CN107354191B

CN107354191B - 一种用于促进植物生长和病虫害防治的生物制剂

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Publication number: CN107354191B
Application number: CN201710676176.2A
Authority: CN
Inventors: 刘欣; 胡业勤; 刘军鹏; 刘胜; 朱德武
Original assignee: Hubei Wei Sheng Yuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hubei Wei Sheng Yuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-08-09
Filing date: 2017-08-09
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2037-08-09
Also published as: CN107354191A

Abstract

本发明涉及一种制备含有过敏蛋白(Harpin)的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤，(1)菌种复苏及扩增；(2)发酵罐发酵；(3)发酵液处理；其中，步骤(1)所述的菌种复苏及扩增步骤为：取转化了过敏蛋白(Harpin)工作种子库菌种，待融化后扩增培养；步骤(2)所述的发酵罐发酵包括：1)菌种驯化；2)菌体扩增；3)诱导表达；步骤(3)所述的发酵液处理为：缓慢加入尿素至发酵液中，至尿素终浓度为8mol/L且完全溶解后继续搅拌15～45分钟，冷却该液体组合物至2～8℃。

Description

一种用于促进植物生长和病虫害防治的生物制剂

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及一种用于促进植物生长和病虫害防治的生物制剂。

背景技术

化肥和农药是提高作物产量和防治病虫害的主选产品，但同时产生了环境、能源以及成本等方面的问题，成为现在困扰世界各国的经济与社会发展的重大，严重制约着农业的可持续性发展。而利用来自微生物或真菌的蛋白质制备的生物制品(包括生物肥料和生物农药)是当代作物优质、高效和无公害生产的主要措施。近年来，国内外在此方面已开展了大量的科学研究。早期的微生物蛋白主要是来自苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白(ICP),新型微生物蛋白主要是蛋白激发子类物质，目前研究报道的具有代表性的新型微生物蛋白主要有过敏蛋白(Harpin)、隐地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)，这些蛋白质不直接杀灭害虫和病原物，也不直接提供营养物质，而是在促进植物生长发育和对营养物质的吸收、增强植物的广谱抗病性(包括对多种细菌、真菌和病毒的抗性)、增强植物的驱虫性、增强植物的抗逆性(植物对干旱、严寒、盐碱等不良环境的耐受性)、延长作物产品的储存时间、对盆花和苗木的塑形作用方面有广泛应用前景。因此，它们可以配制成生物制品，应用到以上方面。

这些新型微生物蛋白或多肽大都通过发酵重组大肠杆菌等生物工程菌来实现大批量生产，在发酵后的下一步工艺为溶解细菌悬浮液中的细菌细胞以释放微生物蛋白或多肽。细胞溶解的方法有非化学的方法，如高压或超声波处理，使用该方法对设备要求较高，能耗高且难以大规模应用。作为另外的选择，大部分厂商采用将细胞悬浮液与溶菌酶接触来进行，之后还需要进行40-42℃消化，离心去细胞碎片和变性蛋白，以及蛋白纯化工艺，这些工艺操作复杂，且会降低微生物蛋白和多肽的收率并降低它们的生物活性和稳定性。

因此，需要有更适合大规模工业化生产的方法生产这类新型微生物蛋白或多肽。

发明内容

本发明的首先提供一种制备含微生物蛋白或多肽的稳定液体组合物的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获得基本上无固体不溶物且包含微生物蛋白或多肽的液体提取物；

