CN104039126A

CN104039126A - 用于增加植物产量的方法和产量改善组合物

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Publication number: CN104039126A
Application number: CN201280065454.6A
Authority: CN
Inventors: Z·魏
Original assignee: Plant Health Care Inc
Current assignee: Plant Health Care Inc
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2012-12-31
Publication date: 2014-09-10
Also published as: US9204638B2; US20160021887A1; BR112014016238A2; US9307769B2; IN2014CN04944A; WO2013102189A1; BR112014016238A8; US20130172185A1; MX354592B; MX2014007986A

Abstract

本发明涉及一种增加植物产量的方法。所述方法涉及向植物和/或栽培区域施用甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段，其中所述施用在有效诱导植物的协同产量的条件下实施。本发明还涉及一种包含液体或固体载体、甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段的组合物。

Description

用于增加植物产量的方法和产量改善组合物

本申请要求2011年12月30日提交的美国临时专利申请序列第61/581,819号的优先权权益，该临时专利申请全部以引用方式并入本文。

发明领域

本发明涉及增加植物产量的方法，和改善植物产量的组合物。

发明背景

在作物生产中，存在对于改善植物的健康状况的农用组合物和处理的持续需求。更加健康的植物是合乎需要的，因为其使得植物或作物具有更佳的产量和/或更佳的质量。更加健康的植物还更好地抵抗生物性和/或非生物性胁迫。对于生物性胁迫的更高抵抗进而允许施用更低数量的杀虫剂，从而可减缓针对相应杀虫剂的抗性的发生。

超敏反应(“HR”)激发蛋白质(也称为harpin蛋白质)引起植物的抗病性并且增加植物生长。美国专利No.6,277,814描述增强植物生长的方法，其涉及在为植物或从植物种子生长的植物赋予增强的生长的条件下将HR激发多肽或蛋白质以非传染形式施用至植物或植物种子。实施这些方法以实现任何形式的植物生长增强或促进，包括更大产量、所产生的种子的数量增加、发芽种子的百分比增加、植物尺寸增加、更大生物质，更多和更大的果实、更早果实着色，和更早果实和植物成熟。较早发芽和较早成熟允许作物在某些区域生长，否则在这些区域中，较短生长季节会使这些作物在此地区不可能生长。种子发芽百分比增加导致作物群丛改善和更有效的种子使用。更大产量、增加的尺寸，和增强的生物质产生允许从给定田区产生更大收入。

含有分离的HR激发蛋白质的农用组合物已经用于改善植物健康状况和增加产量。举例来说，Wei的PCT公布号WO 04/057957教导通过在有效增加农用化学品的功效的条件下将至少一种农用化学品和至少一种HR激发蛋白质或多肽施用至植物或植物种子来增加农用化学品的功效。

需要提供对于植物产量的协同效应的农用组合物和植物处理，这意味着试剂的组合效应大于每个个别试剂的相加效应。

本发明涉及克服本领域中的这些限制。

发明概述

本发明的一方面涉及一种增加植物产量的方法。此方法涉及向植物和/或栽培区域施用甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段，其中所述施用在有效诱导植物的协同产量增加的条件下实施。

本发明的另一个方面涉及一种包含液体或固体载体、甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段的组合物。

本发明涉及通过施用试剂来增加植物产量，所述试剂在一起或依序施用时对于植物产量具有协同效应。所述试剂至少包含杀真菌剂甲基托布津(或另一种苯并咪唑杀真菌剂)和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段。

如伴随实施例中表明，甲基托布津与称为PHC-351的分离超敏反应激发多肽(Plant Health Care,Inc.,Pittsburgh,PA)在斑豆和花生中的组合效应表明两种试剂对于植物产量的令人惊讶的协同效应。

附图简述

图1是显示来自实验的结果的表格，所述实验通过将PHC-351和甲基托布津处理个别和组合地施用至植物来测试斑豆植物中的白霉病的控制。这些结果展示斑豆植物中的产量增加百分比的计算。

图2是显示来自实验的结果的表格，所述实验通过将PHC-351和甲基托布津处理个别和组合地施用至植物来测试花生植物中的白霉病的控制。这些结果展示产量的增加百分比的计算。

发明详述

本发明涉及一种增加植物的产量的方法，和适用于增加植物产量的组合物。

根据本发明的方法，杀真菌剂甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段在响应于所述施用有效诱导植物的协同产量的条件下来施用至植物和/或栽培区域。

短语“栽培区域”是指植物生长或预定生长于其中的任何类型的环境、土壤、区域或材料。

如本文使用，术语“植物”包括植物的所有部分，包括草本植被、叶、根、茎、花朵结构、花粉等。另外，“植物”是指所有植物，并且尤其是指具有经济重要性的植物。植物可基于其人类使用和/或消费来分类成农业、造林、观赏和园艺植物。另外，“植物”包括天然或野生型植物，和已经基因修饰的植物。

“农业”植物是其一部分或全部以商业规模来收获或栽培或充当饲料、食物、纤维(例如，棉花和亚麻)、可燃物(例如，木头、生物乙醇、生物柴油和生物质)或其它化合物的重要来源的植物。农业植物还包括蔬菜。因此，农业植物包括谷物(例如小麦、黑麦、大麦、黑小麦、燕麦、高粱和水稻)；甜菜(例如、糖用甜菜或饲料甜菜)；豆科植物(例如豆科作物、豆类、豌豆、苜蓿和大豆)；油料植物(例如油菜、油籽油菜、菜籽、芥菜(Brassica juncea)、亚麻籽、芥子、橄榄、向日葵、可可豆、蓖麻油植物、油棕、花生和大豆)；葫芦(例如南瓜、黄瓜和甜瓜)；纤维植物(例如棉花、亚麻、***和黄麻)；蔬菜(例如黄瓜、菠菜、莴苣、芦笋、白菜、胡萝卜、红萝卜、芜菁、芹菜、菊苣、苦苣、抱子甘蓝、防风草、花椰菜、椰菜、大蒜、茄子、胡椒、南瓜、洋葱、蕃茄、土豆、甘薯、葫芦和红椒)；月桂科植物(例如鳄梨、肉桂和樟脑)；能量和原材料植物(例如玉米、大豆、油菜、菜籽、甘蔗和油棕)；烟草；坚果(包括花生)；咖啡；茶；藤(例如鲜食葡萄和果汁葡萄藤)；啤酒花；核果；苹果；越橘；草莓；梨；柑橘；悬钩子；菠萝；甘蔗；草坪、天然橡胶植物和***。

“园艺植物”普遍地用于园艺的植物并且包括但不限于观赏植物、蔬菜和水果。“观赏”植物是普遍地用于花园，例如公园、花园、和阳台和庭院的植物。观赏植物的非限制实例包括草坪、天竺葵、天竺葵属、矮牵牛花、秋海棠和晚樱科植物。蔬菜的非限制实例如上所述。水果的非限制实例包括苹果、梨子、樱桃、草莓、柑橘、桃子、杏子和蓝莓。

“造林”植物应理解为树，更具体地说，用于重新造林或人工造林的树。人工造林总体上用于以下用途：商业生产林产品如木头、纸浆、纸张、橡胶树、圣诞树或幼树园艺用途。造林植物的非限制实例是针叶树(例如，松树)，尤其松(Pinus)属冷杉和云杉；桉树；热带树(例如，柚木、橡胶树、油棕)；柳树(柳(Salix))，尤其柳属；杨树(三叶杨)，尤其杨(Populus)属；山毛榉，尤其山毛榉(Fagus)属；桦树；油棕；樱桃、胡桃和橡树。

在一个实施方案中，用于本发明的方法的植物选自干豆、花生、豌豆和大豆。

如以上提及，术语“植物”还包括从其野生型形式修饰的植物。这类修饰可经由育种、诱变或遗传工程(包括转基因和非转基因植物)来发生。通过遗传工程化来修饰的植物包括具有通过使用重组DNA技术来修饰的遗传物质的植物。这类修饰通常包括在天然情况、突变或天然重组下不能容易地通过杂交育种来获得的修饰。典型地，一个或多个基因已经整合至基因修饰植物的遗传物质中以便改善植物的某些性质。基因修饰植物的实例于下文描述。

用于本发明的方法中的植物，例如，由于育种包括遗传工程方法而耐受除草剂、杀真菌剂或杀虫剂的作用的作物，或与现有植物比较具有改变特性的植物，其可通过例如传统育种方法和/或产生突变体，或通过重组程序来产生。

在一个实施方案中，按照本发明的方法施用甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段的植物包括对于施用特定类别除草剂变得具有耐受性的植物。对于除草剂的耐受性可通过在除草剂作用部位产生不敏感性来获得，方法是表达对于除草剂有抵抗力的目标酶，通过表达使除草剂钝化的酶来快速代谢(偶联或降解)除草剂，或除草剂的不良吸收和移位。

非限制实例包括表达与野生型酶相比可耐受除草剂的酶，如表达5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)，其可耐受草甘磷(参见例如，“Development and Characterization of a CP4 EPSPS-Based,Glyphosate-Tolerant Corn Event,”Heck等,Crop Sci.45:329-339(2005)；Funke等,“Molecular Basis for the Herbicide Resistance of RoundupReady Crops,”PNAS 103:13010-13015(2006)；Shah等的美国专利No.5,188,642；Shah等的美国专利No.4,940,835；Barry等的美国专利No.5,633,435；Barry等的美国专利No.5,804,425；和Barry等的美国专利No.5,627,061，其各自全部以引用方式并入本文)；表达谷氨酰胺合成酶，其可耐受草铵膦和双丙氨磷(参见例如，Leemans等的美国专利No.5,646,024和5,561,236，其全部以引用方式并入本文)；和编码麦草畏降解酶的DNA构建物(参见例如中的一般参考，Bhatti等的美国专利申请公布号2009/0105077和Weeks等的美国专利No.7,105,724，其各自全部以引用方式并入本文)，其在豆类和玉米(参见Monsanto Technology LLC的PCT公布号WO 08/051633，全部以引用方式并入本文)、棉花(参见Grossmann等的美国专利No.5,670,454，其全部以引用方式并入本文)、豌豆、马铃薯、高粱、大豆(参见Grossmann等的美国专利No.5,670,454，其全部以引用方式并入本文)、向日葵、烟草、番茄中具有麦草畏抗性(参见Grossmann等的美国专利No.5,670,454，其全部以引用方式并入本文)。基因构建物可从例如可耐受除草剂的微生物或植物获得，如农杆菌菌株CP4EPSPS，其抵抗草甘磷；抵抗草铵膦的链霉菌属细菌；具有编码HDDP的嵌合基因序列的拟南芥属(Arabidopsis)、胡萝卜(Daucus carota)、假单胞菌亚种或玉蜀黍(Zea mays)(参见例如，Rhone-Poulenc Agrochimie的PCT公布号WO 96/38567和Biogemma的PCT公布号WO04/55191，其各自全部以引用方式并入本文)；拟南芥(Arabidopsisthaliana)，其抵抗原卟啉原氧化酶抑制剂(参见例如，Heifetz等的美国专利申请公布号2002/0073443，其全部以引用方式并入本文)。

