CN102559707A - 小反刍兽疫病毒h、f蛋白抗原表位基因片段及其表达、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段，将预测筛选的各抗原表位以柔性氨基酸片段连接，再加入一个外源通用辅助性T淋巴细胞表位PADRE，根据抗原表位氨基酸序列推导出核苷酸序列，在串联表位氨基酸序列的5′和3′端分别加入BamHI和Xho I酶切位点，并在末端加上TAA终止密码子，合成了长度为456bp的目的基因片段，同时提供了该基因片段的表达以及应用。本发明所述的小反刍兽疫抗原表位疫苗安全、易于生产、便于储藏和使用，能广泛适用于基因工程领域。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段及其表达、应用。
背景技术
小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des PetitsRuminants Virus，PPRV)引起的一种严重危害山羊、绵羊等小反刍类动物的传染病，也称小反刍兽伪牛瘟，卡他、肺肠炎以及口肺肠炎综合症，山羊高度易感，发病率和病死率均较高。该病在世界上被认为是十分重要的烈性传染病之一，在我国该病也被列为一类动物传染病。1942年，小反刍兽疫在西非的科特迪瓦首次被报道，随后几年里，非洲的大部分国家都报道发生此病。近几年来，小反刍兽疫进一步蔓延，流行趋势日益严峻。在2007年7月和2010年5月，我国西藏阿里地区发生了该病，对我国动物卫生安全构成了严重威胁。
目前，世界上大多数国家防制PPR主要依赖于疫苗免疫接种。对于已发病的动物没有有效的治疗方法，耐过动物可获得主动免疫。PPRV与RPV在基因上的同源性很高，在过去一般都是采用RPV组织培养疫苗来对PPR进行防疫。
表位疫苗属于亚单位疫苗的一种，在设计表位疫苗时，由于表位片段短，表达产物分子量小，为***合适的免疫增强因子进行共表达提供了可能。最重要的是，表位疫苗不存在基因重组、整合的问题。H蛋白是PPRV上的一种糖蛋白，构成病毒表面的一种纤突。H蛋白刺激机体产生中和抗体，参与体液保护性免疫。Makoto Sugiyama等研究表明，是PPRV重要的结构蛋白，它主要包含两个中和性抗原表位区域I和II。F蛋白是PPRV病毒表面上的一种纤突，决定病毒能否成功感染，能够诱导产生细胞溶血素、细胞融合、启动病毒感染细胞等生物学活性。H、F蛋白都是PPRV主要的保护性抗原。
迄今为止，小反刍兽疫疫苗生产技术虽然几经革新，但是广泛使用的仍是弱毒苗，虽然DNA疫苗、重组疫苗等的优越性以及所取得的成就引起了广泛关注，但毕竟研究的历史较短，不够深入，在实际应用中不可避免的存在很多问题，如应用对象的安全性问题、免疫耐受性问题等，这些都是表位疫苗有待解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足，本发明提供一种小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段，设计并串联了F、H基因的10个B细胞抗原表位和一个通用T细胞表位，各表位之间以柔性甘氨酸间隔，并在原核***中进行表达，可用于小反刍兽疫病毒新型疫苗。
其技术方案为：
根据PPRV Nigeria 75/1毒株的F、H蛋白氨基酸序列在预测软件Bcepred预测结果，综合分析F、H蛋白蛋白的亲水性、可及性、beta转角等，最后预测出的F、H蛋白10条B细胞抗原表位氨基酸序列见表1所示。
表1
将预测筛选的各抗原表位以柔性氨基酸片段连接，再加入一个外源通用辅助性T淋巴细胞表位PADRE，根据抗原表位氨基酸序列推导出核苷酸序列，在串联表位氨基酸序列的5′和3′端分别加入BamH I和Xho I酶切位点，并在末端加上TAA终止密码子，合成了长度为456bp的目的基因片段，所述抗原表位氨基酸序列为(下划线部分为甘氨酸接头)：
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GKSYVRSLGGGG AKFVAAWTLKAAA
所述推导出的核苷酸序列为(下划线部分分别为BamH I和Xho I酶切位点)：
GGATCCATGACTAAGGATGTCTTAACTCCCCTGTTTAAAATCGGTGGTGGAGGTGGGAC
AGGCTGTCTCGGCAGGACAGGGGGCGGGGGTGACTATCGGAGCTGTCTTTTAGGCGGT
GGAGGAACGGTGGAGAAACTCTATTTATCCTCACATAGGGGAGGGGGTGGATCATCTTA
CTTCTACCCAGTCCGATTGAATGGCGGGGGCGGAATACTGGCGGTACAGGGCGTCCAA
GACTATGGGGGCGGTGGAACGTCATGCGTCTTCACTCCAGAGGGAGGTGGCGGGCCTG
ATAAACTACTAACTGTTATAGGTGGGGGTGGTTACCCAGATTCTGTATACCTACATGAAA
TAGACTTAGGGGGTGGGGGCAAGTCGTACGTGAGATCACTGGGTGGTGGGGGGGCCA
AGTTCGTGGCTGCCTGGACCCTGAAGGCTGCCGCTTAATAACTCGAG
一种小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段的纯化表达方法：
表达载体的构建：
将合成的抗原表位基因、PET30a(+)载体用BamH I和Xho I双酶切，回收酶切片段，连接，构建PET30a(+)表达载体，连接产物转化DH5a，挑取单菌落接种LB液体培养基，扩增、纯化回收质粒并进行酶切鉴定筛选阳性重组体，经过测序，证实阅读框架正确，重组质粒命名为PET30a-BW；
