CN102559707A - 小反刍兽疫病毒h、f蛋白抗原表位基因片段及其表达、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段,将预测筛选的各抗原表位以柔性氨基酸片段连接,再加入一个外源通用辅助性T淋巴细胞表位PADRE,根据抗原表位氨基酸序列推导出核苷酸序列,在串联表位氨基酸序列的5′和3′端分别加入BamHI和Xho I酶切位点,并在末端加上TAA终止密码子,合成了长度为456bp的目的基因片段,同时提供了该基因片段的表达以及应用。本发明所述的小反刍兽疫抗原表位疫苗安全、易于生产、便于储藏和使用,能广泛适用于基因工程领域。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段及其表达、应用。
背景技术
小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des PetitsRuminants Virus,PPRV)引起的一种严重危害山羊、绵羊等小反刍类动物的传染病,也称小反刍兽伪牛瘟,卡他、肺肠炎以及口肺肠炎综合症,山羊高度易感,发病率和病死率均较高。该病在世界上被认为是十分重要的烈性传染病之一,在我国该病也被列为一类动物传染病。1942年,小反刍兽疫在西非的科特迪瓦首次被报道,随后几年里,非洲的大部分国家都报道发生此病。近几年来,小反刍兽疫进一步蔓延,流行趋势日益严峻。在2007年7月和2010年5月,我国西藏阿里地区发生了该病,对我国动物卫生安全构成了严重威胁。
目前,世界上大多数国家防制PPR主要依赖于疫苗免疫接种。对于已发病的动物没有有效的治疗方法,耐过动物可获得主动免疫。PPRV与RPV在基因上的同源性很高,在过去一般都是采用RPV组织培养疫苗来对PPR进行防疫。
表位疫苗属于亚单位疫苗的一种,在设计表位疫苗时,由于表位片段短,表达产物分子量小,为***合适的免疫增强因子进行共表达提供了可能。最重要的是,表位疫苗不存在基因重组、整合的问题。H蛋白是PPRV上的一种糖蛋白,构成病毒表面的一种纤突。H蛋白刺激机体产生中和抗体,参与体液保护性免疫。Makoto Sugiyama等研究表明,是PPRV重要的结构蛋白,它主要包含两个中和性抗原表位区域I和II。F蛋白是PPRV病毒表面上的一种纤突,决定病毒能否成功感染,能够诱导产生细胞溶血素、细胞融合、启动病毒感染细胞等生物学活性。H、F蛋白都是PPRV主要的保护性抗原。
迄今为止,小反刍兽疫疫苗生产技术虽然几经革新,但是广泛使用的仍是弱毒苗,虽然DNA疫苗、重组疫苗等的优越性以及所取得的成就引起了广泛关注,但毕竟研究的历史较短,不够深入,在实际应用中不可避免的存在很多问题,如应用对象的安全性问题、免疫耐受性问题等,这些都是表位疫苗有待解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足,本发明提供一种小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段,设计并串联了F、H基因的10个B细胞抗原表位和一个通用T细胞表位,各表位之间以柔性甘氨酸间隔,并在原核***中进行表达,可用于小反刍兽疫病毒新型疫苗。
其技术方案为:
根据PPRV Nigeria 75/1毒株的F、H蛋白氨基酸序列在预测软件Bcepred预测结果,综合分析F、H蛋白蛋白的亲水性、可及性、beta转角等,最后预测出的F、H蛋白10条B细胞抗原表位氨基酸序列见表1所示。
表1
将预测筛选的各抗原表位以柔性氨基酸片段连接,再加入一个外源通用辅助性T淋巴细胞表位PADRE,根据抗原表位氨基酸序列推导出核苷酸序列,在串联表位氨基酸序列的5′和3′端分别加入BamH I和Xho I酶切位点,并在末端加上TAA终止密码子,合成了长度为456bp的目的基因片段,所述抗原表位氨基酸序列为(下划线部分为甘氨酸接头):
TKDVLTPLFKIGGGGGTGCLGRTGGGGDYRSCLLGGGGTVEKLYLSSHRGGGGSSYFYPV
RLNGGGGILAVQGVQDYGGGGTSCVFTPEGGGGPDKLLTVIGGGGYPDSVYLHEIDLGGG
GKSYVRSLGGGG AKFVAAWTLKAAA
所述推导出的核苷酸序列为(下划线部分分别为BamH I和Xho I酶切位点):
GGATCCATGACTAAGGATGTCTTAACTCCCCTGTTTAAAATCGGTGGTGGAGGTGGGAC
AGGCTGTCTCGGCAGGACAGGGGGCGGGGGTGACTATCGGAGCTGTCTTTTAGGCGGT
GGAGGAACGGTGGAGAAACTCTATTTATCCTCACATAGGGGAGGGGGTGGATCATCTTA
CTTCTACCCAGTCCGATTGAATGGCGGGGGCGGAATACTGGCGGTACAGGGCGTCCAA
GACTATGGGGGCGGTGGAACGTCATGCGTCTTCACTCCAGAGGGAGGTGGCGGGCCTG
ATAAACTACTAACTGTTATAGGTGGGGGTGGTTACCCAGATTCTGTATACCTACATGAAA
TAGACTTAGGGGGTGGGGGCAAGTCGTACGTGAGATCACTGGGTGGTGGGGGGGCCA
AGTTCGTGGCTGCCTGGACCCTGAAGGCTGCCGCTTAATAACTCGAG
一种小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段的纯化表达方法:
表达载体的构建:
将合成的抗原表位基因、PET30a(+)载体用BamH I和Xho I双酶切,回收酶切片段,连接,构建PET30a(+)表达载体,连接产物转化DH5a,挑取单菌落接种LB液体培养基,扩增、纯化回收质粒并进行酶切鉴定筛选阳性重组体,经过测序,证实阅读框架正确,重组质粒命名为PET30a-BW;
重组蛋白的诱导表达:
将测序正确的重组质粒转化菌接种至含卡那青霉素的LB培养液,37℃振荡培养至培养液OD600达0.6-0.8时,加入终浓度为0.2mol/L~1.0mol/L的IPTG,37℃诱导表达2h~8h,诱导完毕后4℃、12000r/min离心收集菌体,反复冻融3次后冰浴中超声波破碎处理10-15min,使菌体尽量全部破碎,超声破碎好的菌液会从粘稠变得较稀,之后4℃、12000r/min离心,分别收集上清和沉淀,沉淀用含8M尿素的PBS溶解,最后SDS-PAGE电泳分析上述收集组分;
包涵体形式重组蛋白的纯化:
将挑选出的表达量高的重组菌200μL接种于20mL Kan/LB液体培养液中,37℃,230r/min振荡培养10-12h;
取6mL过夜培养物接入600mL Kan/LB培养液中,37℃,于2L锥形瓶中于振荡培养约2h至OD600nm=0.6~0.8;
加入IPTG至终浓度为1mmol/L,37℃继续诱导培养8h;
细菌诱导培养物于4℃以3500r/min离心15min,弃上清,收集菌体沉淀,将菌体用PBS洗涤3次,每次以4℃,3500r/min离心20min,之后重悬于15mL的PBS缓冲液中,反复冻融3次,至菌体粘稠;
4℃冰浴中超声裂解菌体沉淀,待超声结束后于4℃,6000rpm/20min离心收集包涵体;
加入0.2%的DOC 30ml(solutionA配制)混匀,室温静置30min,4℃,9000-10000rpm×20min离心收集沉淀包涵体;
用0.2%的DOC 30ml再次清洗包涵体7500rpm×20min离心;
用2%的DOC 30ml(solutionA配制)混匀包涵体,室温静置30min;4℃9000-10000rpm×20min离心收集沉淀包涵体;
用solutionA配制0.9%的SKL,室温溶解包涵体1.5-2h;4℃7500rpm×20min离心,收集上清;
镍琼脂糖凝胶FF装柱,柱床体积约为10mL;
加至少5个柱体积的缓冲液1平衡柱子,流速1ml/min;
0.45μm滤器处理包涵体样品,与填料混匀,放到摇床上2~3h;
将混匀的填料样品倒回柱内,,静置,自然沉降,而后打开开关,放出流穿液;
用缓冲液1再洗2~5个柱床体积,流速为1mL/min;
用咪唑浓度分别为100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L洗脱缓冲液洗脱,中间各静置15min后,进行蛋白洗脱;收集各阶段洗脱峰,用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度;
用5个柱体积的缓冲液1洗脱柱子,20%的乙醇处理后,取出填料,4℃保存。
进一步优选,所述诱导时间为8h。
进一步优选,所述IPTG浓度为1.0mmol/L。
进一步优选,所述咪唑浓度分别为100mmol/L。
本发明小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段在制备小反刍兽疫抗原表位疫苗中的应用。
本发明的有益效果:
1.本发明人工合成了预测的H和F蛋白的10条抗原表位肽段,应用间接ELISA方法对其生物学功能进行了初步鉴定,结果表明这10条多肽均能和PPR阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。
2.戊二醛法将10条抗原表位肽段与载体BSA偶联,混合免疫新西兰大白兔。用间接ELISA检测免疫血清中抗各个合成多肽的抗体,除了H4其它9条抗原表位多肽均能诱导产生特异性的抗体,具有良好的免疫原性;并且多肽免疫血清能针对75/1毒产生特异性反应,抗体滴度能达到1∶1600;血清中和实验表明,此抗血清能诱导实验动物产生中和抗体,具有中和病毒的作用。
4.H、F蛋白的10个B细胞抗原表位串联,再加上一个外源通用T细胞表位,表位之间用甘氨酸间隔,人工合成一条多抗原表位编码基因序列,构建原核表达载体pET30a(+),成功表达获得了分子量为19kD的表达蛋白,ELISA和Western结果表明该蛋白可与PPRV感染阳性血清发生特异性免疫反应。
5.本发明小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段既具有良好反应原性又具有良好免疫原性。
6.本发明所述的小反刍兽疫抗原表位疫苗安全、易于生产、便于储藏和使用。
附图说明
图1是本发明所述多肽偶联后SDS电泳鉴定图;
图2是本发明所述重组质粒PET30a-BW酶切鉴定结果图,其中1:重组质粒PET30a-BW酶切结果,M:DNA分子量标准;
图3是本发明所述重组蛋白原核表达图,其中1:未诱导表达的PET30a-BW;2,3诱导表达的PET30a-BW,M:蛋白质分子质量标准;
图4是本发明所述诱导时间对重组蛋白表达量的影响图,其中M:蛋白质Marker;2-6:诱导后样品,诱导时间2、4、6、8、10;1:未诱导样品;
图5是本发明IPTG浓度对重组蛋白表达量的影响图,其中M:蛋白质Marker;1:未诱导样品;2-6:诱导后样品,IPTG终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L;
