CN105018435A - 一种病毒样颗粒的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫学领域，尤其涉及一种病毒样颗粒的纯化方法。该方法将含有病毒样颗粒的液体依次经蔗糖浓缩、凝胶层析、陶瓷羟基磷灰石层析。陶瓷羟基磷灰石目前尚未见用于病毒样颗粒的纯化。而本发明应用陶瓷羟基磷灰缩短了纯化步骤，成功纯化出与天然病毒具有相似形态学特征的病毒样颗粒，纯化过程收率较高，纯化产物纯度良好。

Description

一种病毒样颗粒的纯化方法
技术领域
本发明涉及免疫学领域，尤其涉及一种病毒样颗粒的纯化方法。
背景技术
目前常见的疫苗种类有基因工程亚单位疫苗，DNA疫苗，病毒样颗粒疫苗，减毒活疫苗。其中，病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒核酸，不能自主复制。由于，VLPs和天然病毒形态相似，很大程度上保持了蛋白的自然结构，且VLP抗原决定簇及表位与真正的病毒没有本质区别，因此可以诱导激发较强的细胞免疫及体液免疫。并且，由于VLPs不含有病毒基因组核酸，因此具有相对较高的安全性。目前，VLPs疫苗被认为最具有潜力的疫苗。
虽然病毒样颗粒与活病毒有相似的形态学结构，但病毒样颗粒蛋白的性质可能与活病毒有差异，由于病毒样颗粒组装成的空间结构是什么能力使其形成正二十面体结构目前还不是很清楚，并且其大小与杆状病毒大小相近。这就给病毒样颗粒制备过程中的纯化带来了很多困难。
现有研究结果表明，选用常规的离子交换层析很难将目的蛋白与杂蛋白分离开来，对VLPs的纯化通常需要经过多个步骤。然而，在纯化过程中，每增加一个步骤就会对待纯化物造成一定的损失，步骤越多，收率越低。而病毒样颗粒的产生大多通过昆虫或酵母表达***获得，如纯化方式不当，则很难获得病毒样颗粒，这无疑限制了病毒样颗粒疫苗的广泛应用。
羟基磷灰石是由钙和磷酸盐成的化合物。陶瓷羟基磷灰石(CHT)中，磷酸离子与带正电的蛋白质以离子键结合，具有离子交换特性，可由NaCl浓度梯度或磷酸钠浓度梯度洗脱，其中的Ca2+离子与带负电蛋白质的自由羧基以金属螯合方式结合，该结合方式对NaCl不敏感，可由磷酸、钠浓度梯度洗脱。羟基磷灰石因陶瓷化工艺不同分为2种类型：I型和II型。现有研究结果认为，陶瓷羟基磷灰石I型对蛋白质具有更大的保留，对酸性蛋白质具有更大的动态载量，因此，陶瓷羟基磷灰石I型主要用于纯化大部分蛋白质(分子量一般在100kd以下)；陶瓷羟基磷灰石II型由于孔径较I型大，因而对抗体和部分 重组疫苗等大分子量蛋白质的动态载量更高，而对HSA几乎无保留，因而陶瓷羟基磷灰石II型更适合于抗体的纯化，同时II型对核酸具有更大的保留，能够分辩单、双链、超螺旋等各种高级结构的DNA，因而也适合纯化核酸但目前普遍认为，陶瓷羟基磷灰石在纯化过程中损失量过高，因此，尚无将陶瓷羟基磷灰石应用于病毒样颗粒的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种病毒样颗粒的纯化方法。该方法回收率高、制得的病毒样颗粒纯度大。
本发明提供的病毒样颗粒的纯化方法，包括以下步骤：将含有病毒样颗粒的液体依次经蔗糖浓缩、凝胶层析、陶瓷羟基磷灰石层析。
由于陶瓷羟基磷灰石具有良好的捕捉力和选择性，能够分离其他介质不能分离的各种比较难分离的，性质比较接近的生物分子，因此，采用CHT纯化能够大大减少纯化步骤，且所得产物纯度较高。尽管如此，现有研究结果表明，采用陶瓷羟基磷灰石层析的方法纯化样品损失量较高，收率较低，因此，陶瓷羟基磷灰石层析通常不适用于纯化浓度低、含量少的物质。而病毒样颗粒通常通过真菌或昆虫细胞表达产生，其产量通常较低，因此目前尚未有将陶瓷羟基磷灰石层析用于病毒样颗粒的纯化。本发明采用CHT层析，将病毒样颗粒与CHT特异性吸附，经洗脱去除大部分大分子蛋白和杂质蛋白。在本发明的实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的填料为CHT I型。
在本发明的实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液为PBS缓冲液；其中NaCl的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L；pH值为7.0～8.5。
在一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0.2mol/L～0.5mol/L，pH值为8.5。
作为优选，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0.5mol/L
在另一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L，pH值为8.0。
作为优选，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0.4mol/L。
在本发明的实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的洗脱液为PBS缓冲液；其中NaCl的浓度为1mol/L；pH值为7.0～8.5。
在一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的洗脱液的pH值为8.0。
