CN102149283A - 稳定的液体harpin蛋白制剂的制备、制剂及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了制备稳定液体组合物的方法，该液体组合物含有harpin蛋白或多肽、水基载体、有效量的杀生剂和任选有效量的蛋白酶抑制剂或非离子表面活性剂之一或这两者。该组合物保持harpin活性至少约72小时。还公开了通过对植物或植物种子施加该组合物而诱导植物反应的方法。

Description

稳定的液体HARPIN蛋白制剂的制备、制剂及用途

本申请要求提交于2008年8月12日的序列号为61/088,195的美国临时专利申请的优先权，据此将该申请以全文引用的方式并入。

技术领域

本发明涉及稳定的液体harpin蛋白制剂的制备、制剂及用途。

背景技术

植物已经进化出能辨别和响应包括病原体感染在内的环境信号的一系列复杂的生物化学通路。在病原体和植物之间有两种主要的相互作用—相容和不相容。当病原体和植物相容时，通常就发生疾病。如果病原体和植物不相容，则植物通常对该特定的病原体有抵抗力。在不相容的相互作用中，植物通过引起感染部位周围一小范围的局部坏死或组织死亡而限制病原体的繁殖。植物的这一反应被定义为过敏反应(“HR”)(Kiraly，″Defenses Triggered by the Invader：Hypersensitivity，″Plant Disease：An Advanced Treatise 5：201-224J.G.Horsfall and E.B.Cowling，eds.Academic Press，New York(1980)；Klement，″Hypersensitivity，“Phytopathogenic Prokaryotes 2：149-177，M.S.Mount and G.H.Lacy，eds.Academic Press，New York(1982))。局部细胞死亡不仅能遏制感染病原体的进一步扩散，还会导致***抗性，防止其它病原体的后续感染。因此，HR是植物对由细菌、真菌、线虫和病毒引起的疾病的抗性的常见形式。

一组命名为hrp(Hypersensitive Response and Pathogenicity)的基因是由包括欧文氏菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属和劳尔氏菌属在内的病原菌诱导HR的原因(Willis等″hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria，″Mol.Plant-Microbe Interact.4：132-138(1991)；Bonas，″hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria，″pp.79-98 in：Current Topics in Microbiology and Immunology，Vol.192，Bacterial Pathogenesis of Plants and Animals：Molecular and Cellular Mechanisms.J.L.Dangl，ed.Springer-Verlag，Berlin(1994)；Alfano等，″Bacterial Pathogens in Plants：Life Up Against the Wall，″Plant Cell 8：1683-98(1996))。通常，有多个hrp基因聚集在30-40kb的DNA片段中。hrp基因中的任何一个的突变将导致宿主植物中细菌病原性的丧失和非宿主植物的HR。

基于基因和生物化学表征，hrp基因的作用可以分为三组：(1)编码位于细胞外的如harpin的HR诱导子的结构基因(Wei等″Harpin，Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora″Science 257：85(1992)；He等″Pseudomonas syringae pv.Syringae harpinpss：A Protein that is Secreted Via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants，″Cell 73：1255(1993)；Arlat等″PopAl，a Protein which Induces a Hypersensitive-Like Response on Specific Petunia Genotypes，Is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum，″EMBO J.13：543-53(1994)；Kim等″HrpW of Erwinia amylovora，a New Harpin that Contains a Domain Homologous to Pectate Lyases of a Distinct Class，″J.Bacteriol.180：5203-10(1998))；(2)编码用于将HR诱导子和其它蛋白质从细菌的细胞质输出至细胞表面或细胞外空间的泪液分泌部的分泌基因(Van Gijsegem等，″Evolutionary Conservation of Pathogenicity Determinants Among Plant and Animal Pathogenic Bacteria，″Trends Microbiol.1：175-180(1993)；He等，″Pseudomonas syringae pv.Syringae harpinpss：AProtein that is Secreted Via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants，″Cell 73：1255(1993)；Wei等，″HrpI of Erwinia amylovora Functions in Secretion of Harpin and is a Member of a New Protein Family，″J.Bacteriol.175：7985-67(1993)；Arlat等″PopAl，a Protein which Induces a Hypersensitive-Like Response on Specific Petunia Genotypes，IsSecreted via the Hrp Pathway  ofPseudomonas solanacearum″EMBO J.13：543-53(1994)；Galan等，″Cross-talk Between Bacterial Pathogens and Their Host Cells，″Ann.Rev.Cell Dev.Biol.12：221-55(1996)；Bogdanove等，″Erwinia amylovora Secretes Harpin via a Type III Pathway and Contains a Homo log of yopN of Yersinia，″J.Bacteriol.178：1720-30(1996)；Bogdanove等，″Homology and Functional Similarity of a hrp-linked Pathogenicity Operon，dspEF，of Erwinia amylovora and the avrE Locus of Pseudomonas syringae Pathovar Tomato，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：1325-30(1998))；和(3)控制hrp基因表达的调节基因(Wei，″Harpin，Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora″Science 257：85(1992)；Wei等，″hrpL Activates Erwinia amylovora hrp Genes in Response to Environmental Stimuli，″J.Bacteriol.174：1875-82(1995)；Xiao等，″A Single Promoter Sequence Recognized by a Newly Identified Alternate Sigma Factor Directs Expression of Pathogenicity and Host Range Determinants in Pseudomonas syringae″J.Bacteriol.176：3089-91(1994)；Kim等，″The hrpA and hrpC Operons of Erwinia amylovora Encode Components of a Type III Pathway that Secretes Harpin，″J.Bacteriol.179：1690-97(1997)；Kim等，″HrpW of Erwinia amylovora，a New Harpin that Contains a Domain Homologous to Pectate Lyases of a Distinct Class，″J.Bacteriol.180：5203-10(1998)；Wengelnik等，″HrpG，A Key hrp Regulatory Protein of Xanthomonas campestris pv.Vesicatoria is Homologous to Two Component Response Regulators，″Mol.Plant-Microbe  Interact.9：704-12(1996))。由于在植物和微生物之间相互作用中所起的作用，hrp基因已经成为细菌病原性和植物防御反应研究的焦点。

除局部防御反应外，HR还激活同一植物中未被感染部分的防御***。这就产生了对继发性感染的全面的***抗性，命名为***获得抗性(“SAR”)(Ross，″Systemic Acquired Resistance Induced by Localized Virus Infections in Plants，″Virology 14：340-58(1961)；Malamy等，″Salicylic Acidand Plant Disease Resistance，″Plant J.2：643-654(1990))。SAR赋予对广谱病原体长期的***疾病抗性，并与某一套基因的表达相关联(Ward等，″Coordinate Gene Activity in Response to Agents that Induce Systemic Acquired Resistance，″Plant Cell 3：1085-94(1991))。由于诱导植物保护自己的潜力能显著地减少或摆脱对化学杀虫剂的需求，所以SAR是植物抗病性的重要组成部分，已经长期受到关注。SAR可以用生物试剂(微生物)或非生物(化学)试剂诱导(Gorlach et al.，″Benzothiadiazole，A Novel Class of Inducers of Systemic Acquired Resistance，Activates Gene Expression and Disease Resistance In Wheat，″Plant Cell 8：629-43(1996))。历史上，弱毒性的病原体被用作SAR的生物诱导剂。也有报道指无毒的植物生长促进细菌能诱导某些植物对于各种疾病的抗性。

生物试剂诱导的SAR已成为很多研究的主题。随着分子生物学的发展，第一个具有广宿主谱的蛋白质HR诱导子于1992年从引起苹果树和梨树火疫病的梨火疫病欧文氏菌(Erwinia amylovora)(一种病原菌)中分离出来。该HR诱导子被命名为“harpin″，现被称为harpinEa或HrpNsa。HarpinEa，由403个氨基酸组成，分子量约为40kDa。编码这一蛋白质的基因，hrpN，包含在位于hrp基因簇中间的1.3kb DNA片段中。HarpinEa被分泌入细胞外的空间，对蛋白酶消化很敏感。

自从梨火疫病欧文氏菌中分理出harpin_Ea以来，其它一些harpin或类harpin的蛋白质也已经从其它主要的植物病原菌组中分离出来。除harpin_Ea外，以下的harpin或类harpin的蛋白质已被分离并被表征：菊欧氏杆菌的HrpN、软腐欧氏杆菌(Wei等，″Harpin，Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora，″Science 257：85(1992))和玉米枯萎欧氏杆菌、丁香假单胞杆菌的HrpZ(He et al.，″Pseudomonas syringae pv.Syringae harpinpss：A Protein that is Secreted Via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants，″Cell 73：1255(1993))、青枯雷尔氏菌的PopA(Arlat等，″PopAl，a Protein which Induces a Hypersensitive-Like Response on Specific Petunia Genotypes，Is Secreted viathe Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum，″EMBO J.13：543-53(1994))和梨火疫病欧文氏菌的HrpW(Kim等，″Hrp W of Erwinia amylovora，a New Harpin that Contains a Domain Homologous to Pectate Lyases of a Distinct Class，″J.Bacteriol.180：5203-10(1998))和丁香假单胞杆菌。

类harpin的蛋白质有共同的特性。它们是热稳定的具有不多于一个半胱氨酸残基(更典型地，没有半胱氨酸残基)的富含甘氨酸的蛋白质，对蛋白酶消化敏感，以及诱发HR并诱导许多植物对多种疾病的抗性。基于它们共有的生物化学、生物物理学特性以及生物学功能，这些来自不同病原菌的HR诱导子属于harpin蛋白系列。这些共有的特性和它们在大范围的植物中诱导HR的能力使harpin蛋白系列区别于其它的宿主特异性蛋白酶HR，如来自疫霉菌的激发素(Bonnet等，″Acquired Resistance Triggered by Elicitors in Tobacco and Other Plants，″Eur.J.Plant Path 102：181-92(1996)；Keller等″Physiological and Molecular Characteristics of Elicitin-induced Systemic Acquired Resistance in Tobacco，″Plant Physiol.110：365-76(1996))和来自黄枝孢菌的非病原性蛋白(如Avr9)，这些仅能激发特定种属植物中的HR。