图6是本发明所述重组蛋白可溶性分析图,其中M:蛋白质Marker;1:未诱导的pET-30a(+)沉淀;2:诱导的重组表达质粒上清;3:诱导的重组表达质粒沉淀;
图7是本发明所述表达产物纯化后的SDS-PAGE分析图,其中M.蛋白质分子质量标准;1、2:100mM咪唑洗脱液;
图8是本发明所述表达产物的免疫印迹分析图,其中M:蛋白质Marker;1、2:阳性血清免疫印迹;
图9是本发明所述重组蛋白与阳性血清的ELISA反应结果图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细地说明。
其技术方案为:
根据PPRV Nigeria 75/1毒株的F、H蛋白氨基酸序列在预测软件Bcepred预测结果,综合分析F、H蛋白蛋白的亲水性、可及性、beta转角等,最后预测出的F、H蛋白10条B细胞抗原表位氨基酸序列见表1所示。
将预测筛选的各抗原表位以柔性氨基酸片段连接,再加入一个外源通用辅助性T淋巴细胞表位PADRE,根据抗原表位氨基酸序列推导出核苷酸序列,在串联表位氨基酸序列的5′和3′端分别加入BamH I和Xho I酶切位点,并在末端加上TAA终止密码子,合成了长度为456bp的目的基因片段,所述抗原表位氨基酸序列为(下划线部分为甘氨酸接头):
TKDVLTPLFKIGGGGGTGCLGRTGGGGDYRSCLLGGGGTVEKLYLSSHRGGGGSSYFYPV
RLNGGGGILAVQGVQDYGGGGTSCVFTPEGGGGPDKLLTVIGGGGYPDSVYLHEIDLGGG
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所述推导出的核苷酸序列为(下划线部分分别为BamH I和Xho I酶切位点):
GGATCCATGACTAAGGATGTCTTAACTCCCCTGTTTAAAATCGGTGGTGGAGGTGGGAC
AGGCTGTCTCGGCAGGACAGGGGGCGGGGGTGACTATCGGAGCTGTCTTTTAGGCGGT
GGAGGAACGGTGGAGAAACTCTATTTATCCTCACATAGGGGAGGGGGTGGATCATCTTA
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GACTATGGGGGCGGTGGAACGTCATGCGTCTTCACTCCAGAGGGAGGTGGCGGGCCTG
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TAGACTTAGGGGGTGGGGGCAAGTCGTACGTGAGATCACTGGGTGGTGGGGGGGCCA
AGTTCGTGGCTGCCTGGACCCTGAAGGCTGCCGCTTAATAACTCGAG
一种小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段的纯化表达方法:
表达载体的构建:
将合成的抗原表位基因、PET30a(+)载体用BamH I和Xho I双酶切,回收酶切片段,连接,构建PET30a(+)表达载体,连接产物转化DH5a,挑取单菌落接种LB液体培养基,扩增、纯化回收质粒并进行酶切鉴定筛选阳性重组体,经过测序,证实阅读框架正确,重组质粒命名为PET30a-BW;
重组蛋白的诱导表达:
将测序正确的重组质粒转化菌接种至含卡那青霉素的LB培养液,37℃振荡培养至培养液OD600达0.6-0.8时,加入终浓度为0.2mol/L~1.0mol/L的IPTG,37℃诱导表达2h~8h,诱导完毕后4℃、12000r/min离心收集菌体,反复冻融3次后冰浴中超声波破碎处理10-15min,使菌体尽量全部破碎,超声破碎好的菌液会从粘稠变得较稀,之后4℃、12000r/min离心,分别收集上清和沉淀,沉淀用含8M尿素的PBS溶解,最后SDS-PAGE电泳分析上述收集组分;
包涵体形式重组蛋白的纯化:
将挑选出的表达量高的重组菌200μL接种于20mL Kan/LB液体培养液中,37℃,230r/min振荡培养10-12h;
取6mL过夜培养物接入600mL Kan/LB培养液中,37℃,于2L锥形瓶中于振荡培养约2h至OD600nm=0.6~0.8;
加入IPTG至终浓度为1mmol/L,37℃继续诱导培养8h;
细菌诱导培养物于4℃以3500r/min离心15min,弃上清,收集菌体沉淀,将菌体用PBS洗涤3次,每次以4℃,3500r/min离心20min,之后重悬于15mL的PBS缓冲液中,反复冻融3次,至菌体粘稠;
4℃冰浴中超声裂解菌体沉淀,待超声结束后于4℃,6000rpm/20min离心收集包涵体;
加入0.2%的DOC 30ml(solutionA配制)混匀,室温静置30min,4℃,9000-10000rpm×20min离心收集沉淀包涵体;
用0.2%的DOC 30ml再次清洗包涵体7500rpm×20min离心;
用2%的DOC 30ml(solutionA配制)混匀包涵体,室温静置30min;4℃9000-10000rpm×20min离心收集沉淀包涵体;
用solutionA配制0.9%的SKL,室温溶解包涵体1.5-2h;4℃7500rpm×20min离心,收集上清;
镍琼脂糖凝胶FF装柱,柱床体积约为10mL;
加至少5个柱体积的缓冲液1平衡柱子,流速1ml/min;
0.45μm滤器处理包涵体样品,与填料混匀,放到摇床上2~3h;
将混匀的填料样品倒回柱内,,静置,自然沉降,而后打开开关,放出流穿液;
用缓冲液1再洗2~5个柱床体积,流速为1mL/min;