(2)调整发酵液pH值，将pH控制在7.0～7.4，使其能在2～8℃保存条件下保持微生物蛋白或多肽的活性至少12个月。

所述的微生物蛋白或多肽包括杀虫晶体蛋白(ICP)、过敏蛋白(Harpin)、隐地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)，优选为过敏蛋白(harpin)，所述的过敏蛋白包括但不限于，harpin蛋白家族的HrpN_Ea(来源于解淀粉欧文氏菌，蛋白长度403个氨基酸)、HrpN_Ech(来源于菊欧文氏菌，蛋白长度340个氨基酸)、HrpN_Ecc(来源于菊欧文氏菌，蛋白长度340个氨基酸)、HrpN_Ea(来源于菊欧文氏菌，蛋白长度340个氨基酸)、HrpN_Ea(来源于胡萝卜软腐欧文氏菌，蛋白长度356个氨基酸)、HrpN_Est(来源于斯氏欧文氏菌)、HrpW_Pss(来源于丁香假单胞菌，蛋白长度424个氨基酸)、HrpW_Ea(来源于解淀粉欧文氏菌，蛋白长度447个氨基酸)、HrpZ_Pss(来源于丁香假单胞菌，蛋白长度341个氨基酸)、PopA1(来源于R.solanacearum，蛋白长度344个氨基酸)、HarpinXoo(来源于水稻白叶枯菌，蛋白长度139个氨基酸)；其中最优选的，所述的过敏蛋白为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的过敏蛋白(Harpin)的部分序列：

Seq ID No.1：

MSLNTSGLGASTMQISIGGAGGNNGLLGTHMPGTSSSPGLFQSGGDNGLGGHNANSALGQQPIDRQTIEQMAQLLAELLKSLLDSGEKLGDNFGASADSASGTGQQDLMTQVLNGLAKSMLDDLLTKQDGGTSFSEDDSGPAKDGNANAGANDPSKNDPSKSQGPQSANKTGNVDDANNQDPMQALMQLLEDLVKLLKAALHMQQPGGNDKGNGVGGDSGQNDDSTSGTDSTSDSSDPMQQLLKMFSEIMQSLFGDEQDGTDSTSGSRFTRTGIGMKAGIQALNDIGTHSDSSTRSFVNKGDRAMAKEIGQFMDQYPEVFGKPQYQKGPGQEVKTDDKSWAKALSKPDDDGMTPASMEQFNKAKGMIKSAMAGDTGNGNLQARGAGGSSLGIDAMMAGDAINNMALGKLGAA-。

所述的步骤(1)包括如下步骤，

a、质粒及菌种构建

1、质粒构建

基因片段扩增：为了将过敏蛋白(Harpin)基因克隆到大肠杆菌表达载体pET28a(该载体自身含有lacIq，背景表达低，适合有毒蛋白表达)上，

1)扩增Harpin基因片段：

正向引物SHs(SEQ ID No.2)：5'-ATAGAATTCATGAGTCTGAATACAAGTGGGCTG-3'(EcoRI用下划线表示)；

逆向引物SHa(SEQ ID No.3)：5'-TCAAAGCTTTTAAGCCGCGCCCAGC-3'(HindIII用下线表示)。

片段PCR扩增在50μL的反应体系进行，包括Ex Taq聚合酶(Takara)，使用150ng正向和逆向引物以及1ng模板质粒DNA。

PCR产物通过0.8％(w/v)琼脂糖凝胶进行分离，通过SYBR Safe(Invitrogen)进行检测，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，用洗脱缓冲液TE(50μL)进行洗脱。

2)重组质粒制备：

将纯化的PCR产物和质粒pET28a分别用EcoRI/HindIII双酶切，PCR产物和线性化载体通过0.8％(w/v)琼脂糖凝胶进行分离，通过SYBR Safe(Invitrogen)进行检测，使用QIAquick试剂盒(Qiagen)纯化，用洗脱缓冲液TE(15μL)进行洗脱；

将5μL双酶切(EcoRI/HindIII)PCR产物(100～300ng)和1μL(50ng)线性化载体pET28a(EcoRI/HindIII)，在T4DNA ligase反应体系，4℃连接过夜；

将连接产物通过热休克的方式将反应混合物共转化进50μL DH5α化学法感受态细胞，最后铺板到选择性平板(25-50μg/ml kanamycin)；

挑选单菌落接种到加了适当抗生素的0.8ml的LB培养基中，培养物在37℃，200rpm转速下生长过夜，通过碱裂解法处理过夜培养物，制备质粒DNA，将质粒DNA用限制性内切酶EcoRI/HindII鉴定和PCR检测，筛选重组质粒，将重组质粒进行DNA测序鉴定，获得质粒pET28a-SH。

