CN101643737A - 化学合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用 - Google Patents

Abstract

本发明化学合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。本发明通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区片段，第1个氨基酸至第284个氨基酸，共284个氨基酸，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技术表达该基因片段、制备HSV1病毒gD糖蛋白的强抗原表位片段及HSV1病毒gD糖蛋白的抗血清。表达的HSV1病毒gD糖蛋白可用于疫苗、HSV1病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HSV1病毒单抗和多抗等。

Description

化学合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用

技术领域

本发明是化学合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组HSV1病毒gD糖蛋白。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV1病毒的gD糖蛋白胞外区片段，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于疫苗及HSV1病毒抗体或抗原的检测等，本发明涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。

背景技术

单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)是最早发现的人类疱疹病毒，容易导致复发性感染和潜伏感染，对人体危害严重，分为HSV-1及HSV-2两个血清型。1型单纯疱疹病毒主要引起口面部感染、眼部感染和疱疹性脑炎等；而2型主要引起生殖器感染，并且和女性***的发生密切相关。近年HSV1的感染显著增多，约占该病的10％～40％。目前药物治疗HSV感染时常出现相应耐药性，所以研制疫苗是切实可行的有效方法，它能使机体在抗HSV感染免疫中，发挥体液免疫和细胞免疫功能来消除HSV感染。至今已研制了多种HSV疫苗，已有两种HSV糖蛋白疫苗进入III期临床试验，即Chiron公司研制的重组gD2/gB2糖蛋白与MF59佐剂配伍而成的疫苗以及Glaxo Smith Kline(GSK)公司开发的重组gD2糖蛋白与另一佐剂(3-de-O-酰化单磷酸类脂A和明矾)配伍而成的疫苗，这两种疫苗均有一定的保护作用，但临床效果有限。国内目前对HSV疫苗的研究，主要集中在DNA核酸疫苗的探索研究方面。

目前认为HSV基因组有34个基因，编码70多种蛋白质，其中胞膜糖蛋白正式命名的有12种，它们以独特或复合体的形式在HSV复制循环及病毒的感染致病中发挥不同的作用。其中gD由HSV的US6基因编码，是病毒胞膜的主要成分，对于病毒与细胞稳定结合具有重要意义，促进病毒胞膜和细胞间的溶解，介导病毒的胞间扩散、释放。同时gD蛋白在病毒的复制和刺激中和抗体的产生中起重要作用，也是宿主细胞免疫和体液免疫反应的主要靶标之一，因此HSV1gD糖蛋白是构建HSV基因疫苗理想的目的基因。

HSV1病毒gD糖蛋白基因全长1185bp，编码312个氨基酸序列的胞外区、54个氨基酸序列的跨膜区、28氨基酸序列的胞内区。研究表明，为增强编码抗原蛋白的免疫原性，可去除其部分功能性编码序列，特别在完整抗原蛋白对宿主具有毒性或免疫抑制作用的情况下，对抗原蛋白进行截短表达就尤其重要。而截短后的gD基因构建的疫苗，与用完整gD基因构建的疫苗对HSV1病毒攻击具有相同的保护作用。故本研究通过计算机分析，我们筛选出含强抗原表位的HSV1病毒的gD糖蛋白胞外区片段，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达产物具有较好的抗原性和免疫原性，表达的蛋白可用于疫苗及HSV1病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HSV1病毒单抗和多抗等。

发明内容

本发明是化学合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组HSV1病毒gD糖蛋白胞外区片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区片段，第1个氨基酸到第284个氨基酸，共284个氨基酸，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达该基因。表达的蛋白可用于疫苗、HSV1病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HSV1病毒单抗和多抗等。

化学合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用是采取以下步骤实施的：

1.HSV1病毒gD糖蛋白胞外区抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：

利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析HSV1病毒gD糖蛋白的氨基酸序列，发现gD糖蛋白的N端(第1氨基酸到第284氨基酸)含有较强的抗原决定簇。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5’端增加了Hind III酶切位点(下画线部分)，转录调控序列(GCCGCCACC)，起始密码子(ATG)，人IgG κ轻链信号肽(波浪线部分)，8×His标签及TEV蛋白酶酶切位点(gaaaacctgtacttccagggt)，在3’端增加了终止密码子(TAA)和BamH I酶切位点(下画线部分)，使该基因片段易于克隆至质粒pCEP4内的Hind III和BamH I酶切位点内，并且使gD蛋白更易于表达和纯化。

筛选的HSV1病毒gD糖蛋白内的抗原表位氨基酸序列(第1个氨基酸到第284个氨基酸)：

Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp

Leu Pro Val Leu Asp Pro Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Arg Arg Val Tyr His Ile Gln Ala

Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu

Arg Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala

Ser Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly Gly Asn

Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala

Cys Pro Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp

Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu Val

Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys

Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln

Gly Val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val

Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu

Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro

Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Val Gly

化学合成的含HSV1病毒gD糖蛋白胞外区抗原表位基因的DNA序列(981bp)：

AAGCTT GCC GCC ACC ATG

CAT CAT CAC CAT CAC CAT CAC CAT GAA AAC CTG TAC TTC CAG GGT AAG TAC

GCT CTG GCC GAT GCT AGC CTG AAG ATG GCT GAT CCT AAC CGC TTC AGA GGT AAG GAC CTG CCT

GTG CTG GAC CAG CTG ACC GAC CCT CCT GGC GTG CGC AGA GTG TAC CAC ATT CAG GCT GGT CTG

CCT GAC CCT TTC CAG CCT CCT AGC CTG CCT ATC ACC GTG TAC TAC GCC GTG CTG GAG AGA GCC

TGT CGC AGC GTG CTG CTG AAC GCT CCT AGC GAG GCT CCT CAG ATC GTG AGA GGT GCT AGC GAA

GAC GTG AGG AAG CAG CCT TAC AAC CTG ACC ATC GCC TGG TTC AGG ATG GGT GGT AAC TGT GCT

ATC CCT ATC ACC GTG ATG GAG TAC ACC GAG TGT TCT TAC AAC AAG AGC CTG GGC GCT TGT CCT

ATC CGC ACC CAG CCT AGG TGG AAC TAC TAC GAC AGC TTC AGC GCT GTG AGC GAG GAC AAC CTG

GGC TTC CTG ATG CAC GCT CCT GCC TTC GAG ACC GCT GGC ACC TAC CTG AGG CTG GTG AAG ATC

AAC GAC TGG ACC GAG ATC ACC CAG TTC ATC CTG GAG CAC AGA GCC AAG GGT AGC TGT AAG TAC

GCT CTG CCT CTG AGA ATC CCT CCT AGC GCT TGT CTG AGC CCT CAG GCC TAC CAG CAA GGC GTG

ACC GTG GAC AGC ATC GGT ATG CTG CCT CGC TTC ATC CCT GAG AAC CAG AGG ACC GTG GCT GTG

TAC AGC CTG AAG ATC GCT GGC TGG CAC GGT CCT AAG GCT CCT TAC ACC AGC ACT CTG CTG CCT

CCT GAG CTG AGC GAG ACC CCT AAC GCC ACT CAG CCT GAG CTG GCT CCT GAG GAC CCT GAG GAC

AGC GCT CTG CTG GAG GAC CCT GTG GGT TAA GGATCC

2.表达HSV1病毒gD糖蛋白胞外区片段重组质粒的构建：

提取质粒pCEP4，用Hind III和BamH I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内。同样用Hind III和BamH I双酶切化学合成的HSV1病毒gD糖蛋白基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内。

取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连接，使HSV1病毒gD糖蛋白基因片段***到真核质粒pCEP4内的Hind III和BamH I位点之间，构成重组真核表达载体pCEP4-gD1。

3.重组质粒的筛选与鉴定：

将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，涂布含氨苄青霉素(100ug/ml)LB平板，置37℃过夜。次日随机挑取转化菌落和1个对照菌(质粒pCEP4转化菌)，分别提取质粒，以提取的质粒为模板，PCR扩增HSV1病毒gD糖蛋白胞外区基因片段，含HSV1病毒gD糖蛋白胞外区基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长约981bp的基因片段。将含有外源基因的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有合成的HSV1病毒gD糖蛋白基因片段，序列完全正确：

AAGCTT GCC GCC ACC ATG GAA ACC CCA GCG CAG CTT CTC TTC CTC CTG CTA CTC TGG CTC CCA

GAT ACC ACC GGA CAT CAT CAC CAT CAC CAT CAC CAT GAA AAC CTG TAC TTC CAG GGT AAG TAC

GCT CTG GCC GAT GCT AGC CTG AAG ATG GCT GAT CCT AAC CGC TTC AGA GGT AAG GAC CTG CCT

GTG CTG GAC CAG CTG ACC GAC CCT CCT GGC GTG CGC AGA GTG TAC CAC ATT CAG GCT GGT CTG

CCT GAC CCT TTC CAG CCT CCT AGC CTG CCT ATC ACC GTG TAC TAC GCC GTG CTG GAG AGA GCC

TGT CGC AGC GTG CTG CTG AAC GCT CCT AGC GAG GCT CCT CAG ATC GTG AGA GGT GCT AGC GAA

GAC GTG AGG AAG CAG CCT TAC AAC CTG ACC ATC GCC TGG TTC AGG ATG GGT GGT AAC TGT GCT

ATC CCT ATC ACC GTG ATG GAG TAC ACC GAG TGT TCT TAC AAC AAG AGC CTG GGC GCT TGT CCT

ATC CGC ACC CAG CCT AGG TGG AAC TAC TAC GAC AGC TTC AGC GCT GTG AGC GAG GAC AAC CTG

GGC TTC CTG ATG CAC GCT CCT GCC TTC GAG ACC GCT GGC ACC TAC CTG AGG CTG GTG AAG ATC

AAC GAC TGG ACC GAG ATC ACC CAG TTC ATC CTG GAG CAC AGA GCC AAG GGT AGC TGT AAG TAC

GCT CTG CCT CTG AGA ATC CCT CCT AGC GCT TGT CTG AGC CCT CAG GCC TAC CAG CAA GGC GTG

ACC GTG GAC AGC ATC GGT ATG CTG CCT CGC TTC ATC CCT GAG AAC CAG AGG ACC GTG GCT GTG

TAC AGC CTG AAG ATC GCT GGC TGG CAC GGT CCT AAG GCT CCT TAC ACC AGC ACT CTG CTG CCT

CCT GAG CTG AGC GAG ACC CCT AAC GCC ACT CAG CCT GAG CTG GCT CCT GAG GAC CCT GAG GAC

AGC GCT CTG CTG GAG GAC CCT GTG GGT TAA GGATCC

构建的重组质粒表达HSV1的病毒gD糖蛋白胞外区片段(284个氨基酸)，在其N端添加了8×His标签(8个氨基酸)及TEV蛋白酶酶切位点(7个氨基酸)，全长299个氨基酸，其氨基酸序列如下：