PBS缓冲液，即磷酸缓冲盐溶液，其中包括NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4。本发明采用的PBS缓冲液中，KCl的浓度为2.7mmol/L，Na2HPO4的浓度为10mmol/L，KH2PO4的浓度为2mmol/L。本发明实验表明，固定PBS缓冲液中KCl、Na2HPO4和KH2PO4的浓度，而调整其中的NaCl的浓度，以低NaCl浓度的PBS来平衡层析柱，以高NaCl浓度的PBS来洗脱病毒样颗粒能够达到很好的纯化效果，且可以保证收率。实验表明，采用本发明提供给的方法，以陶瓷羟基磷灰石层析的方法纯化病毒样颗粒的收率为86.31％，而纯度可由60％～70％提升至95％。
在本发明的实施例中，凝胶层析的填料为superdex-500。
在凝胶层析步骤中，收集外水体积流穿峰。经过凝胶层析后，能够去除一些小分子蛋白。
在本发明的实施例中，凝胶层析平衡液为PBS缓冲液；其中NaCl的浓度为0.2mol/L～0.5mol/L；pH值为7.0～8.5。
在一些实施例中，凝胶层析的平衡液中NaCl的浓度为0.5mol/L，pH值为8.5。
蔗糖浓缩的主要目的是为了将目的蛋白进行富集，除去脂类和一些杂蛋白。蔗糖的浓度和离心的速度会对浓缩结果产生影响。
在本发明的实施例中，蔗糖浓缩具体为：将含有病毒样颗粒的液体与含有蔗糖的PBS缓冲液混合，27500rpm离心3～4小时；含有蔗糖的PBS缓冲液中蔗糖的质量分数为30％。
蔗糖浓缩采用的PBS缓冲液中，KCl的浓度为2.7mmol/L，Na2HPO4的浓度为10mmol/L，KH2PO4的浓度为2mmol/L，NaCl的浓度为137mmol/L。
经蔗糖浓缩，样品浓缩10～50倍。在一些实施例中，经蔗糖浓缩样品浓缩20倍。
本发明提供的纯化方法用于纯化EV71病毒样颗粒或CVA16病毒样颗粒。
作为优选，纯化EV71病毒样颗粒，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0.2mol/L～0.5mol/L，pH值为8.5。
优选的，纯化EV71病毒样颗粒，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0.5mol/L。
作为优选，纯化CVA16病毒样颗粒，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L，pH值为8.5。
优选的，纯化CVA16病毒样颗粒，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0.4mol/L。
在本发明的实施例中，含有病毒样颗粒的液体的制备方法为：以含有CVA16或EV71目的基因的杆状病毒感染昆虫细胞，培养至30％～40％的细胞出现病变；离心收获细胞，经反复冻融后，离心去除残渣，经过滤制得含有病毒样颗粒的液体。
采用本发明提供的方法纯化CVA16病毒或EV71病毒能够有效减少纯化步骤，经纯化后病毒样颗粒的纯度不低于95％，总收率不低于31％。
本发明还提供了一种EV71病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将EV71病毒的P1片段和3CD片段构建入pFastBAcdual载体，与大肠杆菌DH10BAC转座重组，获得含有EV71目的基因的表达载体；
步骤2：以含有EV71目的基因的表达载体转染昆虫细胞，培养、传代获得含有EV71目的基因的杆状病毒；
步骤3：以含有EV71目的基因的杆状病毒感染昆虫细胞，培养至30％～40％的细胞出现病变；离心收获细胞，经反复冻融后，离心去除残渣，经过滤制得含有病毒样颗粒的液体；
步骤4：将所述含有病毒样颗粒的液体依次经蔗糖浓缩、凝胶层析、陶瓷羟基磷灰石层析；制得EV71病毒样颗粒。
本发明还保护由本发明提供的制备方法制得的病毒样颗粒。
EV71病毒的P1片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，构建入pFastBAcdual载体采用的酶切位点为Pst I和HindⅢ。
EV71病毒的3CD片段如SEQ ID NO:2所示，构建入pFastBAcdual载体采用的酶切位点为Sph I和Kpn I。
在本发明提供的实施例中，昆虫细胞为SF9细胞。
在一些实施例中，步骤2中培养的时间为3～4天；传代的次数为2次。
在一些实施例中，步骤3中昆虫细胞经活化，具体方法为：将SF9细胞系培养在1L摇瓶中，按1：3比例分种，培养4天接种于WAVE生物反应器中培养。
在一些实施例中，步骤3中含有EV71目的基因的杆状病毒感染昆虫细胞的接种量MOI为0.5～1。
在一些实施例中，步骤3中培养的温度为27℃，时间为72h～96h。
在一些实施例中，步骤3中反复冻融的次数为3～4次。
在一些实施例中，步骤3中过滤采用0.45μm滤膜。
在一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的填料为CHT I型。
在一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液为PBS缓冲液；其中NaCl的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L；pH值为7.0～8.5。
在一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L，pH值为8.5。