重组蛋白的诱导表达：
将测序正确的重组质粒转化菌接种至含卡那青霉素的LB培养液，37℃振荡培养至培养液OD600达0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mol/L～1.0mol/L的IPTG，37℃诱导表达2h～8h，诱导完毕后4℃、12000r/min离心收集菌体，反复冻融3次后冰浴中超声波破碎处理10-15min，使菌体尽量全部破碎，超声破碎好的菌液会从粘稠变得较稀，之后4℃、12000r/min离心，分别收集上清和沉淀，沉淀用含8M尿素的PBS溶解，最后SDS-PAGE电泳分析上述收集组分；
包涵体形式重组蛋白的纯化：
将挑选出的表达量高的重组菌200μL接种于20mL Kan/LB液体培养液中，37℃，230r/min振荡培养10-12h；
取6mL过夜培养物接入600mL Kan/LB培养液中，37℃，于2L锥形瓶中于振荡培养约2h至OD600nm＝0.6～0.8；
加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续诱导培养8h；
细菌诱导培养物于4℃以3500r/min离心15min，弃上清，收集菌体沉淀，将菌体用PBS洗涤3次，每次以4℃，3500r/min离心20min，之后重悬于15mL的PBS缓冲液中，反复冻融3次，至菌体粘稠；
4℃冰浴中超声裂解菌体沉淀，待超声结束后于4℃，6000rpm/20min离心收集包涵体；
加入0.2％的DOC 30ml(solutionA配制)混匀，室温静置30min，4℃，9000-10000rpm×20min离心收集沉淀包涵体；
用0.2％的DOC 30ml再次清洗包涵体7500rpm×20min离心；
用2％的DOC 30ml(solutionA配制)混匀包涵体，室温静置30min；4℃9000-10000rpm×20min离心收集沉淀包涵体；
用solutionA配制0.9％的SKL，室温溶解包涵体1.5-2h；4℃7500rpm×20min离心，收集上清；
镍琼脂糖凝胶FF装柱，柱床体积约为10mL；
加至少5个柱体积的缓冲液1平衡柱子，流速1ml/min；
0.45μm滤器处理包涵体样品，与填料混匀，放到摇床上2～3h；
将混匀的填料样品倒回柱内，，静置，自然沉降，而后打开开关，放出流穿液；
用缓冲液1再洗2～5个柱床体积，流速为1mL/min；
用咪唑浓度分别为100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L洗脱缓冲液洗脱，中间各静置15min后，进行蛋白洗脱；收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；
用5个柱体积的缓冲液1洗脱柱子，20％的乙醇处理后，取出填料，4℃保存。
进一步优选，所述诱导时间为8h。
进一步优选，所述IPTG浓度为1.0mmol/L。
进一步优选，所述咪唑浓度分别为100mmol/L。
本发明小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段在制备小反刍兽疫抗原表位疫苗中的应用。
本发明的有益效果：
1.本发明人工合成了预测的H和F蛋白的10条抗原表位肽段，应用间接ELISA方法对其生物学功能进行了初步鉴定，结果表明这10条多肽均能和PPR阳性血清发生特异性反应，具有良好的反应原性。
2.戊二醛法将10条抗原表位肽段与载体BSA偶联，混合免疫新西兰大白兔。用间接ELISA检测免疫血清中抗各个合成多肽的抗体，除了H4其它9条抗原表位多肽均能诱导产生特异性的抗体，具有良好的免疫原性；并且多肽免疫血清能针对75/1毒产生特异性反应，抗体滴度能达到1∶1600；血清中和实验表明，此抗血清能诱导实验动物产生中和抗体，具有中和病毒的作用。
4.H、F蛋白的10个B细胞抗原表位串联，再加上一个外源通用T细胞表位，表位之间用甘氨酸间隔，人工合成一条多抗原表位编码基因序列，构建原核表达载体pET30a(+)，成功表达获得了分子量为19kD的表达蛋白，ELISA和Western结果表明该蛋白可与PPRV感染阳性血清发生特异性免疫反应。
5.本发明小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段既具有良好反应原性又具有良好免疫原性。
6.本发明所述的小反刍兽疫抗原表位疫苗安全、易于生产、便于储藏和使用。
附图说明
图1是本发明所述多肽偶联后SDS电泳鉴定图；
图2是本发明所述重组质粒PET30a-BW酶切鉴定结果图，其中1：重组质粒PET30a-BW酶切结果，M：DNA分子量标准；
图3是本发明所述重组蛋白原核表达图，其中1：未诱导表达的PET30a-BW；2，3诱导表达的PET30a-BW，M：蛋白质分子质量标准；
图4是本发明所述诱导时间对重组蛋白表达量的影响图，其中M：蛋白质Marker；2-6：诱导后样品，诱导时间2、4、6、8、10；1：未诱导样品；
图5是本发明IPTG浓度对重组蛋白表达量的影响图，其中M：蛋白质Marker；1：未诱导样品；2-6：诱导后样品，IPTG终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L；
图6是本发明所述重组蛋白可溶性分析图，其中M：蛋白质Marker；1：未诱导的pET-30a(+)沉淀；2：诱导的重组表达质粒上清；3：诱导的重组表达质粒沉淀；