具有除草剂耐受性的可购得植物的非限制实例包括玉米(玉蜀黍)品种Roundup Corn、Roundup(Monsanto)、AgrisureAgrisure Agrisure Agrisure(Syngenta)、YieldGard VT 和YieldGard VT (Monsanto)，其具有草甘磷耐受性；玉米品种Liberty(Bayer)、 Xtra(Dow,Pioneer)、Agrisure和Agrisure(Syngenta)，其具有草铵膦耐受性；大豆品种Roundup Soybean(Monsanto)和Optimum(DuPont,Pioneer)，其具有草甘磷耐受性；棉花品种RoundupCotton和Roundup Ready(Monsanto)，其具有草甘磷耐受性；棉花品种FiberMax Liberty(Bayer)，其具有草铵膦耐受性；棉花品种(Calgene)，其具有溴苯腈耐受性；菜籽品种和(Rhone-Poulenc)，其具有溴苯腈耐受性；菜籽品种RoundupCanola(Monsanto)，其具有草甘磷耐受性；菜籽品种(Bayer)，其具有草铵膦耐受性；具有草铵膦耐受性的水稻品种LibertyRice(Bayer)和具有草甘磷耐受性的苜蓿品种Roundup ReadyAlfalfa。

用除草剂改性的其它植物普遍地已知，并且包括具有草甘磷耐受性的苜蓿、苹果、桉树、亚麻、葡萄、豆类、油籽油菜、豌豆、马铃薯、水稻、糖用甜菜、向日葵、烟草、番茄草坪草和小麦(参见例如，Shah等的美国专利No.5,188,642和4,940,835以及Barry等的美国专利No.5,633,435、5,804,425和5,627,061，其各自全部以引用方式并入本文)；具有麦草畏耐受性的豆类、大豆、棉花、豌豆、马铃薯、向日葵、番茄、烟草、玉米、高粱和甘蔗(参见例如，Bhatti等的美国专利申请公布号2009/0105077；Weeks等的美国专利No.7,105,724；和Grossmann等的美国专利No.5,670,454，其各自全部以引用方式并入本文)；具有2,4-D耐受性的胡椒、苹果、番茄、小米、向日葵、烟草、马铃薯、玉米、黄瓜、小麦、大豆和高粱(参见例如，Streber等的美国专利No.6,153,401和6,100,446；Dow Agrosciences LLC的PCT公布号WO 05/107437；Kaphammer的美国专利No.5,608,147；和Grossmann等的美国专利No.5,670,454，其各自全部以引用方式并入本文)；具有草铵膦耐受性的甜菜、马铃薯、番茄和烟草(参见例如Leemans等的美国专利No.5,646,024和5,561,236，其各自全部以引用方式并入本文)；菜籽、大麦、棉花、芥菜、莴苣、豆类、甜瓜、小米、燕麦、油籽油菜、马铃薯、水稻、黑麦、高粱、大豆、甜菜、向日葵、烟草、番茄、和小麦，其具有乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制除草剂耐受性，如***并嘧啶磺酰胺、生长抑制剂和咪唑啉酮(参见例如，Bedbrook等的美国专利No.5,013,659；BASF AgrochemicalProducts,B.V.的PCT公布号WO 06/060634；Anderson等的美国专利No.4,761,373、5,304,732、6,211,438、6,211,439和6,222,100，其各自全部以引用方式并入本文)；具有HPPD抑制剂除草剂耐受性的谷物、甘蔗、水稻、玉米、烟草、大豆、棉花、油菜籽、糖用甜菜和马铃薯(参见例如Biogemma的PCT公布号WO 04/055191、Rhone-PoulencAgrochimie的PCT公布号WO 96/38567、E.I.Du Pont De Nemours andCo.的PCT公布号WO 97/049816和Garcon等的美国专利No.6,791,014，其各自全部以引用方式并入本文)；具有前原卟啉氧化酶(PPO)抑制剂除草剂耐受性的小麦、大豆、棉花、糖用甜菜、油菜、水稻、玉米、高粱和甘蔗(参见例如，Heifetz等的美国专利申请公布号2002/0073443、Dam等的美国专利申请公布号2008/0052798，以及Li和Nicholl,“Development of PPO Inhibitor-resistant Cultures andCrops,”Pest Management Science61:277-285(2005)，其各自全部以引用方式并入本文)。产生这类除草剂抗性植物的方法总体上为本领域普通技术人员已知的，并且描述于本文引用的参考文献中。具有除草剂耐受性的可购得修饰植物的其它实例包括玉米、油菜、水稻、豆类和向日葵(BASF)，其具有咪唑啉酮除草剂耐受性。

其它植物可包括能够合成一种或多种杀虫蛋白质的那些植物，尤其已知来自细菌属芽孢杆菌，尤其苏云金芽孢杆菌的那些杀虫蛋白质，如δ-内毒素，例如，CryIA(b)、CryIA(c)、CryIF、CryIF(a2)、CryIIA(b)、CryIIIA、CryIIIB(b1)和Cry9c；营养期杀虫蛋白质(“VIP”)，例如，VIP1、VIP2、VIP3和VIP3A；细菌定植线虫，例如，光杆状菌属或致病杆菌属的杀虫蛋白质；由动物产生的毒素，如蝎子毒素、节肢动物毒素、黄蜂毒素和其它昆虫特异性神经毒素；由真菌产生的毒素，诸如链霉菌毒素；植物凝集素，如豌豆或大麦凝集素(lectin)；凝集素(agglutinin)；蛋白酶抑制剂，如胰蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、马铃薯糖蛋白、胱抑素或木瓜蛋白酶抑制剂；核糖体钝化蛋白质(“RIP”)，如蓖麻毒素、玉米RIP、相思豆毒素、丝瓜素、皂素和异株腹泻毒蛋白；类固醇代谢酶，如3-羟基类固醇氧化酶、蜕化类固醇-IDP-糖基转移酶、胆固醇氧化酶、蜕皮素抑制剂和HMG-CoA-还原酶；离子通道阻滞剂，如钠或钙通道阻滞剂；保幼激素酯酶；利尿激素受体(螺旋激肽受体)；茋合成酶；联苄合成酶；几丁质酶；和葡聚糖酶。

上述杀虫蛋白质或毒素还应理解为预毒素、杂化蛋白质、截短或以其它方式修饰的蛋白质。杂化蛋白质的特征是蛋白质结构域的新组合(参见例如，Syngenta Participations AG的PCT公布号WO02/015701，其全部以引用方式并入本文)。这类毒素或能够合成这类毒素的基因修饰植物的其它实例公开于例如全部属于Ciba-Geigy AG的欧洲专利号0374753和PCT公布号WO 93/007278和WO 95/34656；Pioneer Hi Bred Int.的欧洲专利号0427529；Bayer Bioscience NV的欧洲专利号0451878；以及Syngenta Participations AG的PCT公布号WO 03/18810和WO 03/52073，其各自全部以引用方式并入本文。产生这类基因修饰植物的方法总体上为本领域普通技术人员已知的并且描述于例如上面引用的参考文献。

包含于基因修饰植物中的这些杀虫蛋白质赋予产生这些蛋白质的植物对于来自所有分类群节肢动物的有害害虫的耐受性，尤其甲虫(鞘翅类(Coleoptera))，二翅昆虫(双翅类(Diptera))，和飞蛾(鳞翅类(Lepidoptera))和线虫(线虫类(Nematoda))。能够合成一种或多种杀虫蛋白质的基因修饰植物例如描述于以上提到的引用中，一些可购得如(产生Cry1Ab毒素的玉米品种)、Plus(产生Cry1Ab和Cry3Bb1毒素的玉米品种)、(产生Cry9c毒素的玉米品种)、RW(玉米品种产生Cry34Ab1、Cry35Ab1和酶草丁膦-N-乙酰基转移酶[PAT])；33B(由Cry1Ac毒素产生的棉花品种)、I(由Cry1Ac毒素产生的棉花品种)、II(产生Cry1Ac和Cry2Ab2毒素的棉花品种)；(产生VIP-毒素的棉花品种)；(产生Cry3A毒素的马铃薯品种)；Bt11(例如，CB)，和来自Syngenta Seeds SAS,France的Bt176(产生Cry1Ab毒素和PAT酶的玉米品种)、来自Syngenta Seeds SAS,France的MIR604(产生修饰型式Cry3A毒素的玉米品种(参见SyngentaParticipations AG的PCT公布号WO 03/018810，其全部以引用方式并入本文)、来自Monsanto Europe S.A.,Belgium的MON 863(产生Cry3Bb1毒素的玉米品种)、来自Monsanto Europe S.A.,Belgium的IPC531(产生修饰型式Cry1Ac毒素的棉花品种)，和来自PioneerOverseas Corporation,Belgium的1507(产生Cry1F毒素和PAT酶的玉米品种)。

植物还包括如下那些植物，其经由使用重组DNA技术，能够合成一种或多种蛋白质以增加那些植物对于细菌、病毒或真菌病原体的抗性或耐受性。这类蛋白质的非限制实例是所谓“发病机制相关蛋白质”(“PR”蛋白质，参见例如，Syngenta Participations AG的欧洲专利号0392225，其全部以引用方式并入本文)、植物抗病性基因(例如，马铃薯品种，其表达对于从墨西哥野生马铃薯栗色球茄(Solanumbulbocastanum)获得的致病疫霉(Phytophthora infestans)起作用的抗性基因)或T4-溶菌酶(例如，能够合成这些蛋白质的马铃薯品种，所述蛋白质具有针对细菌如解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)的增加的抗性)。产生这类基因修饰植物的方法总体上为本领域普通技术人员已知的并且描述于例如以上提及的参考文献中。

适合于本发明的方法的植物还包括如下那些植物，其经由使用重组DNA技术能够合成一种或多种蛋白质以增加生产力(例如，生物质产生、粮食产量、淀粉含量、含油量和/或蛋白质含量)、对于干旱、盐度或其它生长限制环境因素的耐受性或对于那些植物的害虫和真菌、细菌或病毒病原体的耐受性。

合适植物还包括如下那些植物，其经由使用重组DNA技术含有改变量的内含物质或新的内含物质，以专门改善人类或动物营养，例如，产生健康促进长链Ω-3脂肪酸或不饱和Ω-9脂肪酸的油料作物(例如，油菜，DOW Agro Sciences,加拿大)。

合适植物还包括如下那些植物，其经由使用重组DNA技术含有改变量的内含物质或新的内含物质，以专门改善原材料产生，例如，产生增加量的支链淀粉的马铃薯(例如，马铃薯，BASF SE,德国)。

尤其适合的植物已经变得可耐受至少一种除草剂、抵抗草甘磷或其农业上可接受的盐，且/或抵抗麦草畏或其农业上可接受的盐。

本发明的方法涉及将甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段施用至植物和/或栽培区域。

甲基托布津是杀真菌剂，其属于功能类别的苯并咪唑前体杀真菌剂，或托布津类。这些杀真菌剂通过在有丝***中干扰β-微管蛋白组装来起作用。基于伴随实施例中的结果，据信类似协同效应可用此类别苯并咪唑的其它成员来获得。