本质上，当发生某些细菌感染时，harpin蛋白被表达，然后被细菌分泌，给植物发信号对感染发动抵抗。Harpin充当信号以激活植物的防御反应及其它生理***，包括SAR、生长增强和对某些虫害的抗性。

迄今为止，harpin产品及其在农业和园艺中的用途一直是作为涂在淀粉上的粉状固体。由于粉状harpin蛋白在水中的悬浮液体在发生明显降解和失活前仅有48-72小时的有效使用寿命，这就限制了harpin蛋白的使用和多用性。

本发明涉及克服现有技术中的这些以及其它的局限性。

发明内容

本发明的一个方面涉及制备含harpin蛋白或多肽的稳定液体组合物的方法。本方法包括获得基本上没有细胞碎屑且包含harpin蛋白或多肽的液体提取物。将杀生剂和任选蛋白酶抑制剂与非离子表面活性剂之一或这两者引入该液体提取物，由此得到包含harpin蛋白或多肽的液体组合物，其保持harpin活性至少约72小时。

本发明的另一方面涉及组合物，所述组合物包含水基载体、harpin蛋白或多肽、有效量的杀生剂和任选有效量的蛋白酶抑制剂或非离子表面活性剂之一或这两者。该组合物保持harpin活性至少约72小时。

本发明的再一方面涉及诱导植物反应的方法。本方法包括对植物或植物种子施加本发明的组合物。在能有效地诱导植物反应的条件下实施对植物或植物种子施加本发明的组合物。

本发明涉及制备harpin蛋白或多肽的稳定液体制剂的新方法。如在所附的实例中所示，已经制备了在数月时间内能保持显著的过敏反应诱导活性的稳定制剂。因为不再需要进行大量处理以制备粉状的含harpin制剂，在制造和销售含harpin的产品中，延长液体harpin制剂的保存期限的能力非常重要。这导致了若干优点或好处，包括(i)通过排除了粉末载体材料以及当前在生产粉末制剂中使用的干燥工艺而节约了成本；(ii)避免了对使用者的粉尘危害；(iii)液体制剂更容易使用，因为它能容易地用水稀释和与其它液体(待施用的其它农用化学品)混合，而粉末制剂需监视其溶解；(iv)因为与称量正确量的粉末制剂相比，液体制剂更容易配制适量的体积，所以液体制剂能更精确地配制；和(v)液体制剂具有与其它农用化学品一起作为技术级材料用于制剂的潜力。

具体实施方式

本发明的一个方面涉及制备含harpin蛋白或多肽的稳定液体组合物的方法。本方法包括获得基本上没有细胞碎屑且包含harpin蛋白或多肽的液体提取物。将杀生剂和任选蛋白酶抑制剂与非离子表面活性剂之一或这两者引入该液体提取物，由此得到包含harpin蛋白或多肽的液体组合物，其保持harpin活性至少约72小时。

用在本文中的术语“harpin蛋白或多肽”是指现有技术中公认类别的蛋白质中的任何一员，所述蛋白质由植物细菌产生，并共有结构特性及诱导植物过敏反应的能力。在生物化学中，这些蛋白质或多肽具有若干共同的结构特性。这些共同的结构特性包括富含甘氨酸、对热稳定、亲水、无N-末端信号序列和易发生蛋白水解。参见Bonas，″Bacterial Home Goal by Harpins，″Trends Microbiol.2：1-2(1994)；Gopalan等“Bacterial Genes Involved in the Elicitation of Hypersensitive Response and Pathogenesis，″Plant Disease 80：604-10(1996)；和Alfano等″The Type III Hrp)Secretion Pathway of Plant Pathogenic Bacteria：Trafficking Harpins，Avr Proteins，and Death，″Journal of Bacteriology 179：5655-5662(1997)，据此将上述每个的内容均以引用的方式全文并入。此外，harpin共有与其独特的生物活性相关的独特二级结构。该结构具有两种主要的组分，α螺旋单元和具有片状或随机转角结构的松弛酸性单元。当缺乏上述一种或两种组分时，过敏反应诱导不会发生。参见Fan等PCT Publ.No.WO 01/98501，该文以全文引用的方式并入。

harpin蛋白还共有能诱导特定植物反应的能力(即，在处理植物和生长出该植物的植物种子之后)。诱导植物抗病性、植物生长、抗虫性、抗脱水性以及收获后抗病性(在诸如水果和蔬菜的收获后的植物产品中)是其中的一些较重要的用途。harpin蛋白的这些用途描述于以下专利中：授予Qiu等的美国专利第6,277,814号、授予Wei等的美国专利第5,776,889号、授予Zitter等的美国专利第5,977,060号、授予Qiu等的美国专利第6,235,974号、Wei等的美国专利申请第2003/0104979号、Wei等的美国专利申请第2002/0019337号以及美国专利申请第2004/0265442号，以上每项专利以全文引用的方式并入。这些反应的诱导的原因是茉莉酸/乙烯和水杨酸防御途径的上调以及调节光和作用和营养摄入的植物生长途径。

一组harpin蛋白或多肽包括(但不限于)梨火疫病欧文氏菌HrpN的同源物，其包括那些来自欧文菌属、泛菌属和果胶杆菌属的种属。这种同源物的例子包括在以下确定的那些harpin蛋白：Genbank Accession Nos.AAC31644(梨火疫病欧文氏菌)；AAQ21220、AAQ17045、CAE25423、CAE25424、CAE25425和CAF74881(亚洲梨火疫病菌)；CAC20124、Q47278、Q47279和AAY17519(菊欧氏杆)；CAE25422(欧文菌株JP557)；AAG01466(玉米细菌性枯萎病菌)；AAF76342(成团泛菌)；ABZ05760、ABI15988、ABI15989、ABI15990、ABI15991、ABI15992、ABI15996、ABK80762、ABD04037、ABI15994、ABD04035、ABD04036、AAY17521、AAX38231、ABI15995、AAQ73910和CAL69276(细菌性软腐病菌)；YP_050198、AAS20361和CAE45180(Pseudomonas atrosepticum)；和ABD22989(Pseudomonas betavasculorum)；上述菌属以全部引用的方式并入本文。

另一组harpin蛋白或多肽包括(但不限于)梨火疫病欧文氏菌HrpW和丁香假单胞菌的同源物，其包括选自以下种属的那些菌属：欧文菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、噬酸菌属和果胶杆菌属。这种同源物的例子包括在以下确定的那些harpin蛋白：Genbank Accession Nos.U94513、CAA74158、AAC04849和AAF63402(梨火疫病欧文氏菌)；AAQ17046(亚洲梨火疫病菌)；YP_001906489(欧文氏菌)；YP_050207(细菌性软腐病菌atrosepticum亚种)；AF037983(菌性斑点病菌)；AAO50075(菜豆晕疫病菌)；AAL84244(十字花科蔬菜黑斑病假单胞菌)；AAX58537、AAX58557、AAX58525、AAX58531、AAX58527、AAX58577、AAX58491、AAX58515、AAX58517、AAX58523、AAX58583、AAX58451、AAX58561、AAX58453、AAX58541、AAX58589、AAT96311、AAX58497、AAX58579、AAX58449、AAX58485、AAX58563、AAX58581、AAX58575、AAX58569、AAX58567、AAX58505、AAX58591、AAX58503、AAX58507、AAX58509、AAX58469、AAX58441、AAX58543、AAX58495、AAX58549、AAX58593、AAX58511、AAX58519、AAT96270、AAX58447、AAX58571、AAX58465、AAX58489、AAX58533、AAX58535、AAX58461、AAT96350、AAX58473、AAX58483、AAX58475、AAX58457、AAX52461、AAX52457、AAT96222，(绿黄假单胞菌)；ABA47299和BAG24117(菊假单胞病菌)；CAH57075(Pseudomonas avellanae)；BAE80274和BAE80242(燕麦噬酸菌)；和AAM37767(柑桔溃疡病菌)；上述菌属以全部引用的方式并入本文。

再一组harpin蛋白或多肽包括(但不限于)丁香假单胞菌属HrpZ的同源物，其包括假单胞菌属的其它种属中的那些。这种同源物的例子包括在以下中确定的那些harpin蛋白：Genbank Accession Nos.P35674、AAB00127、ABL01505、AAQ92359、BAD20880、BAD20876、BAD20892、BAD20884、BAD20928、BAD20936、BAD20932、BAD20924、BAD20856、BAD20864、BAD20860、BAD20848、BAD20844、BAD20836、BAD20840、BAD20824、BAD20842、BAD20820、BAD20916、BAD20872、BAC81526、O87653、BAA74798、BAD20904，AAB86735、BAD20912、BAD20908、ABL01504、BAB40655、AB026225、AB026228(细菌性叶斑病菌)；BAD20868(Pseudomonas ficuserectae)；AAX52452、AAT96159、AAX52266、AAX52396、AAT96322、AAT96281、AAX52272、AAX52306、AAX52270、AAX52402、AAX52276、AAX52318、AAX52262和AAT96361(Pseudomonas viridiflava)；CAJ76697(Pseudomonas avellanae)；YP_001185537(门多萨假单胞菌)；以及ABA47309和BAG24128(细菌性叶斑病菌)；上述菌属以全部引用的方式并入本文。