用咪唑浓度分别为100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L洗脱缓冲液洗脱,中间各静置15min后,进行蛋白洗脱;收集各阶段洗脱峰,用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度;
用5个柱体积的缓冲液1洗脱柱子,20%的乙醇处理后,取出填料,4℃保存。
进一步优选,所述诱导时间为8h。
进一步优选,所述IPTG浓度为1.0mmol/L。
进一步优选,所述咪唑浓度分别为100mmol/L。
本发明小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段在制备小反刍兽疫抗原表位疫苗中的应用。
主要试剂
牛血清白蛋白(BSA),鱼明胶,HRP标记的羊抗兔二抗、弗氏完全佐剂和不完全佐剂均为美国Sigma公司产品;DMEM、胎牛血清为美国Gibco公司产品。
50%戊二醛、Lys固体粉末购自上海生工;
TMB为Promega公司产品;
兔抗PPRV Nigeria 75/1株多克隆抗体由本实验室制备保存。
内切酶BamH I、Xho I、T4DNA连接酶、质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自OMIGA公司;
DNA Marker、Protein marker、购自全式金生物工程技术服务有限公司;
镍琼脂糖凝胶FF购自北京韦氏博惠色谱科技有限公司;
菌种和载体
E.coli DH5α、BL21由本实验室保存;pET30a(+)由翟军军博士赠送。
实验动物
2-3月龄新西兰大白兔由兰州兽医研究所实验动物中心提供。
主要耗材及仪器
96孔酶联免疫吸板、96孔细胞培养板(Nunc,美国)
二氧化碳培养箱(SANYO,日本)
紫外凝胶成像仪(Syngene,美国)
倒置显微镜(XS2-D重庆光学仪器厂)
DYY-31A型稳压稳流电泳仪(北京六一厂)
电热恒温培养箱(DNP-9272型,上海精宏实验设备有限公司)
超净工作台(苏净集团安泰公司)
凝胶成相仪(SYNGENE):ADIVISION OF SYNOPTICS LTD;
制冰机(Scotsman,美国)。
主要溶液及配制配制
包被缓冲液(CBS)
NaHCO32.9g,Na2CO31.5g,加双蒸水定容至1000ml,调pH至9.6,4℃保存备用。
磷酸盐缓冲液(PBS)和洗涤液(PBST)
称取KH2PO40.2g、KCl 0.2g、Na2HPO4-12H2O 2.93g、NaCI 80g加去离子水至IO00ml,并分装100ml/瓶,4℃保存。在磷酸盐缓冲液中加入0.5%的Tween-20,即成洗涤液。
样品稀释液
称取0.1g牛血清白蛋白(BSA)加入到100ml0.01mol/LpH7.4的PBS中。
封闭液
称取进口鱼明胶0.8g加PBS至100ml,37℃水浴至完全溶解,即可使用。
终止液(2mol/L的H2SO4)
量取711ml去离子水,逐滴加入89ml浓硫酸(98%),混匀后室温保存。
0.2%戊二醛溶液
0.01mol/LpH7.4的PBS 100ml
50%戊二醛 40μL
1mol/L的Lys溶液
称取146.19mg的Lys固体粉末加入到1ml去离子水中,混匀后4℃保存。
聚丙烯酰胺凝胶电泳所用主要试剂
Tris-缓冲液:Tris Base 1.5g、甘氨酸9.4g、SDS 0.5g溶解于500mL去离子水中。
2×SDS-PAGE上样缓冲液:100mmol/L Tris-HCl pH8.0、4%SDS、0.2%溴酚兰、20%甘油、200mmol/L巯基乙醇,震荡至混合均匀,4℃保存。
考马斯亮蓝染色液:称取0.25g考马斯亮兰溶解于45mL甲醇、10mL冰醋酸、45mL水中。
脱色液:量取甲醇150mL,冰乙酸50mL,蒸馏水300mL混合后即为脱色液。
蛋白质转印所用试剂
转移缓冲液:称取2.9g甘氨酸、5.8g Tris base、0.37g SDS,并加入200mL甲醇,加蒸馏水至总体积1000mL。
PBS和PBST见2.1.4。
封闭液:含3%BSA的PBS,量取PBS 50mL,按3%的比例加入1.5g BSA(牛血清白蛋白),混匀。
DAB显色液:称取二氨基联苯胺(DAB)25mg和氯化钴15mg,加含0.5%吐温-20的PBS(pH 7.2)至50mL,在使用时加入30.0%过氧化氢50μL。
洗涤包涵体及蛋白纯化用溶液
洗涤包涵体所用主要溶液:
solutionA:50mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,5%甘油,50mM NaCl 0.2mMDTT
镍琼脂糖凝胶FF纯化带His标签重组包涵体蛋白所用缓冲液组成:具体见产品说明书。
试验方法
PPRV-F蛋白B细胞抗原表位预测
将PPRV Nigeria 75/1毒株的F蛋白的氨基酸序列用抗原表位预测软件Bcepred,综合分析该蛋白的亲水性、可及性、beta转角等,最后预测其B细胞抗原表位。
PPRV-H蛋白B细胞抗原表位预测
将PPRV Nigeria 75/1毒株的H蛋白的氨基酸序列同样用Bcepred软件进行分析,综合分析该蛋白的亲水性、可及性、beta转角等,预测其B细胞抗原表位。
抗原表位的合成
将软件筛选预测的10条抗原表位氨基酸序列和1条无关多肽序列送GeneScript公司用多肽合成仪合成,合成后用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)分析多肽合成的纯度及氨基酸的正确性。