作为优选，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0.5mol/L
在一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的洗脱液为PBS缓冲液；其中NaCl的浓度为1mol/L；pH值为7.0～7.5。
在一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的洗脱液的pH值为8.5。
在一些实施例中，凝胶层析的填料为superdex-500。
在一些实施例中，凝胶层析平衡液为PBS缓冲液；其中NaCl的浓度为0.2mol/L～0.5mol/L；pH值为7.0～8.5。
在一些实施例中，凝胶层析的平衡液中NaCl的浓度为0.4mol/L，pH值为8.5。
在本发明的实施例中，蔗糖浓缩具体为：将含有病毒样颗粒的液体与含有蔗糖的PBS缓冲液混合，27500rpm离心3～4小时；含有蔗糖的PBS缓冲液中蔗糖的质量分数为30％。
蔗糖浓缩采用的PBS缓冲液中，KCl的浓度为2.7mmol/L，Na2HPO4的浓度为10mmol/L，KH2PO4的浓度为2mmol/L，NaCl的浓度为137mmol/L。
经蔗糖浓缩，样品浓缩10～50倍。在一些实施例中，经蔗糖浓缩样品浓缩20倍。
本发明还提供了一种EV71病毒样颗粒疫苗，包括本发明提供的制备方法制得的EV71病毒样颗粒和佐剂。
在一些实施例中，佐剂为Al(OH)3佐剂。
作为优选，病毒样颗粒与Al(OH)3佐剂的质量比为(0.5～1)：(250～500)。
作为优选，本发明提供的EV71病毒样颗粒疫苗的免疫剂量为0.5μg/次～1μg/次。
本发明提供的纯化方法能够有效的纯化病毒样颗粒，去除细胞碎片及非目的蛋白，因此，以该方法制得的疫苗能够具有良好的品质。
本发明还提供了一种CVA16病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将CVA16病毒的P1片段和3CD片段构建入pFastBAcdual载体，与大肠杆菌DH10BAC转座重组，获得含有CVA16目的基因的表达载体；
步骤2：以含有CVA16目的基因的表达载体转染昆虫细胞，培养、传代获得含有CVA16目的基因的杆状病毒；
步骤3：以含有CVA16目的基因的杆状病毒感染昆虫细胞，培养至30％～40％的细胞出现病变；离心收获细胞，经反复冻融后，离心去除残渣，经过滤制得含有病毒样颗粒的液体；
步骤4：将含有病毒样颗粒的液体依次经蔗糖浓缩、凝胶层析、陶瓷羟基磷灰石层析；制得CVA16病毒样颗粒。
CVA16病毒的P1片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，构建入pFastBAcdual载体采用的酶切位点为Not I和Hind III。
CVA16病毒的3CD片段如SEQ ID NO:4所示，构建入pFastBAcdual载体采用的酶切位点为NCo I和Xho I。
在本发明提供的实施例中，昆虫细胞为SF9细胞。
在一些实施例中，步骤2中培养的时间为3～4天；传代的次数为2次。
在一些实施例中，步骤3中昆虫细胞经活化，具体方法为：将SF9细胞系培养在1L摇瓶中，按1：3比例分种，培养4天接种于WAVE生物反应器中培养。
在一些实施例中，步骤3中含有CVA16目的基因的杆状病毒感染昆虫细胞的接种量MOI为0.5～1。
在一些实施例中，步骤3中培养的温度为27℃，时间为72h～96h。
在一些实施例中，步骤3中反复冻融的次数为3～4次。
在一些实施例中，步骤3中过滤采用0.45μm滤膜。
在一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的填料为CHT I型。
在一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液为PBS缓冲液；其中NaCl 的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L；pH值为7.0～8.5。
在一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0.2mol/L～0.5mol/L，pH值为8.5。
作为优选，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0.4mol/L
在一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的洗脱液为PBS缓冲液；其中NaCl的浓度为1mol/L；pH值为7.0～8.5。
在一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的洗脱液的pH值为8.4。
在一些实施例中，凝胶层析的填料为superdex-500。
在一些实施例中，凝胶层析平衡液为PBS缓冲液；其中NaCl的浓度为0.2mol/L～0.5mol/L；pH值为7.0～8.5。
在一些实施例中，凝胶层析的平衡液中NaCl的浓度为0.4mol/L，pH值为7.4。
在本发明的实施例中，蔗糖浓缩具体为：将含有病毒样颗粒的液体与含有蔗糖的PBS缓冲液混合，27500rpm离心3～4小时；含有蔗糖的PBS缓冲液中蔗糖的质量分数为30％。
蔗糖浓缩采用的PBS缓冲液中，KCl的浓度为2.7mmol/L，Na2HPO4的浓度为10mmol/L，KH2PO4的浓度为2mmol/L，NaCl的浓度为137mmol/L。