2、菌种构建

将质粒pET28a-SH转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)化学法感受态细胞，最后铺板到选择性平板(ZYM505，含1.2-1.5％琼脂及卡那霉素25μg/ml)，12-16小时后，选择10个形状规则、大的、相互间隔距离较大的菌落分别PCR鉴定和表达鉴定。

2.1PCR鉴定

挑单克隆到ZYM505培养基(1-2ml即可)，培养6小时后(或肉眼已经能看到微弱浑浊)进行PCR鉴定(采用pET28通用引物和Harpin基因引物)。鉴定阳性的菌培养过夜，2％接种量转接LB培养基(含卡那霉素34μg/ml)诱导表达。

2.2表达鉴定

使用LB诱导表达：将菌摇到约0.6-1.0OD600，用终浓度1mM IPTG诱导4小时后取样，取加IPTG前为诱导前样品。采用10％SDS-PAGE电泳进行检测，每个菌株都是诱导前和诱导2个样品电泳，每张胶上1个Marker，考染，脱色至背景几乎无蓝色。

2.3种子菌种保存

优选表达量较大的菌株1-2株，接种于扩增培养基中(ZYM505液体培养基)，含卡那霉素34μg/ml)，37℃，100-200rpm/分钟，培养6-8h，将培养物中加入20％甘油溶液(甘油溶液预先除菌过滤)至甘油终浓度为10～15％，混匀，分装于2.0ml冻存管，每管1.0ml，保存菌种于-80℃，即主种子库。

取主种子库菌种，待融化后取200μl加入80ml扩增培养基中(ZYM505液体培养基，含卡那霉素34μg/ml)，37℃，100-200rpm/分钟，培养6-8h，将培养物中加入80ml 20％甘油溶液(甘油溶液预先除菌过滤)，混匀，分装于2.0ml冻存管，每管1.0ml，保存菌种于-80℃，即工作种子库。

b、液体组合物生产

1、菌种复苏及扩增

取工作种子库菌种，待融化后加入装有50ml LB培养基(含卡那霉素34μg/ml)的200ml容量的三角瓶中，37℃，100-200rpm/分钟，培养6-8h，从中取1ml加入至装有500ml LB培养基(含卡那霉素34μg/ml)的2000ml容量的三角瓶中，37℃，100-200rpm/分钟，培养过夜，即为扩增后的菌液。

2、发酵罐发酵

发酵罐总容积为300L，装料系数70％，顶部磁力搅拌：变频调速的转速在5～1000rpm之间，搅拌桨确保搅拌均匀，可方便拆卸，搅拌桨的型式为轴向流和径向流组合。罐内温度控制：夹套的热流体的可加热可降温。水温控制+10～40℃；精度：±0.2℃；分辨率：0.1℃。

分为3个步骤

第一个步骤菌种驯化

基础培养基配制(含消泡剂，121℃20分钟灭菌，补料培养基灭菌，乳糖溶液单独灭菌，卡那霉素除菌过滤，配制1N HCl，2N NaOH(酸碱的存料瓶灭菌)；

取扩增后的菌液，接种于基础培养基(接种浓度为5％)中，加入灭菌后卡那霉素至终浓度为34μg/ml，37℃培养，控制溶氧为40～50％，pH 7.0～7.4；发酵培养2-3h，溶氧曲线陡然上升即为菌种驯化培养终点。

第二个步骤菌体扩增

溶氧曲线陡然上升，启动补料，37℃培养，控制溶氧40-50％，pH 7.0～7.4，培养3-4小时，调节通气、搅拌和补料速度，培养过程中需不断增加通气量和搅拌速度，溶氧上升趋势趋于稳定时，即为菌种扩增终点。