图7是本发明所述表达产物纯化后的SDS-PAGE分析图，其中M.蛋白质分子质量标准；1、2：100mM咪唑洗脱液；
图8是本发明所述表达产物的免疫印迹分析图，其中M：蛋白质Marker；1、2：阳性血清免疫印迹；
图9是本发明所述重组蛋白与阳性血清的ELISA反应结果图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细地说明。
其技术方案为：
根据PPRV Nigeria 75/1毒株的F、H蛋白氨基酸序列在预测软件Bcepred预测结果，综合分析F、H蛋白蛋白的亲水性、可及性、beta转角等，最后预测出的F、H蛋白10条B细胞抗原表位氨基酸序列见表1所示。
将预测筛选的各抗原表位以柔性氨基酸片段连接，再加入一个外源通用辅助性T淋巴细胞表位PADRE，根据抗原表位氨基酸序列推导出核苷酸序列，在串联表位氨基酸序列的5′和3′端分别加入BamH I和Xho I酶切位点，并在末端加上TAA终止密码子，合成了长度为456bp的目的基因片段，所述抗原表位氨基酸序列为(下划线部分为甘氨酸接头)：
TKDVLTPLFKIGGGGGTGCLGRTGGGGDYRSCLLGGGGTVEKLYLSSHRGGGGSSYFYPV
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所述推导出的核苷酸序列为(下划线部分分别为BamH I和Xho I酶切位点)：
GGATCCATGACTAAGGATGTCTTAACTCCCCTGTTTAAAATCGGTGGTGGAGGTGGGAC
AGGCTGTCTCGGCAGGACAGGGGGCGGGGGTGACTATCGGAGCTGTCTTTTAGGCGGT
GGAGGAACGGTGGAGAAACTCTATTTATCCTCACATAGGGGAGGGGGTGGATCATCTTA
CTTCTACCCAGTCCGATTGAATGGCGGGGGCGGAATACTGGCGGTACAGGGCGTCCAA
GACTATGGGGGCGGTGGAACGTCATGCGTCTTCACTCCAGAGGGAGGTGGCGGGCCTG
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TAGACTTAGGGGGTGGGGGCAAGTCGTACGTGAGATCACTGGGTGGTGGGGGGGCCA
AGTTCGTGGCTGCCTGGACCCTGAAGGCTGCCGCTTAATAACTCGAG
一种小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段的纯化表达方法：
表达载体的构建：
将合成的抗原表位基因、PET30a(+)载体用BamH I和Xho I双酶切，回收酶切片段，连接，构建PET30a(+)表达载体，连接产物转化DH5a，挑取单菌落接种LB液体培养基，扩增、纯化回收质粒并进行酶切鉴定筛选阳性重组体，经过测序，证实阅读框架正确，重组质粒命名为PET30a-BW；
重组蛋白的诱导表达：
将测序正确的重组质粒转化菌接种至含卡那青霉素的LB培养液，37℃振荡培养至培养液OD600达0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mol/L～1.0mol/L的IPTG，37℃诱导表达2h～8h，诱导完毕后4℃、12000r/min离心收集菌体，反复冻融3次后冰浴中超声波破碎处理10-15min，使菌体尽量全部破碎，超声破碎好的菌液会从粘稠变得较稀，之后4℃、12000r/min离心，分别收集上清和沉淀，沉淀用含8M尿素的PBS溶解，最后SDS-PAGE电泳分析上述收集组分；
包涵体形式重组蛋白的纯化：
将挑选出的表达量高的重组菌200μL接种于20mL Kan/LB液体培养液中，37℃，230r/min振荡培养10-12h；
取6mL过夜培养物接入600mL Kan/LB培养液中，37℃，于2L锥形瓶中于振荡培养约2h至OD600nm＝0.6～0.8；
加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续诱导培养8h；
细菌诱导培养物于4℃以3500r/min离心15min，弃上清，收集菌体沉淀，将菌体用PBS洗涤3次，每次以4℃，3500r/min离心20min，之后重悬于15mL的PBS缓冲液中，反复冻融3次，至菌体粘稠；
4℃冰浴中超声裂解菌体沉淀，待超声结束后于4℃，6000rpm/20min离心收集包涵体；
加入0.2％的DOC 30ml(solutionA配制)混匀，室温静置30min，4℃，9000-10000rpm×20min离心收集沉淀包涵体；
用0.2％的DOC 30ml再次清洗包涵体7500rpm×20min离心；
用2％的DOC 30ml(solutionA配制)混匀包涵体，室温静置30min；4℃9000-10000rpm×20min离心收集沉淀包涵体；
用solutionA配制0.9％的SKL，室温溶解包涵体1.5-2h；4℃7500rpm×20min离心，收集上清；
镍琼脂糖凝胶FF装柱，柱床体积约为10mL；
加至少5个柱体积的缓冲液1平衡柱子，流速1ml/min；
0.45μm滤器处理包涵体样品，与填料混匀，放到摇床上2～3h；
将混匀的填料样品倒回柱内，，静置，自然沉降，而后打开开关，放出流穿液；
用缓冲液1再洗2～5个柱床体积，流速为1mL/min；
用咪唑浓度分别为100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L洗脱缓冲液洗脱，中间各静置15min后，进行蛋白洗脱；收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；