经蔗糖浓缩，样品浓缩10～50倍。在一些实施例中，经蔗糖浓缩样品浓缩20倍。
本发明还提供了一种CVA16病毒样颗粒疫苗，包括本发明提供的制备方法制得的CVA16病毒样颗粒和佐剂。
在一些实施例中，佐剂为Al(OH)3佐剂。
作为优选，病毒样颗粒与Al(OH)3佐剂的质量比为(0.5～1)：(250～500)。
作为优选，本发明提供的CVA16病毒样颗粒疫苗的免疫剂量为0.5μg/次～1μg/次。
本发明提供的纯化方法能够有效的纯化病毒样颗粒，去除细胞碎片及非目的蛋白，因此，以该方法制得的疫苗能够具有良好的品质。
本发明提供了一种病毒样颗粒的纯化方法，该方法将含有病毒样颗粒的液体依次经蔗糖浓缩、凝胶层析、陶瓷羟基磷灰石层析。陶瓷羟基磷灰石目前尚未见用于病毒样颗粒的纯化，。本发明提供的方法缩短了纯化步骤，成功 纯化出病毒样颗粒，纯化过程收率较高，纯化产物纯度良好。
附图说明
图1示重组含有EV71目的基因的表达载体验证；
图2示含有EV71目的基因的杆状病毒滴度测定；
图3示实施例2凝胶过滤层析分析图；
图4示实施例2陶瓷羟基磷灰石层析分析图；
图5-a示电泳鉴定实施例2纯化的病毒样颗粒；
图5-b示免疫印迹鉴定实施例2纯化的病毒样颗粒；
图6示电镜鉴定实施例2纯化的病毒样颗粒；
图7示高效液相色谱分析实施例2纯化的病毒样颗粒；
图8示对比例1凝胶过滤层析分析图；
图9示电泳鉴定对比例1纯化的病毒样颗粒；
图10示电镜鉴定对比例1纯化的病毒样颗粒；
图11实施例11陶瓷羟基磷灰石层析分析图；
图12高效液相色谱分析实施例11纯化的病毒样颗粒。
具体实施方式
本发明提供了一种病毒样颗粒的纯化方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中，superdex-500购自GE公司；
陶瓷羟基磷灰石(CHTI型)购自Bio-Rad公司。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 含有EV71病毒样颗粒的液体的制备
一、制备重组杆状病毒
需用EV71流行株，基因合成全基因组，全基因组的genbank登录号为：EU703814.1。
设计引物扩增P1片段和3CD片段，并加入酶切位点。
其中，P1片段的酶切位点为PstI/HindⅢ，扩增引物序列为：
上游5’[CTGCAGGCCACCATGGGTTCGCAAGTGTCT]3’；如SEQ ID NO:5所示；
下游5’[AAGCTTTCAAAGAGTAGTGATCGCTGTGC]3’如SEQ ID NO:6所示；
3CD片段的酶切位点为SphI/KpnI，扩增引物序列为：
上游5’d[GCATGCGCCACCATGGGCCCGAGCCTTGA]3’如SEQ ID NO:7所示；
下游5’[GGTACCTCAAAATAACTCGAGCCAATTGC]3’如SEQ ID NO:8所示。
以基因合成全基因组为模板，分别通过PCR扩增，回收目的基因，分别将目的基因构建到pFastBAcdual双启动子表达载体上，构建得到pFastBAcdual-EV71(P1)-EV71(3CD)。将pFastBAcdual-EV71(P1)-EV71(3CD)与DH10a重组，获得重组子，经提取杆粒之后，以M13为引物PCR鉴定杆粒。(结果如图1)
PCR的程序为： 
M13的上游引物序列为5’d[GTTTTCCCAGTCACGAC]3’,
下游引物序列为5’d[CAGGAAACAGCTATGAC]3’
将检测正确的杆粒按Invitrogen说明书转染SF9昆虫细胞，昆虫细胞数6孔板每个孔为9×105个，转染试剂(CellfectinI)μL：杆粒μg为2:8。转染 的细胞经培养3～4天细胞出现病变，1000rpm离心10min收获细胞上清为P1杆状装病毒。持续感染2次SF9细胞扩增病毒为P3杆状病毒.
二：杆状病毒滴度测定
收获稳定生长期SF9昆虫细胞，在SFX培养基中制备细胞悬液，完全混匀，5×105细胞/ml，在6孔板各孔中加入2ml细胞悬液，27℃培养箱孵育过夜。病毒原液用培养基稀释，准备5个梯度稀释(如10-3～10-7，)的病毒悬液1ml，弃去原细胞培养液，依次加入6孔板相应孔中，每块板设置一细胞阴性对照，27℃培养箱孵育4-5小时。吸取细胞上层病毒悬液弃掉，轻轻加入1ml新鲜培养基进行洗涤，弃掉洗涤液，然后缓慢加入含中性红的营养琼脂糖培养基3ml(含0.8﹪低熔点琼脂糖，以1.5×空白培养基稀释，预先平衡至36-38℃)覆盖细胞，静置～30分钟，待琼脂糖完全凝固后放入27℃培养箱培养7～10天。确定病毒滴度。(结果如图2)，结果表明，病毒的滴度为5x108PFU/ml。
三、病毒样颗粒疫苗生产工艺流程
细胞培养：复苏工作库SF9细胞，将三只液氮冻存的细胞复苏接种到一个1L培养瓶中，培养3～4天后，按照1：4比例接种到4个1L培养瓶中，如此传代接种到WAVE生物反应器中。在细胞密度达到2×106个/L～3×106个/L时接种含有编码EV71目的基因的杆状病毒。
病毒接种：培养细胞密度达到2×106个/L～3×106个/L时接种含有编码EV71目的基因的杆状病毒。病毒接种量MOI为0.5～1，培养温度27℃，培养时间为72h～96h。
收获细胞：当细胞出现30％～40％左右病变时，连续流浓缩细胞悬液，离心收获细胞。冻融3～4次，离心去除细胞残渣。0.45μm滤膜过滤收获包含EV71病毒样颗粒的上清。
实施例2 EV71病毒样颗粒的纯化
