙烯颗粒偶联抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I的量为:0.5mg抗胃幽门螺旋杆菌尿素酶抗体I/10mg聚苯乙烯颗粒。
10.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述步骤2)中致敏乳胶聚酯膜的制备具体步骤为:
A.用乳胶缓冲液稀释致敏乳胶颗粒,获得0.2~0.6w/v%的致敏乳胶溶液;
B.用步骤A制备好的致敏乳胶溶液喷涂聚酯膜,干燥,制得致敏乳胶聚酯膜。
11.如权利要求10所述的制备方法,其特征在于,所述步骤A中的乳胶缓冲液配方如下:8~12v% 1.0M Tris液,0.2~0.4w/v%聚乙二醇20000,0.15~0.25w/v%牛血清白蛋白,0.1~0.3w/v%脱脂牛奶,0.25~0.35w/v%酪蛋白,和0.02~0.08w/v%叠氮化钠,用盐酸调节pH至8.0±0.05,余量为水。
12.权利要求1-3任一权利要求所述的试剂盒在制备胃幽门螺旋杆菌检测试剂中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210082601.2A CN102636641B (zh) | 2012-03-26 | 2012-03-26 | 胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒及其制备工艺 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210082601.2A CN102636641B (zh) | 2012-03-26 | 2012-03-26 | 胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒及其制备工艺 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102636641A true CN102636641A (zh) | 2012-08-15 |
CN102636641B CN102636641B (zh) | 2014-06-25 |
Family
ID=46621110
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210082601.2A Active CN102636641B (zh) | 2012-03-26 | 2012-03-26 | 胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒及其制备工艺 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102636641B (zh) |
Cited By (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103529203A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-01-22 | 北京华卫博沃生物科技有限公司 | 检测结核分枝杆菌的方法及量子点标记免疫层析试纸及其制备方法 |
CN103529217A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-01-22 | 北京华卫博沃生物科技有限公司 | 检测脊髓灰质炎病毒的方法及量子点标记免疫层析试纸及其制备方法 |
CN103529215A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-01-22 | 北京华卫博沃生物科技有限公司 | 检测麻疹病毒的方法及量子点标记免疫层析试纸及其制备方法 |
CN103543267A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-01-29 | 北京华卫博沃生物科技有限公司 | 检测甲型肝炎病毒的方法及量子点标记免疫层析试纸及其制备方法 |
CN104931700A (zh) * | 2015-06-01 | 2015-09-23 | 上海凯创生物技术有限公司 | 沙门氏菌乳胶法检测试剂盒 |
CN106290848A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 一种脑膜炎菌乳胶法检测试剂盒 |
CN106290838A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 一种登革热病毒IgG/IgM抗体乳胶法检测试剂盒 |
CN106290839A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒 |
CN106290835A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 一种军团菌抗原乳胶法检测试剂盒 |
CN106290837A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 一种军团菌抗体乳胶法检测试剂盒 |
CN106290840A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 间日疟原虫乳胶法检测试剂盒 |
CN106290850A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 霍乱弧菌o139乳胶法检测试剂盒 |
CN106290841A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 霍乱弧菌o1乳胶法检测试剂盒 |
CN106290843A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 伤寒杆菌乳胶法检测试剂盒 |
CN106290847A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 一种登革热病毒ns1抗原乳胶法检测试剂盒 |
CN106290855A (zh) * | 2015-06-01 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 一种幽门螺旋杆菌抗原近红外荧光检测试剂盒及其用途 |
CN107271666A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-10-20 | 广东顺德工业设计研究院(广东顺德创新设计研究院) | 检测***中***特异性抗原的试纸条及其制备方法和应用 |
CN109342722A (zh) * | 2018-09-30 | 2019-02-15 | 深圳市鸿美诊断技术有限公司 | 一种用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法 |
CN110530858A (zh) * | 2019-08-24 | 2019-12-03 | 谱尼测试集团北京科学技术研究院有限公司 | 一种餐具幽门螺旋杆菌快速检测方法 |
CN110618270A (zh) * | 2019-09-10 | 2019-12-27 | 深圳市鸿美诊断技术有限公司 | 一种用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法 |
CN116254103A (zh) * | 2021-12-01 | 2023-06-13 | 上海凯创生物技术有限公司 | 纳米荧光标记微球、pgⅰ/pgⅱ单克隆抗体探针以及pgⅰ/pgⅱ检测试剂盒 |
Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5542419A (en) * | 1994-02-28 | 1996-08-06 | Boston University | Noninvasive method to detect gastric Helicobacter pylori |