第三个步骤诱导表达

向发酵培养物中加入乳糖溶液至乳糖终浓度为1克/升，补料培养基中加入乳糖溶液至乳糖终浓度为1克/升，启动诱导补料，继续发酵，37℃培养，调节通气、搅拌和补料速度，控制溶氧40～50％，pH 7.0～7.4，培养3～5小时，即为诱导表达终点。

c、发酵液处理

结束培养后，保持搅拌速度为80～150rpm，缓慢加入尿素至发酵液中，至尿素终浓度为8mol/L且完全溶解后继续搅拌15～45分钟；

调节pH值至6.0～8.0，优选的，调节pH值7.0～7.4，最优选的，调节pH值至7.0；

然后，冷却该液体组合物至2～8℃后，即可保存。

本发明还涉及由所述的制备含微生物蛋白或多肽的稳定液体组合物的方法制备获得的生物制剂。

本发明还涉及由所述的生物制剂制备获得的农作物培养添加剂，所述的添加剂为液态叶面肥。

本发明还涉及所述的生物制剂或所述的农作物培养添加剂在诱导植物反应中的应用，所述的植物反应包括，促进植物的生长发育和营养吸收，增强广谱抗病性，增强植物抗逆性，增强植物驱虫性，延长储存时间等。

本发明还涉及使用所述的生物制剂或农作物培养添加剂诱导植物反应的方法，所述的诱导方法为：对植物或植物种子施用所述的生物制剂或农作物培养添加剂。

所述的对植物或植物种子施用所述的生物制剂或农作物培养添加剂的步骤为，

(1)对植物幼苗或成株喷施所述生物制剂或农作物培养添加剂；

(2)以浸种的方式在栽培前浸泡植物根茎或块茎；

所述的喷施或浸种时按照1：300～1：1500的比例将所述生物制剂或农作物培养添加剂兑水制成喷施剂或浸种剂。

根据不同品种采用不同使用方法，

(1)花卉及蔬菜等作物，在作物苗期和快速生长期，每亩共喷施作物叶面3-4次，幼苗期按照1：500比例喷施；其他时期1:1000比例喷施；

(2)林果等作物从新叶舒展期开始使用，直到收获前每隔15-20天喷洒1次，共喷3-5次，新叶舒展期按照1：500比例喷施；其他时期1:1000比例喷施。

(3)以种子或根茎(比如土豆)埋土种植的，可以在种植前先浸种，以本品1；500比例兑水均匀喷施种子、果实表面。

喷施时间：最好在傍晚无风的天气。早上有露水时降低浓度，影响施肥效果；雨天或雨前不宜施肥；喷施后3小时遇雨，晴天应补喷一次。

喷施细则：要求雾滴细小，喷施均匀，注意喷施新叶及叶背面。

喷施次数：4-5次。

喷施周期：幼叶簇出期喷施一次，比例1:500；后面采用1:1000比例，座果后，喷施一次，膨大期喷施一次，转色期喷施一次或3-4周喷施一次至收获。

叶菜类：芽期喷施一次，2-3周喷施一次至采摘。

所述的植物包括：

适用于大田作物以及蔬菜、瓜果、棉花、烟草、茶叶、花卉等经济作物，在种期、苗期、花期及果期使用效果均很好，发芽率高、根多、苗高、苗壮、叶片饱满、叶绿素含量高。特别是瓜果类(草莓、网纹瓜、大枣、桃、葡萄、梨、西瓜和樱桃等)能有效提高甜度及风味物质，茶叶提高出芽率及茶多酚的含量，烟草提高产品等级等。

本发明涉及制备微生物蛋白或多肽的稳定液体剂型的新方法。在所附的实例中所示，已经制备了至少12个月的含harpin制剂，仍能保持显著的过敏反应诱导活性，而且还有多项优点或好处，包括

(i)生产工艺及其简单，在发酵结束后半小时内即可完成，无需其他设备；

(ii)可以将菌液中的绝大部分微生物蛋白或多肽以温和的方式释放出来，并保持其生物活性；

(iii)在实施本制备工艺后，本发明的组合物的温度能降到15℃左右，便于下一步的低温保存；

(iv)添加的化学物质尿素本身也是植物肥料，本实施方法获得的组合物即为最终产品，因此彻底实现零排放，同时也节约了成本；

(v)液体制剂具有与其他农用化学品一起作为技术级材料用于制剂的潜力。

附图说明

图1、实施例1中SDS-PAGE检测Harpin蛋白表达与纯化效果：其中，CL：离心后的上清；FT：Ni-NTA Superflow柱流穿液；E1-E5：分部收集的洗脱液；M：中分子量蛋白质Marker。