蔗糖浓缩病毒样颗粒：将实施例1制得的包含EV71病毒样颗粒的上清置于30％蔗糖PBS溶液，27,500rpm，超速离心4小时，样品浓缩20倍。
凝胶过滤层析：superdex-500介质进行病毒纯化，平衡液体pH值为7.0的PBS缓冲溶液，氯化钠盐浓度为0.5mol/L，收集外水体积流穿峰。(图3)
陶瓷羟基磷灰石层析：陶瓷羟基磷灰石(CHTI型),平衡液体pH值为7.0的PBS缓冲溶液,氯化钠盐浓度为0.5mol/L。洗脱液体pH值为7.0的PBS缓冲溶液,氯化钠盐浓度为1mol/L。(图4)
实施例3 EV71病毒样颗粒的纯化
蔗糖浓缩病毒样颗粒：将实施例1制得的包含EV71病毒样颗粒的上清置于30％蔗糖PBS溶液，27,500rpm，超速离心4小时，样品浓缩20倍。
凝胶过滤层析：superdex-500介质进行病毒纯化，平衡液体pH值为7.5的PBS缓冲溶液，氯化钠盐浓度为0.5mol/L，收集外水体积流穿峰。
陶瓷羟基磷灰石层析：陶瓷羟基磷灰石(CHTI型),平衡液体pH值为7.5的PBS缓冲溶液,氯化钠盐浓度为0.5mol/L。洗脱液体pH值为7.5的PBS缓冲溶液,氯化钠盐浓度为1mol/L。
实施例4 EV71病毒样颗粒的鉴定
蛋白印迹：实施例2～3纯化之后的样品，常规方法电泳，电泳(图5-a)后转膜至PVDF膜，加入3％脱脂奶粉室温封闭3h，1％PBS-T洗涤3遍，每次5分钟，吸取3ul EV71兔多抗(自制)，按照1：1000稀释加入到10ml 1％脱脂奶粉，室温反应1.5h。1％PBS-T洗涤3遍，每次5分钟，加入10ml碱性磷酸酶溶液，含有显色剂NBT 66μL，BCIP 33μL，避光反应5～10分钟。(结果见图5-b)
电镜：实施例2～3纯化之后的样品，取样电镜观察(结果见图6)经电镜观察，纯化之后的EV71病毒样颗粒与EV71病毒具有相同的形态学特征。
以上结果表明，本发明成功制备并纯化出EV71病毒样颗粒。
对EV71病毒样颗粒的品质进行鉴定：
高效液相色谱柱分析样品纯度：HPLC-TSKRG5000，pH7.0～7.5的PBS缓冲溶液，氯化钠盐浓度为0.2mol/L～0.5mol/L。(结果见图7)
ELISA检测实施例2～3纯化过程中样品中病毒样颗粒的含量。
对实施例2的检测结果如表1所示：
表1实施例2纯化过程中样品中病毒样颗粒的含量
对实施例3的检测结果与此相似。
对比例1 EV71病毒样颗粒的纯化
将实施例1制得的包含EV71病毒样颗粒的上清使用不连续蔗糖密度梯度(15％，30％，65％蔗糖密度梯度)，30000g超速离心3小时后，收集15％～35％蔗糖界面上的乳白色条带，超速离心去除蔗糖并浓缩回收病毒。
用pH6.5～7.5的PBS平衡Sepharose6FFTM介质进行病毒纯化，收集外水体积流穿峰。杂蛋白去除可达95％以上。采用DEAE-SepharoseFFTM介质，平衡液为pH6.5～7.5、含有0.05mol/L～0.15mol/L氯化钠的PBS，洗脱液为含0.2mol/L～0.5mol/L氯化钠、pH6.5～7.5的PBS。(图8)
蛋白印迹：纯化之后的样品，常规方法电泳，电泳后转膜至PVDF膜，加入3％脱脂奶粉室温封闭3h，1％PBS-T洗涤3遍，每次5分钟，吸取3ul EV71兔多抗(自制)，按照1：1000稀释加入到10ml 1％脱脂奶粉，室温反应1.5h。1％PBS-T洗涤3遍，每次5分钟，加入10ml碱性磷酸酶溶液，含有显色剂NBT 66μL，BCIP 33μL，避光反应5～10分钟。(结果见图9)预期位置未见病毒样颗粒条带。
电镜：纯化之后的样品，取样电镜观察(结果见图10)经电镜观察，纯化之后的样品中未见病毒样颗粒的存在。
结果显示，采用对比例1的方式无法纯化得到病毒样颗粒。
实施例5 EV71病毒样颗粒疫苗的制备
将实施例2纯化后的EV71病毒样颗粒与氢氧化铝佐剂吸附。并溶与PBS 缓冲溶液中，其中病毒样颗粒与Al(OH)3佐剂的质量比为1μg：500μg。
实施例6 EV71病毒样颗粒疫苗的制备
将实施例3纯化后的EV71病毒样颗粒与氢氧化铝佐剂吸附。并溶与PBS缓冲溶液中，其中病毒样颗粒与Al(OH)3佐剂的质量比为1μg：500μg。
实施例7 疫苗纯度检测
根据《中国药典(第3版)》及《中国生物制品规程》测定实施例5～6制备的疫苗成品的外观，无菌试验，DNA含量，蛋白质含量等。结果见表2：
表2疫苗检定结果
项目 实施例5 实施例6
蛋白质含量 <120ug/剂量 <120ug/剂量
外观 透明液体 透明液体
鉴别试验 EV71抗原 EV71抗原
内毒素 <100EU/剂量 <100EU/剂量
无菌试验 阴性 阴性
pH 7.0～7.2 7.0～7.2
异常毒性 通过 通过
效力 通过 通过
实施例8：疫苗效力测定
配制：纯化后的两批EV71病毒样颗粒分别与氢氧化铝佐剂吸附。并溶与PBS缓冲溶液中，其中病毒样颗粒与AL(OH)3佐剂的质量比为1ug：0.5ug
小鼠免疫：取6-8周雌性ICR鼠，第一次免疫后第二十一天加强免疫。7天之后，眼球取血，4℃离心收集上清，每次腹腔免疫剂量为1ugEV71病毒样颗粒蛋白。
效价测定：将待检测血清56℃灭活30分钟之后，以不含有血清的MEM培养基23～215梯度稀释后加入含有100TCID50病毒，37℃孵箱反应1h。加入RD细胞(1×104细胞/孔)37℃孵箱孵育7天，观察CPE，计算抗体效价。 结果见表3：
表3疫苗效价结果
实施例5 实施例6
1：1024 1：2048
1：2048 1：1024
1：2048 1：2048
1：1536 1：1536
1：2048 1：1024