分离的HR激发蛋白质或多肽片段在本领域中为已知的。在一个实施方案中，分离的HR激发蛋白质或多肽片段是全长HR激发蛋白质，也称为超敏蛋白。超敏蛋白包括本领域认可类别的蛋白质的任何成员，其由植物细菌产生，并且共有结构特征和诱导植物超敏反应的能力。在生物化学上，这些蛋白质或多肽具有许多共同结构特性。这些特性包括富含甘氨酸、低或没有半胱氨酸含量、耐热、亲水性、没有N-末端信号序列和易于蛋白分解。参见Bonas,“Bacterial HomeGoal by Harpins,”Trends Microbiol.2:1-2(1994)；Gopalan等,“BacterialGenes Involved in the Elicitation of Hypersensitive Response andPathogenesis,”Plant Disease80:604-10(1996)；和Alfano等,“The TypeIII(Hrp)Secretion Pathway of Plant Pathogenic Bacteria:TraffickingHarpins,Avr Proteins,and Death,”Journal of Bacteriology179:5655-5662(1997)，其各自全部以引用方式并入本文。另外，超敏蛋白共有与其不同生物活性相关的独特次级结构。所述结构具有两个主要组分，α螺旋单元和具有薄片或随机转动结构的松弛酸性单元。在不存在一个或两个这些组分的情况下，超敏反应激发不会发生。参见Fan等的PCT公布号WO 01/98501，其全部以引用方式并入本文。

超敏蛋白还共有诱导特异性植物反应的能力(即，在其施用至植物和/或栽培区域之后)。诱导植物抗病性、植物生长、抗虫性、抗干燥性和收获后抗病性(在收获的植物产品，如水果和蔬菜中)是若干较重要效用。超敏蛋白的这些使用描述于Qiu等的美国专利No.6,277,814；Wei等的美国专利No.5,776,889；Zitter等的美国专利No.5,977,060；Qiu等的美国专利No.6,235,974；Wei等的美国专利申请公布号2003/0104979；Wei等的美国专利申请公布号2002/0019337；和美国专利申请公布号2004/0265442；其各自全部以引用方式并入本文。这些反应的诱导是由于茉莉酸/乙烯和水杨酸防御途径，以及调控光合作用和营养物吸收的植物生长途径的上调。

一组超敏蛋白或多肽包括但不限于解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)HrpN的同源物，包括来自欧文氏菌(Erwinia)、泛菌(Pantoea)和果胶杆菌(Pectobacterium)属的那些。这类同源物的实例包括以GenBank登录号AAC31644识别的那些超敏蛋白(解淀粉欧文氏菌)；AAQ21220、AAQ17045、CAE25423、CAE25424、CAE25425和CAF74881(梨果实欧文氏菌(Erwinia pyrifoliae))；CAC20124、Q47278、Q47279和AAY17519(菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi))；CAE25422(欧文氏菌菌株JP557)；AAG01466(斯氏泛菌(Pantoeastewartii))；AAF76342(成团泛菌(Pantoea agglomerans))；ABZ05760、ABI15988、ABI15989、ABI15990、ABI15991、ABI15992、ABI15996、ABK80762、ABD04037、ABI15994、ABD04035、ABD04036、AAY17521、AAX38231、ABI15995、AAQ73910和CAL69276(胡萝卜果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum))；YP_050198、AAS20361和CAE45180(黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum))；和ABD22989(甜菜果胶杆菌(Pectobacterium betavasculorum))，其各自全部以引用方式并入本文。

另一组超敏蛋白或多肽包括但不限于解淀粉欧文氏菌HrpW和丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)HrpW的同源物，包括来自欧文氏菌、假单胞菌、黄单孢菌(Xanthomonas)、食酸菌(Acidovorax)和果胶杆菌(Pectobacterium)属的那些。这类同源物的实例包括以GenBank登录号U94513、CAA74158、AAC04849和AAF63402识别的那些超敏蛋白(解淀粉欧文氏菌)；AAQ17046(梨果实欧文氏菌)；YP_001906489(塔斯马尼亚欧文氏菌(Erwinia tasmaniensis))；YP_050207(黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum))；AF037983(丁香假单胞菌番茄致病变型)；AAO50075(丁香假单胞菌菜豆(phaseolicola)致病变型)；AAL84244(丁香假单胞菌斑生(maculicola)致病变型)；AAX58537、AAX58557、AAX58525、AAX58531、AAX58527、AAX58577、AAX58491、AAX58515、AAX58517、AAX58523、AAX58583、AAX58451、AAX58561、AAX58453、AAX58541、AAX58589、AAT96311、AAX58497、AAX58579、AAX58449、AAX58485、AAX58563、AAX58581、AAX58575、AAX58569、AAX58567、AAX58505、AAX58591、AAX58503、AAX58507、AAX58509、AAX58469、AAX58441、AAX58543、AAX58495、AAX58549、AAX58593、AAX58511、AAX58519、AAT96270、AAX58447、AAX58571、AAX58465、AAX58489、AAX58533、AAX58535、AAX58461、AAT96350、AAX58473、AAX58483、AAX58475、AAX58457、AAX52461、AAX52457、AAT96222、(绿黄假单胞菌(Pseudomonas viridiflava))；ABA47299和BAG24117(菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii))；CAH57075(洋榛假单胞菌(Pseudomonas avellanae))；BAE80274和BAE80242(燕麦食酸菌(Acidovorax avenae))；和AAM37767(地毯草黄单孢菌(Xanthomonas axonopodis)桔(citri)致病变型)，其各自全部以引用方式并入本文。

仍另一组超敏蛋白或多肽包括但不限于丁香假单胞菌HrpZ的同源物，包括来自其它假单胞菌属的那些。这类同源物的实例包括以GenBank登录号P35674、AAB00127、ABL01505、AAQ92359、BAD20880、BAD20876、BAD20892、BAD20884、BAD20928、BAD20936、BAD20932、BAD20924、BAD20856、BAD20864、BAD20860、BAD20848、BAD20844、BAD20836、BAD20840、BAD20824、BAD20842、BAD20820、BAD20916、BAD20872、BAC81526、O87653、BAA74798、BAD20904、AAB86735、BAD20912、BAD20908、ABL01504、BAB40655、ABO26225、ABO26228识别的那些超敏蛋白(丁香假单胞菌致病变型)；BAD20868(天仙果假单胞菌(Pseudomonas ficuserectae))；AAX52452、AAT96159、AAX52266、AAX52396、AAT96322、AAT96281、AAX52272、AAX52306、AAX52270、AAX52402、AAX52276、AAX52318、AAX52262和AAT96361(绿黄假单胞菌)；CAJ76697(洋榛假单胞菌)；YP_001185537(门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina))；和ABA47309和BAG24128(菊苣假单胞菌)，其各自全部以引用方式并入本文。

另外一组超敏蛋白或多肽包括但不限于野油菜黄单孢菌HreX的同源物(参见Wei等的美国专利No.6,960,705，其全部以引用方式并入本文)，包括来自其它黄单孢菌属的那些。这类同源物的非限制实例包括以GenBank登录号NP_636614、YP_001904470、YP_362171识别的那些超敏蛋白(野油菜黄单孢菌(Xanthomonas campestris))；ABB72197、ABK51585、ABU48601、ABK51584、YP_198734和ZP_02245223(水稻黄单孢菌(Xanthomonas oryzae))；和ABK51588和NP_640771(地毯草黄单孢菌)；其各自全部以引用方式并入本文。

在另一个实施方案中，分离的HR激发蛋白质或多肽片段是上述超敏蛋白之一的片段或片段组合(即，融合蛋白质)。在一个实施方案中，片段或融合蛋白质包括引起HR的片段。在另一个实施方案中，片段或融合蛋白质包括不引起HR的片段。合适片段包含例如两个结构单元：具有12或更多个氨基酸长度的稳定α-螺旋单元；和具有12或更多个氨基酸长度的亲水性、酸性单元，其可呈β形式、β转动或无序形式。片段还可通过优选地约5或以下的酸性pI值来表征。片段可含有任何数量的氨基酸，例如，在约25与约60之间，或约28至约40氨基酸之间。

合适片段的实例识别于Laby等的美国专利No.6,583,107，和Fan等的PCT公布号WO 01/098501，其各自全部以引用方式并入本文。Fan等的PCT公布号WO 01/098501也描述获得可用于本发明的超敏蛋白或多肽的片段的方法。

合适HR诱导多肽片段包含但不限于在表1中识别的那些。

表1：HR诱导片段的列表

如以上提及，超敏蛋白或多肽的合适片段可不引起植物的超敏反应，但是可仍然适用于本发明的方法和组合物。这类片段描述于Wei等的美国专利No.6,858,707，其全部以引用方式并入本文。

不引起超敏反应的超敏反应激发子的合适片段的实例包括解淀粉欧文氏菌超敏反应激发子的片段，其描述于Wei等的美国专利No.6,858,707中，所述专利全部以引用方式并入本文。这些片段包含美国专利No.6,858,707(其全部以引用方式并入本文)中所列举的HrpN氨基酸序列的C末端片段，其跨越氨基酸169–403、210–403、267–403或343–403；和美国专利No.6,858,707(其全部以引用方式并入本文)中所列举的HrpN氨基酸序列的内部片段，其跨越氨基酸150–179、137–166、121–150、76–168、105–168或137–156。

其片段本身不引起超敏反应的超敏反应激发子的有用片段的另一个实例是含有如美国专利No.6,858,707(其全部以引用方式并入本文)中所列举的HrpZ氨基酸序列的氨基酸190至294的蛋白质片段。

不引起超敏反应的超敏反应激发子的片段的变体可通过例如缺失或添加氨基酸来制得，这些氨基酸对于多肽的性质、次级结构和水疗性质具有最小影响。举例来说，多肽可偶联至蛋白质的N-末端的信号(或前导)序列，所述蛋白质共翻译或翻译后引导蛋白质转移。多肽还可偶联至接头或其它序列以便于合成、纯化或识别多肽。

合适片段可通过多种方法产生。根据一种方法，编码已知超敏蛋白或多肽的基因的亚克隆通过经由亚克隆基因片段的常规分子遗传操作来产生。然后，亚克隆体外或体内表达于细菌细胞中以产生可测试活性的较小蛋白质或肽。

作为替代方法，可通过用蛋白分解酶如胰凝乳蛋白酶或葡萄球菌蛋白酶A或胰蛋白酶来消化全长超敏蛋白或多肽来产生片段。基于超敏蛋白的氨基酸序列，不同蛋白分解酶可能在不同部位来裂解激发蛋白质。由蛋白分解产生的一些片段可为活性激发子。