另外一组harpin蛋白或多肽包括(但不限于)野油菜黄单胞菌HreX的同源物(参见Wei等，美国专利第6,960,705号，其全文以引用的方式并入本文)，其包括来自黄单胞菌属的其它种属的那些菌属。这种同源物的例子包括在以下中确定的那些harpin蛋白：Genbank Accession Nos.NP_636614、YP_001904470、YP_362171(野油菜黄单胞菌)；ABB72197、ABK51585、ABU48601、ABK51584、YP_198734和ZP_02245223(水稻黄单胞菌)；以及ABK51588和NP_640771(柑橘溃疡病菌)；上述菌属以全部引用的方式并入本文。

本发明还包括含有上列harpin蛋白或多肽的过敏反应诱导片段的稳定液体制剂。优选的片段包括两种结构单元：长度为12个或更多个氨基酸的稳定α螺旋单元和长度为12个或更多个氨基酸的亲水酸性单元，该亲水酸性单元可以是β形式、β转角或无序形式的。优选片段的特征还在于其优选为低于5的酸性pI值。优选的片段含有约28个到约40个氨基酸，尽管可以存在更少或更多的氨基酸残基。

合适片段的例子在以下专利中确认，授予Laby等的美国专利第6,583,107号和Fan等的PCT公开第WO 01/098501号，上述每项专利均以全文引用的方式并入本文。Fan等的PCT公开第WO 01/098501号还描述了获得可用于本发明的harpin蛋白或多肽的片段的方法。

合适的HR诱导多肽片段包括(但不限于)下表1中确认的那些。

表1：HR诱导片段列表

harpin蛋白或多肽的合适片段可能不诱导植物内的过敏反应，但仍能用于本发明的制剂及组合物。这种片段在授予Wei等的美国专利第6,858,707号中描述，其以全文引用的方式并入本文。可以采用多种方法制备合适的片段。

根据一种方法，用亚克隆基因片段、通过常规的分子基因操作制备了编码已知harpin蛋白或多肽的基因的亚克隆。然后亚克隆在体外或体内的细菌细胞内表达以产生能用于测定活性的较小的蛋白质或多肽。

作为另一可选方法，片段可以通过用诸如胰凝乳蛋白酶或葡萄球菌属蛋白酶A或胰蛋白酶的蛋白水解酶消化全长harpin蛋白或多肽来制备。根据harpin蛋白的氨基酸序列，不同的蛋白水解酶可在不同的位置断裂开诱导子蛋白质。来自蛋白酶水解作用的这些片段中的一些可以是抗性的活性诱导子。

在再一方法中，根据蛋白质的一级结构，harpin蛋白基因的片段可以通过与选来代表该蛋白质的特定部分的特定组引物一起使用PCR技术来合成。然后将这些片段克隆到用于截短肽或蛋白质的表达的合适的载体。

化学合成也可以用于制备合适的片段。这种合成是通过使用对于所生产的harpin蛋白是已知的氨基酸序列来进行的。作为另外的选择，使全长harpin经受高温和高压将产生片段。然后，通过常规的步骤(例如，色谱法，SDS-PAGE)分离这些片段。

本发明的harpin蛋白或多肽还可以包含分离的过敏反应诱导子蛋白质，其含有一对或多对间隔开的HR诱导域，每一HR诱导域含有连接到α螺旋并能诱导植物内的过敏反应的酸性部分，如Fan等的PCT公开第WO 01/098501中所描述的，该PCT公开以全文引用方式并入本文。例如含有一个或多个HR诱导域的结构单元包括(但不限于)在下表2中所确认的结构单元：

表2：Superharpin结构单元域

随着这些(以及其它)HR诱导域的结合，可以制备新的harpin多肽(即，superharpin)，其具有较高的HR潜力并具有增强的诱导所希望的植物反应(诸如，抗病性、抗虫性、增强的生长、环境压力忍受性及收获后抗病性)的能力。可以使用一种HR域重复单元(串联体，cancatomer)、HR域的不同组合和/或取自其它诱导子的生物活性域形成superharpin。

使用这些结构单元的一些分离的superharpin包括(但不限于)在下表3中确认的那些。

表3：superharpin构造

这些superharpin对热稳定、可溶解，并且已经表明比从植物病原菌(如HrpN)中分离出的harpin蛋白具有改进的生长增强和/或抗病活性。这些superharpin的描述见于Fan等的PCT公开第WO 01/098501号，其以全文引用的方式并入本文。

一种优选的superharpin(现可商购自Plant Healthcare Inc)的特征在于具有如下的SEQ ID NO：1的氨基酸序列：

MSLNTSGLGASTMQISIGGAGGNNGLLGTHMPGTSSSPGLFQSGGDNGLGGHNANSALGQQPIDRQTIEQMAQLLAELLKSLLDSGEKLGDNFGASADSASGTGQQDLMTQVLNGLAKSMLDDLLTKQDGGTSFSEDDSGPAKDGNANAGANDPSKNDPSKSQGPQSANKTGNVDDANNQDPMQALMQLLEDLVKLLKAALHMQQPGGNDKGNGVGGDSGQNDDSTSGTDSTSDSSDPMQQLLKMFSEIMQSLFGDEQDGTDSTSGSRFTRTGIGMKAGIQALNDIGTHSDSSTRSFVNKGDRAMAKEIGQFMDQYPEVFGKPQYQKGPGQEVKTDDKSWAKALSKPDDDGMTPASMEQFNKAKGMIKSAMAGDTGNGNLQARGAGGSSLGIDAMMAGDArNNMALGKLGAA

其中的残基1-30对应于HrpN_Ea的N-末端序列；残基31-34(加粗)是将HR域连接在一起的人工制品；残基35-83对应于Hrp WEa(残基10-59)的一个HR域；残基84-86(加粗)是将HR域连接到一起的人工制品；残基87-138对应于HrpZPss(残基90-141)的一个HR域；残基139-140(加粗)是将HR域连接到一起的人工制品；残基141-211对应于Pop A(残基70-140)的一个HR域；残基212-220对应于将HR域连接到一起的人工制品；残基221-261对应于HrpNEa(残基140-180)的一个HR域；残基262-271对应于将HR域连接到一起的人工制品；以及残基272-412对应于HrpN_Ea(残基263-403)的C-末端序列。

SEQ ID NO：1的superharpin蛋白通过如下SEQ ID NO：2的核苷酸序列编码：

ATGAGTCTGAATACAAGTGGGCTGGGAGCGTCAACGATGCAAATTTCTATCGGCGGTGCGGGCGGAAATAACGGGTTGCTGGGTACGCATATGCCCGGGACCTCGTCCTCGCCGGGTCTGTTCCAGTCCGGGGGGGACAACGGGCTTGGTGGTCATAATGCAAATTCTGCGTTGGGGCAACAACCCATCGATCGGCAAACCATTGAGCAAATGGCTCAATTATTGGCGGAACTGTTAAAGTCACTGCTAGATAGTGGGGAAAAGCTCGGTGACAACTTCGGCGCGTCTGCGGACAGCGCCTCGGGTACCGGACAGCAGGACCTGATGACTCAGGTGCTCAATGGCCTGGCCAAGTCGATGCTCGATGATCTTCTGACCAAGCAGGATGGCGGGACCAGCTTCTCCGAAGACGATAGTGGGCCGGCGAAGGACGGCAATGCCAACGCGGGCGCCAACGACCCGAGCAAGAACGACCCGAGCAAGAGCCAGGGTCCGCAGTCGGCCAACAAGACCGGCAACGTCGACGACGCCAACAACCAGGATCCGATGCAAGCGCTGATGCAGCTGCTGGAAGACCTGGTGAAGCTGCTGAAGGCGGCCCTGCACATGCAGCAGCCCGGCGGCAATGACAAGGGCAACGGCGTGGGCGGTGATAGTGGGCAAAACGACGATTCCACCTCCGGCACAGATTCCACCTCAGACTCCAGCGACCCGATGCAGCAGCTGCTGAAGATGTTCAGCGAGATAATGCAAAGCCTGTTTGGTGATGAGCAAGATGGCACCGATAGTACTAGCGGCTCGAGGTTTACTCGTACCGGTATCGGTATGAAAGCGGGCATTCAGGCGCTGAATGATATCGGTACGCACAGCGACAGTTCAACCCGTTCTTTCGTCAATAAAGGCGATCGGGCGATGGCGAAGGAAATCGGTCAGTTCATGGACCAGTATCCTGAGGTGTTTGGCAAGCCGCAGTACCAGAAAGGCCCGGGTCAGGAGGTGAAAACCGATGACAAATCATGGGCAAAAGCACTGAGCAAGCCAGATGACGACGGAATGACACCAGCCAGTATGGAGCAGTTCAACAAAGCCAAGGGCATGATCAAAAGCGCCATGGCGGGTGATACCGGCAACGGCAACCTGCAGGCACGCGGTGCCGGTGGTTCTTCGCTGGGTATTGATGCCATGATGGCCGGTGATGCCATTAACAATATGGCACTTGGCAAGCTGGGCGCGGCTTAA

根据本发明，制备含有harpin蛋白或多肽的稳定液体组合物的方法包括获得基本上没有细胞碎屑且包含harpin蛋白或多肽的液体提取物。这可以通过发酵能产生harpin蛋白或多肽的植物细菌来进行。harpin蛋白或多肽可以通过在快速生长的细菌中发酵来容易地制备。例如，重组大肠杆菌可以用于harpin蛋白或多肽的大批量生产。当前的技术允许生产相对高细胞内浓度的harpin蛋白或多肽。