结果显示，本发明提供给的疫苗具有良好而稳定的效价。
实施例9 含有CVA16病毒样颗粒的液体的制备
一、制备重组杆状病毒
需CVA16流行株，基因合成全基因组，全基因组的genbank登录号为：AF177911.1。
设计引物扩增P1片段和3CD片段，并加入酶切位点。
其中，P1片段序列如SEQ ID NO:3所示，酶切位点为Not I和Hind III。，扩增引物序列为：
上游5’[GCGGCCGCGCCACCATGGGCTCGCAGGTC]3’；如SEQ ID NO:9所示；
下游5’[AAGCTTTTACAATGTTGTGATCTTGTCCC]3’如SEQ ID NO:10所示；
3CD片段序列如SEQ ID NO:4所示，酶切位点为Xho I和Sph I和，扩增引物序列为：
上游5’d[CCGCTCGAGGCCACCATGGGACCCT]3’如SEQ ID NO:11所示；
下游5’[ACATGCATGCTCAGAAGAGTTCCAGCCAGTTA]3’如SEQ ID NO:12所示。
以基因合成全基因组为模板，分别通过PCR扩增，回收目的基因，分别将目的基因构建到pFastBAcdual双启动子表达载体上，构建得到 pFastBAcdual-CVA16(P1)-CVA16(3CD)。将pFastBAcdual-CVA16(P1)-CVA16(3CD)与DH10a重组，获得重组子，经提取杆粒之后，以M13为引物PCR鉴定杆粒。(结果如图1)
PCR的程序为： 
M13的上游引物序列为5’d[GTTTTCCCAGTCACGAC]3’,
下游引物序列为5’d[CAGGAAACAGCTATGAC]3’
将检测正确的杆粒按Invitrogen说明书转染SF9昆虫细胞，昆虫细胞数6孔板每个孔为9×105个，转染试剂(CellfectinI)μL：杆粒μg为2:8。转染的细胞经培养3～4天细胞出现病变，1000rpm离心10min收获细胞上清为P1杆状装病毒。持续感染2次SF9细胞扩增病毒为P3杆状病毒.
二：杆状病毒滴度测定
收获稳定生长期SF9昆虫细胞，在SFX培养基中制备细胞悬液，完全混匀，5×105细胞/ml，在6孔板各孔中加入2ml细胞悬液，27℃培养箱孵育过夜。病毒原液用培养基稀释，准备5个梯度稀释(如10-3～10-7，)的病毒悬液1ml，弃去原细胞培养液，依次加入6孔板相应孔中，每块板设置一细胞阴性对照，27℃培养箱孵育4-5小时。吸取细胞上层病毒悬液弃掉，轻轻加入1ml新鲜培养基进行洗涤，弃掉洗涤液，然后缓慢加入含中性红的营养琼脂糖培养基3ml(含0.8﹪低熔点琼脂糖，以1.5×空白培养基稀释，预先平衡至36-38℃)覆盖细胞，静置～30分钟，待琼脂糖完全凝固后放入27℃培养箱培养7～10天。确定病毒滴度。(结果如图2)，结果表明，病毒的滴度为5x108PFU/ml。
三、病毒样颗粒疫苗生产工艺流程
细胞培养：复苏工作库SF9细胞，将三只液氮冻存的细胞复苏接种到一个1L培养瓶中，培养3～4天后，按照1：4比例接种到4个1L培养瓶中，如 此传代接种到WAVE生物反应器中。在细胞密度达到2×106个/L～3×106个/L时接种含有编码CVA16目的基因的杆状病毒。
病毒接种：培养细胞密度达到2×106个/L～3×106个/L时接种含有编码CVA16目的基因的杆状病毒。病毒接种量MOI为0.5～1，培养温度27℃，培养时间为72h～96h。
收获细胞：当细胞出现30％～40％左右病变时，连续流浓缩细胞悬液，离心收获细胞。冻融3～4次，离心去除细胞残渣。0.45μm滤膜过滤收获包含CVA16病毒样颗粒的上清。
实施例10 CVA16病毒样颗粒的纯化
收获含有CVA16目的基因的杆状病毒感染的昆虫细胞，冻融3-4次，离心去除细胞残渣。0.45um滤膜过滤收获上清。
蔗糖浓缩病毒样颗粒：上清置于30％蔗糖PBS溶液，27,500rpm，超速离心3小时，样品浓缩20倍，
凝胶过滤层析：superdex-500介质进行病毒纯化，平衡液体pH值为7.0的PBS缓冲溶液，氯化钠盐浓度为0.4mol/L，收集外水体积流穿峰。
陶瓷羟基磷灰石层析：陶瓷羟基磷灰石(CHTI型),平衡液体pH7.0的PBS缓冲溶液,氯化钠盐浓度为0.4mol/L。洗脱液体pH7.0的PBS缓冲溶液,氯化钠盐浓度为1mol/L。
实施例11 CVA16病毒样颗粒的纯化
收获含有CVA16目的基因的杆状病毒感染的昆虫细胞，冻融3-4次，离心去除细胞残渣。0.45um滤膜过滤收获上清。
蔗糖浓缩病毒样颗粒：上清置于30％蔗糖PBS溶液，27,500rpm，超速离心3小时，样品浓缩20倍，
凝胶过滤层析：superdex-500介质进行病毒纯化，平衡液体pH值为7.5的PBS缓冲溶液，氯化钠盐浓度为0.4mol/L，收集外水体积流穿峰。
陶瓷羟基磷灰石层析：陶瓷羟基磷灰石(CHTI型),平衡液体pH7.5的PBS缓冲溶液,氯化钠盐浓度为0.4mol/L。洗脱液体pH7.5的PBS缓冲溶液,氯化钠盐浓度为1mol/L。(如图11)
实施例12 CVA16病毒样颗粒的鉴定
电镜：实施例10～11纯化之后的样品，取样电镜观察经电镜观察，纯化之后的CVA16病毒样颗粒与CVA16病毒具有相同的形态学特征。
以上结果表明，本发明成功制备并纯化出CVA16病毒样颗粒。
对CVA16病毒样颗粒的品质进行鉴定：
高效液相色谱柱分析样品纯度：HPLC-TSKR G5000，pH7.0～8.5的PBS缓冲溶液，氯化钠盐浓度为0.2mol/L～0.5mol/L。(如图12)