His His His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Asp

Ala Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro Val Leu Asp Pro

Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Arg Arg Val Tyr His Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe

Gln Pro Pro Ser Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser Val

Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala Ser Glu Asp Val Arg Lys

Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr

Val Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr Gln

Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe Leu Met

His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr

Glu Ile Thr Gln Phe Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu

Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly Val Thr Val Asp Ser

Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val Ala Val Tyr Ser Leu Lys

Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser

Glu Thr Pro Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu

Glu Asp Pro Val Gly

4.重组质粒的真核转染与细胞表达上清的蛋白检测：

提取阳性重组质粒pCEP4-gD1，用脂质体转染法对HEK293细胞进行转染，37℃，5％CO₂温箱培养48小时后，收集细胞上清进行SDS-PAGE电泳检测，同时以1∶10000稀释的anti-His抗体对带有His标签的蛋白的表达情况进行Western Blot检测，转染细胞表达相对分子量约为46kDa的HSV1病毒gD重组糖蛋白，而阴性对照质粒pCEP4无此蛋白带。

5.表达的HSV1病毒gD糖蛋白的纯化：

将Ni-Sepharose 6Fast Flow亲和层析柱连接至常压层析***，先用平衡液冲洗平衡，细胞上清液加Ni-Sepharose 6Fast Flow凝胶室温结合，上柱后收集穿透液。用平衡缓冲液洗涤柱子，接着用含500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，SDS-PAGE电泳及Western Blot检测目的蛋白。

6.ELISA检测纯化的HSV1病毒gD糖蛋白的抗原性：

将纯化的重组蛋白用PBS倍比稀释，并将阴性对照以同样浓度稀释后包被酶联板，羊抗HSV1+HSV2多抗作为一抗，兔抗山羊IgG-HRP作为二抗，间接酶联免疫法检测纯化蛋白gD1的抗原性和特异性。结果显示(表1)表达的重组蛋白具有较好的抗原性和特异性。

7.ELISA检测纯化的HSV1病毒gD糖蛋白的免疫原性：

1)HSV1病毒gD糖蛋白抗血清的制备

将纯化的重组蛋白与福氏佐剂混合后分别于第1，3，5周腹腔注射免疫小鼠(阴性对照组注射PBS)，并于第3，5，7周眼眶采血。血液37℃放置1h后4℃过夜，2000rpm离心20分钟，取上清，4℃，12000rpm离心20分钟，取上清即得HSV1病毒gD糖蛋白的抗血清。

2)HSV1病毒gD糖蛋白抗血清效价检测：

将纯化的重组蛋白用PBS按1∶100稀释后包被酶联板，抗血清梯度稀释后作为一抗，二抗用羊抗小鼠IgG-HRP，间接酶联免疫法测抗血清效价，阳性血清能与HSV1病毒gD糖蛋白反应，阴性血清则不能。间接ELISA结果显示(表2)表达的重组蛋白具有较好的免疫原性。

8.将表达的HSV1病毒gD糖蛋白片段，用于疫苗、HSV1病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HSV1病毒单抗和多抗等。

9.将合成的HSV1病毒gD糖蛋白基因片段与其他基因片段连接，以融合蛋白的形式进行表达、制备。

上述方法制备的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区基因片段在制备HSV1病毒亚单位疫苗中的应用。

化学合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区基因片段，可利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。

所述方法制备的化学合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区基因片段在制备HSV1病毒疫苗及检测试剂中的应用。

本发明与现有技术相比具有的优点

1.本发明表达的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区片段用作抗原，制备HSV1病毒抗体的酶联免疫检测试剂盒，具有生产较安全、成本低、与其他病毒交叉反应少等优点。

2.HSV1病毒的gD糖蛋白是病毒胞膜的主要成分，在病毒的复制和刺激中和抗体的产生中起重要作用，也是宿主细胞免疫和体液免疫反应的主要靶标之一，因此HSV1病毒gD糖蛋白是构建HSV疫苗理想的目的基因。本发明选择了其强抗原表位，利用基因工程技术表达制备，为研制基因工程疫苗奠定基础。基因工程疫苗安全、成本低。

3.本研究采用真核细胞表达***，表达的蛋白产物能正确地完成折叠、磷酸化、糖基化、二硫键形成、酰基化、蛋白酶加工等蛋白质翻译后加工过程，得到的重组蛋白有较高的生物学活性。

4.本发明根据筛选出的HSV1病毒的gD糖蛋白胞外区片段氨基酸序列，选用真核及原核细胞均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在N端添加人IgG κ轻链信号肽，适宜在哺乳动物细胞中高表达。

5.本发明构建的表达的HSV1病毒的gD糖蛋白的工程细胞，蛋白表达量高，可溶性好，易于纯化，并且具有较好的抗原性和免疫原性。

附图说明

以下将结合附图对本发明作进一步说明：

图1是表达HSV1病毒的gD糖蛋白的重组质粒构建流程图。

图2是1％的Agarose凝胶检测8个重组子的PCR扩增产物。Lane 1：以化学合成含HSV1病毒gD糖蛋白胞外区抗原表位基因的DNA序列为模板PCR扩增产物，阳性对照；Lane 2：以空质粒pCEP4为模板PCR扩增产物，阴性对照；Lane 3-10：1-8号转化子PCR扩增产物，其中2，4，5，7号转化子扩增出981bp的目的基因片段，即图内箭头标示的位置；Lane M：DL2000Marker(TaKaRa)。