在另一个方法中，基于对蛋白质的一级结构的了解，超敏蛋白基因的片段可通过使用PCR技术以及几组特定来合成，所述引物经过选择以代表蛋白质的具体部分。然后，这些片段克隆至适当载体中以表达截短肽或蛋白质。

化学合成也可用于制得合适片段。这类合成使用所产生的超敏蛋白的已知氨基酸序列来实施。或者，使全长超敏蛋白经受高温和压力可产生片段。然后，这些片段可通过常规程序(例如，色谱法、SDS-PAGE)来分离。

本发明的超敏蛋白或多肽还可包括分离超敏反应激发融合蛋白质，其包括两个或更多个间隔开的HR诱导或非诱导域。

含有一个或多个HR诱导域的结构单元包括但不限于在表2中识别的结构单元。

表2：融合蛋白质的结构单元域

使用这些(和其它)HR诱导域的组合，可产生融合蛋白质，其具有较高HR效力并且具有诱导所需植物反应的增强的能力，在此情况下增加的产量和增强的生长。这些融合蛋白质可使用一个HR域重复单元(串联体)、HR域的不同组合，和/或来自其它激发子的生物活性域来形成。

使用这些结构单元，多种分离融合蛋白质包括但不限于在表3中识别的那些。

表3：融合蛋白质构造

这些融合蛋白质是耐热和可溶的，并且已经证明与从植物病原菌分离的超敏蛋白，如HrpN相比，具有改善的生长增强活性。这些融合蛋白质描述于Fan等的PCT公布号WO01/098501，其全部以引用方式并入本文。

一种优选融合蛋白质，现在可从Plant Health Care Inc.购得，由如下氨基酸序列SEQ ID NO:1来表征：

SEQ ID NO:1的残基1-30对应于HrpN_Ea的N-末端序列；残基31-34(粗体)是将HR域连接在一起的人工效应物；残基35-83对应于HrpW_Ea的一个HR域(残基10-59)；残基84-86(粗体)是将HR域连接在一起的人工效应物；残基87-138对应于HrpZ_Pss的一个HR域(残基90-141)；残基139-140(粗体)是将HR域连接在一起的人工效应物；残基141-211对应于PopA的一个HR域(残基70-140)；残基212-220对应于将HR域连接在一起的人工效应物；残基221-261对应于HrpN_Ea的一个HR域(残基140-180)；残基262-271对应于将HR域连接在一起的人工效应物；并且残基272-412对应于HrpN_Ea的C-末端序列(残基263-403)。

SEQ ID NO:1的融合蛋白质由如下SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码：

在实施本发明的方法中，杀真菌剂甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段的施用可通过将每一种化合物依序施用至植物和/或栽培区域或通过施用含有两种化合物的单一组合物来进行。在任一方法中，实施两种化合物(依序或同时)的施用以协同增加植物产量。

在一个实施方案中，实施施用的方法是同时(例如，组合成单一制剂混合物，或以两个个别制剂形式来同时施用)或连续地施用甲基托布津制剂和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段制剂以获得大致上相同结果。

连续施用是指甲基托布津在分离的HR激发蛋白质或多肽片段之前或之后施用。当两个化合物的施用连续地发生时，选择个别施用之间的时间间隔以确保首先施用的活性物质在施用其它有效物质时仍然以足够量存在于作用部位。优选地，后续施用活性化合物(和任何附加化合物)的时间间隔在约几秒直至约3月，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或约10秒，1分钟，约1-3、5、10、15、30或45分钟，约1小时，2-3小时、5小时、10小时、15小时、20小时或24小时，约1-3天、5天、1周、2周、3周、4周、1月，或约1-5月范围内。

两种物质的施用顺序对于本发明的操作是不重要的。此外，如以下更全面论述，一个或两个这些物质或其组合的施用可在生长季节期间重复一次或多次。

甲基托布津和分离的HR激发蛋白质或多肽片段可配制成两个单独制剂或组合物，或单一制剂或组合物。

活性物质的农业制剂是熟知的。非限制实例包括溶液、乳液、悬浮液、粉剂、散剂、糊剂和颗粒剂。所选择的具体制剂可取决于具体预定应用而变化。在每个情况下，它通常有利地确保活性成分在液体或固体载体中的精细和均匀分布。

配制方法教导于例如Littler的美国专利No.3,060,084和BASFAG的欧洲专利号0707445(关于液体浓缩物)；Browning,“Agglomeration,”Chemical Engineering第147-48页(1967)；Perry’sChemical Engineer’s Handbook,第4版,McGraw-Hill,New York,1963；E.I.Du Pont De Nemours and Co.的PCT公布号WO 91/13546；Albert的美国专利No.4,172,714；Frensch等的美国专利No.4,144,050；Albert的美国专利No.3,920,442；Moore的美国专利No.5,180,587；Ogawa等的美国专利No.5,232,701；Hoy等的美国专利No.5,208,030、英国专利号2,095,558；Macmullen的美国专利No.3,299,566；Klingman,Weed Control as a Science,J.Wiley&Sons,New York,1961；Hance等,Weed Control Handbook,第8版,Blackwell Scientific,Oxford,1989；以及Mollet和Grubemann,Formulation Technology,Wiley VCH Verlag,Weinheim,2001，其各自全部以引用方式并入本文。

甲基托布津和分离的HR激发蛋白质或多肽片段可以农用化学品制剂常见的方式来配制(共同或单独)。举例来说，组合物可包括农用化学品制剂惯有的助剂。所使用的具体助剂可分别取决于具体应用形式和活性物质。合适助剂的非限制实例包括溶剂、固体载体、分散剂或乳化剂(例如，其它增溶剂、保护胶体、表面活性剂和粘着剂)、有机和无机增稠剂、杀菌剂、防冻剂、防沫剂、着色剂、增粘剂或结合剂或其组合。

合适溶剂包括水；有机溶剂如中至高沸点的矿物油馏分、煤焦油和来源于植物或动物的油；脂族、环状和芳族烃类(例如，甲苯、二甲苯、石蜡、四氢化萘、烷基化萘或其衍生物)；醇如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和环己醇；乙二醇；酮如环已酮和γ-丁内酯；脂肪酸二甲基酰胺；脂肪酸和脂肪酸酯；和强极性溶剂(例如，胺如N-甲基吡咯烷酮)。

合适固体载体包括矿物质土如硅酸盐、硅胶、滑石粉、高岭土、石灰石、石灰、白垩、红玄武土、黄土、粘土、白云石、硅藻土、硫酸钙、硫酸镁、氧化镁、研磨合成材料、肥料(例如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素和来源于植物的产物，如谷粉、树皮粉、木粉和坚果壳粉)；纤维素粉末；和其它固体载体。

合适表面活性剂(也称为佐剂、润湿剂、增粘剂、分散剂或乳化剂)是芳族磺酸(例如，木素磺酸(类型,Borregard,挪威))苯酚磺酸、萘磺酸(类型,Akzo Nobel,美国)、二丁基萘-磺酸(类型,BASF,德国)、脂肪酸的碱金属、碱土金属和铵盐，烷基磺酸盐、烷基芳基磺酸盐、烷基硫酸盐、月桂醚硫酸盐、脂肪醇硫酸盐、硫酸化十六、十七和十八酸盐、硫酸化脂肪醇二醇醚类、萘或萘磺酸与苯酚和甲醛的缩合物、聚氧乙烯辛基苯基醚、乙氧基化异辛基苯酚、辛基苯酚、壬基酚、烷基苯基聚二醇醚类、三丁基苯基聚乙二醇醚、三硬脂基苯基聚乙二醇醚、烷基芳基聚醚醇、醇和脂肪醇/环氧乙烷缩合物、乙氧基化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚类、乙氧基化聚氧丙烯、月桂醇聚乙二醇醚缩醛、山梨糖醇酯、木质素-亚硫酸盐废液和蛋白质、变性蛋白质、多糖(例如甲基纤维素)、疏水修饰淀粉、聚乙烯醇(类型,Clariant,瑞士)、聚羧酸盐(类型,BASF,德国)、聚烷氧基化物、聚乙烯胺(类型,BASF,德国)、聚乙烯吡咯烷酮和其共聚物。

增稠剂(即，赋予制剂改变的流动性的化合物(即，在静态条件下高粘度和在搅动期间低粘度)的实例是多糖以及有机和无机粘土如黄原胶(CP Kelco,美国)、23(Rhodia,法国)、(R.T.Vanderbilt,美国)或(Engelhard Corp.,NJ,USA)。

杀菌剂可添加至组合物以防腐和稳定。合适杀菌剂的实例包括例如基于双氯酚和苯甲醇半缩甲醛(来自ICI的来自ThorChemie的RS和来自Rohm&Haas的MK)和异噻唑啉酮衍生物如烷基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮(来自ThorChemie的MBS)的那些杀菌剂。

合适防冻剂的实例是乙二醇、丙二醇、尿素和甘油。

防沫剂的实例是硅酮乳液(例如，SRE,Wacker,Germanyand Rhodia,法国)、长链醇、脂肪酸、脂肪酸盐、含氟有机化合物及其混合物。

合适着色剂是低水溶性颜料和水溶性染料。非限制实例包括罗丹明B、C.I.颜料红112、C.I.溶剂红1、颜料蓝15:4、颜料蓝15:3、颜料蓝15:2、颜料蓝15:1、颜料蓝80、颜料黄1、颜料黄13、颜料红112、颜料红48:2、颜料红48:1、颜料红57:1、颜料红53:1、颜料橙43、颜料橙34、颜料橙5、颜料绿36、颜料绿7、颜料白6、颜料褐25、碱性紫10、碱性紫49、酸性红51、酸性红52、酸性红14、酸性蓝9、酸性黄23、碱性红10和碱性红108。

增粘剂或结合剂的实例包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇和纤维素醚类(例如，Shin-Etsu,日本)。

散剂、撒布材料和粉剂可通过混合或同时研磨活性化合物与至少一种固体载体来制备。

颗粒(例如，涂布颗粒、浸渍颗粒和均质颗粒)可通过使活性物质结合至固体载体来制备。固体载体的实例是矿物质土如硅胶、硅酸盐、滑石粉、高岭土、镁质粘土、石灰石、石灰、白垩、红玄武土、黄土、粘土、白云石、硅藻土、硫酸钙、硫酸镁、氧化镁、研磨合成材料、肥料(例如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素和来源于植物的产物，如谷粉、树皮粉、木粉和坚果壳粉)、纤维素粉末和其它固体载体。

在一个实施方案中，组合物被配制成用水稀释。因此，组合物可配制为水溶性浓缩物、可分散浓缩物、可乳化浓缩物、乳液、悬浮液、水可分散的颗粒和/或水溶性颗粒、水可分散的粉末和/或水溶性粉末或凝胶。

在水溶性浓缩物的情况下，制剂可包含例如例如溶解于约90重量份水或水溶性溶剂的约10重量份的本发明的组合物。作为替代方案，可添加润湿剂或其它助剂。活性物质在用水稀释后溶解。以这种方式，获得具有约10重量％活性物质含量的制剂。