图2、喷施过本产品的烟草及对照。

图3、喷施过本产品的南瓜及对照。

图4、喷施过本产品的网纹瓜及对照。

图5、喷施过本产品的葡萄及对照。

图6、喷施过本产品的大葱及对照。

图7、喷试过本产品的大蒜及对照。

图8、喷试过本产品的草莓及对照。

图9、喷施过本产品的草莓及对照。

具体实施方式

根据本发明，制备含有微生物蛋白或多肽的稳定液体组合物的方法包括获得基本上无固体不溶物且包含微生物蛋白或多肽的液体提取物。微生物蛋白或多肽可以通过在快速生产的细菌中发酵来容易的制备。例如，重组大肠杆菌可以用于它们的大批量生产。本领域技术人员完全能确定对于具体发酵的最佳条件。

培养基配方：

ZYM-505液体培养基:1％N-Z-amine AS/蛋白胨,0.5％酵母提取物,25mM磷酸氢二钠,25mM磷酸二氢钾,50mM氯化铵,5mM硫酸钠2mM硫酸镁,(0.2x metals,optional),0.5％甘油,0.05％葡萄糖.

ZYM-505固体培养基加1.2-1.5％琼脂灭菌，临用前融化后加入硫酸镁、抗生素混匀后倒平板。

主要试剂及仪器设备

蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、磷酸一氢钾、氨基酸、甘油、葡萄糖、硫酸镁、发酵罐(套)

实施例1、Harpin生物制剂原液的生产

取工作种子库菌种一支，待融化后加入装有50ml LB培养基(含卡那霉素34μg/ml)的200ml容量的三角瓶中，37℃，100-200rpm/分钟，培养6-8h，从中分别取1ml加入至20个装有500ml LB培养基(含卡那霉素34μg/ml)的2000ml容量的三角瓶中，37℃，100-200rpm/分钟，培养过夜，获得扩增后的菌液10升。

200升基础培养基配制：蛋白胨1000克，酵母提取物500克，无水磷酸钠820克，磷酸二氢钠1080克，硫酸铵260克，氯化铵40克，甘油600克，200升纯化水，200ml硅油(蓝翔化工)，121℃20分钟灭菌。

硫酸镁溶液配制：110克溶于1.8升纯化水中，121℃20分钟灭菌。

1000×卡那霉素母液配制：10.2克卡那霉素溶于300ml水中，用0.2μm滤芯除菌过滤。

30升补料培养基配制：蛋白胨4500克，酵母提取物2250克，甘油1500克，121℃20分钟灭菌。

乳糖溶液配制：230g乳糖溶解于2300ml水中，121℃20分钟灭菌。

配制1mol/升HCl，2mol/升NaOH。

第一个步骤菌体驯化

取扩增后的菌液10L，接种于200L基础培养基中，加入灭菌后的硫酸镁溶液(1.8升)和200毫升1000×卡那霉素母液，37℃培养，起始搅拌速度为100rpm，控制溶氧为40-50％，pH 7.0；发酵培养2小时40分钟，溶氧曲线陡然上升至85％以上，此时搅拌速度为250rpm，菌浓度为5.8OD₆₀₀。

第二个步骤菌体扩增

启动补料，37℃培养，pH7.0，通过控制通气量、搅拌速度和补料速度控制溶氧为40-50％，每隔20分钟提高补料速度，此时溶氧会下降，然后增加通气或提高搅拌速度，培养3小时后，增加补料速度而溶氧趋于稳定，此时搅拌速度为600rpm，已加入补料培养基15升，菌浓度为32.7OD₆₀₀。

第三个步骤诱导表达

向发酵培养物中加入2150毫升乳糖溶液，向剩余15升补料培养基中加入乳糖溶液150毫升，继续补料，37℃培养，调节通气、搅拌，控制溶氧40-50％，pH7.0，培养4小时，停止培养。

c、发酵液处理获得生物制剂原液

停止培养后，保持搅拌速度为80～150rpm，缓慢加入110千克尿素至发酵液中，至尿素完全溶解后继续搅拌15～45分钟；调节pH值至7.0；然后，冷却该液体组合物至2～8℃后，即得Harpin生物制剂，至原液储存罐保存。