图3是1％的Agarose凝胶检测阳性重组子的PCR扩增产物和酶切鉴定产物。Lane 1：4号阳性重组子PCR扩增产物；Lane 2：4号阳性重组子酶切鉴定产物；Lane M：DL2000Marker(TaKaRa)。

图4是表达重组HSV1病毒gD糖蛋白的细胞上清Western Blot检测。Lane M：标准分子量蛋白Marker；Lane 1：Multiple-tag，阳性对照；Lane 2：空质粒pCEP4转染的细胞上清，阴性对照；Lane 3：转染重组质粒pCEP4-gD1的细胞上清。

图5是纯化的重组HSV1病毒gD糖蛋白Western Blot检测。Lane 1：纯化后的重组HSV1病毒gD糖蛋白；Lane 2：空质粒pCEP4转染的细胞上清，阴性对照；Lane 3：标准分子量蛋白Marker；Lane 4：25ng Multiple-tag，阳性对照。

具体实施方式

本发明实施方式的详细说明：

HSV1病毒的gD糖蛋白抗原表位的分析、基因合成及载体构建

通过计算机分析HSV1病毒的gD糖蛋白的全部氨基酸序列，筛选出HSV1病毒gD糖蛋白内的强抗原表位，选用原核及真核均偏爱的密码子，化学合成HSV1病毒的gD糖蛋白含强抗原表位的全新基因片段。将基因片段克隆至质粒pCEP4内的Hind III/BamH I位点，构建重组真核表达载体pCEP4-gD1。

材料与方法

1.菌种与质粒：

大肠杆菌DH5α及真核表达载体pCEP4由本实验室保存。

2.试剂和仪器：

PrimerSTAR HS DNA Polymerase，dNTP，Hind III，BamH I，T4 DNA连接酶，质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为TaKaRa公司产品。TAE电泳缓冲液、SDS-PAGE蛋白电泳试剂等由本室配制(配方参考《精编分子生物学实验指南》)。PCR扩增仪；高速冷冻离心机(美国Beckman公司)；琼脂糖凝胶电泳装置；蛋白电泳装置(Bio-Rad公司)；脱色摇床(江苏兴化市分析仪器厂)。

3.基因片段的合成：

由公司帮助合成。

4.表达HSV1病毒gD糖蛋白胞外区片段重组质粒的构建：

提取质粒pCEP4，用Hind III和BamH I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内。同样用Hind III和BamH I双酶切化学合成的HSV1病毒gD糖蛋白基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内。取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连接，使HSV1病毒gD糖蛋白基因片段***到真核质粒pCEP4内的Hind III和BamH I位点之间，构成重组真核表达载体pCEP4-gD1。

5.重组质粒的筛选与鉴定：

将上步连接的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α，将转化产物涂布含氨苄青霉素(100ug/ml)的固体LB培养基上，置37℃培养过夜。次日随机挑选8个转化子菌落(分别标记为1-8号)和1个对照菌(质粒pCEP4转化菌)，分别接种到含3ml液体LB培养基(含氨苄青霉素100ug/ml)的试管内，置37℃振荡培养5小时，取菌液1ml，离心收菌。分别用50ul去离子水悬浮菌体，沸水煮5分钟，4℃，12000rpm离心5分钟，取上清(内有质粒)2ul用作PCR模板，PCR扩增***载体内的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区截短形式基因片段，PCR反应浓度为：质粒模板2ul、HSV1病毒gD糖蛋白胞外区基因片段的正链引物P1(GCAAGCTTGCCGCCACCATGGAA)和负链引物P2(GCGGATCCTTAACCCACAGGGTC)各1ul、10×pyrobest buffer 2.0ul、2.5mmol/L dNTP 2.0ul、PrimerSTAR HS DNA聚合酶0.5ul(1.25U)、去离子水11.5ul，总体积20ul。扩增条件为：98℃预变性1分钟，98℃10秒、55℃10秒、72℃1分钟，30个循环，最后72C延伸7分钟。取PCR扩增产物5ul，用1.0％的Agarose凝胶检测，阳性转化子应能扩增出981bp的目的片段，而空质粒转化菌无此带。用Hind III和BamH I酶双酶切，重组质粒酶切产物应在975bp、10200bp处出现条带。

6.DNA序列分析：

用QIAGEN公司质粒纯化试剂盒纯化质粒，用DNA全自动测序仪测序。

结果

1.HSV1病毒的gD糖蛋白抗原表位筛选及基因片段的合成：

利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析HSV1病毒的gD糖蛋白的全部氨基酸序列(GeneBank，登录号：EF157320)，筛选出HSV1病毒的gD糖蛋白内的强抗原表位，即从第1个氨基酸到第284个氨基酸，其氨基酸序列如下：

Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp

Leu Pro Val Leu Asp Pro Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Arg Arg Val Tyr His Ile Gln Ala

Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu

Arg Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala

Ser Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly Gly Asn

Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala

Cys Pro Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp

Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu Val

Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys

Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln

Gly Val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val

Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu

Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro

Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Val Gly

根据筛选的HSV1病毒gD糖蛋白内的抗原表位氨基酸序列，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5’端增加了Hind III酶切位点(下画线部分)，转录调控序列(GCCGCCACC)，起始密码子(ATG)，人IgG κ轻链信号肽(波浪线部分)，8×His标签及TEV蛋白酶酶切位点(gaaaacctgtacttccagggt)，在3’端增加了终止密码子(TAA)和BamH I酶切位点(下画线部分)，使该基因片段易于克隆至质粒pCEP4内的Hind III和BamHI酶切位点内，并且使gD蛋白更易于表达和纯化。化学合成的含HSV1病毒gD糖蛋白抗原表位基因的DNA序列(981bp)如下：