在可分散浓缩物的情况下，制剂可包含例如例如约20重量份活性化合物，其溶解于添加有约10重量份分散剂例如聚乙烯吡咯烷酮的约70重量份环已酮中。用水稀释给出分散液。根据此制剂，活性物质含量为约20重量％。

在可乳化浓缩物的情况下，制剂可包含例如例如约15重量份的活性化合物，其溶解于添加有十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧基化物(在每个情况下为约5重量份)的约75重量份二甲苯中。用水稀释给出乳液。组合物具有约15重量％的活性物质含量。

在乳液的情况下，制剂可包含例如例如约25重量份活性化合物，其溶解于添加有十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧基化物(在每个情况下为约5重量份)的约35重量份二甲苯中。借助于乳化机(Ultraturrax)将此混合物引入约30重量份水中并且制成均质乳液。用水稀释给出乳液。组合物具有约25重量％的活性物质含量。

在悬浮液的情况下，在搅拌球磨机中，将约20重量份活性化合物与添加的约10重量份分散剂和润湿剂和约70重量份水或有机溶剂一起研细以给出精细活性物质悬浮液。用水稀释给出活性物质的稳定悬浮液。组合物中的活性化合物占约20重量％。

在水可分散颗粒和/或水溶性颗粒的情况下，制剂可包含例如例如约50重量份活性化合物，其与约50重量份分散剂和润湿剂一起精细研磨并且通过技术设备(例如，挤塑、喷淋塔、流化床)来制备成水可分散或水溶性颗粒。用水稀释给出活性物质的稳定分散液或溶液。组合物具有约50重量％的活性化合物含量。

在水可分散粉末和/或水溶性粉末的情况下，制剂可包含例如例如在转子-定子研磨机中研磨、添加有约25重量份分散剂、润湿剂和硅胶的约75重量份活性化合物。用水稀释给出活性物质的稳定分散液或溶液。组合物的活性化合物含量为约75重量％。

在凝胶的情况下，制剂可包含例如例如约20重量份活性化合物，其在球磨机中搅拌并且与添加的约10重量份分散剂、约1重量份胶凝剂和约70重量份水或有机溶剂一起研细以给出活性物质的精细悬浮液。用水稀释给出活性物质的稳定悬浮液，其中获得具有约20％(w/w)活性化合物的组合物。

在另一个实施方案中，活性化合物配制以便不稀释施用。因此，活性化合物可配制为粉化散剂、颗粒或超低容量(“ULV”)(例如雾化)溶液。

在粉化散剂的情况下，制剂可包含例如例如约5重量份活性化合物，其经过精细研磨并且与约95重量份细碎高岭土一起紧密混合。这获得具有约5重量％活性物质含量的粉化组合物。

在颗粒的情况下，制剂可包含例如例如约0.5重量份活性化合物，其经过精细研磨并且与约99.5重量份载体缔合。这获得具有约0.5重量％活性化合物含量的不稀释即可施用的颗粒。

在ULV溶液的情况下，制剂可包含例如例如约10重量份活性化合物，其溶解于约90重量份有机溶剂例如二甲苯中。这获得具有约10重量％活性化合物含量的不稀释即可施用的组合物。

在本发明中，农用化学品制剂总体上包括约0.01重量％与约95重量％之间，或约0.1重量％与约90重量％之间，或约0.5重量％与约90重量％之间的活性物质。

在一个实施方案中，活性化合物具有约90％至100％，或约95％至100％的纯度(根据NMR光谱)。

因为它尤其涉及分离的HR激发蛋白质或多肽片段的制剂，所以含有超敏蛋白或多肽的稳定液体组合物可涉及获得大致上不含细胞残骸的液体提取物。在一个实施方案中，这通过使超敏蛋白或多肽产生植物细菌的悬浮液发酵来完成。超敏蛋白或多肽可经由在快速生长细菌中发酵来容易地产生。举例来说，重组大肠杆菌可用于大规模超敏蛋白或多肽生产。当前技术使得能够生产相对较大细胞内浓度的超敏蛋白或多肽。

重组方法总体上涉及将表达所感兴趣的蛋白质或多肽的DNA分子***表达***中，相对于所述表达***来说，所述DNA分子是异源的(即，通常不存在)。异源DNA分子以适当有义方向和正确的解读码组***表达***或载体中。载体含有用于转录和翻译***蛋白质编码序列的必要元件。DNA的转录取决于启动子的存在。类似地，原核生物中的mRNA的翻译取决于不同于真核生物的那些信号的适当原核生物信号的存在。关于最大化基因表达的综述，参见Roberts和Lauer,Methods in Enzymology68:473(1979)，其通过引用并入本文。

不管所使用的具体调控序列为何，使用本领域中的标准克隆程序将DNA分子克隆至载体中，如Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Springs Laboratory,Cold Springs Harbor,N.Y.(1989)描述，其全部以引用方式并入本文。一旦编码超敏蛋白或多肽的分离DNA分子已经克隆至表达***中，它准备并入宿主细胞中。取决于载体/宿主细胞***，这类并入可通过各种形式的转化来实施。合适宿主细胞包括但不限于细菌、病毒、酵母、哺乳动物细胞、昆虫、植物等。

任选地，重组宿主细胞可为表达天然或重组、功能型III分泌***的宿主细胞。这详细描述于Bauer等的美国专利No.6,596,509中，其全部以引用方式并入本文。由于表达功能型III分泌***，细胞将表达超敏蛋白或多肽，然后将蛋白质分泌至培养基中。这可简化超敏蛋白或多肽的分离和纯化。

重组宿主细胞可生长于适当发酵室中，优选地在优化宿主细胞的生长和超敏蛋白或多肽的表达的温度和营养物条件下。本领域技术人员完全能够识别具体宿主细胞的最佳条件。

发酵之后，细菌悬浮液可稀释于例如约2至5倍体积的缓冲剂中以将pH调整至约5.5至10之间，更优选地约7至9之间的pH，并且甚至更优选地约8.0的pH。合适缓冲剂在本领域中是熟知的，并且可包括例如磷酸钾缓冲剂或Tris-EDTA缓冲剂。缓冲剂的浓度可为约0.001mM至约0.5M。

pH调整之后，将细菌悬浮溶液热处理至约60℃-130℃的温度，优选地约95℃-125℃的温度。热处理可实施任何一段合适时间。在一个实施方案中，热处理实施时间为约五分钟直至约30分钟。

然后将热的悬浮溶液冷却。合适冷却温度为但不限于约35℃-55℃，优选地约45℃。

冷却之后，如果需要，将细菌悬浮液中的细菌细胞溶解以释放超敏蛋白或多肽。细胞溶解可例如通过使细菌悬浮液与溶菌酶接触来实施。溶菌酶的浓度可为约2ppm至100ppm之间的任何浓度。或者，细胞溶解可涉及非化学方法，如高压或超声处理，其均为本领域普通技术人员所熟知。

在细胞溶解之后，可能需要孵育细菌悬浮液。合适孵育时间可变化。举例来说，可能需要在约40℃-42℃的温度下孵育细菌悬浮液约30-45分钟的时间。

溶解之后，所需蛋白质或多肽(即，超敏蛋白或多肽，或其片段)可通过移除细胞残骸来进一步提取，并且从以前的热处理步骤来产生变性蛋白质。在一个实施方案中，将提取物离心约10-20分钟以移除一些细胞残骸。合适离心速度可为约4,000至20,000rpm并且旋转沉降时间可为约10分钟至20分钟。然后，进一步细胞残骸可通过热处理和离心分离上清液来移除以便通过移除超过约60％、70％、80％、90％或95％总固体量来获得大致上不含细胞残骸的液体提取物。此后续热处理可在约60℃温度下实施多达约两个小时、约100℃下约10分钟，或约121℃与15psi压力下约5分钟。这些温度和时间可取决于其它条件而变化。

含有超敏蛋白或多肽的稳定液体组合物可进一步涉及将杀生物剂以及任选地蛋白酶抑制剂和非离子表面活性剂中的一个或两个引入液体提取物中，从而获得包括分离超敏蛋白或多肽片段的液体组合物。在一个实施方案中，将蛋白酶抑制剂引入没有非离子表面活性剂的液体提取物中。在另一个实施方案中，将非离子表面活性剂引入没有蛋白酶抑制剂的液体提取物中。在另一个实施方案中，将蛋白酶抑制剂和非离子表面活性剂都引入液体提取物中。在另一个实施方案中，蛋白酶抑制剂和非离子表面活性剂都不引入液体提取物中。

将杀生物剂添加至液体提取物以防腐。合适杀生物剂包括但不限于抗生素、毒性化学品和消毒剂。举例来说，合适抗生素是链霉素，合适毒性剂是叠氮化钠，并且合适消毒剂是三效消毒剂(即，具有以下活性成分的EPA批准杀虫剂：1-癸铵内鎓盐，N,N-二甲基-N-辛基氯化物(12.4质量％)；1-辛铵内鎓盐，N,N-二甲基-N-辛基氯化物(12.4质量％)；烷基(C12-16)二甲基苄基铵氯化物(12.4质量％)；碳酸钠(3质量％)；和依地酸钠(2.5质量％))。所引入的杀生物剂的浓度在可约1ppm至约100ppm，更优选地约2ppm至约30ppm，最优选地约5ppm至约10ppm范围内。

可添加蛋白酶抑制剂以防止超敏蛋白提取物中的残留蛋白酶使超敏蛋白降解。蛋白酶抑制剂包括按照蛋白酶类型或其作用机制来归类的各种抑制剂。合适蛋白酶抑制剂可包括但不限于半胱氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)、胰蛋白酶抑制剂、苏氨酸蛋白酶抑制剂、天门冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。合适蛋白酶抑制剂可根据其作用机制来选择。举例来说，合适蛋白酶抑制剂可包括但不限于***抑制剂、过渡状态抑制剂、蛋白质蛋白酶抑制剂和螯合剂。可购得蛋白酶抑制剂的实例包括但不限于抑肽酶、乌苯美司、钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、胰凝乳、E-64、亮肽素(N-乙酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酸)、α-2-巨球蛋白、pefabloc SC、胃蛋白酶抑制剂、PMSF(苯甲磺酰氟化物)和甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮(TLCK)。

蛋白酶抑制剂可以约1ppm至约100ppm，更优选地约2ppm至约30ppm，最优选地约5ppm至约10ppm的浓度添加至提取物。

合适非离子表面活性剂包括但不限于山梨醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、脂肪酸聚甘油酯、脂肪酸醇聚乙二醇醚、乙炔二醇、乙炔醇、氧化烯嵌段聚合物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯苯乙烯基芳基醚、聚氧乙烯二醇烷基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油和聚氧丙烯脂肪酸酯。