用5个柱体积的缓冲液1洗脱柱子，20％的乙醇处理后，取出填料，4℃保存。
进一步优选，所述诱导时间为8h。
进一步优选，所述IPTG浓度为1.0mmol/L。
进一步优选，所述咪唑浓度分别为100mmol/L。
本发明小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段在制备小反刍兽疫抗原表位疫苗中的应用。
主要试剂
牛血清白蛋白(BSA)，鱼明胶，HRP标记的羊抗兔二抗、弗氏完全佐剂和不完全佐剂均为美国Sigma公司产品；DMEM、胎牛血清为美国Gibco公司产品。
50％戊二醛、Lys固体粉末购自上海生工；
TMB为Promega公司产品；
兔抗PPRV Nigeria 75/1株多克隆抗体由本实验室制备保存。
内切酶BamH I、Xho I、T4DNA连接酶、质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自OMIGA公司；
DNA Marker、Protein marker、购自全式金生物工程技术服务有限公司；
镍琼脂糖凝胶FF购自北京韦氏博惠色谱科技有限公司；
菌种和载体
E.coli DH5α、BL21由本实验室保存；pET30a(+)由翟军军博士赠送。
实验动物
2-3月龄新西兰大白兔由兰州兽医研究所实验动物中心提供。
主要耗材及仪器
96孔酶联免疫吸板、96孔细胞培养板(Nunc，美国)
二氧化碳培养箱(SANYO，日本)
紫外凝胶成像仪(Syngene，美国)
倒置显微镜(XS2-D重庆光学仪器厂)
DYY-31A型稳压稳流电泳仪(北京六一厂)
电热恒温培养箱(DNP-9272型，上海精宏实验设备有限公司)
超净工作台(苏净集团安泰公司)
凝胶成相仪(SYNGENE)：ADIVISION OF SYNOPTICS LTD；
制冰机(Scotsman，美国)。
主要溶液及配制配制
包被缓冲液(CBS)
NaHCO32.9g，Na2CO31.5g，加双蒸水定容至1000ml，调pH至9.6，4℃保存备用。
磷酸盐缓冲液(PBS)和洗涤液(PBST)
称取KH2PO40.2g、KCl 0.2g、Na2HPO4-12H2O 2.93g、NaCI 80g加去离子水至IO00ml，并分装100ml/瓶，4℃保存。在磷酸盐缓冲液中加入0.5％的Tween-20，即成洗涤液。
样品稀释液
称取0.1g牛血清白蛋白(BSA)加入到100ml0.01mol/LpH7.4的PBS中。
封闭液
称取进口鱼明胶0.8g加PBS至100ml，37℃水浴至完全溶解，即可使用。
终止液(2mol/L的H2SO4)
量取711ml去离子水，逐滴加入89ml浓硫酸(98％)，混匀后室温保存。
0.2％戊二醛溶液
0.01mol/LpH7.4的PBS 100ml
50％戊二醛 40μL
1mol/L的Lys溶液
称取146.19mg的Lys固体粉末加入到1ml去离子水中，混匀后4℃保存。
聚丙烯酰胺凝胶电泳所用主要试剂
Tris-缓冲液：Tris Base 1.5g、甘氨酸9.4g、SDS 0.5g溶解于500mL去离子水中。
2×SDS-PAGE上样缓冲液：100mmol/L Tris-HCl pH8.0、4％SDS、0.2％溴酚兰、20％甘油、200mmol/L巯基乙醇，震荡至混合均匀，4℃保存。
考马斯亮蓝染色液：称取0.25g考马斯亮兰溶解于45mL甲醇、10mL冰醋酸、45mL水中。
脱色液：量取甲醇150mL，冰乙酸50mL，蒸馏水300mL混合后即为脱色液。
蛋白质转印所用试剂
转移缓冲液：称取2.9g甘氨酸、5.8g Tris base、0.37g SDS，并加入200mL甲醇，加蒸馏水至总体积1000mL。
PBS和PBST见2.1.4。
封闭液：含3％BSA的PBS，量取PBS 50mL，按3％的比例加入1.5g BSA(牛血清白蛋白)，混匀。
DAB显色液：称取二氨基联苯胺(DAB)25mg和氯化钴15mg，加含0.5％吐温-20的PBS(pH 7.2)至50mL，在使用时加入30.0％过氧化氢50μL。
洗涤包涵体及蛋白纯化用溶液
洗涤包涵体所用主要溶液：
solutionA：50mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，5％甘油，50mM NaCl 0.2mMDTT
镍琼脂糖凝胶FF纯化带His标签重组包涵体蛋白所用缓冲液组成：具体见产品说明书。
试验方法
PPRV-F蛋白B细胞抗原表位预测
将PPRV Nigeria 75/1毒株的F蛋白的氨基酸序列用抗原表位预测软件Bcepred，综合分析该蛋白的亲水性、可及性、beta转角等，最后预测其B细胞抗原表位。
PPRV-H蛋白B细胞抗原表位预测
将PPRV Nigeria 75/1毒株的H蛋白的氨基酸序列同样用Bcepred软件进行分析，综合分析该蛋白的亲水性、可及性、beta转角等，预测其B细胞抗原表位。
抗原表位的合成
将软件筛选预测的10条抗原表位氨基酸序列和1条无关多肽序列送GeneScript公司用多肽合成仪合成，合成后用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)分析多肽合成的纯度及氨基酸的正确性。
间接ELISA检测合成表位肽段的抗原性
间接ELISA操作程序如下：
①包被：用pH9.6的包被缓冲液将纯化蛋白稀释为2μg/100μL，分别以10条表位肽段和1条无关肽段包被ELISA反应板，4℃过夜。
②洗涤：取出抗原包被的ELISA反应板，倒掉包被液，PBST洗板3次