重组方法一般涉及将表达所关注的蛋白质或多肽的DNA分子***对所述DNA分子是异源(即，通常不存在)的表达***。异源DNA分子以适当的有义方向和正确的读码框***表达***或载体。载体含有用于转录和转译***的编码蛋白质的序列的必要成分。DNA的转录依赖于启动子的存在。相似地，原核微生物中的mRNA的翻译依赖于不同于真核微生物信号的合适的原核微生物信号的存在。关于最大化基因表达的综述，参见Roberts和Lauer，Methods in Enzymology 68：473(1979)，该文以引用的方式并入本文。

不管所采用的具体调节序列如何，DNA分子通过采用现有技术中的标准克隆程序(如由Sambrook等在“Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Springs Laboratory，Cold Springs Harbor，N.Y.(1989)”中描述的，该文以引用的方式并入本文)被克隆到载体内。一旦编码harpin蛋白或多肽的分离的DNA分子被克隆到表达***内，它就很容易结合到宿主细胞内。这种结合可以通过各种形式的转化来实施，这取决于载体/宿主细胞***。合适的宿主细胞包括(但不限于)细菌、病毒、酵母、哺乳动物细胞、昆虫、植物等。

任选地，重组宿主细胞可以是表达原生或重组的第III类功能性分泌***的宿主细胞。这在授予Bauer等的美国专利第6,596,509号(以全文引用的方式并入本文中)中被详细描述。作为表达第III类功能性分泌***的结果，细胞将表达harpin蛋白或多肽，然后将蛋白质分泌到培养基内。这将简化harpin蛋白或多肽的分离和纯化。

重组宿主细胞可以在适当的发酵室内生长，优选处于使宿主细胞的生长和harpin蛋白或多肽的表达最优化的温度和营养条件下。本领域技术人员完全能确定对于具体宿主细胞的最佳条件。

发酵之后，将细菌悬浮液稀释在例如约2到5倍体积的缓冲液中，调节pH值至约5.5到10之间，更优选调节pH值至约7到9之间，甚至更优选调节pH值至约8.0。合适的缓冲溶液在本领域已知，可包括例如磷酸钾缓冲液或一种Tris-EDTA缓冲液。缓冲液的浓度可以是从约0.001mM到约0.5M。

调节pH值之后，将细菌悬浮溶液热处理到温度为约60-130℃，优选温度为约95-125℃。热处理可以进行任何适当的时间。在一个实施例中，热处理进行的时间从约5分钟到长达约30分钟。

然后，冷却被加热的悬浮溶液。适当的冷却温度是(但不限于)约35-55℃，优选为约45℃。

冷却之后，如需要，溶解细菌悬浮液中的细菌细胞以释放harpin蛋白或多肽。细胞溶解可以通过诸如将细菌悬浮液与溶菌酶接触来进行。溶菌酶的浓度可以是约2ppm到100ppm中的任何值。作为另外的选择，细胞溶解可包括非化学的方法，如高压或声处理，两种方法对于本领域内的一般技术人员均是熟知的。

可取的是，在细胞溶解后培养细菌悬浮液。合适的培养时间是可变的。例如，可取的是在约40-42℃的温度下将细菌悬浮液培养约30-45分钟的时间。

溶解后，可通过除去来自前面热处理步骤的细胞碎屑和变性蛋白来进一步提取所需蛋白或多肽(即harpin蛋白或多肽)。在一实施例中，离心处理提取物约10-20分钟以除去一些细胞碎屑。合适的离心速度可以是从约4,000到20,000rpm，旋转停止时间可以是从约10分钟到20分钟。然后可以通过热处理和离心处理上清液除去更多的细胞碎屑，以得到除去所有固体中的60％、70％、80％、90％或95％的基本上没有细胞碎屑的液体提取物。这一随后的热处理可以在约60℃的温度下进行长达约两小时、在约100℃进行约10分钟或在121℃和15psi压力下进行约5分钟。根据其它条件，这些温度和时间可以变化。

制备本发明含harpin蛋白或多肽的稳定液体组合物的方法进一步涉及向液体提取物中引入杀生剂和任选蛋白酶抑制剂与非离子表面活性剂之一或这两者，以此得到含harpin蛋白或多肽的液体组合物。在一个实施例中，将蛋白酶抑制剂引入到液体提取物中，不引入非离子表面活性剂。在另一实施例中，将非离子表面活性剂引入到液体提取物中，不引入蛋白酶抑制剂。在再一实施例中，将蛋白酶抑制剂和非离子表面活性剂同时引入到液体提取物中。在另一实施例中，蛋白酶抑制剂与非离子表面活性剂均不引入到液体提取物中。为了保存，在液体提取物中加入杀生剂。

合适的杀生剂包括(但不限于)抗生素、有毒化学品和消毒剂。例如，合适的抗生素是链霉素，合适的毒剂是叠氮化钠，合适的消毒剂是三效消毒剂(即EPA批准的含有以下活性成分的杀虫剂：1-十烷基-N，N-二甲基-N-辛基氯化铵(12.4质量％)；1-辛基-N，N-二甲基-N-辛基氯化铵(12.4质量％)；烷基(C12-16)二甲基苄基氯化铵(12.4质量％)；碳酸钠(3质量％)；以及依地酸钠(2.5质量％)。所引入的杀生剂的浓度可以是从约1ppm到约100ppm，更优选为约2ppm到约30ppm，最优选为从约5ppm到约10ppm。

可以加入蛋白酶抑制剂来防止由在harpin提取物中的残余蛋白酶引起的harpin降解。蛋白酶抑制剂包括根据蛋白酶类型或它们的作用机理分类的各种抑制剂。合适的蛋白酶抑制剂可以包括(但不限于)半胱氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)、胰蛋白酶抑制剂、苏氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白抑制剂。可以根据它们的作用机理，来选取合适的蛋白酶抑制剂。例如，合适的蛋白酶抑制剂可以包括(但不限于)***性抑制剂、过渡态抑制剂、蛋白质蛋白酶抑制剂和螯合剂。市售的蛋白酶抑制剂的实例包括(但不限于)抑肽酶、贝他定、钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白抑制剂II、胰凝乳蛋白酶抑制剂、E-64、亮抑酶肽(N-乙酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-精氨醛)、α-2-巨球蛋白、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、胃酶抑素、PMSF(苯甲磺酰氟)和甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮(TLCK)。

以从约1ppm到约100ppm的浓度、更优选以从约2ppm到约30ppm的浓度、最优选以从约5ppm到约10ppm的浓度将蛋白酶抑制剂加到提取物中。

合适的非离子表面活性剂包括(但不限于)失水山梨醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、脂肪酸聚甘油酯、脂肪醇聚乙二醇醚、乙炔二醇、乙炔醇、氧化烯嵌段聚合物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷芳基醚、聚氧乙烯苯乙烯基芳基醚、聚氧乙烯二醇烷基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油和聚氧乙烯脂肪酸酯。

可以以约0.005到约20％、更优选约0.01到约15％、最优选约0.05％到约10％的体积量将非离子表面活性剂加入到提取物中。

作为加入上述的杀生剂和任选蛋白酶抑制剂与表面活性剂的结果，本发明的组合物的特征在于保持其harpin活性至少72小时，优选更长得多的时间。优选地，本发明方法制备的液体组合物保持harpin活性超过约5天、1周、2周、3周或4周，更优选至少约2到3个月，最优选超过约4到6个月。如本文中所用，harpin活性的保持能力可以通过比较老化的液体组合物与新近制备的液体组合物的活性或同一组合物的较早评价来确定。活性可以通过组合物对植物的效果来测量，这种效果是在测试后通过对植物的抗病性、生长增强、抗逆性等进行评价得到的。优选地，本发明的组合物保持(72小时以上)至少约70％的活性、更优选至少约70％到约80％的活性、最优选至少约80％到90％的活性。

做为另外的选择，可以采用例如HPLC分析或能确定特定蛋白质或多肽的数量的其它适当的程序评价本发明的液体组合物的稳定性。可以通过将老化的液体组合物中的harpin蛋白的数量与新近制备的液体组合物中的数量或与先前对同一组合物进行的定量做比较来确定本发明的组合物中的harpin蛋白或多肽的稳定性。harpin蛋白稳定性的测量与活性的保持密切相关。

本发明的另一方面涉及组合物，所述组合物包含水基载体、harpin蛋白或多肽、有效量的杀生剂和任选有效量的蛋白酶抑制剂或非离子表面活性剂之一或这两者。该组合物保持harpin活性至少约72小时。

可以把本发明的组合物配制成任何适当的形式，包括但不限于溶液、乳液、可乳化浓缩物、悬浮液、泡沫、糊剂、气溶胶、悬乳剂浓缩物或浆体。合适的组合物包括用于HV、LV和ULV喷雾和用于ULV冷却和加温雾化制剂的那些。优选的是，按适合大规模或小规模农业及园艺应用的方式配制本发明的组合物。

按已知的方式制备这些制剂，例如将液体组合物与稀释剂(即，液体溶剂、加压液化气体)和/或固体载体混合。还可以按本领域普通技术人员通常已知的方式使用润湿剂和/或表面活性剂(即，乳化剂和/或分散剂)、螯合剂、增塑剂、增白剂、助流剂、聚结剂、蜡、填料、聚合物、抗冻剂、杀生剂、增稠剂、增粘剂和/或泡沫形成剂。如果使用的稀释剂是水，则也可以使用例如有机溶剂为助溶剂。其它可能的添加剂有矿物油和植物油、着色剂(如无机颜料)和微量营养物。