AAGCTT GCC GCC ACC ATG

CAT CAT CAC CAT CAC CAT CAC CAT GAA AAC CTG TAC TTC CAG GGTAAG TAC

GCT CTG GCC GAT GCT AGC CTG AAG ATG GCT GAT CCT AAC CGC TTC AGA GGT AAG GAC CTG CCT

GTG CTG GAC CAG CTG ACC GAC CCT CCT GGC GTG CGC AGA GTG TAC CAC ATT CAG GCT GGT CTG

CCT GAC CCT TTC CAG CCT CCT AGC CTG CCT ATC ACC GTG TAC TAC GCC GTG CTG GAG AGA GCC

TGT CGC AGC GTG CTG CTG AAC GCT CCT AGC GAG GCT CCT CAG ATC GTG AGA GGT GCT AGC GAA

GAC GTG AGG AAG CAG CCT TAC AAC CTG ACC ATC GCC TGG TTC AGG ATG GGT GGT AAC TGT GCT

ATC CCT ATC ACC GTG ATG GAG TAC ACC GAG TGT TCT TAC AAC AAG AGC CTG GGC GCT TGT CCT

ATC CGC ACC CAG CCT AGG TGG AAC TAC TAC GAC AGC TTC AGC GCT GTG AGC GAG GAC AAC CTG

GGC TTC CTG ATG CAC GCT CCT GCC TTC GAG ACC GCT GGC ACC TAC CTG AGG CTG GTG AAG ATC

AAC GAC TGG ACC GAG ATC ACC CAG TTC ATC CTG GAG CAC AGA GCC AAG GGT AGC TGT AAG TAC

GCT CTG CCT CTG AGA ATC CCT CCT AGC GCT TGT CTG AGC CCT CAG GCC TAC CAG CAA GGC GTG

ACC GTG GAC AGC ATC GGT ATG CTG CCT CGC TTC ATC CCT GAG AAC CAG AGG ACC GTG GCT GTG

TAC AGC CTG AAG ATC GCT GGC TGG CAC GGT CCT AAG GCT CCT TAC ACC AGC ACT CTG CTG CCT

CCT GAG CTG AGC GAG ACC CCT AAC GCC ACT CAG CCT GAG CTG GCT CCT GAG GAC CCT GAG GAC

AGC GCT CTG CTG GAG GAC CCT GTG GGT TAA GGATCC

2.表达HSV1病毒gD糖蛋白胞外区片段重组质粒的构建：

将目的基因克隆到pCEP4载体的Hind III和BamH I酶切位点之间，构成重组真核表达载体pCEP4-gD1。(构建流程见图1)。

3.重组质粒的筛选与鉴定：

第2、4、5、7号4个转化子扩增出981bp的目的基因片段，而含质粒pCEP4的对照菌没有扩增出该基因片段(见图2)。提取4号重组子的质粒，用Hind III和BamH I酶双酶切，酶切产物在约975bp、10200bp处出现条带，与预期大小相符(见图3)。提取4号重组子的质粒，测定质粒内的HSV1病毒gD糖蛋白基因序列，DNA序列分析证实，重组质粒含有合成的HSV1病毒gD糖蛋白基因片段，序列完全正确：

AAGCTT GCC GCC ACC ATG GAA ACC CCA GCG CAG CTT CTC TTC CTC CTG CTACTC TGG CTC CCA

GAT ACC ACC GGA CAT CAT CAC CAT CAC CAT CAC CAT GAA AAC CTG TAC TTC CAG GGT AAG TAC

GCT CTG GCC GAT GCT AGC CTG AAG ATG GCT GAT CCT AAC CGC TTC AGA GGT AAG GAC CTG CCT

GTG CTG GAC CAG CTG ACC GAC CCT CCT GGC GTG CGC AGA GTG TAC CAC ATT CAG GCT GGT CTG

CCT GAC CCT TTC CAG CCT CCT AGC CTG CCT ATC ACC GTG TAC TAC GCC GTG CTG GAG AGA GCC

TGT CGC AGC GTG CTG CTG AAC GCT CCT AGC GAG GCT CCT CAG ATC GTG AGA GGT GCT AGC GAA

GAC GTG AGG AAG CAG CCT TAC AAC CTG ACC ATC GCC TGG TTC AGG ATG GGT GGT AAC TGT GCT

ATC CCT ATC ACC GTG ATG GAG TAC ACC GAG TGT TCT TAC AAC AAG AGC CTG GGC GCT TGT CCT

ATC CGC ACC CAG CCT AGG TGG AAC TAC TAC GAC AGC TTC AGC GCT GTG AGC GAG GAC AAC CTG

GGC TTC CTG ATG CAC GCT CCT GCC TTC GAG ACC GCT GGC ACC TAC CTG AGG CTG GTG AAG ATC

AAC GAC TGG ACC GAG ATC ACC CAG TTC ATC CTG GAG CAC AGA GCC AAG GGT AGC TGT AAG TAC

GCT CTG CCT CTG AGA ATC CCT CCT AGC GCT TGT CTG AGC CCT CAG GCC TAC CAG CAA GGC GTG

ACC GTG GAC AGC ATC GGT ATG CTG CCT CGC TTC ATC CCT GAG AAC CAG AGG ACC GTG GCT GTG

TAC AGC CTG AAG ATC GCT GGC TGG CAC GGT CCT AAG GCT CCT TAC ACC AGC ACT CTG CTG CCT

CCT GAG CTG AGC GAG ACC CCT AAC GCC ACT CAG CCT GAG CTG GCT CCT GAG GAC CCT GAG GAC

AGC GCT CTG CTG GAG GAC CCT GTG GGT TAA GGATCC

构建的重组质粒表达HSV1的病毒gD糖蛋白片段(284个氨基酸)，在其N端添加了8×His标签(8个氨基酸)及TEV蛋白酶酶切位点(7个氨基酸)，全长299个氨基酸，其氨基酸序列如下：