③封闭：在微量反应孔中加封闭液，每孔加封闭液100μL，37℃作用2h；
④加样：弃去封闭液，PBST洗涤3次，拍干，将阴性血清、阳性血清分别作1∶200倍稀释，加入微量反应孔，每孔100μL，37℃作用60min。
⑤加HRP标记的羊抗兔酶标二抗：取出微量反应板，倾去孔内液体，PBST洗涤3次，拍干，然后每孔加入1∶15000稀释好的酶标二抗100μL，37℃作用60min。
⑥显色：取出反应板，倾去孔内液体，用PBST洗3次，拍干，然后每孔加入100μL底物TMB显色，置暗盒中37℃显色5min。
⑦每孔50μL终止液终止反应，用酶标检测仪检测各孔OD450nm值。
多肽与BSA偶联
采用戊二醛法进行偶联，具体操作步骤如下：
①先用水将多肽稀释至1mg/ml；
②称取2mg载体BSA溶解在2ml0.01mol/L Ph7.4的PBS缓冲液中，室温下在PBS缓冲液中搅拌透析过夜；
③将稀释好的多肽取出1ml加入到2ml的载体溶液中，边加边搅拌，向上述混合液中滴加1ml0.2％的戊二醛溶液，边加边搅拌。
④室温下搅拌4个小时后，向上述混合液中加入120μl1mol/L的Lys溶液，继续搅拌1小时，使之终止反应；
⑤最后，将上述混合液装入透析袋中，用PBS液4℃透析过夜；将多肽载体偶联液分装，-20℃保存。
⑥偶联后的蛋白产物进行SDS-PAGE电泳鉴定。
多肽免疫动物
将10条偶联后的抗原表位多肽等量混合。选择6只健康白兔，随机分为3组，一组两只。3组分别为混合表位肽、BSA对照和空白阴性对照。第一次用弗氏完全佐剂，第二次用弗氏不完全佐剂，最后一次不加佐剂，免疫纯蛋白，免疫剂量为1.0mg/只，每隔14天免疫一次，3次免疫后2周心脏采血，收集血清。
间接ELISA检测免疫兔血清针对各个多肽的抗体
操作程序如下：
①包被：用包被液将10条抗原表位肽和无关多肽稀释到20μg/mL，并取100μL包被ELISA条板，置4℃下过夜。
②洗涤：取出抗原包被的微量反应板，倾去孔内液体，用PBST洗涤3次，且每次均拍干反应板；
③封闭：在微量反应孔中加入封闭液，每孔100μL，37℃作用60min；
④加样：取出封闭好的微量反应板，弃去封闭液，用PBST洗涤3次，拍干，将三种血清分别作1∶100倍稀释，加入微量反应孔，每孔100μL，37℃作用60min。
⑤加HRP标记的羊抗兔酶标二抗：取出微量反应板，倾去孔内液体，PBST洗涤3次，拍干，然后加入稀释好的酶标二抗，每孔100μL，37℃作用60min。
⑥显色：取出微量反应板，倾去孔内液体，PBST洗涤3次，拍干，然后加入底物TMB显色，暗盒中37℃显色5min，以终止液终止反应，用酶标仪在450nm处测定OD值。
ELISA检测针对PPRV Nigeria 75/1病毒株的抗体滴度
用包被液将PPRV Nigeria 75/1毒液1∶50倍稀释，取每孔100μL包被ELISA反应板，置4℃下过夜。PBST洗涤3次，用0.8％的明胶37℃封闭1h，加入1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600系列稀释的各种抗血清，37℃孵育1h.PBST PBST洗涤3次后，加入HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1h.PBST洗涤4次后TMB显色，450nm处测OD值.450nm处测OD值。
血清中和实验
具体操作程序如下：
①将测定好TCID50的病毒液稀释成100个TCID50的病毒悬液。
②在96孔微量培养板中将混合多肽免疫后的抗血清(预先56℃灭活30min)从1∶2开始作连续倍比稀释一直到1∶256，每个稀释度作5孔。
③在上述各孔内加入50μl稀释好的病毒液，混匀后放入37℃5％CO2培养箱中作用60min。同时设阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照，其中病毒对照要作200个TCID50、20个TCID50、2个TCID50、0.2个TCID504个不同浓度的对照。
④感作完成后每孔加入100μl细胞悬液(Vero)，放37℃5％CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果，观察5-7天。
结果
抗原表位的预测及多肽合成
根据PPRV Nigeria 75/1毒株的F、H蛋白氨基酸序列在预测软件Bcepred预测结果，综合分析F、H蛋白蛋白的亲水性、可及性、beta转角等，最后预测出的F、H蛋白10条B细胞抗原表位氨基酸序列见表1所示。
经高效液相色谱分析，合成多肽纯度均≥85％；多肽中各氨基酸的比率与预期的一致，说明多肽合成正确。
合成多肽的抗原性
表2
表2中的OD值分析表明10条多肽均能与PPRV阳性血清反应，OD值显著性高于无关多肽，且OD阳性/阴性＞2，表明具有良好的抗原性。
多肽的偶联
SDS-PAGE电泳结果显示10条多肽均成功与BSA偶联，结果见图1。ELISA检测针对各个多肽的特异性抗体
用混合抗原表位肽免疫兔子后，用间接ELISA检测免疫血清中抗各个合成多肽的抗体。以BSA免疫血清和正常阴性血清为对照。结果如表3所示除了H4其它9条多肽与混合多肽免疫血清的反应性显著高于无关多肽，而且OD多肽/ODBSA＞2，且OD阳性/OD阴性＞2，结果分析表明除了H4其它9条抗原表位多肽均能诱导产生特异性的抗体，具有良好的免疫原性。
表3
ELISA检测针对75/1毒抗体滴度
免疫血清针对75/1毒液产生的特异性抗体如表4所示，结果表明多肽免疫血清能针对75/1毒产生特异性反应，抗体滴度能达到1∶1600
表4
血清中和实验