这种添加剂的性质和作用是液体制剂领域的普通技术人员熟知的。添加剂不应干扰包含在制剂中的harpin蛋白或多肽或任何其它生物活性组分的作用。

包含在本发明制剂中的harpin蛋白或多肽的活性化合物含量可以在宽范围内变化。例如，活性化合物(即，活性harpin蛋白或多肽)的浓度可以为0.0000001至20重量％，优选为0.0001至15重量％。

在一个实施例中，可取的是将本发明的组合物与有效量的其它农业或园艺化学品合并，这些化学品如除草剂(例如草甘膦)、杀虫剂、灭螨剂、杀线虫剂、杀螺剂、引诱剂、消毒剂、杀菌剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀真菌剂和/或生长调节剂。

一种优选的除草剂是草甘膦，通常称为2(膦酰甲基氨基)乙酸。也可以使用草甘膦盐。合适的草甘膦盐包括(例如)异丙胺盐、二铵盐和三甲基锍盐。包含草甘膦的混合物通常包含一种或多种表面活性剂，通常为一种或多种非离子表面活性剂，虽然应该不要求有表面活性剂。通常可取的是将含草甘膦的制剂应用于草甘膦抗性的植物和植物部分。

适用于本文中所述的组合物的其它除草剂的例子包括(例如)但不限于：酰胺类除草剂，包括草毒死、胺唑草酮、氟丁酰草胺、胺酸杀、苄草胺、溴布呔、唑草胺、CDEA、三环噻草胺、二甲酚噻草胺、二甲酚噻草胺-P、草乃敌、***磺、etnipromid、四唑草胺、氟唑磺隆、氟胺草唑、氟磺胺草醚、halosafen、草特灵、异

草胺、敌草胺、萘草胺、烯草胺、戊炔草胺、克藻胺、苯嘧磺草胺和特丙胺；酰苯胺类除草剂，包括丁酰草胺、咯草隆、稗草胺、环草胺、吡氟草胺、乙氧苯草胺、磺草灵、氟噻草胺、flufenican、卤苯胺唑、苯噻草胺氟草磺、

唑酰草胺、杀草利、萘丙胺、蔬草灭、氟吡草胺、敌稗、甲磺草胺；芳丙氨酸类除草剂，包括新燕灵、麦草氟酯和麦草氟酯-M；氯乙酰苯胺类除草剂，包括乙草胺、甲草胺、丁草胺、丁烯草胺、异丁草胺、乙酰甲草胺、二甲草胺、吡草胺、异丙甲草胺、S-异丙甲草胺、丙草胺、扑草胺、异丙草胺、广草胺、特丁草胺、噻吩甲氯和二甲苯草胺；磺酰苯胺类除草剂，包括氟草黄、氯酯磺草胺酸、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺、氟草磺胺、pyrimisulfan和氟唑草胺；磺酰胺类除草剂，包括磺草灵、除草隆、苯氧威、氨磺灵、五氟磺草胺和甲氧磺草胺；硫代酰胺类除草剂，包括酰苯草酮和氯硫酰草胺；抗生素类除草剂，包括双丙氨膦；芳酸除草剂；苯甲酸类除草剂，包括草灭平、麦草畏、2，3，6-TBA和杀草畏；嘧啶氧苯甲酸类除草剂，包括双草醚和嘧草醚；嘧啶硫苯甲酸类除草剂，包括嘧草硫醚；邻苯二甲酸类除草剂，包括敌草索、皮考啉酸除草剂、氯氨吡啶酸、二氯吡啶酸和毒莠定；喹啉羧酸类除草剂，包括二氯喹啉酸和喹草酸；含砷除草剂，包括卡可酸、CMA、DSMA、六氟盐、MAA、MAMA、MSMA、***和***；苯甲酰环己二酮类除草剂，包括硝磺酮、磺草酮、tefuryltrione和tembotrione；苯并呋喃烷基磺酸类除草剂，包括呋草磺和唑啶草；苯并噻唑类除草剂，包括草除灵、噻草隆、噻唑禾草灵、苯噻草胺和噻唑隆；氨基甲酸酯类除草剂，包括磺草灵、carboxazole、chlorprocarb、苄胺灵、苯醚威、卡草灵和芽根灵；苯氨基甲酸酯类除草剂，包括燕麦灵、BCPC、除草隆、双草胺、CEPC、氯草灵、氯苯胺灵、CPPC、甜菜宁、棉胺宁、苯敌草、苯敌草-乙酯、苯胺灵和灭草灵；环己烯肟类除草剂，包括禾草灭、丁苯草酮、烯草酮、cloproxydim、噻草酮、环苯草酮、稀禾定、吡喃草酮和肟草酮；环丙基异

唑类除草剂，包括异

氯草酮和异唑草酮；二羧酰亚胺类除草剂，包括吲哚酮草酯、氟奋乃静、氟烯草酸、丙炔氟草胺和炔草胺；二硝基苯胺类除草剂，包括氟草胺、地乐胺、敌乐胺、烯氟灵、氟消草、异乐灵、methalpropalin、磺乐灵、安磺灵、硝草胺、氨氟乐灵、环丙氟灵和氟乐灵；二硝基酚类除草剂，包括地乐特、硝丙酚、戊硝酚、地乐酚、特乐酚、DNOC、硝草酚和地乐施；二苯醚类除草剂，包括氟乳醚；硝基苯醚类除草剂，包括氟锁草醚、苯草醚、治草醚、甲氧除草醚、草枯醚、etnipromid、消草醚、乙羧氟草醚、氟除草醚、氟磺胺草醚、氟呋草醚、halosafen、乳氟禾草灵、除草醚、三氟甲草醚和氧氟吩；二硫代氨基甲酸酯类除草剂，包括棉隆和威百亩；卤代脂肪族除草剂，包括alorac、三氯丙酸、茅草枯、氟丙酸、六氯丙酮、碘代甲烷、甲基溴、一氯醋酸、SMA和TCA；咪唑啉酮类除草剂，包括咪草酸、甲氧咪草烟、甲咪唑烟酸、咪唑烟酸、咪唑喹啉酸和咪唑乙烟酸；无机类除草剂，包括氨基磺酸铵、硼砂、氯酸钙、硫酸铜硫酸亚铁、叠氮化钾、氰酸钾、叠氮化钠、氯酸钠和硫酸；腈类除草剂，包括除草溴、溴苯腈、羟敌草腈、敌草腈、iodobonil、碘苯腈和双唑草腈；有机磷类除草剂，包括甲基胺草磷、莎稗磷、地散磷、双丙氨膦、抑草磷、2，4-DEP、DMPA、EBEP、调节膦、草铵膦、草铵膦-P、草甘磷和哌草磷；

二唑类除草剂，包括唑隆、灭杀唑、草酮和

草灵；

唑类除草剂，包括carboxazole、异隆、异

草胺、异

氯草酮、异

氟草、monisouron、派罗克杀草砜和topramezone；苯氧类除草剂，包括杀草全、稗草胺、2，4-DEB、2，4-DEP、戊味禾草灵、赛松、草蓬、etnipromid、fenteracol和精喹禾灵；苯氧乙酸类除草剂，包括4-CPA、2，4-D、3，4-DA、MCPA，2甲4氯乙硫酯和2，4，5-T；苯氧丁酸类除草剂，包括4-CPB、2，4-DB、3，4-DB、MCPB和2，4，5-TB；苯氧丙酸类除草剂，包括调果酸、4-CPP、滴丙酸、滴丙酸-P、3，4-DP、涕丙酸、氯丙酸和氯丙酸-P；芳氧苯氧丙酸类除草剂，包括chlorazifop、炔草酸酯、草丙酯、氰氟草、禾草灵、

唑灵、

唑灵-P、噻唑禾草灵、吡氟禾草灵、吡氟禾草灵-P、吡氟氯禾灵、吡氟氯禾灵-P、异

草醚、

唑酰草胺、喔草酯、喹禾灵、喹禾灵-P和trifop；苯二胺类除草剂，包括敌乐胺和氨氟乐灵；吡唑类除草剂，包括四唑嘧磺隆、野燕枯、吡氯磺隆、灭草胺、吡嘧磺隆和派罗克杀草砜；苯甲酰基吡唑类除草剂，包括吡草酮、pyrasulfotole、苄草唑、匹唑芬和topramezone；苯基吡唑类除草剂，包括异丙吡草酯、吡氯草胺和霸草灵；哒嗪类除草剂，包括醚草敏、pyridafol和哒草特；哒嗪酮类除草剂，包括溴杀草敏、氨基氯哒嗪酮、草哒酮、氟哒嗪草酯、二甲哒草伏、哒草灭、草哒松和pydanon；吡啶类除草剂，包括氯氨吡啶酸、cliodinate、克草立特、吡氟草胺、氟硫草定、flufenican、使它隆、氟啶草、毒莠定、氟吡酰草胺、氯草定、氧磺草胺、噻草啶和氯草定；嘧啶二胺类除草剂，包括iprymidam和tioclorim；季铵类除草剂，包括赛伯刈、diethamquat、野燕枯、敌草快、伐草快和百草枯；硫代氨基甲酸酯类除草剂，包括苏达灭、草灭特、燕麦敌、EPTC、依色卡巴、抑草威、isopolinate、methiobencarb、禾草敌、坪草丹、克草猛、苄草丹、稗草畏、草克死、杀草丹、仲草丹、三氯烯丹和灭草猛；硫代碳酸酯类除草剂，包括草灭散、EXD和扑灭生；硫脲类除草剂，包括灭草恒；三嗪类除草剂，包括杀草净、三嗪氟草胺和三羟嗪；氯三嗪类除草剂，包括阿特拉津、可乐津、草净津、环草津、甘草津，草怕津、灭莠津、环丙腈津、甘扑津、扑灭津、另丁津、西玛津、特丁津和草达津；甲氧三嗪类除草剂，包括阿特拉通、醚草通、扑灭通、仲丁通、西玛通和特丁通；甲基硫代三嗪类除草剂，包括莠灭净、灭苏民、氰草净、敌草净、二甲丙乙净、盖草津、扑草净、西草净、去草净；三嗪酮类除草剂，包括胺嗪酮、胺嗪草酮、六嗪酮、丁嗪草酮、苯嗪草酮、赛克津；***类除草剂，包括氨基***、唑草胺、***磺和氟胺草唑；***酮类除草剂，包括胺唑草酮、酰苯草酮、氟唑草酮、氟酮磺隆、卤苯胺唑、丙苯磺隆、甲磺草胺和酮脲磺草吩；***嘧啶类除草剂，包括氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、甲氧磺草胺、脲嘧啶类除草剂，包括双苯嘧草酮、除草定、氟丙嘧草酯、氟单丙嘧草酯、异草定、环草定、苯嘧磺草胺和特草定；尿素类除草剂，包括噻草隆、苄草隆、环莠隆、氯双脲、二氟吡隆、异草完隆、异