间接ELISA检测合成表位肽段的抗原性
间接ELISA操作程序如下:
①包被:用pH9.6的包被缓冲液将纯化蛋白稀释为2μg/100μL,分别以10条表位肽段和1条无关肽段包被ELISA反应板,4℃过夜。
②洗涤:取出抗原包被的ELISA反应板,倒掉包被液,PBST洗板3次
③封闭:在微量反应孔中加封闭液,每孔加封闭液100μL,37℃作用2h;
④加样:弃去封闭液,PBST洗涤3次,拍干,将阴性血清、阳性血清分别作1∶200倍稀释,加入微量反应孔,每孔100μL,37℃作用60min。
⑤加HRP标记的羊抗兔酶标二抗:取出微量反应板,倾去孔内液体,PBST洗涤3次,拍干,然后每孔加入1∶15000稀释好的酶标二抗100μL,37℃作用60min。
⑥显色:取出反应板,倾去孔内液体,用PBST洗3次,拍干,然后每孔加入100μL底物TMB显色,置暗盒中37℃显色5min。
⑦每孔50μL终止液终止反应,用酶标检测仪检测各孔OD450nm值。
多肽与BSA偶联
采用戊二醛法进行偶联,具体操作步骤如下:
①先用水将多肽稀释至1mg/ml;
②称取2mg载体BSA溶解在2ml0.01mol/L Ph7.4的PBS缓冲液中,室温下在PBS缓冲液中搅拌透析过夜;
③将稀释好的多肽取出1ml加入到2ml的载体溶液中,边加边搅拌,向上述混合液中滴加1ml0.2%的戊二醛溶液,边加边搅拌。
④室温下搅拌4个小时后,向上述混合液中加入120μl1mol/L的Lys溶液,继续搅拌1小时,使之终止反应;
⑤最后,将上述混合液装入透析袋中,用PBS液4℃透析过夜;将多肽载体偶联液分装,-20℃保存。
⑥偶联后的蛋白产物进行SDS-PAGE电泳鉴定。
多肽免疫动物
将10条偶联后的抗原表位多肽等量混合。选择6只健康白兔,随机分为3组,一组两只。3组分别为混合表位肽、BSA对照和空白阴性对照。第一次用弗氏完全佐剂,第二次用弗氏不完全佐剂,最后一次不加佐剂,免疫纯蛋白,免疫剂量为1.0mg/只,每隔14天免疫一次,3次免疫后2周心脏采血,收集血清。
间接ELISA检测免疫兔血清针对各个多肽的抗体
操作程序如下:
①包被:用包被液将10条抗原表位肽和无关多肽稀释到20μg/mL,并取100μL包被ELISA条板,置4℃下过夜。
②洗涤:取出抗原包被的微量反应板,倾去孔内液体,用PBST洗涤3次,且每次均拍干反应板;
③封闭:在微量反应孔中加入封闭液,每孔100μL,37℃作用60min;
④加样:取出封闭好的微量反应板,弃去封闭液,用PBST洗涤3次,拍干,将三种血清分别作1∶100倍稀释,加入微量反应孔,每孔100μL,37℃作用60min。
⑤加HRP标记的羊抗兔酶标二抗:取出微量反应板,倾去孔内液体,PBST洗涤3次,拍干,然后加入稀释好的酶标二抗,每孔100μL,37℃作用60min。
⑥显色:取出微量反应板,倾去孔内液体,PBST洗涤3次,拍干,然后加入底物TMB显色,暗盒中37℃显色5min,以终止液终止反应,用酶标仪在450nm处测定OD值。
ELISA检测针对PPRV Nigeria 75/1病毒株的抗体滴度
用包被液将PPRV Nigeria 75/1毒液1∶50倍稀释,取每孔100μL包被ELISA反应板,置4℃下过夜。PBST洗涤3次,用0.8%的明胶37℃封闭1h,加入1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600系列稀释的各种抗血清,37℃孵育1h.PBST PBST洗涤3次后,加入HRP标记的羊抗兔IgG,37℃孵育1h.PBST洗涤4次后TMB显色,450nm处测OD值.450nm处测OD值。
血清中和实验
具体操作程序如下:
①将测定好TCID50的病毒液稀释成100个TCID50的病毒悬液。
②在96孔微量培养板中将混合多肽免疫后的抗血清(预先56℃灭活30min)从1∶2开始作连续倍比稀释一直到1∶256,每个稀释度作5孔。
③在上述各孔内加入50μl稀释好的病毒液,混匀后放入37℃5%CO2培养箱中作用60min。同时设阴、阳性血清对照,病毒对照和正常细胞对照,其中病毒对照要作200个TCID50、20个TCID50、2个TCID50、0.2个TCID504个不同浓度的对照。
④感作完成后每孔加入100μl细胞悬液(Vero),放37℃5%CO2培养箱培养,逐日观察并记录结果,观察5-7天。
结果
抗原表位的预测及多肽合成
根据PPRV Nigeria 75/1毒株的F、H蛋白氨基酸序列在预测软件Bcepred预测结果,综合分析F、H蛋白蛋白的亲水性、可及性、beta转角等,最后预测出的F、H蛋白10条B细胞抗原表位氨基酸序列见表1所示。
经高效液相色谱分析,合成多肽纯度均≥85%;多肽中各氨基酸的比率与预期的一致,说明多肽合成正确。
合成多肽的抗原性
表2
表2中的OD值分析表明10条多肽均能与PPRV阳性血清反应,OD值显著性高于无关多肽,且OD阳性/阴性>2,表明具有良好的抗原性。
多肽的偶联
SDS-PAGE电泳结果显示10条多肽均成功与BSA偶联,结果见图1。ELISA检测针对各个多肽的特异性抗体
用混合抗原表位肽免疫兔子后,用间接ELISA检测免疫血清中抗各个合成多肽的抗体。以BSA免疫血清和正常阴性血清为对照。结果如表3所示除了H4其它9条多肽与混合多肽免疫血清的反应性显著高于无关多肽,而且OD多肽/ODBSA>2,且OD阳性/OD阴性>2,结果分析表明除了H4其它9条抗原表位多肽均能诱导产生特异性的抗体,具有良好的免疫原性。
表3
ELISA检测针对75/1毒抗体滴度