His His His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Asp

Ala Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro Val Leu Asp Pro

Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Arg Arg Val Tyr His Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe

Gln Pro Pro Ser Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser Val

Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala Ser Glu Asp Val Arg Lys

Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr

Val Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr Gln

Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe Leu Met

His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr

Glu Ile Thr Gln Phe Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu

Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly Val Thr Val Asp Ser

Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val Ala Val Tyr Ser Leu Lys

Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser

Glu Thr Pro Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu

Glu Asp Pro Val Gly

重组质粒的真核转染、细胞表达上清的蛋白检测与纯化

提取阳性重组质粒pCEP4-gD1，用脂质体转染法对HEK293细胞进行转染。收集细胞上清，根据表达HSV1病毒gD糖蛋白的氨基酸序列，分析其理化特性，确定适当的纯化方法。我们所表达的HSV1病毒gD糖蛋白在N端添加了8×His标签，可很方便用镍琼脂糖凝胶分离，因此我们决定采用亲和层析法，用Ni Sepharose 6Fast Flow凝胶进行纯化。具体步骤如下：

材料和方法

1.主要试剂：

Lipofectamine 2000为invitrogen公司产品，Ni Sepharose 6Fast Flow凝胶为GEHeathcare公司产品，小鼠抗His单抗、羊抗小鼠IgG-HRP为金斯特公司产品。其它试剂为国产或进口分析纯试剂。

2.重组质粒pCEP4-gD1真核转染：

转染前一天以0.5-2×10⁵/孔的密度接种HEK293细胞至24孔板，37℃，5％CO₂温箱培养过夜，使其达到孔底面积90-95％时进行转染。取重组质粒pCEP4-gD1 5ul(200ng/ul)稀释于50ul无血清DMEM培养基中(设对照空质粒pCEP4)，温和混匀。取Lipofectamine 2000 2ul稀释于50ul无血清DMEM培养基中，温和混匀，室温静置5分钟。将稀释的重组质粒和脂质体温和混匀，室温静置20分钟后加入到含有HEK293细胞的24孔板中，100ul/孔，温和混匀，37℃，5％CO₂温箱培养48小时后，收集细胞上清进行检测。

3.Western Blot检测表达重组HSV1病毒gD糖蛋白的细胞上清：

收集转染细胞上清进行SDS-PAGE电泳，PVDF膜湿转，100V，1小时，4℃封闭过夜(5％milk-PBST)。PBST洗膜3次，每次10分钟，小鼠抗His单抗(1mg/ml)1∶10000稀释于封闭液中，室温孵育2小时，洗膜3×10分钟，羊抗小鼠IgG-HRP 1∶10000稀释于封闭液中，室温孵育1小时，洗膜3×10分钟，加发光底物反应3分钟，暗室中压片曝光。

4.重组HSV1病毒gD糖蛋白的纯化：

上清溶液加已经平衡的Ni Sepharose 6Fast Flow凝胶3ml，混匀后4℃结合过夜，上样，收集穿透液。用十倍柱床体积的平衡液(1×PBS，0.5mol/L NaCl+，20mmol/L imidazole，pH7.4)洗涤柱子，接着将1ml洗脱液(1×PBS，0.5mol/L NaCl，500mmol/L imidazole，pH7.4)加入胶体中，静置20分钟后洗脱目的蛋白，即为纯化的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区片段。

5.Western Blot检测纯化的重组HSV1病毒gD糖蛋白：

对纯化的重组HSV1病毒gD糖蛋白进行12％SDS-PAGE胶电泳，19mA，80分钟。PVDF膜湿转，100V，1小时，4℃封闭过夜(5％milk-PBST)。PBST洗膜3次，每次10分钟，小鼠抗His单抗(1mg/ml)1∶10000稀释于封闭液中，室温孵育2小时，洗膜3×10分钟，羊抗小鼠IgG-HRP1∶10000稀释于封闭液中，室温孵育1小时，洗膜3×10分钟，加发光底物反应3分钟，暗室中压片曝光。

结果

1.Western Blot检测表达重组HSV1病毒gD糖蛋白的细胞上清：

经重组质粒转染的HEK293细胞明显表达出重组HSV1病毒gD糖蛋白，表达产物以可溶性形式存在于细胞上清中，分子量约46kDa，与预期大小相符。结果表明，重组HSV1病毒gD糖蛋白表达成功(见图4)。

2.Western Blot检测纯化的重组HSV1病毒gD糖蛋白：

将从Ni Sepharose 6Fast Flow凝胶柱上洗脱的蛋白进行Western Blot分析，蛋白带分子量约46kDa，与预期大小相符。结果表明，重组HSV1病毒gD糖蛋白纯化成功(见图5)。