隆、甲苯噻隆、monisouron和草完隆；苯基脲类除草剂，包括anisuron、播土隆、氯溴隆、chloreturon、绿麦隆、枯草隆、杀草隆、枯莠隆、唑隆、敌草隆、非草隆、伏草隆、氟硫隆、异丙隆、利谷隆、灭草恒、甲基杀草隆、吡喃隆、秀谷隆、甲氧隆、绿谷隆、灭草隆、草不隆、对氟隆、稀草隆、环草隆、四氟隆和噻苯隆；磺脲类除草剂；嘧啶磺酰脲类除草剂，包括氨基嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、豆磺隆、环丙嘧磺隆、乙氧磺隆、啶嘧磺隆、氟吡磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、吡氯磺隆、唑吡嘧磺隆、甲基二磺隆、烟嘧磺隆、嘧苯胺磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、吡嘧磺隆、玉嘧磺隆、嘧黄隆、磺酰磺隆和三氟啶磺隆；三嗪磺酰脲类除草剂，包括氯磺隆、醚磺隆、胺苯磺隆、碘磺隆、甲磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、氟胺磺隆和三氟甲磺隆；噻二唑脲类除草剂，包括丁噻隆、磺噻隆、特丁噻草隆、噻氟隆和噻苯隆；以及未分类的除草剂，包括丙烯醛、烯丙醇、环丙嘧啶酸、唑啶草酮、噻草平、苯并双环酮、丁硫咪唑酮、氰氨化钙、cambendichlor、伐草克、燕麦酯、氟咪杀、氯甲丹、环庚草醚、异

草酮、CPMF、甲酚、氨基氰、邻二氯苯、哌草丹、草多索、唑啶草、氟啶酮、氟咯草酮、呋草酮、嗪草酸、茚草酮、异硫氰酸甲酯、OCH、

嗪草酮、五氯苯酚、环戊

草酮、乙酸苯汞、唑啉草酯、甲硫磺乐灵、嘧啶肟草醚、环酯草醚、灭藻醌、硫氰苯胺、sulglycαβin、噻二唑草胺、灭草环、三甲隆、tripropindan和草达克。上面的列举只是示例性的，可以使用其它除草剂，这也将属于本发明的范围之内。

可以在本文中教导的组合物中使用的杀虫剂、灭螨剂、杀线虫剂和杀螺剂的具体例子包括但不限于：阿巴美丁；乙酰甲胺磷；啶虫脒；阿纳宁；棉铃威；涕天威；α-氯氰菊酯；顺式氯氰菊酯；阿米曲拉；谷硫磷A；甲基谷硫磷；***锡；

虫威；丙硫克百威；杀虫磺；β-氟氯氰菊酯；联苯菊酯；苄螨醚；溴硫磷A；丁苯氨酯；稻虱净；布嘉信；butylpyridaben；硫线磷；甲萘威；卡巴呋喃；三硫磷；呋喃威；杀螟丹；氯乙克；氯虫苯甲酰胺；氯氧磷；杀螟威；枯草隆；氯甲磷；毒死蜱；顺式苄呋菊酯；功夫菊酯；四螨嗪；噻虫胺；cyanoimine；杀螟腈；乙氰菊酯；氟氯氰菊酯；环己锡；溴氰菊酯；内吸磷M；内吸磷S；甲基内吸磷；丁醚脲；丁硫克百威；除线磷；dicliphos；乙硫磷；除虫脲；乐果；二甲基亚硝胺；呋虫胺；二

磷；多拉克丁；克瘟散；埃玛菌素；硫丹；高氰戊菊酯；杀虫丹；乙硫磷；乙虫腈；醚菊酯；灭线磷；乙嘧硫磷；克线磷；芬杀螨；六苯丁锡氧；杀螟硫磷；仲丁威；苯硫威；苯氧威；甲氰菊酯；吡螨胺；唑螨酯；倍硫磷；氰戊菊酯；氟虫腈；氟啶胺；氟虫酰胺；氟环脲；氟氰戊菊酯；氟芬隆；氟醚菊酯；氟草肟；大福松；安果；噻唑膦；苄螨醚；γ氯氟氰菊酯；HCH；庚烯磷；六伏隆；噻螨酮；吡虫啉；异稻瘟净；异丙威；异

唑磷；伊维菌素、λ氯氟氰菊酯；林丹；氯芬奴隆；马拉硫磷；灭蚜磷；倍硫磷亚砜；四聚乙醛；甲胺磷；甲硫威；灭多虫；速灭威；速灭磷；密灭汀；米尔贝肟；莫昔克丁；二溴磷；NC 184；烯啶虫胺；硝基亚甲基类；氧乐果；草氨酰；砜吸磷M；异亚砜磷；对硫磷；甲基对硫磷；苄氯菊脂；稻丰散；甲拌磷；伏杀磷；亚胺硫磷；辛硫磷；抗蚜威；嘧啶磷A；嘧啶磷M；猛杀威；丙虫磷；残杀威；丙硫磷；发硫磷；吡蚜酮；吡唑硫磷；pyrada-phenthion；pyresmethrin；除虫菊；哒螨灵；嘧螨醚；蚊蝇醚；吡丙醚；氯虫苯甲酰胺；水杨硫磷；克线丹；氟硅菊酯；硫特普；硫灭克磷；虫酰肼；毗螨胺；tebupihmphos；伏虫隆；七氟菊酯；硫甲双磷；叔丁威；特丁磷；杀虫畏；噻虫啉；thiafenox；噻虫嗪；硫双卡；硫伐隆；硫磷嗪；苏云金素；四溴菊酯；triarthen；唑蚜威；***磷；唑蚜威；敌百虫；杀铃脲；混杀威；蚜灭多；灭杀威；ζ-氯氰菊酯；zetamethrin；和苏云金芽孢杆菌(Bt)产品，包括它们的盐和酯。上面的列举只是示例性的，可以使用其它杀虫剂，这也属于本发明的范围之内。

本发明的实施例中可以使用多种杀真菌剂。它们包括例如以下文献中分类和列举的那些：Fungicide Resistance Action Committee(FRAC)，FRAC CODE LIST 1：Fungicides sorted by FRAC Code，December 2006，据此将上述内容以全文引用的方式并入。这里所列出的总结如下：苯并咪唑氨基甲酸甲酯(MBC)：例如，苯并咪唑和硫菌灵；二羧酰亚胺；去甲基化抑制剂(DMI)(SBI：I类)：例如，咪唑、哌嗪、吡啶、嘧啶和***；苯基酰胺(PA)：例如，酰基丙氨酸、

唑烷酮和丁内酯；胺(SBI：II类)：例如，吗啉、哌啶和螺环菌胺；硫代磷酸酯and二硫戊环；甲酰胺：例如，苯甲酰胺、呋喃甲酰胺、氧硫杂环己二烯甲酰胺、噻唑甲酰胺、吡唑甲酰胺和吡啶甲酰胺；羟基-(2-氨基-)嘧啶；苯胺基-嘧啶(αβ)；N-苯基氨基甲酸酯；苯醌外抑制剂(Qol)：例如，甲氧基丙烯酸酯、甲氧基-氨基甲酸酯、羟亚氨基醋酸酯、羟亚氨基-乙酰胺、

唑烷-二酮、二氢-二

嗪、咪唑啉酮和苄基-氨基甲酸酯；苯基吡咯；喹啉；芳烃(AH)和杂芳族化合物I：例如，1，2，4-噻二唑；肉桂酸；黑色素生物合成抑制剂-还原酶(MBI-R)：例如，异苯并呋喃酮、吡咯并喹啉酮和***苯并噻唑；黑色素生物合成抑制剂-脱水酶(MBI-D)：例如，环丙烷-甲酰胺、甲酰胺和丙酰胺；羟基酰替苯胺(SBI：III类)；羟基酰替苯胺(SBI：IV类)：例如，硫代氨基甲酸酯和烯丙胺；多氧菌素：例如，肽基嘧啶核苷；苯基脲；苯醌内抑制剂(Qil)：例如，氰基咪唑和氨磺酰-***；苯甲酰胺：例如，甲苯酰胺；抗生素：例如，吡喃醣醛酸、己吡喃、链霉素和维利霉素；氰基乙酰胺-肟；氨基甲酸酯；二硝基苯基巴豆酸酯；嘧啶酮-腙；2，6-二硝基-苯胺；有机锡化合物：例如，三苯基锡化合物；羧酸；杂芳族化合物II：例如，异