ELISA检测实施例10～11纯化过程中样品中病毒样颗粒的含量。
对实施例10的检测结果如表1所示：
表4实施例10纯化过程中样品中病毒样颗粒的含量
对实施例11的检测结果与此相似。
实施例13 CVA16病毒样颗粒疫苗的制备
将实施例10纯化后的CVA16病毒样颗粒与氢氧化铝佐剂吸附。并溶与PBS缓冲溶液中，其中病毒样颗粒与Al(OH)3佐剂的质量比为1μg：500μg
实施例14 CVA16病毒样颗粒疫苗的制备
将实施例11纯化后的CVA16病毒样颗粒与氢氧化铝佐剂吸附。并溶与PBS缓冲溶液中，其中病毒样颗粒与Al(OH)3佐剂的质量比为1μg：500μg
实施例15 疫苗纯度检测
根据《中国药典(第3版)》及《中国生物制品规程》测定实施例13～14制备的疫苗成品的外观，无菌试验，DNA含量，蛋白质含量等。结果见表5：
表5疫苗检定结果
项目 实施例13 实施例14
蛋白质含量 <120ug/剂量 <120ug/剂量
外观 透明液体 透明液体
鉴别试验 EV71抗原 EV71抗原
内毒素 <100EU/剂量 <100EU/剂量
无菌试验 阴性 阴性
pH 7.0～7.2 7.0～7.2
异常毒性 通过 通过
效力 通过 通过
实施例16：疫苗效力测定
配制：纯化后的两批CVA16病毒样颗粒分别与氢氧化铝佐剂吸附。并溶与PBS缓冲溶液中，其中病毒样颗粒与AL(OH)3佐剂的质量比为1ug：0.5ug
小鼠免疫：取6-8周雌性ICR鼠，第一次免疫后第二十一天加强免疫。7天之后，眼球取血，4℃离心收集上清，每次腹腔免疫剂量为1ugEV71病毒样颗粒蛋白。
效价测定：将待检测血清56℃灭活30分钟之后，以不含有血清的MEM培养基23～215梯度稀释后加入含有100TCID50病毒，37℃孵箱反应1h。加入RD细胞(1×104细胞/孔)37℃孵箱孵育7天，观察CPE，计算抗体效价。结果见表3：
表6疫苗效价结果
实施例10 实施例11
1：256 1：128
1：512 1：512
1：512 1：256
1：256 1：256
1：512 1：512
结果显示，本发明提供给的疫苗具有良好而稳定的效价。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (13)

1.一种病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，包括：将含有病毒样颗粒的液体依次经蔗糖浓缩、凝胶层析、陶瓷羟基磷灰石层析。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液为PBS缓冲液；其中NaCl的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L；pH值为7.0～8.5。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述陶瓷羟基磷灰石层析的洗脱液为PBS缓冲液；其中NaCl的浓度为1mol/L；pH值为7.0～8.5。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述凝胶层析的填料为superdex-500；所述凝胶层析平衡液为PBS缓冲液；其中NaCl的浓度为0.2mol/L～0.5mol/L；pH值为7.0～8.5。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述蔗糖浓缩具体为：将含有病毒样颗粒的液体与含有蔗糖的PBS缓冲液混合，27500rpm离心3～4小时；所述含有蔗糖的PBS缓冲液中蔗糖的质量分数为30％。
6.根据权利要求1～5任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述病毒样颗粒为EV71病毒样颗粒或CVA16病毒样颗粒。
7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述含有病毒样颗粒的液体的制备方法为：以含有CVA16或EV71目的基因的杆状病毒感染昆虫细胞，培养至30％～40％的细胞出现病变；离心收获细胞，经反复冻融后，离心去除残渣，经过滤制得含有病毒样颗粒的液体。
8.一种EV71病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将EV71病毒的P1片段和3CD片段构建入pFastBAcdual载体，与大肠杆菌DH10BAC转座重组，获得含有EV71目的基因的表达载体；
步骤2：以所述含有EV71目的基因的表达载体转染昆虫细胞，培养、传代获得含有EV71目的基因的杆状病毒；
步骤3：以所述含有EV71目的基因的杆状病毒感染昆虫细胞，培养至30％～40％的细胞出现病变；离心收获细胞，经反复冻融后，离心去除残渣，经过滤制得含有病毒样颗粒的液体；
步骤4：将所述含有病毒样颗粒的液体依次经蔗糖浓缩、凝胶层析、陶瓷羟基磷灰石层析；制得EV71病毒样颗粒。
9.如权利要求8所述制备方法制得的病毒样颗粒。
10.一种EV71病毒样颗粒疫苗，其特征在于，包括如权利要求8所述制备方法制得的病毒样颗粒和佐剂。
11.一种CVA16病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将CVA16病毒的P1片段和3CD片段构建入pFastBAcdual载体，与大肠杆菌DH10BAC转座重组，获得含有CVA16目的基因的表达载体；