免疫血清针对75/1毒液产生的特异性抗体如表4所示,结果表明多肽免疫血清能针对75/1毒产生特异性反应,抗体滴度能达到1∶1600
表4
血清中和实验
表5
表5血清中和实验表明,此抗血清能诱导实验动物产生中和抗体,具有中和病毒的作用,说明这些抗原表位里面有的是中和性表位。
小反刍兽疫标准阳性血清的制备
用PPRV Nigeria 75/1毒株免疫健康的6月龄山羊制备PPR阳性血清,每次皮下接种5000个TCID50,间隔15d,第一次用弗氏完全佐剂,第二、三次用弗氏不完全佐剂,第四、五次用全病毒,五免后从第10天开始,每隔两天采血,间接ELISA法(包被抗原为PPRV Nigeria75/1)测定抗体效价,在效价达到最高值时剖杀实验羊分离血清。
抗原表位重组原核表达载体的构建
串联抗原表位基因的获得
将预测到的各H、F抗原表位以柔性甘氨酸片段连接,再串联一个外源通用辅助性T淋巴细胞表位(PADRE),并在5′和3′端分别加入BamH I和Xho I酶切位点,在末端加上TAA终止密码子,将设计好的此串联抗原表位基因序列送上海生工生物公司合成。
目的片段与载体的酶切回收
按下列体系配制酶切反应体系:
混匀后瞬时离心,置37℃恒温水浴锅中酶切4h。65℃水浴5min灭活内切酶。电泳检测酶切产物,切下目的条带,用OMEGA公司的DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段和载体片段(具体操作方法见试剂盒说明书),电泳检测回收情况。
目的片段与表达载体的连接
取胶回收的目的片段5μL和pET-30a(+)载体1μL(50μg/μL)混合后,加入10×ligasebuffer 2μL,T4DNA连接酶1μL(3U/μL),补去离子水至终体积为20μL,混匀后置4℃连接过夜。
连接产物的转化
①感受态细胞解冻后,在无菌条件下将连接产物20μL全部加入感受态细胞中,温和摇动混匀,冰浴放置30min。
②将混合物置于42℃水浴中热激90s,随后立即冰浴5min。;
③向装有菌液的eppendorf管中加入800μL预热的LB培养液,37℃、150r/min温和振荡1h,使菌液恢复抗性;
④取出eppendorf管,5000r/min离心5min,弃上清,留沉淀。
⑤向菌液沉淀中加入50μL LB培养液,轻轻吹打混匀,均匀涂布于含Amp(100μg/mL)的LB琼脂平板上。
⑥将平皿倒置,于37℃培养箱培养12~16h后观察结果。
重组质粒的提取与鉴定
碱裂解法小量提取质粒
见OMEGA试剂盒说明书。
重组质粒的鉴定
①重组质粒的酶切鉴定:按照本章所述的双酶切体系酶切质粒,酶切后琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果,同时用空白质粒作为阴性对照。
②重组质粒的测序:将初步酶切鉴定为阳性的菌液过夜培养,送大连宝生物公司测序。测序结果用NCBI Blast等软件对序列进行分析,阳性重组质粒命名为PET30a-BW。
重组蛋白的诱导表达
将测序正确的重组质粒转化菌接种至含卡那青霉素的LB培养液,37℃振荡培养至培养液OD600达0.6-0.8时,加IPTG至终浓度为0.8mM,37℃诱导表达8h。诱导完毕后4℃、12000r/min离心收集菌体,反复冻融3次后冰浴中超声波破碎处理10-15min,使菌体尽量全部破碎,超声破碎好的菌液会从粘稠变得较稀,之后4℃、12000r/min离心,分别收集上清和沉淀,沉淀用含8M尿素的PBS溶解。最后SDS-PAGE电泳分析上述收集组分。
表达产物的SDS-PAGE电泳
操作程序如下所述:具体方法见分子克隆指南。
重组蛋白表达条件的优化
将确定已经成功表达蛋白的菌种转接于含卡那青霉素(Kan)的LB液体培养基上,对其表达条件进行优化。在培养物中分别加入终浓度为0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L的诱导剂(IPTG),37℃诱导表达,同时与37℃分别诱导表达2h、4h、6h、8h和10h,以确定诱导最佳时间。按照3.2.3.6的过程收集并处理菌体,通过SDS-PAGE电泳评价优化效果,确定诱导表达的最佳时间和最适IPTG浓度。
重组蛋白的可溶性分析
取过夜培养物,按1∶100的比例(体积比)加入到含卡那霉素LB培养液中,37℃、230r/min快速振荡培养至OD600值为0.8时,加入IPTG使其终浓度为1mmol/L,37℃、230r/min诱导培养8h。将诱导厚的细菌培养液离心,菌体用PBS缓冲液洗涤2次,每次以4℃,4000r/min离心20min,之后重悬于PBS缓冲液中,反复冻融3次,菌悬液置于4℃冰浴中进行超声裂解,裂解完全后于4℃,12000r/min离心10min,分别收集上清和沉淀。取沉淀,加入8mol/L尿素裂解1小时,再加入等体积的2×蛋白电泳上样缓冲;直接取上清,加入等量的蛋白电泳上样缓冲液,将沉淀和上清同时置水浴中煮沸5min,各取15μL进行SDS-PAGE蛋白电泳。
包涵体形式重组蛋白的纯化
重组蛋白包涵体表达形式的收集
①将挑选出的表达量高的重组菌200μL接种于20mL Kan/LB液体培养液中,37℃,230r/min振荡培养10-12h。
②取6mL过夜培养物接入600mL Kan/LB培养液中,37℃,于2L锥形瓶中于振荡培养约2h至OD600nm=0.6~0.8。
③加入IPTG至终浓度为1mmol/L,37℃继续诱导培养8h。
④细菌诱导培养物于4℃以3500r/min离心15min,弃上清,收集菌体沉淀,将菌体用PBS洗涤3次,每次以4℃,3500r/min离心20min,之后重悬于15mL的PBS缓冲液中,反复冻融3次,至菌体粘稠。