唑和异噻唑酮；膦酸酯：例如，乙基膦酸酯和亚磷酸及盐；氨甲酰苯甲酸；苯并三嗪；苯磺酰胺；哒嗪酮；噻吩-甲酰胺；嘧啶酰胺；CAA-杀真菌剂(羧酸酰胺)：例如，肉桂酸酰胺、缬氨酰胺氨基甲酸酯和扁桃酸酰胺；四环素；硫代氨基甲酸酯；苯酰胺：例如，酰基皮考啉；寄主植物防卫诱导剂：例如，苯并噻二唑BTH、苯并异噻唑和噻二唑-甲酰胺；未分类的物质：例如，噻唑甲酰胺、苯基乙酰胺、喹唑啉酮和二苯甲酮；多点接触材料：例如，铜盐、硫、二硫代氨基甲酸酯和相关物、邻苯二甲酰亚胺、氯代腈(酞腈)、硫酰胺、胍、三嗪和醌(蒽醌)；未分类的物质：例如，矿物油、有机油、碳酸氢钾和生物材料。

本领域技术人员将认识到，在本发明的各实施例中使用其它杀真菌剂也是可行的，故在本文中不列出具体的杀真菌剂或杀真菌剂的种类并不意味着对权利要求有限制。

本发明的组合物可以在聚合物物质中微胶囊化。合适的微胶囊化材料的例子包括下述类别的材料，其中提供了代表性的成员。对本领域技术人员显而易见的是，可以使用具有聚合物性质的其它类材料，并且每个给定类别及其它聚合物类别之内的其它材料可用于微胶囊化。在本说明书中，微胶囊化的含义包括纳米胶囊化的方法和材料。例子包括但不限于：树胶和天然大分子：如***树胶、琼脂、海藻酸钠、卡拉胶和明胶；碳水化合物：如淀粉、葡聚糖、玉米糖浆和P-环糊精；纤维素及半合成大分子：如羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、硝化纤维素、乙酰纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、邻苯二甲酸丁酸醋酸纤维素、环氧化物和聚酯；类脂物：如蜡、石蜡、硬脂酸、单甘油酯、磷脂、双甘油酯、蜂蜡、油类、脂肪、硬化油和卵磷脂；无机材料：如硫酸钙、硅酸盐和粘土；蛋白质：如谷蛋白、酪蛋白、胶质和白蛋白；生物材料：如，来自有机体的排出细胞，如酵母及其它微生物，连同其它以往的活细胞组织。此外，在微胶囊化或纳米胶囊化过程中可以单独或混合使用这些材料。

本发明的又一方面涉及诱导植物反应的方法。这一方法涉及对植物、植物种子或果实施加本发明的组合物。在能有效地诱导植物对组合物施加的反应的条件下对植物、植物种子或果实施加所述组合物。

植物对组合物的反应包括通过与harpin蛋白或多肽接触产生的任何反应。例如，所述反应可包括但不限于抗病性、植物生长、抗昆虫性、抗逆性、收获后抗病性和抗脱水性。

关于赋予抗病性，可能无法获得针对感染的绝对免疫，但可以降低疾病的严重程度和推迟症状的发展。病灶数目、病灶尺寸和真菌病原体的孢子形成程度均可减少。这种赋予抗病性的方法有可能用于治疗以前无法治疗的疾病、治疗***性疾病(由于成本的原因可能无法进行单独的治疗)和避免使用传染性试剂或环境有害的材料。

关于脱水，可能无法获得针对脱水的完全保护，但可以降低脱水的严重程度。脱水保护必然要至少在某种程度上依赖于其它条件，如储存温度、光照等。然而，控制脱水有可能免去进行其它的处理(即，使用涂敷的蜡)，这可有助于降低成本，或至少基本上不增加成本

根据本发明对植物赋予病原体抗性适用于对包括病毒、细菌和真菌在内的多种病原体赋予抗性。通过本发明的方法尤其可以获得对以下病毒的抗性：烟草花叶病毒和番茄花叶病毒。根据本发明也可以给植物赋予对以下细菌的抗性：青枯假单胞菌、烟草野火病菌和野油菜黄单胞菌。通过利用本发明的方法尤其可以使植物对以下真菌产生抗性：尖孢镰刀菌和马铃薯晚疫病菌。

关于增强植物生长，可以实现多种形式的植物生长增强或促进作用。这可发生于早在植物从种子开始生长之时或在以后的植物生长阶段。例如，根据本发明的植物生长包括更高的产量、增加的种子产量、增加的发芽种子百分比、增大的植物尺寸、更多的生物质、更多和更大的果实、更早的果实着色和更早的果实及植物成熟。因此，本发明的组合物给种植者提供显著的经济效益。例如，早期发芽和早熟可以使作物在短生长季节的域生长，不然的话该地点将妨碍它们的生长。种子发芽百分比的提高可导致作物株的改善和更有效地利用种子。产量提高、尺寸增大和生物质生产的提高可以在给定的地块上获得更好的收成。

根据本发明的昆虫控制包括防止昆虫接触已施加过敏反应诱导子的植物、防止昆虫通过吃食损伤对植物造成直接的伤害、使昆虫离开这种植物、杀死接近这种植物的昆虫、干扰昆虫幼虫吃食这种植物、防止昆虫定殖于寄主植物、防止定殖昆虫释放植物毒素等。本发明的组合物还可防止后续由昆虫感染造成对植物的病害。

本发明的组合物对多种昆虫是有效的。欧洲玉米螟是玉米(臼齿形玉米和甜玉米)的主要害虫，但还吃食200多种植物，包括绿豆、蜡豆、利马豆、大豆、辣椒、土豆、番茄和许多种杂草。损害多种蔬菜作物的另外的昆虫幼虫吃食害虫包括但不限于甜菜夜蛾、粉纹夜蛾、玉米穗虫、秋夜蛾、小菜蛾、白菜根蛆、葱蛆、种蝇、泡菜虫(甜瓜野螟)、胡椒实蝇和番茄蛲虫。总的来说，这组昆虫害虫代表了对世界各地蔬菜生产经济上最重要的害虫群体。

本发明的另一方面涉及对植物赋予抗逆性。压力包括对植物生理和生长具有不利影响的任何环境因素。这种环境压力的例子包括但不限于与气候有关的压力(例如，干旱、水、霜、低温、高温、强光和光线不足)、空气污染压力(例如，二氧化碳、一氧化碳、二氧化硫、NOX、碳氢化合物、臭氧、紫外线辐射、酸雨)、化学药品(例如，杀虫剂、杀真菌剂、除草剂、重金属)和营养方面的压力(例如，肥料、微营养素、常量营养素)。本发明的组合物可用于给植物赋予对这种形式的环境压力的抗性。

本发明的这种方法可用于控制许多由多种病原体引起的收获后疾病。可根据本发明治疗的这些收获后疾病以及致病物包括但不限于如下所述：青霉菌(例如指状青霉)、葡萄孢菌(例如灰葡萄孢霉)、疫霉(例如，柑桔褐腐疫霉)和欧文氏菌(例如，胡萝卜软腐欧文氏菌)。

当对植物的全部或一部分(包括但不限于叶、茎、根、繁殖芽体(例如切枝)、果实等)进行治疗时，可以通过多种程序实施涉及施加本发明组合物的本发明的方法。这可能(但不必)涉及使harpin蛋白或多肽渗入植物。合适的施加方法包括在接近进行诱导子施加的时候进行高压或低压喷洒、注射和擦叶。合适的施加方法还可以包括雾化、形成泡沫、成雾、涂抹和包外层。

当处理植物种子时，可以通过低压或高压喷洒、涂抹、浸泡或注射施加harpin蛋白或多肽。本领域技术人员可以设想其它合适的施加程序，条件是它们能够实现使过敏反应诱导子多肽或蛋白质与植物或植物种子的细胞相接触。一经用本发明的组合物进行处理便可以在天然或人工土壤上种植种子，并采用常规程序栽培以生产植物。在已经用本发明处理的种子播种植物之后，可以对植物进行一次或多次施加本发明组合物的处理，从而对植物赋予抗病性、增强植物生长、控制植物上的昆虫、赋予抗逆性和/或收获后的抗病性。

可以对水果或植物实施本发明组合物的施加以提高水果的寿命或对植物增熟以抑制收获后疾病在收获的水果或植物中的发病和收获的水果或植物的脱水。根据一个实施例，在能有效获得这些效果的条件下用本发明的液体组合物处理水果或植物。可以在收获水果或植物之前或之后，采用本文中所述的技术对水果或植物施加本发明的液体组合物。

在一个实施例中，组合物是对植物施加的。对植物施加组合物的实施速率可以为约0.1至10,000g/ha的harpin蛋白或多肽。优选的是，对植物实施的施加速率为约10至1,000g/ha的harpin蛋白或多肽。

在本发明的这种方法的另一实施例中，组合物是对植物种子施加的。对植物种子施加组合物的实施速率可以是对种子为约0.001至50g/kg的harpin蛋白或多肽。优选的是，对植物种子实施的施加速率是对种子为约0.01至10g/kg的harpin蛋白或多肽。

根据本发明可以单独地或者作为与其它物质的混合物对植物、植物种子或水果施加本发明的组合物。做为选择，可以单独地对植物施加本发明的组合物，而在不同的时间施加其它物质。