非离子表面活性剂可以约0.005至约20％，更优选地约0.01至约15％，最优选地约0.05％至约10％的体积量添加至提取物。

由于引入杀生物剂和任选地如上所述的蛋白酶抑制剂和表面活性剂，组合物可保持其超敏蛋白活性至少72小时和优选地长得多的时间。优选地，组合物保持超敏蛋白活性超过约5天、1周、2周、3周或4周，更优选地至少约2至3个月，并且最优选地长于约4至6个月。如本文使用，超敏蛋白活性的保持可通过将陈化液体组合物的活性与最近制备的液体组合物或对于相同组合物进行的以前评估比较来确定。活性可通过组合物对于植物的效应来测量，如通过激发之后的植物的抗病性、生长增强、胁迫抗性等来评估。优选地，本发明的组合物保持(超过72小时)至少约70％活性，更优选地至少约70％至约80％活性和最优选地至少约80％至90％活性。

本发明的组合物的活性物质(即，至少甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段)可单独和依序，或作为单一组合物，例如，以直接可喷淋溶液、散剂、悬浮液、分散液、乳液、油分散液、糊剂、粉化产品、撒布材料或颗粒形式，借助于喷淋、喷雾、撒粉、撒布、涂抹、浸渍或倾倒来施用。施用形式取决于预定用途以确保在每个情况下活性化合物的最精细可能分布。

水性施用形式可通过添加水从乳液浓缩物、糊剂或可湿润粉末(例如，可喷淋粉末和油分散液)来制备。为了制备乳液、糊剂或油分散液，按照原样或溶解于油或溶剂中的物质(即，活性化合物)可借助于润湿剂、粘着剂、分散剂或乳化剂来在水中均化。或者，可制备主要由活性物质、润湿剂、粘着剂、分散剂或乳化剂以及如果适当的溶剂或油组成的浓缩物，并且这类浓缩物适合于用水稀释。

个别化合物相对于总组合物的重量比取决于个别化合物的性质(例如，具体分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段，和/或其它化合物的存在)。随时可用的制剂中的活性物质浓度可在相对宽范围内变化。总体上，其为约0.0001重量％至约10重量％，或约0.001重量％至约1重量％。组合物还可成功用于超低容量过程(ULV)中，可施加包含超过95重量％活性物质的组合物，或甚至施用没有添加剂的活性物质。

各种类型的油、润湿剂、佐剂、除草剂、杀真菌剂、其它杀虫剂或杀菌剂可添加至农用组合物，并且如果适当直到使用之前才立即添加(例如，桶混(tank mix))。这些试剂可以约1:100至约100:1，或约1:10至约10:1的重量比与活性化合物掺合。个别杀虫剂组分可总体上是本领域普通技术人员已知的，如在The Pesticide Manual,第15版，British Crop Protection Council(2009)中描述的那些，其全部以引用方式并入本文。

制剂还可含有肥料，如硝酸铵、尿素、碳酸钾、过磷酸盐、植物毒素、植物生长调控剂和安全剂。肥料可与活性物质的制剂分开地施用或可例如通过在使用之前立即添加(桶混)而包含于组合物中。在一个实施方案中，植物和/或栽培区域可在其用肥料处理之前或之后用本发明的组合物喷淋。

在一个实施方案中，组合物包括甲基托布津并且以约1液量盎司/英亩至约200液量盎司/英亩之间的甲基托布津，或约5液量盎司/英亩与约100液量盎司/英亩之间的甲基托布津，或约10液量盎司/英亩与约50液量盎司/英亩之间的甲基托布津，或约15液量盎司/英亩至约30液量盎司/英亩之间的甲基托布津的量施用至植物和/或栽培区域。

在另一个实施方案中，组合物包括分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段并且以约0.25干量盎司/英亩与约15干量盎司/英亩之间的分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段，或约0.5干量盎司/英亩与约10干量盎司/英亩之间的分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段，或约0.75干量盎司/英亩与约5干量盎司/英亩之间的分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段，或约1干量盎司/英亩至约2.5干量盎司/英亩之间的分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段的量施用至植物和/或栽培区域。

制剂中的活性化合物可具有不同结晶修饰以改变生物活性。在所使用的所有三级和四级组合物中，化合物以导致协同植物健康增加效应的量存在。

然后，可根据需要将其它活性化合物，例如，杀虫剂、除草剂、杀真菌剂和/或除草或生长调控化合物或肥料作为其它活性组分来添加。在一个实施方案中，本发明的制剂可包括选自草甘磷、麦草畏和草铵膦的组的一种或多种附加活性成分。在此实施方案中，植物抵抗这些除草剂。

草甘磷和麦草畏也可以其农业上可接受的盐和酯形式来使用。草甘磷的合适盐包括其中相对离子是农业上可接受的阳离子的草甘磷的那些盐。这类盐的合适非限制实例是草甘磷-铵、草甘磷-联铵、草甘磷-二甲基铵、草甘磷-异丙基铵、草甘磷-钾、草甘磷-钠、草甘磷-倍半钠、草甘磷-倍半钾、草甘磷-三甲基锍(草硫膦)、草甘磷-三甲基硫盐，以及乙醇胺和二乙醇胺盐。在一个实施方案中，草甘磷的盐选自草甘磷-联铵、草甘磷-异丙基铵、草甘磷-倍半钠和草甘磷-三甲基锍(草硫膦)。

麦草畏的合适盐包括其中相对离子是农业上可接受的阳离子的麦草畏的那些盐。这类盐的合适实例是麦草畏-钠、麦草畏-钾、麦草畏-甲基铵、麦草畏-二甲基铵、麦草畏-异丙基铵、麦草畏-二甘醇胺、麦草畏-胺、麦草畏-二乙醇胺，和麦草畏-三乙醇胺。合适酯的实例是麦草畏甲酯和麦草畏丁氧乙酯

对于包括草甘磷的组合物来说，根据一个实施方案，将组合物施用至植物、植物部分、栽培区域或其任何组合以约1g/ha与约2500g/ha草甘磷之间，或约5g/ha与约1500g/ha草甘磷之间，或约100g/ha与约750g/ha草甘磷之间的比率来实施。

对于包括麦草畏的本发明的组合物来说，根据一个实施方案，将组合物施用至植物、植物部分、栽培区域或其任何组合以约1g/ha与约1500g/ha之间，或约5g/ha与约750g/ha之间，或约50g/ha与约500g/ha之间的比率来实施。

对于包括草铵膦的本发明的组合物来说，根据一个实施方案，将组合物施用至植物、植物部分、栽培区域或其任何组合以约1g/ha与约1000g/ha之间，或约5g/ha与约500g/ha之间，或约20g/ha与约300g/ha之间，或约30g/ha与约200g/ha之间的比率来实施。

根据本发明的方法来施用甲基托布津和分离的HR激发蛋白质或多肽片段可在不存在害虫(例如，真菌病原体)压力的情况下且/或在任何害虫(例如，真菌病原体)感染材料或植物前后来实施。

取决于所需效应，根据本发明的方法来施用甲基托布津和分离的HR激发蛋白质或多肽片段可在植物的各种不同生长阶段进行。

术语“生长阶段”(GS)是指扩展BBCH量表，它是用于统一编码所有单和双子叶植物种类的生物季节学类似生长阶段的***，其中植物的整个发育周期细分成清楚可识别和可区分的更持久发育期。BBCH量表使用十进制码***，其划分成主要和次要生长阶段。缩写BBCH得自农林联邦生物研究中心(德国)、Bundessortenamt(德国)和化学工业。

施用可在GS 00与GS 73 BBCH、GS00与GS 63 BBCH、GS11与GS 63 BBCH，或GS 11与GS 34 BBCH之间的生长阶段(GS)实施。

施用可例如以2、3、4、5、6、7、8或更多次施用来重复实施。在一个实施方案中，甲基托布津和分离的HR激发蛋白质或多肽片段在BBCH生长阶段11至63之间首先施用，并且在BBCH生长阶段65至75之间再次施用。

施用甲基托布津和分离的HR激发蛋白质或多肽片段可通过叶喷处理、犁沟内施用或以任何其他方式来实施。

根据本发明，与通过单独施用甲基托布津或分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段的可能效果相比，同时(即，联合或单独)施用甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段(和任选的附加活性化合物)和连续施用甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段(和任选的附加活性化合物)可增强和/或增加植物健康。活性化合物甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段对于植物产量具有协同效应，这意味着其以给出所需效应的数量来使用，这种效应是植物健康的协同增加但是优选地对于所处理的植物不产生任何植物毒性症状。

在实施本发明的方法中，由于将甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段施用至植物和/或栽培区域的协同效应，植物的总体健康增加。协同效应是其中施用个别组分的纯粹累加效应(在数学上)被施用所述组合超越的情形(参见图1-2)。

如本文使用，“植物的健康”或“植物健康”是指由单独或彼此组合的几个方面确定的植物和/或其产物的状况，这些方面如增加的产量、植物活力、质量和对于非生物和/或生物性胁迫的耐受性。

遭受真菌或杀虫攻击的植物经常产生较少生物质，从而导致与已经受针对病原性真菌或任何其它相关害虫的治疗或预防性处理并且可在没有生物性胁迫因素导致的破坏的情况下生长的植物相比，产量减少。然而，按照本发明的方法来施用甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段甚至不存在任何生物性胁迫的情况下导致植物健康增强。这意味着甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段的积极效应不能仅通过活性成分的杀真菌、杀虫和/或除草活性来解释，而是基于其它活性谱。因此，将甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段施用至植物和/或栽培区域还可在植物上不存在害虫压力的情况下实施。

根据本发明，“增加植物产量”是指植物产物的产量以可测量的量增加超过在相同条件下，但是没有将甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段施用至植物和/或栽培区域时产生的相同植物产物的产量。在一个实施方案中，术语“产量”是指本来意义上的果实，以及蔬菜、坚果、籽粒和种子。

“籽粒”和“果实”应理解为在收获之后进一步利用的任何植物产物，例如，本来意义上的果实、蔬菜、坚果、籽粒、种子、木材(例如，在造林植物的情况下)、花朵(例如，在园艺植物和观赏植物的情况下)等，意指由植物产生的具有经济价值的任何对象。

增加的植物产量可由以下非限制性性质来表征：增加植物重量；增加生物质，如较高总鲜重(FW)和/或较高总干重(DW)；每个植物的花朵数量增加；较高籽粒和/或果实产量；更多分蘖或侧枝(分枝)；较大叶子；增加枝条生长；增加蛋白质含量；增加含油量；增加淀粉含量；增加色素含量；增加叶绿素含量；和其任何组合。

叶绿素含量与植物的光合作用率具有正相关，并且因此，叶绿素含量越高，植物产量越高。

根据一个实施方案，与其中没有甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段施用至植物和/或栽培区域的植物相比，干燥豆类产量的协同增加大于约23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％或更大。

根据另一个实施方案，与其中没有甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段施用至植物和/或栽培区域的植物相比，花生产量的协同增加大于约2％、3％、4％或更大。