实施例2Harpin蛋白的纯化及原液功能的检定方法

对Harpin生物制剂的生物学活性的检测，

a、Harpin蛋白的纯化

取10ml诱导表达后菌液，12000RPM离心3min，弃去上清，沉淀称重，菌体按照5mg/100ul的比例用20mM TrisHCl(pH8.0)重悬，超声破碎；12000RPM离心3min，收取离心后的上清；使用5个柱体积的20mM TrisHCl(pH8.0)平衡镍柱，然后用上一步离心后的上清过镍柱，再用清洗缓冲液(20mM TrisHCl，pH8.0，20mM咪唑)洗5个柱体积，用洗脱缓冲液(20mMTrisHCl，pH8.0，250mM咪唑)洗5个柱体积，结果如图1所示，得到纯度超过95％的Harpin蛋白，经过定量后，冻干保存，作为Harpin组合物检定的阳性对照。

b、harpin蛋白及harpin生物制剂功能的检定

受试材料：烟草、辣椒、茄子、番茄均可，烟草最佳、辣椒、番茄其次。种植于25-30℃温室，光照流明≥300lx，肥水充足，受试时期为4-8片真叶期，受试叶片重0.5-1.5g为佳。

检定样品包括：

步骤a提取的harpin蛋白作为阳性对照；

实施例1制备获得的harpin生物制剂样品；

阴性对照(水)；

将各个样品稀释到1、5、25ug/ml，经过标定浓度后，用10ul微量注射器将2ul不同浓度样品注射入叶片叶脉中，每种样品注射3-5片叶片，不同组可在一株植物上测试，但同组样品尽量分在不同植株上。

判断：注射样品后的0.5-6小时出现症状，症状类型有：卷边、组织坍塌(像煮熟了)、局部空斑化，按等级评定

1级：组织坍塌、局部空斑化

2级：卷边

3级：无明显症状

等级之间默认为活性相差一个数量级(即需高一个浓度数量级样品才能达到更高效果)。

注：所有测试叶片前后均需拍照留记录以备复核。

综合判断：

1.已发现电泳条带有明显弥散、拖带的，可直接判断为失败，无需执行活性测试

2.活性测试中无反应的(3级)，需写报告，报告应包括受试植株整体及细节照片、受试植株种植环境条件记录，由技术团队进行综合讨论后再做判断；

3.电泳条带无明显弥散、拖带，活性测试中有反应(2级)，由技术团队进行综合讨论(活性数据，生产浓度数据)后再做处理判断；

3.电泳条带无明显弥散、拖带，活性测试中有反应(1级)，判断为合格。

实施例3、Harpin生物制剂叶面施用效果

取果树、烟草、茶叶等作物，在作物苗期和快速生长期，喷施实施例1制备获得的Harpin生物制剂原液，共喷施作物叶面3-4次，幼苗期按照1：500比例喷施；其他时期1:1000比例即可；

烟草的喷施效果如图2所示，相比对照组(仅含有相同浓度的尿素，不含harpin蛋白)，叶片明显变厚变大，植株也更高大，统计结果干物质增长超过20％。

南瓜的喷施效果如图3所示，可见，相比于未能喷施的对照组，喷施后其萌发率增加约60％。

网纹瓜的喷施效果如图4所示，相比对照组，生长速度增快，收获时，亩产相比对照组提高50％，对照组网纹瓜含糖量为21.3克/升，施用组网纹瓜含糖量为41.3克/升。

葡萄从新叶舒展期开始使用，直到收获前每隔15-20天喷洒1次，共喷5次，新叶舒展期按照1：500比例喷施；其他时期1:1000比例即可，如图5所示，植株更茂盛，产量和品质显著提升。

大葱的喷施效果如图6所示，大蒜的喷施效果如图7所示，相比对照组，生长速度更快。

草莓的喷施效果如图8和9所示，相比对照组，植株更茂盛，收获的草莓的糖度提高20％以上，货架期延长。

在山东烟台的茶树实验显示，使用茶农长年用肥料收获的茶叶中儿茶素类总量为14.98％，茶多酚为17.30％，而使用本产品的茶树叶片明显增厚，叶面形状饱满，品质提高，收获的茶叶中儿茶素类总量为20.06％，茶多酚为23.06％。