纯化HSV1病毒的gD糖蛋白的鉴定及应用

将纯化的重组HSV1病毒gD糖蛋白抗原，通过间接ELISA试验方法检测，以鉴定表达的HSV1病毒gD糖蛋白的抗原性和特异性。再用纯化的重组HSV1病毒gD糖蛋白抗原免疫小鼠，通过间接ELISA试验方法检测小鼠血清中抗体浓度，以鉴定表达的HSV1病毒gD糖蛋白的免疫原性。

材料和方法

1.主要试剂及材料：

山羊抗HSV1+HSV2多抗为Abcam公司产品，兔抗山羊IgG-HRP为博士德公司产品，完全福氏佐剂和不完全福氏佐剂为SIGMA公司产品。其它试剂为国产或进口分析纯试剂。实验动物4周龄雄性昆明小鼠，SPF级，购自北京军事医学科学研究院实验动物中心。

2.重组HSV1病毒gD糖蛋白的鉴定：

采用间接ELISA检测重组HSV1病毒gD糖蛋白的抗原性。基本步骤为：用1×PBS(pH7.4)按1∶25-1∶400倍比稀释纯化的重组HSV1病毒gD糖蛋白，包被酶联板(阴性对照取正常HEK293细胞上清)，每孔100ul，4℃过夜。次日用封闭液(1×PBS，1％小牛血清)封闭，每孔130ul，室温2小时。将山羊抗HSV1+HSV2多抗，用样本稀释液(1×PBS，0.1％小牛血清)1∶500稀释后，分别加至封闭后的酶联板孔内，每孔100ul，37℃反应1小时，用PBST液(1×PBS，0.5％吐温-20)洗5遍后，加1∶40000稀释的兔抗山羊IgG-HRP，每孔100ul，37℃反应30分钟，PBST洗5遍，加底物TMB溶液，每孔100ul，37℃避光显色10分钟，每孔加50ul 1N盐酸终止反应，用酶联仪测定A450值。

3.HSV1病毒gD糖蛋白抗血清的制备：

将纯化的重组HSV1病毒gD糖蛋白与福氏佐剂等体积混合后分别于第1，3，5周(第1周用完全福氏佐剂，第3，5周用不完全福氏佐剂)腹腔注射免疫小鼠，1.25ug/只/次(阴性对照组注射等体积PBS)，并于第3，5，7周眼眶采血。血液37℃放置1小时后4℃过夜，2000rpm离心20分钟，取上清，4℃，12000rpm离心20分钟，取上清即得HSV1病毒gD糖蛋白的抗血清。

4.HSV1病毒gD糖蛋白抗血清效价检测：

采用间接ELISA检测重组HSV1病毒gD糖蛋白的免疫原性。基本步骤为：用1×PBS按1∶100稀释纯化的重组HSV1病毒gD糖蛋白，包被酶联板，每孔100ul，4℃过夜。次日用封闭液封闭酶联板，每孔130ul，室温2小时。将抗血清用样本稀释液按1∶50，1∶500，1∶5000稀释后，分别加至封闭后的酶联板孔内，每孔100ul，37℃反应1小时，用PBST洗5遍后，加1∶10000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP，每孔100ul，37℃反应30分钟，PBST洗5遍，加底物TMB溶液每孔100ul，37℃避光显色10分钟，加50ul 1N盐酸终止反应，用酶联仪测定A450值。阳性血清应能与HSV1病毒gD糖蛋白反应，阴性血清则不能。

结果

1.重组HSV1病毒gD糖蛋白抗原性鉴定：

用间接ELISA法检测纯化的重组蛋白的抗原性，结果显示(表1)蛋白浓度与其OD值之间有良好的线性关系，说明表达的重组HSV1病毒gD糖蛋白有较好的抗原性和特异性。

2.重组HSV1病毒gD糖蛋白免疫原性鉴定：

用间接ELISA法检测纯化的重组蛋白的免疫原性，结果显示(表2)第一次免疫后抗体水平较低，第二次免疫后抗体水平明显上升，第三次免疫后抗体水平与第二次持平，说明表达的重组HSV1病毒gD糖蛋白有良好的免疫原性，为的研制奠定了基础。

表1表达蛋白抗原性检测的ELISA实验结果

表2表达蛋白免疫原性检测的ELISA实验结果

化学合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区基因片段序列表

<110>李越希

<120>化学合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用

<160>2

<210>1

<211>852

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)…(852)

<223>人工合成的全新基因片段，编码含强抗原表位的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区284个氨