WO2000008204A2 (en) * | 1998-07-31 | 2000-02-17 | Byk Gulden Lomberg Chemische Fabrik Gmbh | Process for identification of substances modulating urei dependent mechanisms of helicobacter pylori metabolism |
US20020037341A1 (en) * | 1999-02-08 | 2002-03-28 | Heo Cheol Seong | Food containing active strains for inhibiting infection and treating gastritis, gastric and duodenal ulcers |
CN1887349A (zh) * | 2006-07-20 | 2007-01-03 | 中国人民解放军第三军医大学 | 基于尿素酶b亚单位活性片段的幽门螺杆菌疫苗及其制备方法 |
CN2864679Y (zh) * | 2005-07-15 | 2007-01-31 | 万积成 | 幽门螺旋杆菌检测试纸 |
CN101082623A (zh) * | 2007-07-12 | 2007-12-05 | 福建医科大学 | 幽门螺杆菌高毒力株检测试剂的制备 |
CN201053964Y (zh) * | 2007-05-21 | 2008-04-30 | 四川省迈克科技有限责任公司 | 疫苗保护性抗体快速检测试剂盒 |
CN101363848A (zh) * | 2008-09-24 | 2009-02-11 | 深圳市菲鹏生物股份有限公司 | 间接标记纳米颗粒的抗体检测双抗原夹心法及其试剂盒 |
CN101905018A (zh) * | 2010-04-06 | 2010-12-08 | 中国人民解放军第三军医大学 | 治疗和预防幽门螺杆菌感染的重组融合蛋白疫苗及减毒活菌载体疫苗 |
CN201756552U (zh) * | 2010-06-29 | 2011-03-09 | 陈隆玉 | 胃幽门螺杆菌快速反应装置 |
CN102297964A (zh) * | 2011-05-20 | 2011-12-28 | 广州万孚生物技术有限公司 | 一种三聚氰胺免疫层析检测试纸条 |
-
2012
- 2012-03-26 CN CN201210082601.2A patent/CN102636641B/zh active Active
Patent Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5542419A (en) * | 1994-02-28 | 1996-08-06 | Boston University | Noninvasive method to detect gastric Helicobacter pylori |
WO2000008204A2 (en) * | 1998-07-31 | 2000-02-17 | Byk Gulden Lomberg Chemische Fabrik Gmbh | Process for identification of substances modulating urei dependent mechanisms of helicobacter pylori metabolism |
US20020037341A1 (en) * | 1999-02-08 | 2002-03-28 | Heo Cheol Seong | Food containing active strains for inhibiting infection and treating gastritis, gastric and duodenal ulcers |
CN2864679Y (zh) * | 2005-07-15 | 2007-01-31 | 万积成 | 幽门螺旋杆菌检测试纸 |
CN1887349A (zh) * | 2006-07-20 | 2007-01-03 | 中国人民解放军第三军医大学 | 基于尿素酶b亚单位活性片段的幽门螺杆菌疫苗及其制备方法 |
CN201053964Y (zh) * | 2007-05-21 | 2008-04-30 | 四川省迈克科技有限责任公司 | 疫苗保护性抗体快速检测试剂盒 |
CN101082623A (zh) * | 2007-07-12 | 2007-12-05 | 福建医科大学 | 幽门螺杆菌高毒力株检测试剂的制备 |
CN101363848A (zh) * | 2008-09-24 | 2009-02-11 | 深圳市菲鹏生物股份有限公司 | 间接标记纳米颗粒的抗体检测双抗原夹心法及其试剂盒 |
CN101905018A (zh) * | 2010-04-06 | 2010-12-08 | 中国人民解放军第三军医大学 | 治疗和预防幽门螺杆菌感染的重组融合蛋白疫苗及减毒活菌载体疫苗 |
CN201756552U (zh) * | 2010-06-29 | 2011-03-09 | 陈隆玉 | 胃幽门螺杆菌快速反应装置 |
CN102297964A (zh) * | 2011-05-20 | 2011-12-28 | 广州万孚生物技术有限公司 | 一种三聚氰胺免疫层析检测试纸条 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
BRUCE E. DUNN ET AL: "Localization of Helicobacter pylori Urease and Heat Shock Protein in Human Gastric Biopsies", 《INFECTION AND IMMUNITY》 * |
周维英等: "幽门螺杆菌双亚单位表位融合蛋白的构建、表达及鉴定", 《免疫学杂志》 * |
张化涛等: "幽门螺旋杆菌IgG 抗体及现症感染条带(CIM)蛋白抗体联合检测在健康查体人群中的临床应用", 《中国实验诊断学》 * |
葛迪等: "幽门螺杆菌UreB414-OMPl8-LTB融合蛋白的构建及免疫原性初步研究", 《第三军医大学学报》 * |
Cited By (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103529203A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-01-22 | 北京华卫博沃生物科技有限公司 | 检测结核分枝杆菌的方法及量子点标记免疫层析试纸及其制备方法 |
CN103529217A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-01-22 | 北京华卫博沃生物科技有限公司 | 检测脊髓灰质炎病毒的方法及量子点标记免疫层析试纸及其制备方法 |
CN103529215A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-01-22 | 北京华卫博沃生物科技有限公司 | 检测麻疹病毒的方法及量子点标记免疫层析试纸及其制备方法 |
CN103543267A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-01-29 | 北京华卫博沃生物科技有限公司 | 检测甲型肝炎病毒的方法及量子点标记免疫层析试纸及其制备方法 |
CN106290841A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 霍乱弧菌o1乳胶法检测试剂盒 |
CN106290843A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 伤寒杆菌乳胶法检测试剂盒 |
CN106290838A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 一种登革热病毒IgG/IgM抗体乳胶法检测试剂盒 |