增加植物产量可涉及改善植物活力。植物活力体现于多个方面，包括植物的一般视觉外观。改善植物活力可尤其通过以下来表征：改善植物生命力；改善植物生长；改善植物发育；改善视觉外观；改善植物群丛(更少植物颠倒/倒伏)；改善萌发；增强根系生长和/或更发达根系；增强生节，尤其根瘤菌生节；更大叶片；更大尺寸；增加植物高度；增加分蘖数；增加侧枝数量；每个植物的花朵数量增加；增加枝条生长；增加根系生长(广泛根系)；增强光合作用活性；增强色素含量；较早开花；较早结实；较早和改善发芽；较早籽粒成熟；较少无效分蘖；较少死亡基生叶；需要较少输入(如肥料或水)；叶子较绿；在较短植物生长期下完全成熟；需要较少肥料；需要较少播种种子；更容易收获；更快和更均匀的成熟；更长有效保存期；更长圆锥花序；延迟衰老；更强和/或更多有效分蘖；成分的较好提取性；改善种子质量(以在随后季节播种进行种子繁殖)；减少乙烯产生和/或抑制其由植物接收；和其任何组合。

植物的光合作用活性增强可基于植物的气孔导度增加和/或CO₂吸收率增加。

增加植物产量可涉及改善植物和/或其产物的质量。改善植物质量可包括但不限于改善某些植物特性，如某些成分的含量和/或组成以可测量或显著的量增加超过在相同条件下，但是没有施用本发明的组合物时产生的植物的相同因子。增强质量可尤其通过以下来表征：增加营养物含量；增加蛋白质含量；增加脂肪酸含量；增加代谢物含量；增加类胡萝卜素含量；增加糖含量；增加必需氨基酸的量；改善营养物组成；改善蛋白质组成；改善脂肪酸组成；改善代谢物组成；改善类胡萝卜素组成；改善糖组成；改善氨基酸组成；改善或最佳果实颜色；改善叶颜色；较高存储容量；收获产物的较高可加工性；或其任何组合。

增加植物产量可涉及改善植物对于生物性和/或非生物性胁迫因素的耐受性或抗性。生物和非生物性胁迫，尤其在较长时期内，可对于植物具有有害效应。生物性胁迫由活生物体引起，而非生物性胁迫由例如恶劣环境引起。在一个实施方案中，按照本发明的方法来将本发明的组合物施用至植物可增强对于生物性和/或非生物性胁迫因素的耐受性或抗性，这意味着：(1)与暴露于相同条件，但是没有用本发明混合物处理的植物相比，由生物性和/或非生物性胁迫引起的某些不利因素以可测量或显著的量减弱，并且(2)不利因素并非通过组合物对于胁迫因素的直接作用，例如，其直接破坏微生物或害虫的杀真菌或杀虫作用而得以减弱，而实际上通过刺激植物自身的针对所述胁迫因子的防御反应而得以减弱。

由生物性胁迫如病原体和害虫引起的不利因素是广泛已知的，并且从斑叶到植物完全破坏而不同。生物性胁迫可由活生物体引起，如害虫(例如，昆虫类、蛛形纲动物和线虫类)、竞争植物(例如，杂草)、微生物(例如，植物病原真菌和/或细菌)和/或病毒。

由非生物性胁迫引起的不利因素也是熟知的，并可经常观察为减少的植物活力(如上所述)或以下症状：斑叶、“焦化”叶、生长减少、花朵较少、生物质较少、作物产量较少、作物营养价值减少，和较晚作物成熟，仅给出几个例子。非生物性胁迫可尤其由以下引起：极端温度如热或冷(热胁迫/冷胁迫)、温度强烈变化、对于特定季节不正常的温度、干旱(干旱胁迫)、极端湿润、高盐度(盐胁迫)、辐射(例如由于臭氧层减少而导致UV辐射增加)、臭氧水平增加(臭氧胁迫)、有机污染(例如植物毒性量的杀虫剂)、无机污染(例如重金属污染物)，和其任何组合。

生物性和/或非生物性胁迫因素降低受胁迫植物、其作物和果实的数量和质量。就质量来说，生殖发育可受影响，对于果实或种子至关重要的作物具有一定后果。蛋白质的合成、积累和存储主要受温度影响；生长被几乎所有类型的胁迫减缓；多糖合成，在结构和存储方面，均减少或改变。这些效应导致生物质(产量)减少和植物产物的营养价值变化。

植物的健康状况的以上识别指标可为互相依存的并且可彼此产生。举例来说，对于生物性和/或非生物性胁迫的抗性增加可导致更好植物活力，例如，更好和更大作物，并且因而导致增加产量。相反地，更发达根系可导致对于生物性和/或非生物性胁迫的抗性增加。

将甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段施用至植物和/或栽培区域对于植物具有协同效应：增加植物健康、增加植物产量、增加植物生物质、增加植物含油量、增加植物活力、增加植物群丛、增加植物萌发、增加植物根系生长、增加植物光合作用活性、改善植物质量、改善植物的营养物组成、改善植物的蛋白质组成、改善植物的类胡萝卜素组成、增加植物对于生物性胁迫的耐受性、增加植物对于真菌的耐受性、增加植物对于线虫的耐受性、增加植物对于细菌的耐受性、增加植物对于非生物性胁迫的耐受性、增加植物对于干旱胁迫的耐受性、增加植物对于冷胁迫的耐受性、增加植物对于热胁迫的耐受性、增加植物对于盐胁迫的耐受性、增加植物对于臭氧胁迫的耐受性，和/或其任何组合。

增加相对于生物和非生物性胁迫的抗性的最重要因素之一是刺激植物的天然防御反应，这种反应通过根据本发明的方法来施用甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段而发生。

也可将甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段(和任选地附加活性化合物)封装并且用作联合组合物。因此，本发明的另一个方面涉及试剂盒，其包括配制的甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段(和任选地附加活性化合物)。

在一个实施方案中，试剂盒可包括一个或多个，包括所有，组分，其可用于制备农用化学品组合物，所述组合物含有甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段(和任选地附加活性化合物)。举例来说，试剂盒可包括甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段(和任选地附加活性化合物)和/或佐剂组分和/或进一步杀虫化合物(例如，杀虫剂、杀真菌剂或除草剂)和/或生长调控组分。一个或多个组分可能已经组合在一起或预配制。

在其中超过两种活性化合物提供于试剂盒中的那些实施方案中，活性化合物可能已经组合在一起并且因此封装于单一容器如小瓶、瓶子、套罩、囊、袋子或罐中。在替代实施方案中，两种或更多种活性化合物可个别地封装(即，未预配制)。因此，试剂盒可包括一个或多个单独容器如小瓶、套罩、瓶子、囊、袋子或罐，每个容器含有农用化学品组合物的单独组分。在两种形式中，试剂盒组分可与其它组分分开或一起施用或作为联合组合物的组分。

然后，用户可通常从预用量装置、背包式喷雾器、喷淋罐或喷雾飞机来施用组合物。在这里，农用化学品组合物用水和/或缓冲剂补充至所需施用浓度，如果适当，可添加进一步助剂，并且由此获得根据本发明的随时可用的喷雾液或农用化学品组合物。在一个实施方案中，每公顷农业有效面积施用约50至约500升随时可用的喷雾液，或约50至约400升。

在另一个实施方案中，配制为组合物的个别化合物或部分预混合的化合物(例如，甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段(和任选地附加活性化合物))由用户在喷淋罐中混合，并且如果适当，添加其它助剂和添加剂(桶混)。

在另一个实施方案中，个别化合物(例如，甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段(和任选地附加活性化合物))或部分预混合的化合物(例如甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段(和任选地附加活性化合物))共同地(例如，在桶混之后)或连续地施用。

本发明的这些方面进一步在以下实施例中示出。

实施例

提供下列实施例以说明本发明的实施方案，而绝不是意欲限制其范围。

实施例1–用PHC-351和甲基托布津来控制斑豆植物中的白霉病

此实施例的目的是提供以下问题的答案：在以具体时序施用时，PHC-351影响作物的视觉外观吗？在以指定时序施用时，PHC-351影响产量吗？在以指定时序施用时，PHC-351减少白霉病(核盘菌)发病率或严重性吗？在白霉病(核盘菌)管理和总体植物产量方面，在M 70WP与PHC-351之间存在相互作用吗？

材料

PHC-351含有SEQ ID NO:1的超敏蛋白融合蛋白质，其为植物激发子。在此试验中，它与M处理组合以叶喷剂形式在干豆植物上测试。M 70WP是甲基托布津杀真菌剂70％可湿性散剂。以前试验指示在此方案中指定的时序晚于影响作物秧苗所需要的时序。为了影响植物生长和产量，超敏蛋白通常在结实体发育之前的较早植物发育阶段，即营养期来施用。在这里，它在其中结实体已经存在的较晚阶段来施用。

田区确立和试验布置

测试在适合于干豆产生，并且可能患有白霉病的多个测试场地开始。这些场地的干燥豆类在前一年患有白霉病，并且在测试当年未耕作。避免具有白霉病耐受性的斑豆品种(如‘Chase’)。

田区尺寸、行间隔和缓冲地带：6行(15-30”间隔＝10英尺宽)×25+英尺田区。在各区组之间有至少5英尺顺行田区两侧上的2个外部行是未收割的缓冲地带或边界。

试验设计：种植8次。使用随机化完全区组设计。在14天群丛计数之后，基于群丛将田区分区。

种植日期：种子在商业上可接受的种植窗口内种植。

植物密度：此试验强调产量；因此，种植应获得沿着所述行的非常均匀的植物间隔。

场地管理：植物生长(肥料)、昆虫、疾病和杂草根据本地公认做法并且在此方案中提到的其它限制范围内来进行管理。所有田区同等地管理，并且对测试场地进行管理以生长健康植物，同时将害虫的有害影响减少到最低限度。

混合和施用

喷雾施用：处理以正确校准的地面设备来施用，所述设备配备有屏蔽式喷杆来最小化喷雾偏差。使用具有间隔开～18-20英寸的3个喷嘴的5英尺宽、2行喷杆，喷淋每个田区的中心两个行。调整杆宽度以拟合行间隔。

冲洗：所有混合和施用设备在喷淋田区之前仔细冲洗三次，并且在转换至下一个处理之前，将喷淋***冲洗三次。喷淋处理以处理列表(表4)的顺序来实施。

水体积和来源：20-30gpa。喷淋以确保全面覆盖花朵，如果可获得，使用滴嘴。如果桶水的总矿物质含量、盐度和/或悬浮体较高，则使用清洁水。

桶混合物：将PHC-351施用至适当田区并且允许处理物干燥。然后，将M 70WP施用至适当田区。没有其它材料添加至这些处理物。

PHC-351操作：产品在混合8小时内使用。对于重复试验目的：开启封包在8小时内使用。打开之后，使用施用所需要的物品，并且将剩余材料放弃。在植物积极生长的当天和当时制得喷雾剂。

处理时序：在处理列表指定的时序，即，当100％植物具有至少1个开放花朵时，进行施用以实现花朵的全面覆盖。

表4.处理清单

*水对照应与化学处理同时用水处理。

数据收集

在种植时—复合土壤样品：在种植之前0-7天，收集并且分析复合土壤样品。样品用来表征整个试验场地。在现场试验的种植区域随机提取20个土芯，并且将所述芯混合。土芯提交至指定实验室并且请求分析有机物质、微量营养素、宏量营养素、土壤pH、计算阳离子交换能力和阳离子饱和％。样品按照标准土壤分析准则来操作。