本发明的方法可用来处理许多种植物或它们的种子，从而对其赋予抗病性、增强生长、控制昆虫、赋予抗逆性和/或收获后抗病性。合适的植物包括双子叶植物和单子叶植物。更具体地，适用的植物作物可以包括但不限于苜蓿、稻米、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、豆类、豌豆、菊苣、莴苣、苣荬菜、卷心菜、抱子甘蓝、甜菜、防风草、萝卜、花椰菜、青花菜、萝卜、小萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、辣椒、芹菜、胡萝卜、西葫芦、南瓜、小胡瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、树莓、菠萝、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。合适的观赏植物的例子包括但不限于拟南芥、非洲紫罗兰、矮牵牛花、天竺葵、一品红、菊花、康乃馨和百日草。

通过下面的实例进一步阐述本发明的这些方面。

实例

提供以下实例用于阐述本发明的实施例，但它们绝不是为了限制本发明的范围。

实例1-含Harpinαβ^*的稳定液体组合物的制备及其在抗病性试验中的功效

在组成型启动子的控制下使用重组大肠杆菌来表达harpinαβ(SEQ ID NO：1的superharpin)。发酵后在2倍体积的磷酸钾缓冲液中稀释悬浮液，以将悬浮液的PH值调至7.0。

所得溶液用热交换***在95℃热处理分钟，然后在40分钟内冷却到45℃。

在达到约38-42℃之后向溶液中加入溶菌酶，混合至最终浓度为1ppm，然后让其反应45分钟。这有助于细菌的细胞壁破裂，导致形成粗harpinαβ提取物。

然后对所得粗提取物离心5分钟以除去一些细胞碎屑。分开所得上清液并在下面的条件下进行进一步的热处理：(i)在121℃和15psi压力下进行5分钟，或者(ii)在100℃进行10分钟。在温度冷却到20-25℃后，以20,000rpm对提取物再离心5-10分钟以除去剩余的细胞碎屑和一些变性蛋白。包含没有细胞碎屑和大多数变性蛋白的澄清的上清液用于形成稳定的液体组合物。

在两个澄清的上清液(i)和(ii)的一个处理液中，向harpinαβ提取物中加入三效消毒剂到最终浓度为0.5％以进一步阻止任何活生物体的生长。在另一处理液中，既不加抗生素也不加消毒剂。

对所得组合物进行下面的试验：(i)harpinαβ蛋白的HPLC分析，(ii)其在抗病性试验中的功效。含磷酸盐缓冲盐水的同等处理的组合物(有和没有0.5％的三效剂)用作阴性对照。在抗病性诱导试验中，具有1％的harpin αβ的商业产品Pro Act(Plant Healthcare，Inc.)用作阳性对照。

HPLC分析

对于HPLC分析，进行以下试验。样品1：100℃处理10分钟，没有三效剂；样品2：100℃处理10分钟，加0.5％的三效剂；样品3：121℃处理5分钟，没有三效剂；和样品4：121℃处理5分钟，用0.5％的三效剂。

HPLC分析表明，在不加消毒剂的情况下在100℃处理10分钟，液体harpinαβ组合物只稳定约4周。但在添加0.5％的三效消毒剂的情况下，同样的处理导致harpinαβ的稳定超过3个月。在添加或不添加消毒剂的情况下在121℃处理5分钟也能稳定超过3个月。显示harpinαβ浓度的这些实验的结果列于下表4。

表4：液体组合物的稳定性数据

这些结果表明，harpinαβ蛋白的液体制剂的生物降解主要归因于活生物体的自然环境。然而，进行高温处理或在消毒剂存在的情况下，harpinαβ蛋白的液体制剂可以保持较长时间的稳定。

抗病性诱导试验

抗病性诱导试验进行如下。除了上述四个样品外，使用1％干产品ProAct作为阳性对照，使用有和没有消毒剂的5mM磷酸钾缓冲液作为阴性对照。通过叶面喷洒的方式以5ppm的比率把所有含harpin的样品局部施加到出现第一片真叶后过8周的6颗烟苗上。所有的秧苗都生长在温室条件下，日间温度约25℃，夜间温度约18℃，白天光照约16小时，夜间处于黑暗中约8小时。湿度保持在70％左右。

烟草植株用浓度为2μg/ml的烟草花叶病毒(“TMV”)进行测试。通过数出接种后的第7天出现在叶片上的病灶数来评价疾病的严重程度。试验数据(表5)显示，就TMV病灶的减少来说，液体harpinαβ组合物获得了与商业产品ProAct同等的结果。如上所述，鉴于液体制剂提供的益处显著优于粉末制剂，使用者应该更倾向于给出同等功效的液体制剂。

表5：抗病性诱导试验结果

虽然为阐述本发明的目的已做了详细的描述，但应理解的是，这种细节纯粹是为了上述目的，在不偏离本发明的实质和由以下权利要求书所确定的范围的情况下，本领域技术人员可以对其进行变化。

Claims (33)

1.一种制备含harpin蛋白或多肽的稳定液体组合物的方法，所述方法包括：

获得基本上不含细胞碎屑且包含harpin蛋白或多肽的液体提取物；和

向所述液体提取物当中引入杀生剂和任选蛋白酶抑制剂与非离子表面活性剂中的一个或这两者，从而获得含所述harpin蛋白或多肽的液体组合物，所述液体组合物保持harpin活性至少约72小时。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述harpin蛋白或多肽选自梨火疫病欧文氏菌HrpN的同源物、梨火疫病欧文氏菌HrpW的同源物、丁香假单胞菌HrpW的同源物、丁香假单胞菌HrpZ的同源物、野油菜黄单胞菌HreX的同源物和包含两个或更多过敏反应诱导域的融合蛋白中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得包括：

把发酵的细菌悬浮液加热到温度为约60至100℃；

冷却所述悬浮液；

在所述细菌悬浮液中裂解细胞；和

从所述悬浮液中除去细胞碎屑。

4.根据权利要求3所述的方法，进一步包括在所述加热之前把所述发酵细菌悬浮液的pH调节到约5.5至10的pH。

5.根据权利要求4所述的方法，其中使用磷酸钾缓冲液或Tris-EDTA缓冲液进行所述调节。

6.根据权利要求3所述的方法，其中用浓度约1ppm至100ppm的溶菌酶进行所述裂解。

7.根据权利要求1所述的方法，其中以约1ppm至100ppm的浓度向所述液体提取物当中引入所述杀生剂。

8.根据权利要求1所述的方法，其中向所述液体提取物当中引入蛋白酶抑制剂。

9.根据权利要求8所述的方法，其中以约1ppm至100ppm的浓度向所述液体提取物当中引入所述蛋白酶抑制剂。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂选自抑肽酶、贝他定、钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、胰凝乳蛋白酶抑制剂、E-64、亮肽素、α-2-巨球蛋白、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、胃酶抑素、苯甲磺酰氟和甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮。

11.根据权利要求1所述的方法，其中将非离子表面活性剂引入所述液体提取物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中以约0.05％至约10％体积量将所述非离子表面活性剂引入所述液体提取物。

13.根据权利要求1所述的方法，其中将蛋白酶抑制剂和非离子表面活性剂两者引入所述液体提取物。

14.由权利要求1所述的方法得到的液体组合物。

15.一种组合物，包含水基载体、harpin蛋白或多肽、有效量的杀生剂和任选有效量的蛋白酶抑制剂与非离子表面活性剂之一或这两者，由此所述组合物保持harpin活性至少约72小时。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述harpin蛋白或多肽选自梨火疫病欧文氏菌HrpN的同源物、梨火疫病欧文氏菌HrpW的同源物、丁香假单胞菌HrpW的同源物、丁香假单胞菌HrpZ的同源物、野油菜黄单胞菌HreX的同源物和包含两个或更多过敏反应诱导域的融合蛋白中的一种或多种。

17.根据权利要求15所述的组合物，其中所述杀生剂的存在量为约1ppm至100ppm。

18.根据权利要求15所述的组合物，其形式为溶液、乳液、可乳化的浓缩物、悬浮液、泡沫、气溶胶、悬乳剂浓缩物、浆体或糊剂。

19.根据权利要求15所述的组合物，还包含：有效量的除草剂、杀虫剂、引诱剂、消毒剂、杀菌剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀真菌剂和/或生长调节剂。

20.根据权利要求15所述的组合物，其中所述组合物在聚合物物质中被微胶囊化。

21.根据权利要求15所述的组合物，其中所述组合物保持至少约50％的活性超过72小时。

22.根据权利要求15所述的组合物，其中所述组合物保持至少约90％的活性超过3个月。

23.根据权利要求15所述的组合物，包含蛋白酶抑制剂。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述蛋白酶抑制剂的存在量为约1ppm至100ppm。

25.根据权利要求23所述的组合物，其中所述蛋白酶抑制剂选自抑肽酶、贝他定、钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、胰凝乳蛋白酶抑制剂、E-64、亮肽素、α-2-巨球蛋白、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、胃酶抑素、PMSF和TLCK。

26.根据权利要求15所述的组合物，包含非离子表面活性剂。

27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述非离子表面活性剂的存在体积量为约0.05％至约10％。

28.根据权利要求15所述的组合物，包含蛋白酶抑制剂和非离子表面活性剂两者。

29.一种诱导植物反应的方法，包括：对植物、植物种子或果实施加根据权利要求14所述的组合物，所述施加是在能有效地诱导植物对所述施加做出反应的条件下进行的。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述植物反应是抗病性、植物生长、抗虫性和抗脱水性中的一种或多种。

31.根据权利要求29所述的方法，其中所述施加是通过喷洒、雾化、形成泡沫、成雾、涂抹和/或包外层的方式进行的。

32.根据权利要求29所述的方法，其中所述施加是以约0.1至10,000g/ha的harpin蛋白或多肽的比率对植物进行的。

33.根据权利要求29所述的方法，其中所述施加是对植物种子进行的，对种子的施加比率为约0.001至50g/kg的harpin蛋白或多肽。