表5
表5血清中和实验表明，此抗血清能诱导实验动物产生中和抗体，具有中和病毒的作用，说明这些抗原表位里面有的是中和性表位。
小反刍兽疫标准阳性血清的制备
用PPRV Nigeria 75/1毒株免疫健康的6月龄山羊制备PPR阳性血清，每次皮下接种5000个TCID50，间隔15d，第一次用弗氏完全佐剂，第二、三次用弗氏不完全佐剂，第四、五次用全病毒，五免后从第10天开始，每隔两天采血，间接ELISA法(包被抗原为PPRV Nigeria75/1)测定抗体效价，在效价达到最高值时剖杀实验羊分离血清。
抗原表位重组原核表达载体的构建
串联抗原表位基因的获得
将预测到的各H、F抗原表位以柔性甘氨酸片段连接，再串联一个外源通用辅助性T淋巴细胞表位(PADRE)，并在5′和3′端分别加入BamH I和Xho I酶切位点，在末端加上TAA终止密码子，将设计好的此串联抗原表位基因序列送上海生工生物公司合成。
目的片段与载体的酶切回收
按下列体系配制酶切反应体系：
混匀后瞬时离心，置37℃恒温水浴锅中酶切4h。65℃水浴5min灭活内切酶。电泳检测酶切产物，切下目的条带，用OMEGA公司的DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段和载体片段(具体操作方法见试剂盒说明书)，电泳检测回收情况。
目的片段与表达载体的连接
取胶回收的目的片段5μL和pET-30a(+)载体1μL(50μg/μL)混合后，加入10×ligasebuffer 2μL，T4DNA连接酶1μL(3U/μL)，补去离子水至终体积为20μL，混匀后置4℃连接过夜。
连接产物的转化
①感受态细胞解冻后，在无菌条件下将连接产物20μL全部加入感受态细胞中，温和摇动混匀，冰浴放置30min。
②将混合物置于42℃水浴中热激90s，随后立即冰浴5min。；
③向装有菌液的eppendorf管中加入800μL预热的LB培养液，37℃、150r/min温和振荡1h，使菌液恢复抗性；
④取出eppendorf管，5000r/min离心5min，弃上清，留沉淀。
⑤向菌液沉淀中加入50μL LB培养液，轻轻吹打混匀，均匀涂布于含Amp(100μg/mL)的LB琼脂平板上。
⑥将平皿倒置，于37℃培养箱培养12～16h后观察结果。
重组质粒的提取与鉴定
碱裂解法小量提取质粒
见OMEGA试剂盒说明书。
重组质粒的鉴定
①重组质粒的酶切鉴定：按照本章所述的双酶切体系酶切质粒，酶切后琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，同时用空白质粒作为阴性对照。
②重组质粒的测序：将初步酶切鉴定为阳性的菌液过夜培养，送大连宝生物公司测序。测序结果用NCBI Blast等软件对序列进行分析，阳性重组质粒命名为PET30a-BW。
重组蛋白的诱导表达
将测序正确的重组质粒转化菌接种至含卡那青霉素的LB培养液，37℃振荡培养至培养液OD600达0.6-0.8时，加IPTG至终浓度为0.8mM，37℃诱导表达8h。诱导完毕后4℃、12000r/min离心收集菌体，反复冻融3次后冰浴中超声波破碎处理10-15min，使菌体尽量全部破碎，超声破碎好的菌液会从粘稠变得较稀，之后4℃、12000r/min离心，分别收集上清和沉淀，沉淀用含8M尿素的PBS溶解。最后SDS-PAGE电泳分析上述收集组分。
表达产物的SDS-PAGE电泳
操作程序如下所述：具体方法见分子克隆指南。
重组蛋白表达条件的优化
将确定已经成功表达蛋白的菌种转接于含卡那青霉素(Kan)的LB液体培养基上，对其表达条件进行优化。在培养物中分别加入终浓度为0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L的诱导剂(IPTG)，37℃诱导表达，同时与37℃分别诱导表达2h、4h、6h、8h和10h，以确定诱导最佳时间。按照3.2.3.6的过程收集并处理菌体，通过SDS-PAGE电泳评价优化效果，确定诱导表达的最佳时间和最适IPTG浓度。
重组蛋白的可溶性分析
取过夜培养物，按1∶100的比例(体积比)加入到含卡那霉素LB培养液中，37℃、230r/min快速振荡培养至OD600值为0.8时，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，37℃、230r/min诱导培养8h。将诱导厚的细菌培养液离心，菌体用PBS缓冲液洗涤2次，每次以4℃，4000r/min离心20min，之后重悬于PBS缓冲液中，反复冻融3次，菌悬液置于4℃冰浴中进行超声裂解，裂解完全后于4℃，12000r/min离心10min，分别收集上清和沉淀。取沉淀，加入8mol/L尿素裂解1小时，再加入等体积的2×蛋白电泳上样缓冲；直接取上清，加入等量的蛋白电泳上样缓冲液，将沉淀和上清同时置水浴中煮沸5min，各取15μL进行SDS-PAGE蛋白电泳。
包涵体形式重组蛋白的纯化
重组蛋白包涵体表达形式的收集
①将挑选出的表达量高的重组菌200μL接种于20mL Kan/LB液体培养液中，37℃，230r/min振荡培养10-12h。
②取6mL过夜培养物接入600mL Kan/LB培养液中，37℃，于2L锥形瓶中于振荡培养约2h至OD600nm＝0.6～0.8。
③加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续诱导培养8h。
④细菌诱导培养物于4℃以3500r/min离心15min，弃上清，收集菌体沉淀，将菌体用PBS洗涤3次，每次以4℃，3500r/min离心20min，之后重悬于15mL的PBS缓冲液中，反复冻融3次，至菌体粘稠。