基酸片段。

<400>1

AAG TAC GCT CTG GCC GAT GCT AGC CTG AAG ATG GCT GAT CCT AAC CGC TTC AGA GGT AAG  60

GAC CTG CCT GTG CTG GAC CAG CTG ACC GAC CCT CCT GGC GTG CGC AGA GTG TAC CAC ATT  120

CAG GCT GGT CTG CCT GAC CCT TTC CAG CCT CCT AGC CTG CCT ATC ACC GTG TAC TAC GCC  180

GTG CTG GAG AGA GCC TGT CGC AGC GTG CTG CTG AAC GCT CCT AGC GAG GCT CCT CAG ATC  240

GTG AGA GGT GCT AGC GAA GAC GTG AGG AAG CAG CCT TAC AAC CTG ACC ATC GCC TGG TTC  300

AGG ATG GGT GGT AAC TGT GCT ATC CCT ATC ACC GTG ATG GAG TAC ACC GAG TGT TCT TAC  360

AAC AAG AGC CTG GGC GCT TGT CCT ATC CGC ACC CAG CCT AGG TGG AAC TAC TAC GAC AGC  420

TTC AGC GCT GTG AGC GAG GAC AAC CTG GGC TTC CTG ATG CAC GCT CCT GCC TTC GAG ACC  480

GT GGC ACC TAC CTG AGG CTG GTG AAG ATC AAC GAC TGG ACC GAG ATC ACC CAG TTC ATC   540

CTG GAG CAC AGA GCC AAG GGT AGC TGT AAG TAC GCT CTG CCT CTG AGA ATC CCT CCT AGC  600

GCT TGT CTG AGC CCT CAG GCC TAC CAG CAA GGC GTG ACC GTG GAC AGC ATC GGT ATG CTG  660

CCT CGC TTC ATC CCT GAG AAC CAG AGG ACC GTG GCT GTG TAC AGC CTG AAG ATC GCT GGC  720

TGG CAC GGT CCT AAG GCT CCT TAC ACC AGC ACT CTG CTG CCT CCT GAG CTG AGC GAG ACC  780

CCT AAC GCC ACT CAG CCT GAG CTG GCT CCT GAG GAC CCT GAG GAC AGC GCT CTG CTG GAG  840

GAC CCT GTG GGT

<210>2

<211>284

<212>PRT

<213>HSV1病毒gD蛋白胞外区片段

<220>

<223>含强抗原表位的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区片段，第1个氨基酸-第284个氨基酸，

共284个氨基酸。

<400>2

Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys

1               5                   10                  15                  20

Asp Leu Pro Val Leu Asp Pro Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Arg Arg Val Tyr His Ile

21              25                  30                  35                  40

Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala

41              45                  50                  55                  60

Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile

61              65                  70                  75                  80

Val Arg Gly Ala Ser Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe

81              85                  90                  95                  100

Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser Tyr

101             105                 110                 115                 120

Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser

121             125                 130                 135                 140

Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr

141             145                 150                 155                 160

Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile

161             165                 170                 175                 180

Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro Ser

181             185                 190                 195                 200

Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly Val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu

201             205                 210                 215                 220

Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly

221             225                 230                 235                 240

Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr

241             245                 250                 255                 260

Pro Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu

261             265                 270                 275                 280

Asp Pro Val Gly

281

Claims (3)

1.一种化学合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区基因片段，该基因片段编码含强抗原表位的HSV1病毒的gD糖蛋白胞外区片段，即第1个氨基酸至第284个氨基酸，共284个氨基酸，化学合成的基因序列全长852bp，序列如下：

AAG TAC GCT CTG GCC GAT GCT AGC CTG AAG ATG GCT GAT CCT AAC CGC TTC AGA

GGT AAG GAC CTG CCT GTG CTG GAC CAG CTG ACC GAC CCT CCT GGC GTG CGC AGA

GTG TAC CAC ATT CAG GCT GGT CTG CCT GAC CCT TTC CAG CCT CCT AGC CTG CCT

ATC ACC GTG TAC TAC GCC GTG CTG GAG AGA GCC TGT CGC AGC GTG CTG CTG AAC

GCT CCT AGC GAG GCT CCT CAG ATC GTG AGA GGT GCT AGC GAA GAC GTG AGG AAG

CAG CCT TAC AAC CTG ACC ATC GCC TGG TTC AGG ATG GGT GGT AAC TGT GCT ATC

CCT ATC ACC GTG ATG GAG TAC ACC GAG TGT TCT TAC AAC AAG AGC CTG GGC GCT

TGT CCT ATC CGC ACC CAG CCT AGG TGG AAC TAC TAC GAC AGC TTC AGC GCT GTG

AGC GAG GAC AAC CTG GGC TTC CTG ATG CAC GCT CCT GCC TTC GAG ACC GCT GGC

ACC TAC CTG AGG CTG GTG AAG ATC AAC GAC TGG ACC GAG ATC ACC CAG TTC ATC

CTG GAG CAC AGA GCC AAG GGT AGC TGT AAG TAC GCT CTG CCT CTG AGA ATC CCT

CCT AGC GCT TGT CTG AGC CCT CAG GCC TAC CAG CAA GGC GTG ACC GTG GAC AGC

ATC GGT ATG CTG CCT CGC TTC ATC CCT GAG AAC CAG AGG ACC GTG GCT GTG TAC

AGC CTG AAG ATC GCT GGC TGG CAC GGT CCT AAG GCT CCT TAC ACC AGC ACT CTG

CTG CCT CCT GAG CTG AGC GAG ACC CCT AAC GCC ACT CAG CCT GAG CTG GCT CCT

GAG GAC CCT GAG GAC AGC GCT CTG CTG GAG GAC CCT GTG GGT

2.权利要求1所述的化学合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区基因片段，利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达，制备HSV1病毒的gD糖蛋白胞外区284个氨基酸蛋白片段，序列如下：

Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg

Gly Lys Asp Leu Pro Val Leu Asp Pro Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Arg Arg

Val Tyr His Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro Ser Leu Pro

Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu Asn

Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly Ala Ser Glu Asp Mal Arg Lys

Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile

Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala

Cys Pro Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val

Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly

Thr Tyr Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile

Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg Ile Pro

Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly Val Thr Val Asp Ser

Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val Ala Val Tyr

Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu

Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro

Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Val Gly

3.权利要求2所述方法制备的化学合成的HSV1病毒gD糖蛋白胞外区基因片段在制备HSV1病毒疫苗及检测试剂中的应用。

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