当令计数：请求这些测量结果以确定是否存在与处理相关的早期视觉效应。

(a)在萌发之后第14和28天(DAE)计数植物群丛，计数两个行的整个长度，然后转化并且以植株/英亩来报告。使用14天计数以将复现实验分区，也就是说，在复现实验内具有所有条目的相同或几乎相同群丛计数。

(b)通过视觉评估活力，在14和28DAE的活力(1-9)。

(c)记录中心两个行在开花时的冠层闭合百分比。

疾病发生率和严重性：收获之前10-14天，百分比感染植物中的白霉病发病率，并且严重性以1-5量表来评定，其中1是最不严重并且5为最严重。

产量：将每个田区的中心2行机器收获。收获在惯常窗口内并且避免收获延迟。为了最小化边缘效应，避免收获每个田区最前和最后2.5英尺。报告每个田区的豆类重量和水分含量(％)。校正水分之后，计算产量并且以蒲式耳/英亩(bu/A)来报告。

统计分析：ANOVA和费歇尔保护LSD，P＝0.10。

实验结果报告于图1中。

试验在其中白霉病常常造成问题的干豆产生区域中进行。在6个场地，2012比正常更热和更干燥，并且在其余场地，比正常更冷和更润湿。喷淋前数据示出群丛、活力或冠层闭合没有差异，指示没有不正常的预先存在田区变化。白霉病出现于5个场地(WA、WI、MI和ID)。总体上，在单独施用PHC-351(超敏蛋白)时，它增加产量超过未处理对照达平均3.59％。在单独施用M(甲基托布津)时，它增加产量超过未处理对照达18.6％。然而，在其同时用于植物上时，产量增加超过3.59％与18.6％的总和。所述组合的产量增加是25.1％；这比预测产量多几乎3％，证明意外和协同结果。预期任何其它干豆品种有类似结果。

实施例2–使用PHC-351和甲基托布津，对于Runner型花生植物中的产量和叶斑病控制的影响

此实施例的目的是提供以下问题的答案：在以具体时序施用时，PHC-351影响作物的视觉外观吗？在以指定时序施用时，PHC-351影响产量吗？在以指定时序施用时，PHC-351减少白霉病(早期＝尾孢属，晚期＝尾孢菌)发病率或严重性吗？在白霉病(早期＝尾孢属，晚期＝尾孢菌)管理和总体植物产量方面，在M与PHC-351之间存在相互作用吗？

材料

PHC-351含有SEQ ID NO:1的超敏蛋白融合蛋白质，其为植物激发子。在此试验中，它与M处理组合以叶喷剂形式在Runner型花生植物上测试。M 70WP是甲基托布津杀真菌剂70％可湿性散剂。以前试验指示在此方案中指定的时序晚于影响作物秧苗所需要的时序。为了影响植物生长和产量，超敏蛋白通常在结实体发育之前的较早植物发育阶段，即营养期来施用。在这里，它在其中结实体已经存在的较晚阶段来施用。

田区确立和试验布置

测试在适合于Runner型花生产生，并且可能患有叶斑病的测试场地开始。

田区尺寸、行间隔和缓冲地带：6行(36”间隔＝18英尺宽)×30+英尺田区。在区组之间留下至少10英尺通道。田区两侧上的2个外部行是未处理或收割的边界。

试验设计：种植6次。使用随机化完全区组设计。田区基于统一的群丛来分区。

种植日期：种子在商业上可接受的种植窗口内种植。

场地管理：昆虫、疾病和杂草根据本地公认做法并且在此方案中提到的其它限制范围内来进行管理。所有田区同等地管理，并且对测试场地进行管理以生长健康植物，同时将害虫的有害影响减少到最低限度。整个试验区域用其它杀真菌剂(百菌清)喷淋以控制疾病。

混合和施用

喷雾施用：处理以正确校准的地面设备来施用，所述设备配备有屏蔽式喷杆来最小化喷雾偏差。使用具有间隔开～18-24英寸的6个喷嘴的6英尺宽、2行喷杆，喷淋每个田区的中心四个行。调整杆宽度以拟合行间隔。

冲洗：所有混合和施用设备在喷淋田区之前仔细冲洗三次，并且在转换至下一个处理之前，将喷淋***冲洗三次。喷淋处理以处理列表(表5)的顺序来实施。

表5.处理列表

*水对照应与化学处理同时用水处理。

水体积和来源：15-20gpa。喷淋以确保全面覆盖叶子。如果桶水的总矿物质含量、盐度和/或悬浮体较高，则使用清洁水。

桶混合物：将PHC-351施用至适当田区并且允许处理物干燥。然后，将M施用至适当田区。没有其它材料添加至这些处理物。

处理时序：如叶斑病控制所需要，在35-40DAE进行施用，并且以14天时间间隔来重复。进行至少3次施用。每季施用仅仅2lbs./A的

数据收集

(a)在萌发之后第28天(DAE)计数植物群丛，计数两个行的整个长度，然后转化并且以植株/英亩来报告。使用28天计数以将复现实验分区，也就是说，在复现实验内具有所有条目的相同或几乎相同群丛计数。

(b)在28DAE时的活力(1-9)，通过视觉评估整个田区的活力来获得(1＝最差和9＝最佳)。

疾病发病率和严重性：叶斑病在收获之前30天评定，并且在收获之前5-7天再次评定。将百分比感染植物中的叶斑病(早期＝尾孢属，晚期＝尾孢菌)发病率，和根据1-10量表的严重性加以报告，其中1是最不严重并且10是最严重。

产量：将每个田区的中心2行机器收获。收获在惯常窗口内并且避免收获延迟。报告每个田区的花生重量并且计算产量，并以磅/英亩(lbs/A)为单位来报告。

统计分析：ANOVA和费歇尔保护LSD，P＝0.10。

实验结果报告于图2中。

试验根据如上所述方案来进行。在这些试验中，疾病压力(晚期叶斑病伯克利球腔菌(Mycosphaerella berkeleyi))是低到中度的。记录产量，并且发现在两个位置的产量很高并且是类似的。PHC-351处理展示稍微减少产量(达5.3％或311lbs)。然而，M(甲基托布津)处理稍微增加产量；在单独施用时，M增加产量超过未处理对照(177lbs)达3.0％。意外地发现尽管PHC-351在单独施用时导致对于产量的轻微有害影响，但是当它与甲基托布津组合施用时，产量增加超过未处理对照(218lb)达3.7％。与任一产物个别地，或相加地增加产量相比，此组合更大地增加产量，从而展示明显协同作用。

虽然本发明已经出于说明目的来详细描述，但是应了解这类详述仅出于此目的，并且其中本领域技术人员可做出变化而不背离以下权利要求限定的本发明的精神和范围。

Claims

1.一种增加植物产量的方法，所述方法包括：

向植物和/或栽培区域施用甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段，其中所述施用在有效诱导所述植物的协同产量的条件下实施。

2.根据权利要求1所述的方法，其中产量选自改善的植物活力、对于生物性和/或非生物性胁迫的增加的耐受性或抗性、增加的植物重量、增加的生物质、每个植物的增加的花朵数量、较高籽粒和/或果实产量、更多分蘖或侧枝、较大叶子、增加的枝条生长、增加的蛋白质含量、增加的含油量、增加的淀粉含量、增加的色素含量、增加的叶绿素含量及其组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是干豆并且产量增加至少约23％。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是花生并且产量增加至少约3％。

5.根据权利要求1所述的方法，其中甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段以单一组合物形式施用。

6.根据权利要求1所述的方法，其中甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段同时以单独组合物形式施用。

7.根据权利要求1所述的方法，其中甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段连续地以单独组合物形式施用。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用进一步包括：

施用有效量的附加杀虫剂、附加杀真菌剂、除草剂、植物生长调节剂或其组合。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述施用包括施用有效量的除草剂，其选自草甘磷、麦草畏、草铵膦、其农业上可接受的盐和酯或其组合。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用通过喷淋、喷雾、撒粉、撒布、涂抹、浸渍和/或倾倒来实施。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用的量为约1液量盎司/英亩至约200液量盎司/英亩的甲基托布津之间。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用的量为约0.25干量盎司/英亩至约15干量盎司/英亩的所述超敏反应激发蛋白质或多肽片段之间。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述超敏反应激发蛋白质或多肽片段是重组的。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述超敏反应激发蛋白质或多肽片段包括全长超敏反应激发蛋白质。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述超敏反应激发蛋白质或多肽片段包含融合蛋白质。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述融合蛋白质包含分离的一对或更多个间隔开的结构域，每个结构域包含连接至α-螺旋的酸性部分。

17.根据权利要求16所述的方法，其中每个结构域来自不同原始有机体。

18.根据权利要求16所述的方法，其中存在3个或更多个间隔开的结构域。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物选自豆科作物、豆类、花生、芹菜、葫芦、菜籽、小麦、核果、苹果、越橘、草莓、苜蓿、水稻、大麦、黑麦、棉花、向日葵、玉米、马铃薯、甘薯、豌豆、菊苣、莴苣、苦苣、卷心菜、抱子甘蓝、甜菜防风草、花椰菜、西兰花、芜菁、萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、胡萝卜、倭瓜、南瓜、西葫芦、黄瓜、梨、甜瓜、柑橘、葡萄、树莓、菠萝、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物选自干豆、花生、豌豆和大豆。

21.一种组合物，其包含液体或固体载体、甲基托布津和分离的超敏反应激发蛋白质或多肽片段。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述载体是液体载体。

23.根据权利要求21所述的组合物，其中所述载体是固体载体。

24.根据权利要求21所述的组合物，其中所述组合物呈溶液、乳液、悬浮液、粉剂、散剂、糊剂或颗粒剂形式。

25.根据权利要求21所述的组合物，其进一步包含：

有效量的附加杀虫剂、附加杀真菌剂、除草剂、植物生长调节剂或其组合。

26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述组合物包括有效量的除草剂，其选自草甘磷、麦草畏、草铵膦、其农业上可接受的盐和酯或其组合。

27.根据权利要求21所述的组合物，其中所述超敏反应激发蛋白质或多肽片段是重组的。

28.根据权利要求21所述的组合物，其中所述超敏反应激发蛋白质或多肽片段包括全长超敏反应激发蛋白质。

29.根据权利要求21所述的组合物，其中所述超敏反应激发蛋白质或多肽片段包含融合蛋白质。

30.根据权利要求21所述的组合物，其中所述超敏反应激发蛋白质或多肽片段包含分离的一对或更多个间隔开的结构域，每个结构域包含连接至α-螺旋的酸性部分。

31.根据权利要求30所述的组合物，其中每个结构域来自不同原始有机体。

32.根据权利要求30所述的组合物，其中存在3个或更多个间隔开的结构域。