⑤4℃冰浴中超声裂解菌体沉淀，待超声结束后于4℃，6000rpm/20min离心收集包涵体。
⑥加入0.2％的DOC 30ml(solutionA配制)混匀，室温静置30min，4℃，9000-10000rpm×20min离心收集沉淀包涵体。
⑦用0.2％的DOC 30ml再次清洗包涵体7500rpm×20min离心。
⑧用2％的DOC 30ml(solutionA配制)混匀包涵体，室温静置30min；4℃9000-10000rpm×20min离心收集沉淀包涵体。
⑨用solutionA配制0.9％的SKL，室温溶解包涵体1.5-2h；4℃7500rpm×20min离心，收集上清。
包涵体形式重组蛋白的纯化
按照北京韦氏博惠色谱科技有限公司的镍琼脂糖凝胶FF纯化说明进行纯化操作，具体步骤如下：
①镍琼脂糖凝胶FF装柱，柱床体积约为10mL；
②加至少5个柱体积的缓冲液1平衡柱子，流速1ml/min；
③0.45μm滤器处理包涵体样品，与填料混匀，放到摇床上，2～3h；
④将混匀的填料样品倒回柱内，静置，自然沉降，而后打开开关，放出流穿液；
⑤用缓冲液1再洗2～5个柱床体积，流速为1mL/min；
⑥用咪唑浓度分别为100m、200m、300m洗脱缓冲液洗脱，中间各静置15min后，进行蛋白洗脱；收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；
⑥用5个柱体积的缓冲液1洗脱柱子，20％的乙醇处理后，取出填料，4℃保存。表达产物的Western-blotting检测
SDS-PAGE电泳后对表达产物进行Western检测：一抗为1∶100倍稀释的抗PPR Nigeria75/1的羊的阳性血清和阴性血清；1∶2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的小鼠抗山羊的酶标二抗，用DAB显色。
间接ELISA检测重组抗原表位蛋白的反应性
将纯化的重组蛋白和H+F全长蛋白用0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释到10ug/ml，包被酶标板，每孔100uL，4℃过夜。弃去包被液，PBST洗涤3次，加入1％的明胶封闭，每孔100uL，37℃封闭1h。PBST洗涤后，分别加入用PBST稀释好的阴阳性血清，每孔100uL，同时设空白对照，37℃作用1h，PBST洗涤。加入辣根过氧化酶标记的抗山羊的二抗，每孔1OOuL37℃作用1小时。PBST洗涤后，每孔加100uLTMB显色，最后每孔加50uL2mol/LH2SO4终止，测定OD450值。
结果
小反刍兽疫标准阳性血清的制备
以PPRV Nigeria 75/1病毒作为包被抗原，用间接ELISA方法检测免疫山羊制备的PPRV标准阳性血清，其抗体效价为1∶12000，此即为PPRV标准阳性血清。
抗原表位基因的合成
基因合成测序报告和比较图谱分析表明人工成功合成了长度为456pb的目的基因片段。
重组抗原表位表达载体的构建
BamH I和Xho I双酶切筛选鉴定阳性重组子，进行1％琼脂糖凝胶电泳，获得了与预期大小一致的约456bp的目的基因片段，见图2。测序结果核苷酸序列与原设计序列一致，表明重组质粒构建成功。
重组抗原表位基因的原核表达
重组质粒转化表达菌BL21，培养至OD值为0.6-0.8时，用IPTG诱导，裂解后用SDS-PAGE分离个蛋白条带并白Marker对照，电泳结果显示表达蛋白与预期大小相符合，见图3。
重组蛋白表达条件的优化
在不同诱导时间下，重组菌表达的P蛋白在8h时表达量最多。在不同浓度IPTG诱导下，1.0mmol/L时表达量最大。具体见图4、图5。
重组蛋白的可溶性分析
诱导表达菌体经裂解后，对上清和沉淀分别进行SDS-PAGE分析表明，具体见图6，表达蛋白大量存在于菌体的不溶性的包涵体沉淀中，只有少量的存在于可溶性的上清中含量很少。
表达蛋白的纯化
表达产物处理后的包涵体经镍琼脂糖凝胶过柱分离纯化后，将以此收集的洗脱液进行SDS-PAGE分析，结果如图7表明，在咪唑浓度为100mmol/L时洗脱液中目的蛋白含量较大，条带单一，大小与目的蛋白条带吻合，说明纯化得到了比较纯的蛋白。
重组蛋白的Western-Blot分析
纯化的表达产物经SDS-PAGE后转移到NC膜上与小反刍兽疫标准阳性血清进行反应，结果显示，在目的蛋白所处的位置有一条特异性条带出现，具体见图8，说明表达蛋白具有反应活性。
ELISA检测重组蛋白与阳性血清的反应
分别以小反刍兽疫病毒H+F全长蛋白和抗原表位重组蛋白包被ELISA反应板，包被量均为1ug/孔，每种抗原做两孔重复，与各血清反应，血清均做1∶800倍稀释，读取OD450，以平均值作图，结果如图9所示，抗原表位重组蛋白的反应性略低于H+F全长的反应性，但ODP/N大于2，表明重组蛋白与阳性血清也具有良好的反应性。
Claims (6)
1.一种小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段，其特征在于，将预测筛选的各抗原表位以柔性氨基酸片段连接，再加入一个外源通用辅助性T淋巴细胞表位PADRE，根据抗原表位氨基酸序列推导出核苷酸序列，在串联表位氨基酸序列的5′和3′端分别加入BamH I和Xho I酶切位点，并在末端加上TAA终止密码子，合成了长度为456bp的目的基因片段，所述抗原表位氨基酸序列为：
TKDVLTPLFKIGGGGGTGCLGRTGGGGDYRSCLLGGGGTVEKLYLSSHRGGGGSSYFYPV
RLNGGGGILAVQGVQDYGGGGTSCVFTPEGGGGPDKLLTVIGGGGYPDSVYLHEIDLGGG