⑤4℃冰浴中超声裂解菌体沉淀,待超声结束后于4℃,6000rpm/20min离心收集包涵体。
⑥加入0.2%的DOC 30ml(solutionA配制)混匀,室温静置30min,4℃,9000-10000rpm×20min离心收集沉淀包涵体。
⑦用0.2%的DOC 30ml再次清洗包涵体7500rpm×20min离心。
⑧用2%的DOC 30ml(solutionA配制)混匀包涵体,室温静置30min;4℃9000-10000rpm×20min离心收集沉淀包涵体。
⑨用solutionA配制0.9%的SKL,室温溶解包涵体1.5-2h;4℃7500rpm×20min离心,收集上清。
包涵体形式重组蛋白的纯化
按照北京韦氏博惠色谱科技有限公司的镍琼脂糖凝胶FF纯化说明进行纯化操作,具体步骤如下:
①镍琼脂糖凝胶FF装柱,柱床体积约为10mL;
②加至少5个柱体积的缓冲液1平衡柱子,流速1ml/min;
③0.45μm滤器处理包涵体样品,与填料混匀,放到摇床上,2~3h;
④将混匀的填料样品倒回柱内,静置,自然沉降,而后打开开关,放出流穿液;
⑤用缓冲液1再洗2~5个柱床体积,流速为1mL/min;
⑥用咪唑浓度分别为100m、200m、300m洗脱缓冲液洗脱,中间各静置15min后,进行蛋白洗脱;收集各阶段洗脱峰,用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度;
⑥用5个柱体积的缓冲液1洗脱柱子,20%的乙醇处理后,取出填料,4℃保存。表达产物的Western-blotting检测
SDS-PAGE电泳后对表达产物进行Western检测:一抗为1∶100倍稀释的抗PPR Nigeria75/1的羊的阳性血清和阴性血清;1∶2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的小鼠抗山羊的酶标二抗,用DAB显色。
间接ELISA检测重组抗原表位蛋白的反应性
将纯化的重组蛋白和H+F全长蛋白用0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释到10ug/ml,包被酶标板,每孔100uL,4℃过夜。弃去包被液,PBST洗涤3次,加入1%的明胶封闭,每孔100uL,37℃封闭1h。PBST洗涤后,分别加入用PBST稀释好的阴阳性血清,每孔100uL,同时设空白对照,37℃作用1h,PBST洗涤。加入辣根过氧化酶标记的抗山羊的二抗,每孔1OOuL37℃作用1小时。PBST洗涤后,每孔加100uLTMB显色,最后每孔加50uL2mol/LH2SO4终止,测定OD450值。
结果
小反刍兽疫标准阳性血清的制备
以PPRV Nigeria 75/1病毒作为包被抗原,用间接ELISA方法检测免疫山羊制备的PPRV标准阳性血清,其抗体效价为1∶12000,此即为PPRV标准阳性血清。
抗原表位基因的合成
基因合成测序报告和比较图谱分析表明人工成功合成了长度为456pb的目的基因片段。
重组抗原表位表达载体的构建
BamH I和Xho I双酶切筛选鉴定阳性重组子,进行1%琼脂糖凝胶电泳,获得了与预期大小一致的约456bp的目的基因片段,见图2。测序结果核苷酸序列与原设计序列一致,表明重组质粒构建成功。
重组抗原表位基因的原核表达
重组质粒转化表达菌BL21,培养至OD值为0.6-0.8时,用IPTG诱导,裂解后用SDS-PAGE分离个蛋白条带并白Marker对照,电泳结果显示表达蛋白与预期大小相符合,见图3。
重组蛋白表达条件的优化
在不同诱导时间下,重组菌表达的P蛋白在8h时表达量最多。在不同浓度IPTG诱导下,1.0mmol/L时表达量最大。具体见图4、图5。
重组蛋白的可溶性分析
诱导表达菌体经裂解后,对上清和沉淀分别进行SDS-PAGE分析表明,具体见图6,表达蛋白大量存在于菌体的不溶性的包涵体沉淀中,只有少量的存在于可溶性的上清中含量很少。
表达蛋白的纯化
表达产物处理后的包涵体经镍琼脂糖凝胶过柱分离纯化后,将以此收集的洗脱液进行SDS-PAGE分析,结果如图7表明,在咪唑浓度为100mmol/L时洗脱液中目的蛋白含量较大,条带单一,大小与目的蛋白条带吻合,说明纯化得到了比较纯的蛋白。
重组蛋白的Western-Blot分析
纯化的表达产物经SDS-PAGE后转移到NC膜上与小反刍兽疫标准阳性血清进行反应,结果显示,在目的蛋白所处的位置有一条特异性条带出现,具体见图8,说明表达蛋白具有反应活性。
ELISA检测重组蛋白与阳性血清的反应
分别以小反刍兽疫病毒H+F全长蛋白和抗原表位重组蛋白包被ELISA反应板,包被量均为1ug/孔,每种抗原做两孔重复,与各血清反应,血清均做1∶800倍稀释,读取OD450,以平均值作图,结果如图9所示,抗原表位重组蛋白的反应性略低于H+F全长的反应性,但ODP/N大于2,表明重组蛋白与阳性血清也具有良好的反应性。
Claims (6)
1.一种小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段,其特征在于,将预测筛选的各抗原表位以柔性氨基酸片段连接,再加入一个外源通用辅助性T淋巴细胞表位PADRE,根据抗原表位氨基酸序列推导出核苷酸序列,在串联表位氨基酸序列的5′和3′端分别加入BamH I和Xho I酶切位点,并在末端加上TAA终止密码子,合成了长度为456bp的目的基因片段,所述抗原表位氨基酸序列为:
TKDVLTPLFKIGGGGGTGCLGRTGGGGDYRSCLLGGGGTVEKLYLSSHRGGGGSSYFYPV
RLNGGGGILAVQGVQDYGGGGTSCVFTPEGGGGPDKLLTVIGGGGYPDSVYLHEIDLGGG
GKSYVRSLGGGGAKFVAAWTLKAAA
所述推导出的核苷酸序列为:
GGATCCATGACTAAGGATGTCTTAACTCCCCTGTTTAAAATCGGTGGTGGAGGTGGGAC
AGGCTGTCTCGGCAGGACAGGGGGCGGGGGTGACTATCGGAGCTGTCTTTTAGGCCGGT
GGAGGAACGGTGGAGAAACTCTATTTATCCTCACATAGGGGAGGGGGTGGATCATCTTA
CTTCTACCCAGTCCGATTGAATGGCGGGGGCGGAATACTGGCGGTACAGGGCGTCCAA
GACTATGGGGGCGGTGGAACGTCATGCGTCTTCACTCCAGAGGGAGGTGGCGGGCCTG
ATAAACTACTAACTGTTATAGGTGGGGGTGGTTACCCAGATTCTGTATACCTACATGAAA
TAGACTTAGGGGGTGGGGGCAAGTCGTACGTGAGATCACTGGGTGGTGGGGGGGCCA
AGTTCGTGGCTGCCTGGACCCTGAAGGCTGCCGCTTAATAACTCGAG。
2.一种权利要求1所述的小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段的纯化表达方法,其特征在于,
表达载体的构建:
将合成的抗原表位基因、PET30a(+)载体用BamH I和Xho I双酶切,回收酶切片段,连接,构建PET30a(+)表达载体,连接产物转化DH5a,挑取单菌落接种LB液体培养基,扩增、纯化回收质粒并进行酶切鉴定筛选阳性重组体,经过测序,证实阅读框架正确,重组质粒命名为PET30a-BW;
重组蛋白的诱导表达:
将测序正确的重组质粒转化菌接种至含卡那青霉素的LB培养液,37℃振荡培养至培养液OD600达0.6-0.8时,加入终浓度为0.2mol/L~1.0mol/L的IPTG,37℃诱导表达2h~8h,诱 导完毕后4℃、12000r/min离心收集菌体,反复冻融3次后冰浴中超声波破碎处理10-15min,使菌体尽量全部破碎,超声破碎好的菌液会从粘稠变得较稀,之后4℃、12000r/min离心,分别收集上清和沉淀,沉淀用含8M尿素的PBS溶解,最后SDS-PAGE电泳分析上述收集组分;
包涵体形式重组蛋白的纯化:
将挑选出的表达量高的重组菌200μL接种于20mL Kan/LB液体培养液中,37℃,230r/min振荡培养10-12h;
取6mL过夜培养物接入600mL Kan/LB培养液中,37℃,于2L锥形瓶中于振荡培养约2h至OD600nm=0.6~0.8;
加入IPTG至终浓度为1mmol/L,37℃继续诱导培养8h;
细菌诱导培养物于4℃以3500r/min离心15min,弃上清,收集菌体沉淀,将菌体用PBS洗涤3次,每次以4℃,3500r/min离心20min,之后重悬于15mL的PBS缓冲液中,反复冻融3次,至菌体粘稠;
4℃冰浴中超声裂解菌体沉淀,待超声结束后于4℃,6000rpm/20min离心收集包涵体;
加入0.2%用solutionA配制的DOC 30ml混匀,室温静置30min,4℃,9000-10000rpm×20min离心收集沉淀包涵体;
用0.2%的DOC 30ml再次清洗包涵体7500rpm×20min离心;
用2%的用solutionA配制DOC 30ml混匀包涵体,室温静置30min;4℃9000-10000rpm×20min离心收集沉淀包涵体;
用solutionA配制0.9%的SKL,室温溶解包涵体1.5-2h;4℃7500rpm×20min离心,收集上清;
镍琼脂糖凝胶FF装柱,柱床体积约为10mL;
加至少5个柱体积的缓冲液1平衡柱子,流速1ml/min;
0.45μm滤器处理包涵体样品,与填料混匀,放到摇床上2~3h;
将混匀的填料样品倒回柱内,,静置,自然沉降,而后打开开关,放出流穿液;
用缓冲液1再洗2~5个柱床体积,流速为1mL/min;
用咪唑浓度分别为100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L洗脱缓冲液洗脱,中间各静置15min后,进行蛋白洗脱;收集各阶段洗脱峰,用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度;
用5个柱体积的缓冲液1洗脱柱子,20%的乙醇处理后,取出填料,4℃保存。
3.根据权利要求2所述的小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段的纯化表达方法,其特征在于,所述诱导时间为8h。
4.根据权利要求2所述的小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段的纯化表达方法,其特征在于,所述IPTG浓度为1.0mmol/L。
5.根据权利要求2所述的小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段的纯化表达方法,其特征在于,所述咪唑浓度分别为100mmol/L。
6.一种权利要求1-5任一项所述的小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段在制备小反刍兽疫抗原表位疫苗中的应用。
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