实施例4、Harpin生物制剂的稳定性检测

稳定性试验抽取3批连续批号(选择20160607、20160609和20160611)的供试品，按市售包装，保存于2～8℃、25℃以及37℃，分别进行低温稳定性试验、常温稳定性试验和加速热稳定性试验，其中低温稳定性试验计划在0月、2月、4月、6月、8月、10月和12月分别取样一次，检测pH值、外观、蛋白电泳和效力试验等关键指标，分析变化情况；长期稳定性试验计划每两周检测一次，直到不合格为止。加速稳定性计划每周检测一次，直到不合格为止。

检测指标及参数：

1、pH值检测：每次检测前需用效期内的标准缓冲液进行校准；每次更换标准缓冲液或供试品溶液前，应用纯化水充分洗涤电极，然后将水吸尽，也可用所换的标准缓冲液或供试品溶液洗涤；

2、外观：主要观察澄清度和气味，有无浑浊或异常气味。

3、蛋白电泳：FP梯度选择10倍稀释，条带应清晰，没有明显拖带现象，如不满足，可判断为蛋白有降解。

4、效力试验按照实施例2方法进行。

结果显示，Harpin产品在2～8℃可以至少保存一年、25℃下可以保存24周，在37℃下可以保存5周。检测结果见表1～表5

表1低温稳定性试验

表2常温稳定性试验

表3常温稳定性试验(续)

表4加速热稳定性试验

最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做对本发明保护范围的限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北胜苗生物科技有限公司

<120> 一种用于促进植物生长和病虫害防治的生物制剂

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 412

<212> PRT

<213> 过敏蛋白

<400> 1

Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser

1 5 10 15

Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr His Met Pro

20 25 30

Gly Thr Ser Ser Ser Pro Gly Leu Phe Gln Ser Gly Gly Asp Asn Gly

35 40 45

Leu Gly Gly His Asn Ala Asn Ser Ala Leu Gly Gln Gln Pro Ile Asp

50 55 60

Arg Gln Thr Ile Glu Gln Met Ala Gln Leu Leu Ala Glu Leu Leu Lys

65 70 75 80

Ser Leu Leu Asp Ser Gly Glu Lys Leu Gly Asp Asn Phe Gly Ala Ser

85 90 95

Ala Asp Ser Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu Met Thr Gln Val

100 105 110

Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu Leu Thr Lys Gln

115 120 125

Asp Gly Gly Thr Ser Phe Ser Glu Asp Asp Ser Gly Pro Ala Lys Asp

130 135 140

Gly Asn Ala Asn Ala Gly Ala Asn Asp Pro Ser Lys Asn Asp Pro Ser

145 150 155 160

Lys Ser Gln Gly Pro Gln Ser Ala Asn Lys Thr Gly Asn Val Asp Asp

165 170 175

Ala Asn Asn Gln Asp Pro Met Gln Ala Leu Met Gln Leu Leu Glu Asp

180 185 190

Leu Val Lys Leu Leu Lys Ala Ala Leu His Met Gln Gln Pro Gly Gly

195 200 205

Asn Asp Lys Gly Asn Gly Val Gly Gly Asp Ser Gly Gln Asn Asp Asp

210 215 220

Ser Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln

225 230 235 240

Gln Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Asp

245 250 255

Glu Gln Asp Gly Thr Asp Ser Thr Ser Gly Ser Arg Phe Thr Arg Thr

260 265 270

Gly Ile Gly Met Lys Ala Gly Ile Gln Ala Leu Asn Asp Ile Gly Thr

275 280 285

His Ser Asp Ser Ser Thr Arg Ser Phe Val Asn Lys Gly Asp Arg Ala

290 295 300

Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe

305 310 315 320

Gly Lys Pro Gln Tyr Gln Lys Gly Pro Gly Gln Glu Val Lys Thr Asp

325 330 335

Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met

340 345 350

Thr Pro Ala Ser Met Glu Gln Phe Asn Lys Ala Lys Gly Met Ile Lys

355 360 365

Ser Ala Met Ala Gly Asp Thr Gly Asn Gly Asn Leu Gln Ala Arg Gly

370 375 380

Ala Gly Gly Ser Ser Leu Gly Ile Asp Ala Met Met Ala Gly Asp Ala

385 390 395 400

Ile Asn Asn Met Ala Leu Gly Lys Leu Gly Ala Ala

405 410

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atagaattca tgagtctgaa tacaagtggg ctg 33