GKSYVRSLGGGGAKFVAAWTLKAAA
所述推导出的核苷酸序列为：
GGATCCATGACTAAGGATGTCTTAACTCCCCTGTTTAAAATCGGTGGTGGAGGTGGGAC
AGGCTGTCTCGGCAGGACAGGGGGCGGGGGTGACTATCGGAGCTGTCTTTTAGGCCGGT
GGAGGAACGGTGGAGAAACTCTATTTATCCTCACATAGGGGAGGGGGTGGATCATCTTA
CTTCTACCCAGTCCGATTGAATGGCGGGGGCGGAATACTGGCGGTACAGGGCGTCCAA
GACTATGGGGGCGGTGGAACGTCATGCGTCTTCACTCCAGAGGGAGGTGGCGGGCCTG
ATAAACTACTAACTGTTATAGGTGGGGGTGGTTACCCAGATTCTGTATACCTACATGAAA
TAGACTTAGGGGGTGGGGGCAAGTCGTACGTGAGATCACTGGGTGGTGGGGGGGCCA
AGTTCGTGGCTGCCTGGACCCTGAAGGCTGCCGCTTAATAACTCGAG。
2.一种权利要求1所述的小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段的纯化表达方法，其特征在于，
表达载体的构建：
将合成的抗原表位基因、PET30a(+)载体用BamH I和Xho I双酶切，回收酶切片段，连接，构建PET30a(+)表达载体，连接产物转化DH5a，挑取单菌落接种LB液体培养基，扩增、纯化回收质粒并进行酶切鉴定筛选阳性重组体，经过测序，证实阅读框架正确，重组质粒命名为PET30a-BW；
重组蛋白的诱导表达：
将测序正确的重组质粒转化菌接种至含卡那青霉素的LB培养液，37℃振荡培养至培养液OD600达0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mol/L～1.0mol/L的IPTG，37℃诱导表达2h～8h，诱 导完毕后4℃、12000r/min离心收集菌体，反复冻融3次后冰浴中超声波破碎处理10-15min，使菌体尽量全部破碎，超声破碎好的菌液会从粘稠变得较稀，之后4℃、12000r/min离心，分别收集上清和沉淀，沉淀用含8M尿素的PBS溶解，最后SDS-PAGE电泳分析上述收集组分；
包涵体形式重组蛋白的纯化：
将挑选出的表达量高的重组菌200μL接种于20mL Kan/LB液体培养液中，37℃，230r/min振荡培养10-12h；
取6mL过夜培养物接入600mL Kan/LB培养液中，37℃，于2L锥形瓶中于振荡培养约2h至OD600nm＝0.6～0.8；
加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续诱导培养8h；
细菌诱导培养物于4℃以3500r/min离心15min，弃上清，收集菌体沉淀，将菌体用PBS洗涤3次，每次以4℃，3500r/min离心20min，之后重悬于15mL的PBS缓冲液中，反复冻融3次，至菌体粘稠；
4℃冰浴中超声裂解菌体沉淀，待超声结束后于4℃，6000rpm/20min离心收集包涵体；
加入0.2％用solutionA配制的DOC 30ml混匀，室温静置30min，4℃，9000-10000rpm×20min离心收集沉淀包涵体；
用0.2％的DOC 30ml再次清洗包涵体7500rpm×20min离心；
用2％的用solutionA配制DOC 30ml混匀包涵体，室温静置30min；4℃9000-10000rpm×20min离心收集沉淀包涵体；
用solutionA配制0.9％的SKL，室温溶解包涵体1.5-2h；4℃7500rpm×20min离心，收集上清；
镍琼脂糖凝胶FF装柱，柱床体积约为10mL；
加至少5个柱体积的缓冲液1平衡柱子，流速1ml/min；
0.45μm滤器处理包涵体样品，与填料混匀，放到摇床上2～3h；
将混匀的填料样品倒回柱内，，静置，自然沉降，而后打开开关，放出流穿液；
用缓冲液1再洗2～5个柱床体积，流速为1mL/min；
用咪唑浓度分别为100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L洗脱缓冲液洗脱，中间各静置15min后，进行蛋白洗脱；收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；
用5个柱体积的缓冲液1洗脱柱子，20％的乙醇处理后，取出填料，4℃保存。
3.根据权利要求2所述的小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段的纯化表达方法，其特征在于，所述诱导时间为8h。
4.根据权利要求2所述的小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段的纯化表达方法，其特征在于，所述IPTG浓度为1.0mmol/L。
5.根据权利要求2所述的小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段的纯化表达方法，其特征在于，所述咪唑浓度分别为100mmol/L。
6.一种权利要求1-5任一项所述的小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位基因片段在制备小反刍兽疫抗原表位疫苗中的应用。
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