步骤2：以所述含有CVA16目的基因的表达载体转染昆虫细胞，培养、传代获得含有CVA16目的基因的杆状病毒；
步骤3：以所述含有CVA16目的基因的杆状病毒感染昆虫细胞，培养至30％～40％的细胞出现病变；离心收获细胞，经反复冻融后，离心去除残渣，经过滤制得含有病毒样颗粒的液体；
步骤4：将所述含有病毒样颗粒的液体依次经蔗糖浓缩、凝胶层析、陶瓷羟基磷灰石层析；制得CVA16病毒样颗粒。
12.如权利要求11所述制备方法制得的病毒样颗粒。
13.一种CVA16病毒样颗粒疫苗，其特征在于，包括如权利要求11所述制备方法制得的病毒样颗粒和佐剂。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106754765A (zh) * 2016-12-20 2017-05-31 吉林大学 一种新城疫病毒样颗粒、制备方法及其应用
CN108531464A (zh) * 2017-03-06 2018-09-14 广州瑞贝斯药业有限公司 一种狂犬病毒颗粒的纯化方法
CN113637054A (zh) * 2021-08-30 2021-11-12 雪莱(武汉)生物医药技术有限公司 一种重组仙台病毒样颗粒的纯化方法及其应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109680026B (zh) * 2019-02-28 2022-12-27 深圳鑫泰康生物科技有限公司 重组ca16病毒样颗粒的纯化、在疫苗中的应用及疫苗
CN114008067A (zh) * 2019-07-04 2022-02-01 株式会社钟化 病毒或病毒样颗粒的纯化方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101487010A (zh) * 2008-01-15 2009-07-22 上海泽润生物科技有限公司 用毕赤酵母表达***制备抗人***瘤病毒18型感染的疫苗的方法
CN101695569A (zh) * 2009-11-03 2010-04-21 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种手足口病单、双价基因工程亚单位疫苗及其制备方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102465144A (zh) * 2010-11-19 2012-05-23 中国科学院上海巴斯德研究所 柯萨奇病毒a16型病毒样颗粒疫苗
CN102533797B (zh) * 2012-01-12 2013-06-19 北京工业大学 重组柯萨奇病毒a16型病毒样颗粒的制备方法及其应用
CN102925476B (zh) * 2012-11-15 2014-12-03 中国科学院上海巴斯德研究所 酵母中自组装的具有免疫原性的肠道病毒病毒样颗粒的制备方法及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101487010A (zh) * 2008-01-15 2009-07-22 上海泽润生物科技有限公司 用毕赤酵母表达***制备抗人***瘤病毒18型感染的疫苗的方法
CN101695569A (zh) * 2009-11-03 2010-04-21 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种手足口病单、双价基因工程亚单位疫苗及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NAKAMURA S等: "Effect of calcium ion concentrations on osteogenic differentiation and hematopietic stem cell niche-related protein expressions in osteoblasts", 《TISSUE ENGINEERING》 *
张喜珍等: "HIV-1病毒样颗粒的纯化及其免疫原性", 《中国生物制品学杂志》 *
程立等: "小鼠白血病病毒的分离及其鉴定——III凝胶层析分离的L6565病毒的致白血病活性", 《复旦学报》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106754765A (zh) * 2016-12-20 2017-05-31 吉林大学 一种新城疫病毒样颗粒、制备方法及其应用
CN106754765B (zh) * 2016-12-20 2020-07-17 吉林大学 一种新城疫病毒样颗粒、制备方法及其应用
CN108531464A (zh) * 2017-03-06 2018-09-14 广州瑞贝斯药业有限公司 一种狂犬病毒颗粒的纯化方法
CN108531464B (zh) * 2017-03-06 2019-04-23 广州瑞贝斯药业有限公司 一种狂犬病毒颗粒的纯化方法
CN113637054A (zh) * 2021-08-30 2021-11-12 雪莱(武汉)生物医药技术有限公司 一种重组仙台病毒样颗粒的纯化方法及其应用
CN113637054B (zh) * 2021-08-30 2023-10-03 雪莱(武汉)生物医药技术有限公司 一种重组仙台病毒样颗粒的纯化方法及其应用

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