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcaaagcttt taagccgcgc ccagc 25

Claims

1.一种制备含有过敏蛋白的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤，

(1)菌种复苏及扩增；

(2)发酵罐发酵；

(3)发酵液处理；

其中，

步骤(1)所述的菌种复苏及扩增步骤为：

取转化了过敏蛋白的工作种子库菌种，待融化后扩增培养；

所述的转化了过敏蛋白的工作种子库菌种为：

通过基因工程的方法构建的含有表达过敏蛋白的质粒，并且经筛选后表达过敏蛋白的大肠杆菌菌株株系，所述的大肠杆菌菌株为BL21；

所述的过敏蛋白的序列如Seq ID No.1所示；

所述的质粒为pET28a-SH质粒，所述的pET28a-SH质粒的构建步骤为：

1)以pET28a质粒为模板，通过EcoRI/HindIII双酶切的方法，将过敏蛋白表达基因克隆至pET28a质粒的EcoRI/HindIII双酶切位点之间；

2)所述的过敏蛋白表达基因通过SEQ ID No.2所示正向引物SHs和SEQ ID No.3所示逆向引物SHa扩增获得；

步骤(2)所述的发酵罐发酵的发酵参数为：

基础培养基：蛋白胨1000份、酵母提取物500份、无水磷酸钠820份、磷酸二氢钠1080份、硫酸铵260份、氯化铵40份、甘油600份，硅油200份，纯化水200000份，卡那霉素终浓度为34μg/ml；

补料培养基：蛋白胨4500份，酵母提取物2250份，甘油1500份，纯化水30000份；

发酵罐发酵的发酵过程包括：

1)菌种驯化：

取扩增后的菌液，按接种浓度为5％接种于基础培养基中，加入灭菌后的硫酸镁溶液至硫酸镁的终浓度为0.4～0.6克/升，37℃搅拌培养，控制溶氧为40-50％，pH 7.0～7.4；发酵培养2-3h，溶氧曲线陡然上升至80％以上即为菌种驯化培养终点；

2)菌体扩增：

溶氧曲线陡然上升时开始添加补料培养基，37℃培养，控制溶氧40-50％，pH 7.0～7.4，培养3-4小时，调节通气、搅拌和补料速度，培养过程中需不断增加通气量和搅拌速度，溶氧上升趋势趋于稳定时，即为菌种扩增终点，此时菌种的OD600浓度为25～40；

3)诱导表达：

向培养物中加入乳糖溶液至乳糖终浓度为1g/L，继续添加含同样浓度乳糖的补料培养基，继续发酵，37℃培养，调节通气、搅拌和补料速度，控制溶氧40～50％，pH 7.0～7.4，培养3～5小时，即为诱导表达终点；

步骤(3)所述的发酵液处理为：

缓慢加入尿素至发酵液中，至尿素终浓度为8mol/L，调节溶液pH值至6～8，继续搅拌15～45分钟，冷却该液体组合物至2～8℃并保存。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，硫酸镁的终浓度为0.55克/升。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的筛选表达过敏蛋白的菌株株系的方法为：将待筛选菌株培养至OD600浓度为0.6-1.0，用终浓度1mM IPTG诱导4小时后取样，取加IPTG前为诱导前对照样品，采用10％SDS-PAGE电泳进行检测，筛选得到表达过敏蛋白的菌株株系。

4.使用权利要求1-3任一所述的方法制备获得的生物制剂。

5.权利要求4所述的生物制剂在制备促进植物生长和病虫害防治的产品中的应用。

6.权利要求4所述的生物制剂或权利要求5中所述的产品在促进植物生长和病虫害防治中的应用，所述的应用为，对植物叶面喷施所述的生物制剂或所述的产品。