CN106290839A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒 |
CN106290835A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 一种军团菌抗原乳胶法检测试剂盒 |
CN106290837A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 一种军团菌抗体乳胶法检测试剂盒 |
CN106290840A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 间日疟原虫乳胶法检测试剂盒 |
CN106290850A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 霍乱弧菌o139乳胶法检测试剂盒 |
CN106290847A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 一种登革热病毒ns1抗原乳胶法检测试剂盒 |
CN106290848A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 一种脑膜炎菌乳胶法检测试剂盒 |
CN104931700A (zh) * | 2015-06-01 | 2015-09-23 | 上海凯创生物技术有限公司 | 沙门氏菌乳胶法检测试剂盒 |
CN106290855A (zh) * | 2015-06-01 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 一种幽门螺旋杆菌抗原近红外荧光检测试剂盒及其用途 |
CN104931700B (zh) * | 2015-06-01 | 2017-03-08 | 上海凯创生物技术有限公司 | 沙门氏菌乳胶法检测试剂盒 |
CN107271666A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-10-20 | 广东顺德工业设计研究院(广东顺德创新设计研究院) | 检测***中***特异性抗原的试纸条及其制备方法和应用 |
CN109342722A (zh) * | 2018-09-30 | 2019-02-15 | 深圳市鸿美诊断技术有限公司 | 一种用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法 |
CN110530858A (zh) * | 2019-08-24 | 2019-12-03 | 谱尼测试集团北京科学技术研究院有限公司 | 一种餐具幽门螺旋杆菌快速检测方法 |
CN110618270A (zh) * | 2019-09-10 | 2019-12-27 | 深圳市鸿美诊断技术有限公司 | 一种用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法 |
CN110618270B (zh) * | 2019-09-10 | 2020-08-25 | 深圳市鸿美诊断技术有限公司 | 一种用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法 |
CN116254103A (zh) * | 2021-12-01 | 2023-06-13 | 上海凯创生物技术有限公司 | 纳米荧光标记微球、pgⅰ/pgⅱ单克隆抗体探针以及pgⅰ/pgⅱ检测试剂盒 |
CN116254103B (zh) * | 2021-12-01 | 2024-05-24 | 上海凯创生物技术有限公司 | 纳米荧光标记微球、pgⅰ/pgⅱ单克隆抗体探针以及pgⅰ/pgⅱ检测试剂盒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102636641B (zh) | 2014-06-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102636641B (zh) | 胃幽门螺旋杆菌乳胶法检测试剂盒及其制备工艺 | |
Stoenner et al. | Antigenic variation of Borrelia hermsii. | |
CN104007261B (zh) | 禽三种呼吸道疾病三联快速检测试剂盒及应用 | |
CN102068690A (zh) | 多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗及其制备方法 | |
CN103333864B (zh) | 抗弓形虫mic3蛋白单克隆抗体及其应用 | |
Minor et al. | STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND STAPHYLOCOCCAL FOOD INTOXICATIONS. A REVIEW: II. ENTEROTOXINS AND EPIDEMIOLOGY. | |
CN108776229A (zh) | 一种甘蔗线条花叶病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒及制备与检测方法 | |
CN108066755A (zh) | 一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
ES2257741T3 (es) | Proteina lkp tip adhesin y acido nucleico de haemophilus influenzae no clasificables. | |
CN106955361A (zh) | 一种含有结核病***反应原ce的药物组合物 | |
CN102590503A (zh) | 一种猪细环病毒ⅱ型抗体间接阻断elisa检测试剂盒 | |
CN107596361A (zh) | 牛a型产气荚膜梭菌的亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
CN101833003A (zh) | 一种水泡性口炎病毒抗体胶体金检测试纸条及其制备方法 | |
CN103983780B (zh) | 检测鸽ⅰ型副粘病毒的胶体金免疫层析试纸条及制备方法 | |
CN113512098B (zh) | 鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接elisa方法及其应用 | |
EP0298991B1 (en) | Novel lectins derived from bacterial pili | |
AU607427B2 (en) | Method of preparation and use for feline leukemia virus antigens | |
CN101921337A (zh) | 间日疟原虫乳酸脱氢酶抗体、相关制备方法、杂交瘤细胞株和应用 | |
De Ree et al. | Monoclonal antibodies raised against Pap fimbriae recognize minor component (s) involved in receptor binding | |
CN111748042B (zh) | 一种含有内毒素的非洲猪瘟融合蛋白及其制备方法和应用 | |
CN104945513B (zh) | 变形链球菌细胞表面蛋白抗原(SpaP)和葡糖基转移酶(GtfB)融合蛋白疫苗及其制备方法 | |
CN112341525B (zh) | 一种重组非洲猪瘟病毒pE120R亚单位可溶性蛋白及其制备方法和应用 | |
CN101261273B (zh) | 检测早期乳腺癌的酶联免疫吸附试剂盒及其制备方法 | |
CN108484736A (zh) | 坦布苏病毒非结构蛋白ns2a截短蛋白的表达方法及其产品和应用 | |
CN104292310B (zh) | 鸭瘟病毒UL15基因exonI重组蛋白及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |