JP2017532981A - 破壊された過敏感反応ボックスを有するエリシターペプチド及びその使用 - Google Patents

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Abstract

植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない、ペプチドが開示されている。これらのペプチドは好ましくは、改善された溶解性、安定性、化学的分解に対する抵抗性、またはこれらの特性の組合せも示す。植物生化学的シグナル伝達をモジュレートするため、植物に病害抵抗性を付与するため、植物成長を増進させるため、生物的ストレスに対する耐性を付与するため、非生物的ストレスに対する耐性及び抵抗性を付与するため、観賞植物から取り出された切り出し部分に乾燥抵抗性を付与するため、果実もしくは野菜に収穫後病害抵抗性もしくは収穫後乾燥抵抗性を付与するため、または果実もしくは野菜の成熟の寿命を延ばすための、これらのペプチドもしくは融合ポリペプチド、またはそれらをコードするDNAコンストラクトの使用も開示されている。

Description

本出願は、それぞれ全体が参照によって本明細書に組み込まれる2014年10月1日出願の米国仮特許出願第62/058,535号、及び2015年6月30日出願の米国仮特許出願第62/186,527号の優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、破壊された過敏感反応ボックスを有する新規のエリシターペプチド、ならびに成長増進、病害抵抗、害虫または昆虫抵抗、及びストレス抵抗を特に含む活性な植物反応を誘導するためのそれらの使用に関する。
発明の背景
ハーピンタンパク質の同定及び単離は、感染がどのように植物と相互作用するかを理解することを試みているCornell Universityでの基礎研究に由来した。防御の第一線は、過敏感反応(HR)という、感染部位での限局性植物細胞死である。細胞死は、病原体の移動に対して物理的バリアを生じ、一部の植物では、死細胞は、侵入病原体に対して毒性な化合物を放出し得る。研究によって、病原細菌はおそらく、HRの開始を担う単一の因子を有することが示されていた。Cornell大学における研究の基本的な目的は、HRの誘発を担う特定の細菌タンパク質を同定することであった。その標的タンパク質は、過敏感反応及び病原性(Hypersensitive Response and Pathogenicity;hrp)遺伝子クラスターと呼ばれる一群の細菌遺伝子の1つによってコードされることが分かっている。セイヨウナシ及びリンゴにおいて火傷病の原因となる細菌エルウィニア・アミロボーラ(Erwinia amylovora)(Ea)におけるhrpクラスターが分析され、ある種の植物においてHRを誘発する単一のタンパク質が同定された。このタンパク質は、ハーピン(後には、ハーピンEa)という名称を与えられ、対応する遺伝子は、hrpNと指定された。これは、あらゆる細菌種から同定されたそのようなタンパク質及び遺伝子の最初の例であった。
それ以来、いくつかの異なるハーピンタンパク質が、特にエルウィニア(Erwinia)、シュードモナス(Pseudomonas)、ラルストニア(Ralstonia)、キサントモナス(Xanthomonas)、及びパントエア(Pantoea)属から同定されている。一次アミノ酸配列レベルでは多様であるが、ハーピンタンパク質は、共通する生化学的及び生物物理学的特徴、さらには、生物学的機能を共有している。それらの独特の特性に基づき、ハーピンタンパク質は、文献において、タンパク質の単一群に属するとみなされる。
それらの同定及び単離に続いて、後に、ハーピンは、植物において病害抵抗性を誘発し、かつ植物成長を増進させ得ることが発見された。重要な初期所見は、精製ハーピンタンパク質の適用が、その後の病原体攻撃に対して、かつ注入部位からかなり離れた植物位置で、植物を抵抗性にすることであった。これは、ハーピンタンパク質が、全身獲得抵抗性(SAR)という、様々なウイルス性、細菌性、及び真菌性病原体に対する抵抗性を与える植物防御機構の引き金を引くことができることを意味する。
作物の保護において、植物の健康を改善する組成物が常に必要とされている。植物または作物のより良好な収量及び/またはより良好な品質をもたらすので、より健康な植物が望ましい。より健康な植物はまた、生物的及び非生物的ストレスにより良好に抵抗する。生物的ストレスに対する高い抵抗性は、今度は、栽培者が適用する農薬の量を減らすこと、及びその結果、個々の農薬に対する抵抗性の発生を遅延させることを可能にする。
ハーピンαβは、いくつかの異なるハーピンに由来する融合タンパク質である。ハーピンαβは、線虫卵の生成を抑制し、植物の成長、品質、及び収量を増進させ、ならびに植物の活力を増大させることが判明している。そのアミノ酸及びヌクレオチド配列は、米国特許出願公開第2010/0043095号(特許文献1)において詳細に記載されている。
今日までに、ハーピン及びハーピンαβの生産、ならびに農業及び園芸用途におけるそれらの使用は、デンプン上に被覆された粉末化固体としてであった。これは、ハーピンタンパク質の使用及び多角性を限定するが、それというのも、水中の粉末化ハーピンタンパク質の液体懸濁液は、活性の著しい低下及び喪失が生じるまでにわずか48〜72時間の有効な有用寿命しか有さないためである。ハーピン溶液に伴う別の問題は、タンパク質溶解性及び安定性である。
水溶液に易溶性であり、安定しており、化学的分解に対して抵抗性を有し、かつとりわけ、増進された植物成長及び生産を含めた活性な植物反応を誘導する際に有効であり、さらには非生物的及び生物的ストレッサーに抵抗性を有する、合成及び誘導体ハーピンペプチドを同定することが望ましいであろう。
本発明は、当技術分野においてこれらの限界及び他の限界を克服することに指向している。
米国特許出願公開第2010/0043095号
本発明の第1の態様は、
Figure 2017532981
のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドに関し、ここで、
前記ペプチドは、システイン及びメチオニンを含まず;
2、3、7、8、12、及び13位の各Xは、任意選択であり、かつ、存在する場合には任意のアミノ酸であり;
4、9、及び14位の各Xは、任意のアミノ酸であり;
1、5、6、10、11、15、及び16位のJ残基の1〜3個が、非疎水性アミノ酸またはAであり、かつJ残基の他の全てが、L、I、V、またはFであり、かつ、前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。
本発明の第2の態様は、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:2、修飾P1/P4コンセンサス)のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドに関し、ここで、
1位のXは、任意選択であり、かつS、N、D、イソD、G、A、またはSであり得;
2位のXは、任意選択であり、かつQ、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり得;
8位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
9位のXは、M、L、I、F、もしくはV、または非疎水性アミノ酸であり;
10位のXは、任意選択であり、かつDまたはイソDであり得;
11位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
12位のXは、M、L、I、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;
13位のXは、M、L、もしくはI、または非疎水性アミノ酸であり;
14位のXは、任意選択であり、かつ任意の親水性アミノ酸、好ましくはS、T、D、イソD、K、またはQ、及び任意選択でAまたはCであり得;
15位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、S、K、またはIであり;
16位のXは、M、L、I、V、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;
17位のXは、M、L、I、A、もしくはV、または非疎水性アミノ酸であり;
18位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、S、M、T、またはKであり;
19位のXは、A、D、イソD、S、V、T、K、R、E、H、またはGであり;
20位のXは、M、L、またはIであり;
21位のXは、M、L、I、V、S、もしくはFであるか、またはセリン以外の非疎水性アミノ酸であり;
22位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、Sであり;
23位のXは、P、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;かつ
9、12、13、16、17、及び20位の残基の少なくとも1つは非疎水性アミノ酸であるか、または21位の残基はセリン以外の非疎水性アミノ酸であり、かつ、前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。
本発明の第3の態様は、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:3、修飾P4コンセンサス)のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドに関し、ここで、
2位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
8位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
9位のXは、M、S、L、A、I、V、もしくはFであるか、またはセリン以外の非疎水性アミノ酸であり;
11位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
12位のXは、L、I、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;
13位のXは、L、A、I、V、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;
14位のXは、任意の親水性アミノ酸であり;
15位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、S、K、またはIであり;
16位のXは、L、A、I、V、M、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;
17位のXは、M、I、S、もしくはFであるか、またはセリン以外の非疎水性アミノ酸であり;
18位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
20位のXは、M、L、I、V、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;
21位のXは、M、L、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;かつ
22位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
9、12、13、16、20、及び21位の残基の1個は、非疎水性アミノ酸もしくはAであるか、または17位の残基はセリン以外の非疎水性アミノ酸であり、かつ、前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。
本発明の第4の態様は、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:4、修飾P1コンセンサス)のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドに関し、ここで、
1位のXは、N、D、イソD、G、A、またはSであり;
2位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
8位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
11位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
15位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
18位のXは、M、T、K、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
22位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
23位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
9、12、13、16、17、20、及び21位のJは、これらの位置のアミノ酸のうちの1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、及びFから選択される疎水性アミノ酸であり、前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。
本発明の第5の態様は、
(i)3位のXが、N、D、またはイソDであり;
6位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
8位のXが、N、D、またはイソDであり;
15位のXが、任意選択であり、かつ任意のアミノ酸であり得;
18位のXが、M、E、g−グルタマート、G、A、S、T、またはKであり;
22位のXが、任意選択であり、かつQ、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり得;かつ
9、12、13、16、17、20、及び21位のJは、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、及びFから選択される疎水性アミノ酸である、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:5、修飾P15b/P20コンセンサス)、
あるいは
(ii)7位のXが、任意選択であり、かつ任意のアミノ酸であり得;
10位のXが、M、E、g−グルタマート、G、A、S、T、またはKであり;
14位のXが、任意選択であり、かつQ、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり得;かつ
1、4、5、8、9、12、及び13位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、及びFから選択される疎水性アミノ酸である、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:6、修飾P15/20minコンセンサス)
のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドに関し、かつ
前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。
本発明の第6の態様は、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:7、修飾P6/6aコンセンサス)のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドに関し、ここで、
6位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
9位のXは、M、E、g−グルタマート、G、A、S、T、またはKであり;
10位のXは、HまたはNであり;
14位のXは、E、g−グルタマート、D、またはイソDであり;
17位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
19位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;かつ
4、7、8、11、12、15、及び16位のJは、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、M、及びFから選択される疎水性アミノ酸であり、前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。
本発明の第7の態様は、
(i)1位のXが、Q、N、D、E、g−グルタマート、イソD、またはSであり得;
2位のXが、D、E、g−グルタマート、イソDであり得;
3位のXが、P、D、E、イソD、またはg−グルタマートであり得;
4位のXが、M、A、S、D、E、イソD、またはg−グルタマートであり得
5位のXが、Q、E、またはg−グルタマートであり得;
6位のXが、A、E、またはg−グルタマートであり得;
8位のXが、M、L、E、Q、D、N、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
9位のXが、Q、N、E、D、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
12位のXが、Q、N、E、D、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
13位のXが、Q、N、E、D、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
16位のXが、K、Q、N、E、D、R、G、A、またはSであり得;かつ
7、10、11、14、15、17、及び18位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、及びFから選択される疎水性アミノ酸である、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:8、修飾P14dコンセンサス)、あるいは
(ii)2位のXが、M、L、E、Q、D、N、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
3位のXが、Q、N、E、D、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
6位のXが、Q、N、E、D、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
7位のXが、Q、N、E、D、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
10位のXが、K、Q、N、E、D、R、G、A、またはSであり得;かつ
1、4、5、8、9、11、及び12位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、及びFから選択される疎水性アミノ酸である、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:9、修飾P14d minコンセンサス)
のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドに関し、ここで、前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。
本発明の第8の態様は、
(i)2位のXが、Q、N、E、g−グルタマート、D、イソD、T、S、A、またはGであり得;
3位のXが、K、Q、N、E、g−グルタマート、D、イソD、T、S、A、またはGであり得;
6位のXが、K、Q、N、E、g−グルタマート、D、イソD、T、S、A、またはGであり得;
9位のXが、E、g−グルタマート、D、イソD、Q、N、T、S、A、またはGであり得;
10位のXが、A、G、S、T、E、g−グルタマート、D、イソD、Q、またはNであり得;かつ
1、4、5、7、8、10、及び11位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、F、及びMから選択される疎水性アミノ酸である、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:10、修飾P25コンセンサス)、あるいは
(ii)2位のXが、T、S、A、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、またはNであり得;
3位のXが、G、T、S、A、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、またはNであり得;
6位のXが、Q、N、E、g−グルタマート、D、イソD、T、S、A、またはGであり得;
7位のXが、K、Q、N、E、g−グルタマート、D、イソD、T、S、A、またはGであり得;
10位のXが、K、Q、N、E、g−グルタマート、D、イソD、T、S、A、またはGであり得;
13位のXが、E、g−グルタマート、D、イソD、Q、N、T、S、A、またはGであり得;
14位のXが、A、G、S、T、E、g−グルタマート、D、イソD、Q、またはNであり得;
1、4、5、8、9、11、12、及び15位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、F、及びMから選択される疎水性アミノ酸であり;かつ16位のJが、任意選択であり、かつL、V、I、及びFから選択される疎水性アミノ酸である、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:11、修飾P25コンセンサス)
のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドに関し、ここで、前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。
本発明の第9の態様は、
(i)1位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
2位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
3位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはP、Q、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
4位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはI、Q、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、N、イソD、K、またはRであり得;
5位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはD、イソD、S、E、g−グルタマート、A、T、G、N、Q、K、またはRであり得;
6位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはR、Q、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、またはKであり得;
7位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
8位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはT、Q、S、E、g−グルタマート、A、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
9位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはI、Q、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
10位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはE、g−グルタマート、Q、S、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
11位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
13位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはA、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
14位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、N、K、またはRであり得;
17位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはA、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
18位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、N、K、またはRであり得;
21位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり得;
22位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはS、A、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
25位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはS、A、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
26位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはP、S、A、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
27位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、S、A、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、N、K、またはRであり得;
12、15、16、19、20、23、及び24位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、F、及びMから選択される疎水性アミノ酸である、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:12、修飾P17/18)、あるいは
(ii)2位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはA、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
3位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、N、K、またはRであり得;
6位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはA、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
7位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、N、K、またはRであり得;
10位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり得;
11位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはS、A、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;かつ
1、4、5、8、9、12、及び13位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、F、及びMから選択される疎水性アミノ酸である、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:13、修飾P17/18minコンセンサス)
のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドに関し、ここで、前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。
本発明の第10の態様は、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:14、修飾P19コンセンサス)のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドに関し、ここで、
1位のXは、任意選択であり、L、I、V、F、またはMであり得;
3位のXは、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり得;
4位のXは、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはA、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
7位のXは、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり得;
10位のXは、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはA、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
11位のXは、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはR、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはKであり得;かつ
2、5、6、8、9、12、及び13位のJは、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、F、及びMから選択される疎水性アミノ酸であり、前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。
本発明の第11の態様は、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:126、P3ミニマム(minimum))のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドに関し、ここで、
3位のXは、任意の親水性アミノ酸、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり;
6位のXは、任意の親水性アミノ酸、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり;
7位のXは、任意の親水性アミノ酸、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり;かつ
及びZの一方が存在し、ただし好ましくは両方ではなく、Zは、LXX−を含み、ここで各Xは、親水性アミノ酸、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり、かつZは、−XXLFを含み、ここで各Xは、親水性アミノ酸、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRである。
本発明の第12の態様は、
Figure 2017532981
のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドに関し、ここで、前記ペプチドは、システイン及びメチオニンを含まず;2、3、6、7位の各Xは、任意のアミノ酸であり、かつ前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。
本発明の第13の態様は、本発明の第1から第12の態様のペプチドの1つを、精製タグ、溶解性タグ、または本発明の第1から第12の態様の1つによる第2のペプチドの1つまたは複数と共に含む融合タンパク質に関する。
本発明の第14の態様は、
Figure 2017532981
からなる群から選択される単離されたペプチドに関する。また、これらのペプチドの1つを、精製タグ、溶解性タグ、または本発明の第1から第12及び第14の態様の1つによる第2のペプチドの1つまたは複数と共に含む融合タンパク質も、本発明のこの態様に包含される。
本発明の第15の態様は、第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、または第14の態様による1種もしくは複数種のペプチドまたは融合タンパク質と担体とを含む組成物に関する。
本発明の第16の態様は、植物に病害抵抗性を付与する方法に関する。この方法は、有効量の、本発明の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13もしくは第14の態様による単離されたペプチドもしくは融合タンパク質、または本発明の第15の態様による組成物を、植物もしくは植物種子にまたは植物が成長している場所もしくは成長すると予測される場所に適用することを含み、前記適用は、病害抵抗性を付与するために有効である。
本発明の第17の態様は、植物成長を増進させる方法に関する。この方法は、有効量の、本発明の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13もしくは第14の態様による単離されたペプチドもしくは融合タンパク質、または本発明の第15の態様による組成物を、植物もしくは植物種子にまたは植物が成長している場所もしくは成長すると予測される場所に適用することを含み、前記適用は、植物成長を増進させるために有効である。
本発明の第18の態様は、生物的ストレッサーに対する植物の耐性及び抵抗性を増大させる方法に関する。この方法は、有効量の、本発明の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13もしくは第14の態様による単離されたペプチドもしくは融合タンパク質、または本発明の第15の態様による組成物を、植物もしくは植物種子にまたは植物が成長している場所もしくは成長すると予測される場所に適用することを含み、前記適用は、昆虫、クモ類、線虫などの害虫、雑草、及びそれらの組合せからなる群から選択される生物的ストレス因子に対する植物の耐性及び抵抗性を増大させるために有効である。
本発明の第19の態様は、非生物的ストレスに対する植物の耐性を増大させる方法に関する。この方法は、有効量の、本発明の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13もしくは第14の態様による単離されたペプチドもしくは融合タンパク質、または本発明の第15の態様による組成物を、植物もしくは植物種子にまたは植物が成長している場所もしくは成長すると予測される場所に適用することを含み、前記適用は、塩ストレス、水ストレス(干ばつ及び潅水を含む)、オゾンストレス、重金属ストレス、低温ストレス、高温ストレス、栄養ストレス(リン酸、カリウム、窒素欠乏)、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される非生物的ストレス因子に対する植物の耐性を増大させるために有効である。
本発明の第20の態様は、観賞植物から取り出された切り出し部分に乾燥抵抗性を付与する方法に関する。この方法は、本発明の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13もしくは第14の態様による単離されたペプチドもしくは融合タンパク質、または本発明の第15の態様による組成物を、植物にまたは植物が成長している場所に適用することを含み、前記適用は、観賞植物から取り出された切り出し部分に乾燥抵抗性を付与するために有効である。
本発明の第21の態様は、果実または野菜に収穫後病害抵抗性または収穫後乾燥抵抗性を付与する方法に関する。この方法は、有効量の、本発明の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13もしくは第14の態様による単離されたペプチドもしくは融合タンパク質、または本発明の第15の態様による組成物を、果実もしくは野菜を含む植物にまたはその植物が成長している場所に適用すること;または有効量のその単離されたペプチドもしくは組成物を、収穫された果実もしくは野菜に適用することを含み、その前記適用は、果実または野菜に収穫後病害抵抗性または収穫後乾燥抵抗性を付与するために有効である。
本発明の第22の態様は、果実または野菜の成熟の寿命を延ばす方法に関する。この方法は、有効量の、本発明の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13もしくは第14の態様による単離されたペプチドもしくは融合タンパク質、または本発明の第15の態様による組成物を、果実もしくは野菜を含む植物にまたはその植物が成長している場所に適用すること;または有効量のその単離されたペプチドもしくは組成物を、収穫された果実もしくは野菜に適用することを含み、前記適用は、果実または野菜の成熟の寿命を延ばすために有効である。
本発明の第23の態様は、植物の1つまたは複数の生物学的シグナル伝達プロセスをモジュレートする方法に関する。この方法は、有効量の、本発明の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13もしくは第14の態様による単離されたペプチド、または本発明の第15の態様による組成物を、植物にまたは植物が成長している場所に適用することを含み、前記適用は、1つまたは複数の生化学的シグナル伝達プロセスを開始させる際に有効である。
本発明の第24の態様は、本発明の第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13もしくは第14の態様によるペプチド、またはこれを含む融合ポリペプチドをコードする第1の核酸分子と;第1の核酸分子に作動可能にカップリングしたプロモーターとして有効な(promoter−effective)核酸分子とを含むDNAコンストラクトに関する。本発明のこの態様はまた、当該DNAコンストラクトを含有する組換え発現ベクター、当該DNAコンストラクトを含有する組換え宿主細胞、さらには、本発明の組換え植物細胞(当該DNAコンストラクトを含有する)を含有する形質転換植物または植物種子を包含する。
本発明の第25の態様は、植物に病害抵抗性を付与するか、植物成長を増進させるか、生物的ストレッサーに対する耐性及び抵抗性を付与するか、非生物的ストレスに対する耐性を付与するか、または植物生化学的シグナル伝達をモジュレートする方法に関する。この方法は、本発明の第24の態様によるDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物を提供すること;及び、そのDNAコンストラクトが当該ペプチドまたは当該融合ポリペプチドを発現してその形質転換植物に対して、病害抵抗性を付与することを可能にするため、植物成長を増進させることを可能にするため、生物的ストレッサーに対する耐性及び抵抗性を付与することを可能にするため、非生物的ストレスに対する耐性を付与することを可能にするため、または生化学的シグナル伝達をモジュレートすることを可能にするために有効な条件下で、その植物を成長させることを含む。
本発明の第26の態様は、観賞植物から取り出された切り出し部分に乾燥抵抗性を付与するか、果実もしくは野菜に収穫後病害抵抗性もしくは収穫後乾燥抵抗性を付与するか、または果実もしくは野菜の成熟の寿命を延ばす方法に関する。当該方法は、本発明の第24の態様によるDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物を提供すること;及び、そのDNAコンストラクトが当該ペプチドまたは当該融合ポリペプチドを発現して、形質転換観賞植物から取り出された切り出し部分に乾燥抵抗性を付与することを可能にするため、形質転換植物から採られた果実もしくは野菜に収穫後病害抵抗性もしくは収穫後乾燥抵抗性を付与することを可能にするため、または形質転換植物から採られた果実もしくは野菜についての成熟の寿命を延ばすことを可能にするために有効な条件下で、その植物を成長させることを含む。
本発明の第27の態様は、植物に病害抵抗性を付与するか、植物成長を増進させるか、生物的ストレッサーに対する耐性及び抵抗性を付与するか、非生物的ストレスに対する耐性を付与するか、または生化学的シグナル伝達をモジュレートする方法に関する。この方法は、本発明の第24の態様によるDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物の種子を提供すること;形質転換植物種子を土壌に植え付けること;及び、当該DNAコンストラクトが当該ペプチドまたは当該融合ポリペプチドを発現して、病害抵抗性を付与することを可能にするため、植物成長を増進させることを可能にするため、生物的ストレスに対する耐性及び生物的ストレッサーに対する抵抗性を付与することを可能にするため、または非生物的ストレスに対する耐性を付与することを可能にするために、その形質転換植物種子から形質転換植物を繁殖させることを含む。
本発明の第28の態様は、観賞植物から取り出された切り出し部分に乾燥抵抗性を付与するか、果実もしくは野菜に収穫後病害抵抗性もしくは収穫後乾燥抵抗性を付与するか、または果実もしくは野菜の成熟の寿命を延ばす方法に関する。当該方法は、本発明の第24の態様によるDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物の種子を提供すること;形質転換植物種子を土壌に植え付けること;及び当該DNAコンストラクトが当該ペプチドまたは当該融合ポリペプチドを発現して、形質転換観賞植物から取り出された切り出し部分に乾燥抵抗性を付与することを可能にするため、形質転換植物から採られた果実もしくは野菜に収穫後病害抵抗性もしくは収穫後乾燥抵抗性を付与することを可能にするため、または形質転換植物から採られた果実もしくは野菜についての成熟の寿命を延ばすことを可能にするために、その形質転換植物種子から形質転換植物を繁殖させることを含む。
過敏感反応を誘発しないが、とりわけ、過酸化物産生、成長増進、ならびに生物的及び非生物的ストレスに対する抵抗を含む他の活性な植物反応を誘発するペプチドであって、溶解性、安定性、化学的分解に対する抵抗性の改善、またはこれらの特性の組合せを望ましくは示す、当該ペプチドを提供することによって、これは、これらのHR陰性ペプチドを含有する有効量の組成物の調製、取扱い、及び野外または温室における植物への送達において、栽培者に、より大きな柔軟性を与えることとなる。栽培者にとって、適用プロセスの簡略化は、より大きなコンプライアンスにつながり、したがって、病害抵抗性、成長増進、生物的ストレッサーに対する耐性及び抵抗性、非生物的ストレスに対する耐性、観賞植物から取り出された切り出し部分についての乾燥抵抗性、植物から収穫された果実もしくは野菜の収穫後病害抵抗性もしくは収穫後乾燥抵抗性、ならびに/または植物から収穫された果実もしくは野菜についての果実もしくは野菜の成熟の寿命の改善の1つまたは複数に関して、改善された結果につながることとなる。これらの利点及び他の利点を本明細書において記載する。
発明の詳細な説明
本発明の一態様は、次の特質:生化学的シグナル伝達の改変;成長の促進;病原体抵抗性;及び/または生物的もしくは非生物的ストレス抵抗性:のうちの1つまたは複数をもたらす、過敏感反応ではないが活性な植物反応を促進する能力を有する新規のペプチドに関する。
本明細書において使用する場合、天然に存在するアミノ酸を、従来の3文字及び/または1文字略語によって特定するが、これは、次のリストによるアミノ酸の慣用名に対応する:アラニン(Ala、A)、アルギニン(Arg、R)、アスパラギン(Asn、N)、アスパラギン酸(Asp、D)、システイン(Cys、C)、グルタミン酸(Glu、E)、グルタミン(Gln、Q)、グリシン(Gly、G)、ヒスチジン(His、H)、イソロイシン(Ile、I)、ロイシン(Leu、L)、リシン(Lys、K)、メチオニン(Met、M)、フェニルアラニン(Phe、F)、プロリン(Pro、P)、セリン(Ser、S)、トレオニン(Thr、T)、トリプトファン(Trp、W)、チロシン(Tyr、Y)、及びバリン(Val、V)。当該略語は、ペプチド分野において認められており、IUPAC−IUB委員会によって生化学命名法において推奨されている。アミノ酸の天然に存在する変形形態には、限定ではないが、ガンマ−グルタマート(g−Glu)及びイソアスパルタート(イソ−AspまたはイソD)が含まれる。
「アミノ酸」という用語はさらに、本明細書において言及されている任意の具体的なアミノ酸の類似体、誘導体、及び同族体、さらには、C末端またはN末端保護されているアミノ酸誘導体(例えば、これらだけに限定されないが、アセチル化、ホルミル化、メチル化、アミド化、エステル化、ペグ化、及び脂質の付加を含む、N末端、側鎖、またはC末端保護基で修飾されたもの)を含む。天然に存在しないアミノ酸は周知であり、下記のとおりの固相合成を使用して、本発明のペプチドに導入することができる。さらに、「アミノ酸」という用語は、D−及びL−アミノ酸の両方を含む。したがって、本明細書において、その名称、3文字記号、または1文字記号によって同定されていて、かつDまたはL立体配置を有すると特に同定されていないアミノ酸は、DまたはL立体配置のいずれか1種を想定していると理解される。一実施形態では、ペプチドは、すべてのL−アミノ酸を含む。
特定の実施形態では、ペプチドは、記載されている配列「からなる」と同定され、その場合、そのペプチドは、そのN末端またはC末端にいずれの外来アミノ酸を伴うことなく、記載されているアミノ酸配列のみを含む。記載されている配列が、示されているXまたはXaa残基の1個または複数個が1個または複数個のアミノ酸のいずれかであり得るコンセンサス配列の形態である限りにおいて、複数のペプチド配列が、そのような記載されている配列からなるペプチドに包含される。
ある種の他の実施形態では、ペプチドは、記載されている配列「から本質的になる」と同定され、その場合、そのペプチドは、任意選択でそのN末端及び/またはC末端に1個または複数個の外来アミノ酸を含む記載されているアミノ酸配列を含み、その外来アミノ酸は、次の特性:(i)活性な植物反応を誘導するペプチドの能力、(ii)水または水溶液におけるペプチドの溶解性、(iii)ある期間(例えば、3週間)にわたる50℃での水または水溶液に溶解されたペプチドの安定性、(iv)ある期間(例えば、3週間)にわたる50℃での生物致死剤(例えば、Proxel(登録商標)GXL)を含む緩衝水溶液の存在下での化学的分解に対するペプチドの抵抗性、及び(v)ペプチドが、植物に対するインフィルトレーションまたは適用の際に過敏感反応を誘導できないこと:のうちの1つまたは複数を著しく変更することはない。
簡単には、ペプチドの化学的分解に対する安定性及び抵抗性は、少なくとも約80%、少なくとも約82%、少なくとも約84%、少なくとも約86%、少なくとも約88%、少なくとも約90%、少なくとも約92%、少なくとも約94%、少なくとも約96%、または少なくとも約98%の当初純度を有するペプチドサンプルを使用して、次のとおりに評価することができる。水安定性では、当該ペプチドを、脱イオン水に直接溶解する。化学的分解試験では、当該ペプチドを、50mM pH緩衝液及び0.25%Proxel GXLを含有する水溶液に溶解する。例示的なpH緩衝液には、限定ではないが、(i)シトラートpH5.6;(ii)MES pH6.2;(iii)MOPS pH6.5;(iv)イミダゾールpH7.0;(v)シトラートpH7.2;(vi)EDDS、pH7.3;(vii)EDTA pH8.0;(viii)リン酸ナトリウムpH8.0;または(ix)TES pH8.0が含まれる。ペプチドを初めに、0.5mg/mlの濃度で水溶液に溶解する。そのサンプルを、分解の加速を可能にする50℃でインキュベートする。当該ペプチドの当初サンプルを取り出し、水で10倍希釈し、逆相HPLCによって分析する。簡単には、サンプル20μlをHPLC機器の溶媒流に注入し、異なるペプチド種を分離するために水/アセトニトリル中のトリエチルアミンホスファート勾配または水中の0.1%TFA/アセトニトリル中の0.1%TFA勾配のいずれかを使用して、C18 HPLCカラム(YMC ProPack C18、YMC、日本、またはC18 Stablebond、Agilent Technologies、USA)で分析する。ペプチドの溶離を、218nmでのUV吸光度によってモニターし、ピーク下の面積に基づき定量化する。当初ペプチドサンプルでのピーク下面積を、その後の溶出物(run)において、相対定量化のための標準として処理する。定期的な間隔で(例えば、1、3、7、10、14、17、及び21日間)、各ペプチドサンプルを調査し、上記のとおりにHPLCによって分析する。必要な場合には、分解(すなわち、そのペプチドが高い化学的安定性の程度を示しているかどうか)を観察するために、このプロトコールを、数週間延長して分解を観察することができる。その後のペプチド溶出物の定量化を、元の(0日目の)HPLC結果に対するパーセンテージとして表す。
水または水溶液に少なくとも部分的に可溶性であるペプチドは、0.1mg/ml超、好ましくは少なくとも約1.0mg/ml、少なくとも約2.0mg/ml、少なくとも約3.0mg/ml、または少なくとも約4.0mg/mlの溶解度を示す。特定の実施形態では、当該ペプチドは、溶解度が少なくとも約5.0mg/ml、少なくとも約10.0mg/ml、少なくとも約15.0mg/ml、または少なくとも約20mg/mlである、水または水溶液に高い溶解性を示す。
水中または水溶液中で安定しているペプチドは、50℃でインキュベートされる指定期間にわたって、元のペプチド濃度の少なくとも約66%、少なくとも約68%、少なくとも約70%、少なくとも約72%、少なくとも約74%、少なくとも約76%、少なくとも約78%、少なくとも約80%、少なくとも約82%、少なくとも約84%、少なくとも約86%、少なくとも約88%、または少なくとも約90%を呈する。特定の実施形態では、指定期間は、3日間、7日間、14日間、21日間、28日間、1か月間、2カ月間、または3カ月間である。
化学的分解に抵抗性を有するペプチドは、50℃でインキュベートされる指定期間にわたって、元のペプチド濃度の少なくとも約66%、少なくとも約68%、少なくとも約70%、少なくとも約72%、少なくとも約74%、少なくとも約76%、少なくとも約78%、少なくとも約80%、少なくとも約82%、少なくとも約84%、少なくとも約86%、少なくとも約88%、または少なくとも約90%を呈する。特定の実施形態では、指定期間は、3日間、7日間、14日間、21日間、28日間、1か月間、2カ月間、3カ月間、または4カ月間である。50℃で4カ月間の安定性は、室温で2年間の安定性とほぼ等しい。
植物組織に対して当該ペプチドをインフィルトレーションまたは適用すると、過敏感反応を誘発するかまたは誘発しないペプチドの特性は、乾燥粉末形態または溶液形態のペプチドを、植物に、特に、専らではないが、植物の葉に適用することによって測定することができる。適用率には、液体溶液では1〜500ug/ml、及び粉末適用では0.0001〜0.5%(w/w)が含まれる。溶液形態でのペプチドの例示的な適用を、添付の実施例において記載する。植物が、48時間以内に、影響を受けた組織の萎れ及び褐変を随伴して、裸眼で見ることができる広く広がった巨視的細胞死を示した場合に、植物をHR陽性(「HR+」)と判断する。植物が、裸眼によって観察可能な識別し得る萎れまた組織死を示さない場合に、植物をHR陰性(「HR−」)と判断する。HR−ペプチドは、裸眼によって観察可能でない処理組織における低割合の細胞の死を引き起こすことが可能である。
特定の実施形態では、1つまたは複数の特性の重要な変更は、1個または複数個の外来アミノ酸を有するペプチドを、1個または複数個の外来アミノ酸を含まず、他の点では同一なペプチドと比較した場合に、記載されている特性において、20%未満の変化、15%未満の変化、10%未満の変化、または5%未満の変化が存在することを意味することが意図されている。特定の実施形態では、N末端またはC末端の外来アミノ酸の数は、一方もしくは両方の末端でアミノ酸最高20個、一方もしくは両方の末端でアミノ酸最高15個、一方もしくは両方の末端でアミノ酸最高10個、一方もしくは両方の末端でアミノ酸最高7個、一方もしくは両方の末端でアミノ酸最高5個、または一方もしくは両方の末端でアミノ酸最高3個である。さらに、記載されている配列が、示されているXまたはXaa残基の1個または複数個が1個または複数個のアミノ酸のいずれかであり得るコンセンサス配列の形態である限りにおいて、そのN末端及び/またはC末端での外来アミノ酸の存在によって得られるそのような配列の追加の変形にかかわらず、複数のペプチド配列が、そのような記載されている配列から本質的になるペプチドに包含される。
本発明の様々な実施形態では、開示しているペプチドは、例えば、指定ペプチド配列のN末端またはC末端のいずれかに親水性アミノ酸配列を含んでよい。親水性アミノ酸配列は、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、または少なくとも10個のアミノ酸長であり、指定ペプチド(すなわち、活性な植物反応を誘導するペプチド)のアミノ酸配列に隣接する、アミノ酸配列の親水性に寄与するアミノ酸残基を含む。アミノ酸残基及びタンパク質の相対疎水性/親水性を計算するために、種々の方法が当技術分野において使用されている(それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれるKyte et al.,“A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein,” J.Mol.Biol.157:105−32(1982);Eisenberg D,“Three−dimensional Structure of Membrane and Surface Proteins,” Ann.Rev.Biochem.53:595−623(1984);Rose et al.,“Hydrogen Bonding,Hydrophobicity,Packing,and Protein Folding,” Annu.Rev.Biomol.Struct.22:381−415(1993);Kauzmann,“Some Factors in the Interpretation of Protein Denaturation,” Adv.Protein Chem.14:1−63(1959))。これらの疎水性スケールの任意の1つを本発明の目的のために使用することができるが;しかしながら、Kyte−Doolittle疎水性スケールがおそらく、最も多く参照されるスケールである。これらの疎水性スケールは、アミノ酸残基の相対疎水性についてのランキングリストを提供する。例えば、親水性に寄与するアミノ酸には、Arg(R)、Lys(K)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、Asn(N)、及びHis(H)、さらには、より低い程度ではあるが、Ser(S)、Thr(T)、Gly(G)、Pro(P)、Tyr(Y)、及びTrp(W)が含まれる。例えば、ポリグルタマート配列を使用して、タンパク質及び他の薬物分子の溶解性を増強することができる(それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるLilie et al,Biological Chemistry 394(8):995−1004(2013);Li et al.,Cancer Research 58:2404−2409(1998)))。
タンパク質またはアミノ酸配列の「ハイドロパシー指数(hydropathy index)」は、その平均親水性または疎水性を表す数値である。マイナスのハイドロパシー指数は、問題のアミノ酸配列の親水性を定義する。ハイドロパシー指数は、問題のアミノ酸配列の親水性に正比例するので;その指数がマイナスであるほど、その親水性は高い。特定の実施形態では、上記の付加される親水性アミノ酸配列は、0、−0.4、−0.9、−1.3、−1.6、−3.5、−3.9、または−4.5未満のハイドロパシー指数を有する。特定の実施形態では、得られるペプチド全体は、0.3、0.2、0.1、または0.0未満、好ましくは−0.1、−0.2、−0.3、−0.4未満、より好ましくは−0.5、−0.6、−0.7、−0.8、−0.9、または−1.0未満のハイドロパシー指数を有するであろう。
本発明のペプチドでは、ペプチド全体として、または付加される親水性アミノ酸配列のいずれかで、親水性のハイドロパシー指数に寄与するアミノ酸には、Arg(R)、Lys(K)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、Asn(N)、His(H)、Ser(S)、Thr(T)、Gly(G)、Pro(P)、Tyr(Y)、及びTrp(W)が含まれる。これらのうち、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、Asn(N)、またはそれらのバリアントが好ましい。例示的なバリアントには、Gluではg−グルタマート、及びAspではイソアスパラギン酸(またはイソD)が含まれる。
本明細書において使用する場合、本発明のこの態様及び他の態様では、「疎水性アミノ酸」という用語は、疎水性を指定アミノ酸配列のハイドロパシー指数に与えるアミノ酸を指すことが意図されている。疎水性のハイドロパシー指数に寄与するアミノ酸には、ペプチド全体として、またはその特定のアミノ酸配列のいずれかで、Ile(I)、Val(V)、Leu(L)、Phe(F)、Cys(C)、Met(M)、及びAla(A)が含まれる。特定の実施形態では、「疎水性アミノ酸」という用語は、Ile(I)、Val(V)、Leu(L)、Phe(F)、Cys(C)、Met(M)、及びAla(A)のいずれか1つ;または、別法では、Ile(I)、Val(V)、Leu(L)、Phe(F)、及びAla(A)のいずれか1つを指し得る。ある種の他の実施形態では、「疎水性アミノ酸」という用語は、Ile(I)、Val(V)、Leu(L)、及びPhe(F)の1つを指し得る。
本明細書において使用する場合、「非疎水性アミノ酸」という用語は、上記で同定した疎水性スケールの1つで、親水性である(または疎水性ではない)アミノ酸を意味することが意図されている。この用語は一般的に、ペプチド全体として、または付加される親水性アミノ酸配列のいずれかで、親水性のハイドロパシー指数に寄与するアミノ酸を指す。
本発明の一態様では、前記ペプチドは、
Figure 2017532981
のアミノ酸配列を含み、ここで、前記ペプチドは、システイン及びメチオニンを含まず、2、3、7、8、12、及び13位の各Xは、任意選択であり、かつ、存在する場合には任意のアミノ酸であり、4、9、及び14位の各X残基は、任意のアミノ酸であり、1、5、6、10、11、15、及び16位のJ残基の1〜3個が、非疎水性アミノ酸またはAであり(好ましくは、Aが存在する場合、1、5、6、10、15、または16位のうちの1つに存在する)、かつJ残基の他の全てが、L、I、V、またはFであり(好ましくはL、I、またはV);かつ前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。
特定の実施形態では、前記ペプチドは、アミノ酸配列
Figure 2017532981
を含まず、かつこれからなるものではない。これらのペプチドは、それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Haapalainen et al.,“Functional Mapping of Harpin HrpZ of Pseudomonas syringae Reveals the Sites Responsible for Protein Oligomerization,Lipid Interactions,and Plant Defence Induction,” Mol.Plant Pathol.12(2):151−66(2011)において同定されている。
一実施形態では、1、5、6、10、11、15、及び16位のJ残基の1〜3個が、非疎水性アミノ酸であり、かつ他の全てが好ましくはL、I、V、またはFである。特定の実施形態によると、1、5、6、10、11、15、及び16位のJ残基の2個以下が非疎水性である。別の実施形態では、1、5、6、10、11、15、及び16位のJ残基の1個以下が非疎水性である。
一実施形態では、J残基の1個以下がAであり、好ましくは、A残基が、1、5、6、10、15、及び16位のうち1つにあり;残りのJ残基の1または2個が、任意選択で非疎水性アミノ酸であり、かつ他の全てのJ残基が、L、I、V、またはFである。特定の実施形態では、J残基の1個以下がAであり、好ましくは、A残基が、1、5、6、10、15、及び16位のうち1つにあり;かつ他の全てのJ残基が、L、I、V、またはFである。
特定の実施形態では、1位の残基を5及び6位から、10及び11位から、ならびに15及び16位から分離するアミノ酸の数は、1〜3個のアミノ酸で変動し得る。一実施形態では、2及び3位のX残基の1個が存在しないか、7及び8位のX残基の1個が存在しないか、12及び13位のX残基の1個が存在しないか、またはこれらの位置のX残基のうち2個以上が存在しない。例えば、一実施形態では、2及び3位のX残基の1個、ならびに7及び8位のX残基の1個が存在しない。別の実施形態では、12位、13位、または両方の位置のX残基が存在しない。別の実施形態では、2及び3位のX残基の1個、7及び8位のX残基の1個、ならびに12及び13位のX残基の1個が存在しない。
別の実施形態では、2、3、7、及び8位のX残基のそれぞれが存在する(すなわち、前記ペプチドは、1位の残基を5及び6位の残基から、ならびに5及び6位の残基を10及び11位の残基から分離する3つのアミノ酸を含む)。別の実施形態では、12位のX残基が存在し、または12及び13位のX残基が存在する(すなわち、前記ペプチドは、10及び11位の残基を15及び16位の残基から分離する2または3つのアミノ酸を含む)。
上記の段落では、残基の番号付けがSEQ ID NO:1を参照しているが、ある特定の残基は任意選択であるため、J残基の実際の位置及び介在する残基は、いずれか1つの特定のペプチドが異なっていてよい。
この実施形態でのペプチド長は、アミノ酸100個未満、または別法では、アミノ酸90個未満、アミノ酸80個未満、アミノ酸70個未満、アミノ酸60個未満、またはアミノ酸約50個未満である。特定の実施形態では、ペプチド長は、12個から約50個のアミノ酸長である。
上記の実施形態では、SEQ ID NO:1の2、3、7、8、12位のそれぞれのX(存在する場合)が、任意のアミノ酸であり得る場合、特定の実施形態では、これらの残基は、Arg(R)、Lys(K)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、Asn(N)、Ser(S)、Thr(T)、Gly(G)、イソアスパラギン酸(イソD)、及びg−グルタマートからなる群から独立に選択され、4、9、及び13位の各X残基は、G、A、S、T、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、及びRからなる群から独立に選択される。
この実施形態では、当該単離されたペプチドは、水に溶解された場合に好ましくは安定しており;上記のとおり、pH緩衝液及び殺生物剤の存在下で、水性条件下で、化学的分解に対して抵抗性を有し;かつ/または少なくとも約1.0mg/mlの水溶液中での溶解度を有する。
本発明の第1の態様による例示的なペプチドは、下記の表1において同定されるアミノ酸配列を含む。
(表1)
Figure 2017532981
特定の実施形態では、これらのペプチドは、SEQ ID NO:19〜46のうち1つまたは複数のアミノ配列から本質的になるかまたはこれらからなる。
本発明の第1の態様による他の例示的なペプチドは、下記の表2において同定されるアミノ酸配列を含む。
(表2)
Figure 2017532981
特定の実施形態では、これらのペプチドは、SEQ ID NO:47〜68のうち1つまたは複数のアミノ配列から本質的になるかまたはこれらからなる。
本発明の第1の態様によるさらなる例示的なペプチドは、下記の表3において同定されるアミノ酸配列を含む。
(表3)
Figure 2017532981
表3では、ペプチドは、イタリック活字体によって示されている溶解性タグSEEEEEを含む。表3に示されている配列を含むがこの特定の溶解性タグを欠失する(または異なる溶解性タグを有する)ペプチドも、本明細書において企図される。
特定の実施形態では、これらのペプチドは、SEQ ID NO:69〜84のうち1つまたは複数のアミノ配列から本質的になるかまたはこれらからなる。
本発明の第1の態様のペプチドは、下記の表4において同定されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
(表4)
Figure 2017532981
表4では、ペプチドは、イタリック活字体によって示されている溶解性タグSEEEEEを含む。表4に示されている配列を含むがこの特定の溶解性タグを欠失する(または異なる溶解性タグを有する)ペプチドも、本明細書において企図される。
特定の実施形態では、これらのペプチドは、SEQ ID NO:85〜98のうち1つまたは複数のアミノ配列から本質的になるかまたはこれらからなる。
本発明の第1の態様の別の実施形態では、ペプチドは、下記の表5において同定されるアミノ酸配列を含む。
(表5)
Figure 2017532981
表5では、ペプチドは、イタリック活字体によって示されている溶解性タグSEEEEEを含む。表5に示されている配列を含むがこの特定の溶解性タグを欠失する(または異なる溶解性タグを有する)ペプチドも、本明細書において企図される。
特定の実施形態では、これらのペプチドは、SEQ ID NO:99〜112のうち1つまたは複数のアミノ配列から本質的になるかまたはこれらからなる。
本発明の別の態様は、下記の表6に示すように、SEQ ID NO:113、114、117〜123、127、133〜138、140〜142、144、145、148〜150、及び153〜155のうちの1つのアミノ酸配列を含む単離されたペプチドに関する。
(表6)
Figure 2017532981
表6では、いくつかのペプチドは、イタリック活字体によって示されている、ポリEセグメントが3〜7個のGlu(E)残基を含有する溶解性タグS−ポリEを含む。表6に示されている配列を含むがこの特定の溶解性タグを欠失する(または異なる溶解性タグを有する)ペプチドも、本明細書において企図される。
特定の実施形態では、これらのペプチドは、SEQ ID NO:113、114、117〜123、127、133〜138、140〜142、144、145、148〜150、153〜159のうち1つまたは複数のアミノ配列から本質的になるかまたはこれらからなる。
本発明の別の態様は、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:2、修飾P1/P4コンセンサス)のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドに関し、ここで、
1位のXは、任意選択であり、かつS、N、D、イソD、G、A、またはSであり得;
2位のXは、任意選択であり、かつQ、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり得;
8位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
9位のXは、M、L、I、F、もしくはV、または非疎水性アミノ酸であり;
10位のXは、任意選択であり、かつDまたはイソDであり得;
11位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
12位のXは、M、L、I、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;
13位のXは、M、L、もしくはI、または非疎水性アミノ酸であり;
14位のXは、任意選択であり、かつ任意の親水性アミノ酸、S、T、D、イソD、K、またはQ、任意選択でAまたはCであり得;
15位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、S、K、またはIであり;
16位のXは、M、L、I、V、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;
17位のXは、M、L、I、A、もしくはV、または非疎水性アミノ酸であり;
18位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、S、M、T、またはKであり;
19位のXは、A、D、イソD、S、V、T、K、R、E、H、またはGであり;
20位のXは、M、L、またはIであり;
21位のXは、M、L、I、V、S、もしくはFであるか、またはセリン以外の非疎水性アミノ酸であり;
22位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、Sであり;
23位のXは、P、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;かつ
9、12、13、16、17、及び20位の残基の少なくとも1つは、非疎水性アミノ酸であるか、または21位の残基はセリン以外の非疎水性アミノ酸であり、かつ前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。
この実施形態では、当該単離されたペプチドは、水に溶解された場合に好ましくは安定しており;上記のとおり、pH緩衝液及び殺生物剤の存在下で、水性条件下で、化学的分解に対して抵抗性を有し;かつ/または少なくとも約1.0mg/mlの水溶液中での溶解度を有する。
本発明のこの態様によるペプチドの1つの例示的なファミリーは、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:3、修飾P4コンセンサス)のアミノ酸配列を有し、ここで、
2位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
8位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
9位のXは、M、S、L、A、I、V、もしくはFであるか、またはセリン以外の非疎水性アミノ酸であり;
11位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
12位のXは、L、I、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;
13位のXは、L、A、I、V、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;
14位のXは、任意の親水性アミノ酸であり;
15位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、S、K、またはIであり;
16位のXは、L、A、I、V、M、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;
17位のXは、M、I、S、もしくはFであるか、またはセリン以外の非疎水性アミノ酸であり;
18位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
20位のXは、M、L、I、V、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;
21位のXは、M、L、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;かつ
22位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
9、12、13、16、20、及び21位の残基の1個は、非疎水性アミノ酸もしくはAであるか、または17位の残基はセリン以外の非疎水性アミノ酸であり、前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。好ましくは、9、12、13、16、20、及び21位の残基の1〜4個、3個以下、2個以下、もしくは正確には1個が、非疎水性アミノ酸であるか、または17位の残基が、セリン以外の非疎水性アミノ酸である。
特定の実施形態では、SEQ ID NO:2によるこれらのペプチドはまた、SEQ ID NO:1のペプチドを定義する構造的特徴も兼ね備えており、この場合、メチオニン及びシステイン残基は存在しない。したがって、これらの実施形態では、14位のXは、メチオニン以外またはシステイン以外の任意の親水性アミノ酸、好ましくはSまたはTであり得る。
SEQ ID NO:3とコンセンサス構造を共有するか、またはSEQ ID NO:3に由来する、例示的なペプチドを、下記の表7において同定している。
(表7)ペプチドP4(コンセンサス SEQ ID NO:3)のペプチドバリアント
Figure 2017532981
ある特定の他の実施形態では、当該単離されたペプチドは、SEQ ID NO:48〜56、58、59、61及び161〜163の1つまたは複数のアミノ酸配列から本質的になるかまたはこれらからなる。
この実施形態では、当該単離されたペプチドは、水に溶解された場合に好ましくは安定しており;上記のとおり、pH緩衝液及び殺生物剤の存在下で、水性条件下で、化学的分解に対して抵抗性を有し;かつ/または少なくとも約1.0mg/mlの水溶液中での溶解度を有する。
本発明のこの態様によるペプチドの別の例示的なファミリーは、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:4、修飾P1コンセンサス)のアミノ酸配列を有し、ここで、
1位のXは、N、D、イソD、G、A、またはSであり;
2位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
8位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
11位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
15位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
18位のXは、M、T、K、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
22位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
23位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;かつ
9、12、13、16、17、20、及び21位のJは、これらの位置のアミノ酸のうちの1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、及びFから選択される疎水性アミノ酸であり、前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。好ましくは、9、12、13、16、17、20、及び21位の残基の1〜4個、3個以下、2個以下、または正確には1個が、非疎水性アミノ酸またはAである。一実施形態では、J残基の1個以下がAであり、好ましくは、A残基は、9、12、13、16、20、及び21位のうちの1つにあり;残りのJ残基の1または2個が、任意選択で非疎水性アミノ酸であり、かつ他の全てのJ残基が、L、I、V、またはFである。特定の実施形態では、J残基の1個以下がAであり、好ましくは、A残基は、9、12、13、16、20、及び21位のうちの1つにあり;他の全てのJ残基が、L、I、V、またはFである。
特定の実施形態では、SEQ ID NO:4によるこれらのペプチドはまた、SEQ ID NO:1のペプチドを定義する構造的特徴も兼ね備えており、この場合、メチオニン及びシステイン残基は存在しない。したがって、これらの実施形態では、18位のXは、T、K、E、g−グルタマート、G、A、またはSである。
この実施形態では、当該単離されたペプチドは、水に溶解された場合に好ましくは安定しており;上記のとおり、pH緩衝液及び殺生物剤の存在下で、水性条件下で、化学的分解に対して抵抗性を有し;かつ/または少なくとも約1.0mg/mlの水溶液中での溶解度を有する。
SEQ ID NO:4とコンセンサス構造を共有する例示的なペプチドを、下記の表8において同定している。
(表8)P1(コンセンサス SEQ ID NO:4)のペプチドバリアント
Figure 2017532981
これらのペプチドのさらなるバリアントは、上記のように、メチオニンの18位でのT、K、E、g−グルタマート、G、A、またはSによる置換を含んでいてよい。
ある種の他の実施形態では、当該単離されたペプチドは、SEQ ID NO:164、166〜179の1つまたは複数のアミノ酸配列から本質的になるかまたはこれらからなる。
この実施形態では、当該単離されたペプチドは、水に溶解された場合に好ましくは安定しており;上記のとおり、pH緩衝液及び殺生物剤の存在下で、水性条件下で、化学的分解に対して抵抗性を有し;かつ/または少なくとも約1.0mg/mlの水溶液中での溶解度を有する。
本発明のまた別の態様は、
(i)3位のXは、N、D、またはイソDであり;
6位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
8位のXが、N、D、またはイソDであり;
15位のXが、任意選択であり、かつ任意のアミノ酸であり得;
18位のXが、M、E、g−グルタマート、G、A、S、T、またはKであり;
22位のXが、任意選択であり、かつQ、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり得;かつ
9、12、13、16、17、20、及び21位のJが、これらの位置のアミノ酸の少なくとも1つが非疎水性アミノ酸であることを除いては、L、V、I、F、及びAから選択される疎水性アミノ酸である、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:5、修飾P15b/P20コンセンサス)、あるいは
(ii)7位のXが、任意選択であり、かつ任意のアミノ酸であり得;
10位のXが、M、E、g−グルタマート、G、A、S、T、またはKであり;
14位のXが、任意選択であり、かつQ、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり得;かつ
1、4、5、8、9、12、及び13位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、及びFから選択される疎水性アミノ酸である、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:6、修飾P15/20minコンセンサス)
のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドに関し、かつ
前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。好ましくは、SEQ ID NO:5の9、12、13、16、17、20、及び21位の残基の1〜4個、3個以下、2個以下、または正確には1個が、非疎水性アミノ酸またはAであり;SEQ ID NO:6の1、4、5、8、9、12、及び13位の残基の1〜4個、3個以下、2個以下、または正確には1個が、非疎水性アミノ酸またはAである。一実施形態では、J残基の1個以下がAであり、好ましくは、A残基は、SEQ ID NO:5の9、12、13、16、20、及び21位、またはSEQ ID NO:6の1、4、5、8、12、及び13位のうちの1つにあり;残りのJ残基の1または2個が、任意選択で非疎水性アミノ酸であり、かつ他の全てのJ残基が、L、I、V、またはFである。特定の実施形態では、J残基の1個以下がAであり、好ましくは、A残基は、SEQ ID NO:5の9、12、13、16、20、及び21位、またはSEQ ID NO:6の1、4、5、8、12、及び13位のうちの1つにあり;他の全てのJ残基が、L、I、V、またはFである。
SEQ ID NO:5または6とコンセンサス構造を共有する例示的なペプチドを、下記の表9において同定している。
(表9)P15/20(コンセンサス SEQ ID NO:5または6)のペプチドバリアント
Figure 2017532981
これらのペプチドのさらなるバリアントは、上記のように、メチオニンの18位でのE、g−グルタマート、G、A、S、T、またはKによる置換を含んでいてよい。
ある種の他の実施形態では、当該ペプチドは、SEQ ID NO:180〜193の1つまたは複数のアミノ酸配列から本質的になるかまたはこれらからなる。
この実施形態では、当該単離されたペプチドは、水に溶解された場合に好ましくは安定しており;上記のとおり、pH緩衝液及び殺生物剤の存在下で、水性条件下で、化学的分解に対して抵抗性を有し;かつ/または少なくとも約1.0mg/mlの水溶液中での溶解度を有する。
本発明のさらなる一態様は、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:7、修飾P6/6aコンセンサス)のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドに関し、ここで、
6位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
9位のXは、M、E、g−グルタマート、G、A、S、T、またはKであり;
10位のXは、HまたはNであり;
14位のXは、E、g−グルタマート、D、またはイソDであり;
17位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
19位のXは、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;かつ
4、7、8、11、12、15、及び16位のJは、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、M、及びFから選択される疎水性アミノ酸であり、
ここで、前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。好ましくは、4、7、8、11、12、15、及び16位の残基の1〜4個、3個以下、2個以下、または正確には1個が、非疎水性アミノ酸またはAである。一実施形態では、J残基の1個以下がAであり、好ましくは、A残基は、SEQ ID NO:7の4、7、8、11、15、及び16位のうちの1つにあり;残りのJ残基の1または2個が、任意選択で非疎水性アミノ酸であり、かつ他の全てのJ残基が、L、I、V、M、またはFである。特定の実施形態では、J残基の1個以下がAであり、好ましくは、A残基は、SEQ ID NO:7の4、7、8、11、15、及び16位のうちの1つにあり;他の全てのJ残基が、L、I、V、M、またはFである。
SEQ ID NO:7とコンセンサス構造を共有する例示的なペプチドを、下記の表10において同定している。
(表10)P6/6a(コンセンサス SEQ ID NO:7)のペプチドバリアント
Figure 2017532981
これらのペプチドのさらなるバリアントは、上記のように、メチオニンの7位でのL、I、V、F、非疎水性アミノ酸、またはAによる置換;及び、上記のように、メチオニンの9位でのL、E、g−グルタマート、G、A、S、T、またはKによる置換を含んでいてよい。
ある種の他の実施形態では、当該単離されたペプチドは、SEQ ID NO:194〜207の1つまたは複数のアミノ酸配列から本質的になるかまたはこれらからなる。
この実施形態では、当該単離されたペプチドは、水に溶解された場合に好ましくは安定しており;上記のとおり、pH緩衝液及び殺生物剤の存在下で、水性条件下で、化学的分解に対して抵抗性を有し;かつ/または少なくとも約1.0mg/mlの水溶液中での溶解度を有する。
本発明の別の態様は、
(i)1位のXが、Q、N、D、E、g−グルタマート、イソD、またはSであり得;
2位のXが、D、E、g−グルタマート、イソDであり得;
3位のXが、P、D、E、イソD、またはg−グルタマートであり得;
4位のXが、M、A、S、D、E、イソD、またはg−グルタマートであり得
5位のXが、Q、E、またはg−グルタマートであり得;
6位のXが、A、E、またはg−グルタマートであり得;
8位のXが、M、L、E、Q、D、N、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
9位のXが、Q、N、E、D、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
12位のXが、Q、N、E、D、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
13位のXが、Q、N、E、D、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
16位のXが、K、Q、N、E、D、R、G、A、またはSであり得;かつ
7、10、11、14、15、17、及び18位のJが、これらの位置のアミノ酸の少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、及びFから選択される疎水性アミノ酸である、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:8、修飾P14dコンセンサス)、あるいは
(ii)2位のXが、M、L、E、Q、D、N、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
3位のXが、Q、N、E、D、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
6位のXが、Q、N、E、D、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
7位のXが、Q、N、E、D、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
10位のXが、K、Q、N、E、D、R、G、A、またはSであり得;かつ
1、4、5、8、9、11、及び12位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、及びFから選択される疎水性アミノ酸である、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:9、修飾P14d minコンセンサス)
のアミノ酸配列を有するペプチドに関し、ここで、前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。好ましくは、SEQ ID NO:8の7、10、11、14、15、17、及び18位の残基の1〜4個、3個以下、2個以下、または正確には1個が、非疎水性アミノ酸またはAであり;SEQ ID NO:9の1、4、5、8、9、11、及び12位の残基の1〜4個、3個以下、2個以下、または正確には1個が、非疎水性アミノ酸またはAである。一実施形態では、J残基の1個以下がAであり、好ましくは、A残基は、SEQ ID NO:8の7、10、11、14、17、及び18位またはSEQ ID NO:9の1、4、5、8、11、及び12位のうちの1つにあり;残りのJ残基の1または2個が、任意選択で非疎水性アミノ酸であり、かつ他の全てのJ残基が、L、I、V、またはFである。特定の実施形態では、J残基の1個以下がAであり、好ましくは、A残基は、SEQ ID NO:8の7、10、11、14、17、及び18位またはSEQ ID NO:9の1、4、5、8、11、及び12位のうちの1つにあり;他の全てのJ残基が、L、I、V、またはFである。
SEQ ID NO:8または9とコンセンサス構造を共有する例示的なペプチドを、下記の表11において同定している。
(表11)P14d(コンセンサス SEQ ID NO:8または9)のペプチドバリアント
Figure 2017532981
これらのペプチドのさらなるバリアントは、上記のように、メチオニンの4及び8位の一方または両方でのL、E、Q、D、N、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートによる置換を含んでいてよい。
ある特定の他の実施形態では、当該単離されたペプチドは、SEQ ID NO:208〜221の1つまたは複数のアミノ酸配列から本質的になるかまたはこれらからなる。
この実施形態では、当該単離されたペプチドは、水に溶解された場合に好ましくは安定しており;上記のとおり、pH緩衝液及び殺生物剤の存在下で、水性条件下で、化学的分解に対して抵抗性を有し;かつ/または少なくとも約1.0mg/mlの水溶液中での溶解度を有する。
本発明のさらなる一態様は、
(i)2位のXが、Q、N、E、g−グルタマート、D、イソD、T、S、A、またはGであり得;
3位のXが、K、Q、N、E、g−グルタマート、D、イソD、T、S、A、またはGであり得;
6位のXが、K、Q、N、E、g−グルタマート、D、イソD、T、S、A、またはGであり得;
9位のXが、E、g−グルタマート、D、イソD、Q、N、T、S、A、またはGであり得;
10位のXは、A、G、S、T、E、g−グルタマート、D、イソD、Q、またはNであり得;かつ
1、4、5、7、8、10、及び11位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、F、及びMから選択される疎水性アミノ酸である、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:10、修飾P25コンセンサス)、あるいは
(ii)2位のXが、T、S、A、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、またはNであり得;
3位のXが、G、T、S、A、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、またはNであり得;
6位のXが、Q、N、E、g−グルタマート、D、イソD、T、S、A、またはGであり得;
7位のXが、K、Q、N、E、g−グルタマート、D、イソD、T、S、A、またはGであり得;
10位のXが、K、Q、N、E、g−グルタマート、D、イソD、T、S、A、またはGであり得;
13位のXが、E、g−グルタマート、D、イソD、Q、N、T、S、A、またはGであり得;
14位のXが、A、G、S、T、E、g−グルタマート、D、イソD、Q、またはNであり得;
1、4、5、8、9、11、12、及び15位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、F、及びMから選択される疎水性アミノ酸であり;かつ
16位のJが、任意選択であり、L、V、I、及びFから選択される疎水性アミノ酸である、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:11、修飾P25コンセンサス)
のアミノ酸配列を有するペプチドに関し、ここで、前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。好ましくは、SEQ ID NO:10の1、4、5、7、8、10、及び11位の残基の1〜4個、3個以下、2個以下、または正確には1個が、非疎水性アミノ酸であり、SEQ ID NO:11の1、4、5、8、9、11、12、15、及び16位の残基の1〜4個、3個以下、2個以下、または正確には1個が、非疎水性アミノ酸である。一実施形態では、J残基の1個以下がAであり、好ましくは、A残基は、SEQ ID NO:10の1、4、5、7、10、及び11位、またはSEQ ID NO:11の1、4、5、8、11、12、15、及び16位のうちの1つにあり;残りのJ残基の1または2個が、任意選択で非疎水性アミノ酸であり、かつ他の全てのJ残基が、L、I、V、またはFである。特定の実施形態では、J残基の1個以下がAであり、好ましくは、A残基は、SEQ ID NO:10の1、4、5、7、10、及び11位、またはSEQ ID NO:11の1、4、5、8、11、12、15、及び16位のうちの1つにあり;他の全てのJ残基が、L、I、V、またはFである。
SEQ ID NO:10または11とコンセンサス構造を共有する例示的なペプチドを、下記の表12において同定している。
(表12)P25(コンセンサス SEQ ID NO:10または11)のペプチドバリアント
Figure 2017532981
これらのペプチドのさらなるバリアントは、上記のように、メチオニンの13位でのL、V、I、及びFによる置換を含んでいてよい。
ある種の他の実施形態では、当該単離されたペプチドは、SEQ ID NO:222〜239の1つまたは複数のアミノ酸配列から本質的になるかまたはこれらからなる。
この実施形態では、当該単離されたペプチドは、水に溶解された場合に好ましくは安定しており;上記のとおり、pH緩衝液及び殺生物剤の存在下で、水性条件下で、化学的分解に対して抵抗性を有し;かつ/または少なくとも約1.0mg/mlの水溶液中での溶解度を有する。
本発明のさらに別の態様は、
(i)1位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
2位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
3位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはP、Q、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
4位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはI、Q、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、N、イソD、K、またはRであり得;
5位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはD、イソD、S、E、g−グルタマート、A、T、G、N、Q、K、またはRであり得;
6位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはR、Q、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、またはKであり得;
7位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
8位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはT、Q、S、E、g−グルタマート、A、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
9位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはI、Q、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
10位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはE、g−グルタマート、Q、S、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
11位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
13位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはA、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
14位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、N、K、またはRであり得;
17位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはA、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
18位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、N、K、またはRであり得;
21位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり得;
22位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはS、A、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
25位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはS、A、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
26位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはP、S、A、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
27位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、S、A、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、N、K、またはRであり得;かつ
12、15、16、19、20、23、及び24位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、F、及びMから選択される疎水性アミノ酸である、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:12、修飾P17/18)、
あるいは
(ii)2位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはA、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
3位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、N、K、またはRであり得;
6位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはA、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
7位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、N、K、またはRであり得;
10位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり得;
11位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはS、A、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;かつ
1、4、5、8、9、12、及び13位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、F、及びMから選択される疎水性アミノ酸である、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:13、修飾P17/18minコンセンサス)
のアミノ酸配列を有するに関し、ここで、前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。好ましくは、SEQ ID NO:12の12、15、16、19、20、23、及び24位の残基の1〜4個、3個以下、2個以下、または正確には1個が、非疎水性アミノ酸またはAであり;SEQ ID NO:13の1、4、5、8、9、12、及び13の残基の1〜4個、3個以下、2個以下、または正確には1個が、非疎水性アミノ酸またはAである。一実施形態では、J残基の1個以下がAであり、好ましくは、A残基は、SEQ ID NO:12の12、15、16、19、23、及び24位、またはSEQ ID NO:13の1、4、5、8、12、及び13位のうちの1つにあり;残りのJ残基の1または2個が、任意選択で非疎水性アミノ酸であり、かつ他の全てのJ残基が、L、I、V、F、またはMである。特定の実施形態では、J残基の1個以下がAであり、好ましくは、A残基は、SEQ ID NO:12の12、15、16、19、23、及び24位、またはSEQ ID NO:13の1、4、5、8、12、及び13位のうちの1つにあり;他の全てのJ残基が、L、I、V、F、またはMである。
SEQ ID NO:12または13とコンセンサス構造を共有するか、またはSEQ ID NO:12もしくは13に由来しかつSEQ ID NO:1のコンセンサス構造をも兼ね備えている、例示的なペプチドを、下記の表13において同定している。
(表13)P17/P18(コンセンサス SEQ ID NO:12または13)のペプチドバリアント
Figure 2017532981
表13では、ペプチドは、イタリック活字体によって示されている溶解性タグSEEEEEを含む。表13に示されている配列を含むがこの特定の溶解性タグを欠失する(または異なる溶解性タグを有する)ペプチドも、本明細書において企図される。
ある種の他の実施形態では、当該単離されたペプチドは、SEQ ID NO:85〜98の1つまたは複数のアミノ酸配列から本質的になるかまたはこれらからなる。
この実施形態では、当該単離されたペプチドは、水に溶解された場合に好ましくは安定しており;上記のとおり、pH緩衝液及び殺生物剤の存在下で、水性条件下で、化学的分解に対して抵抗性を有し;かつ/または少なくとも約1.0mg/mlの水溶液中での溶解度を有する。
本発明のまた別の態様は、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:14、修飾P19コンセンサス)のアミノ酸配列を有するペプチドに関し、ここで、
1位のXは、任意選択であり、かつL、I、V、F、またはMであり得;
3位のXは、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり得;
4位のXは、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはA、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
7位のXは、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり得;
10位のXは、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはA、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
11位のXは、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはR、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはKであり得;かつ
2、5、6、8、9、12、及び13位のJは、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、F、及びMから選択される疎水性アミノ酸であり、
ここで、前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。好ましくは、2、5、6、8、9、12、及び13位の残基の1〜4個、3個以下、2個以下、または正確には1個が、非疎水性アミノ酸である。一実施形態では、J残基の1個以下がAであり、好ましくは、A残基は、SEQ ID NO:14の2、5、6、8、12、及び13位のうちの1つにあり;残りのJ残基の1または2個が、任意選択で非疎水性アミノ酸であり、かつ他の全てのJ残基が、L、I、V、F、またはMである。特定の実施形態では、J残基の1個以下がAであり、好ましくは、A残基は、SEQ ID NO:14の2、5、6、8、12、及び13位のうちの1つにあり;他の全てのJ残基が、L、I、V、F、またはMである。
SEQ ID NO:14の1つとコンセンサス構造を共有するか、またはSEQ ID NO:14の1つに由来しかつSEQ ID NO:1のコンセンサス構造を兼ね備えている、例示的なペプチドを、下記の表14において同定している。
(表14)P19(コンセンサス SEQ ID NO:14)のペプチドバリアント
Figure 2017532981
表14では、ペプチドは、イタリック活字体によって示されている溶解性タグSEEEEEを含む。表14に示されている配列を含むがこの特定の溶解性タグを欠失する(または異なる溶解性タグを有する)ペプチドも、本明細書において企図される。
特定の実施形態では、当該単離されたペプチドは、SEQ ID NO:99〜112のアミノ酸配列から本質的になるかまたはこれらからなる。
この実施形態では、当該単離されたペプチドは、水に溶解された場合に好ましくは安定しており;上記のとおり、pH緩衝液及び殺生物剤の存在下で、水性条件下で、化学的分解に対して抵抗性を有し;かつ/または少なくとも約1.0mg/mlの水溶液中での溶解度を有する。
本発明のさらなる一態様は、
Figure 2017532981
(SEQ ID NO:126、P3ミニマム)のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドに関し、ここで、
3位のXは、任意の親水性アミノ酸、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり;
6位のXは、任意の親水性アミノ酸、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり;
7位のXは、任意の親水性アミノ酸、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり;かつ
及びZの一方が存在し、ただし好ましくは両方ではなく、ZはLXX−を含み、ここで各Xは、親水性アミノ酸、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり、かつ、Zは−XXLFを含み、ここで各Xは親水性アミノ酸、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり、
ここで、前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。
一実施形態では、ZではなくZが存在する。代替の実施形態では、ZではなくZが存在する。
SEQ ID NO:126とコンセンサス構造を共有するか、またはSEQ ID NO:126に由来しかつSEQ ID NO:1のコンセンサス構造を兼ね備えている、例示的なペプチドを、下記の表15において同定している。
(表15)P3(コンセンサス SEQ ID NO:126)のペプチドバリアント
Figure 2017532981
表15では、ペプチドは、イタリック活字体によって示されている溶解性タグSEEE、SEEEE、及びSEEEEEEを含む。表15に示されている配列を含むがこの特定の溶解性タグを欠失する(または異なる溶解性タグを有する)ペプチドも、本明細書において企図される。
特定の実施形態では、当該単離されたペプチドは、SEQ ID NO:156〜159のアミノ酸配列から本質的になるかまたはこれらからなる。
この実施形態では、当該単離されたペプチドは、水に溶解された場合に好ましくは安定しており;上記のとおり、pH緩衝液及び殺生物剤の存在下で、水性条件下で、化学的分解に対して抵抗性を有し;かつ/または少なくとも約1.0mg/mlの水溶液中での溶解度を有する。
本発明の別の態様は、
Figure 2017532981
のアミノ酸配列を有する単離されたペプチドに関し、ここで、前記ペプチドは、システイン及びメチオニンを含まず;2、3、6、7位の各Xは、任意のアミノ酸であり、かつ前記ペプチドは、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない。
特定の実施形態では、2、3、6、及び7位の1つまたは複数におけるXが、非疎水性アミノ酸であり、2、3、6、及び7位の2個以上におけるXが、非疎水性アミノ酸であり、2、3、6、及び7位の3個以上におけるXが、非疎水性アミノ酸であるか、または2、3、6、及び7位の各々におけるXが、非疎水性アミノ酸である。この実施形態では、非疎水性アミノ酸は、独立に、G、A、S、T、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、及びRのいずれか1つであってよい。
本発明のこの態様によるペプチドは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、2015年10月1日に提出された、同時係属のPCT出願PCT/US15/53387号、タイトル“Hypersensitive Response Elicitor Peptides and Use Thereof”に記載されているボHRックス配列の短縮化によって一般に表されている。このように、当該ペプチドの終端またはHRボックス配列の部分を形成するアミノ酸残基の置換のいずれかによるHRボックス配列の短縮化により、この態様による単離されたペプチドは、
Figure 2017532981
のアミノ酸配列を含まず、ここで、2、3、6、7、10、11位の各Xは、任意のアミノ酸である。
SEQ ID NO:116とコンセンサス構造を共有する例示的なペプチドを、下記の表16において同定している。
(表16)
Figure 2017532981
表16では、ペプチドは、イタリック活字体によって示されている溶解性タグSEEEE及びSEEEEEを含む。表15に示されている配列を含むがこの特定の溶解性タグを欠失する(または異なる溶解性タグを有する)ペプチドも、本明細書において企図される。
特定の実施形態では、当該単離されたペプチドは、SEQ ID NO:115、124、128〜132、139、143、146、147、151、152、及び160のアミノ酸配列から本質的になるかまたはこれらからなる。
この実施形態では、当該単離されたペプチドは、水に溶解された場合に好ましくは安定しており;上記のとおり、pH緩衝液及び殺生物剤の存在下で、水性条件下で、化学的分解に対して抵抗性を有し;かつ/または少なくとも約1.0mg/mlの水溶液中での溶解度を有する。
本発明の単離されたペプチドはまた、ペプチド結合を介して本発明のペプチドにカップリングしている第2のアミノ酸配列を追加で含む融合ペプチドの形態で提供することができる。当該第2のアミノ酸配列は、精製を支援するが、後で除去することができる、すなわち、回収後に当該ペプチドから切断することができるポリ−ヒスチジン(His−)、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST−)、またはマルトース結合タンパク質(MBP−)などの精製タグであり得る。プロテアーゼ特異的切断部位または化学的特異的切断部位(すなわち、切断可能なリンカー配列において)を精製タグと所望のペプチドとの間に導入することができる。プロテアーゼ特異的切断部位は、文献において周知であり、これらには、限定ではないが、リシンの後で切断されるエンテロキナーゼ特異的切断部位(Asp)−Lys;アルギニンの後で切断されるファクターXa特異的切断部位Ile−(GluまたはAsp)−Gly−Arg;Lys及びArgの後で切断されるトリプシン特異的切断部位;ならびにGenenase(商標)I特異的切断部位Pro−Gly−Ala−Ala−His−Tyrが含まれる。薬品及びそれらの特異的切断部位には、限定ではないが、メチオニン(Met)残基で切断する臭化シアン(CNBr);トリプトファン(Trp)残基で切断するBNPS−スカトール;アスパラギン酸−プロリン(Asp−Pro)ペプチド結合で切断するギ酸;アスパラギン−グリシン(Asn−Gly)ペプチド結合で切断するヒドロキシルアミン;及びシステイン(Cys)残基で切断する2−ニトロ−5−チオシアノ安息香酸(NTCB)が含まれる(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるCrimmins et al.,“Chemical Cleavage of Proteins in Solution,” Curr.Protocol.Protein Sci.,Chapter 11:Unit 11.4(2005)を参照されたい)。これらの切断方法の1つを使用するために、変異によって、望ましくない切断部位を所望のペプチド配列内から除去することが必要であり得る。例えば、P14−22E,26E−R(SEQ ID NO:23)が、トリプシンとの適合性のために変異されており:9位のリシン残基が、グルタマートに変異され、C末端アルギニンが、理論トリプシン切断の生成物を表すために付加されている。切断された精製タグを除去するために、所望のペプチド生成物をさらに精製することができる。
本発明の単離されたペプチドはまた、上記の種類の切断可能なアミノ酸配列の形態を取っても、または取らなくてもよい、リンカー配列によって一緒に連結された本発明の多数のペプチド配列を含む融合ペプチドの形態で提供し得る。そのような多量体融合タンパク質は、精製タグを含んでも、または含まなくてもよい。一実施形態では、各単量体配列は、第1の切断可能なペプチド配列によって本発明のペプチドに連結された精製タグを含むことができ;複数個の単量体配列は、第2の切断可能なペプチド配列によって、隣接する単量体配列に連結することができる。したがって、多量体融合タンパク質の発現では、すなわち、宿主細胞における発現では、第2の切断可能なペプチド配列を切断し、それによって、精製タグを含む個々の単量体ペプチド配列を放出するために有効なプロテアーゼまたは薬品で、回収した融合タンパク質を処理することができる。親和性精製では、第1の切断可能なペプチド配列を切断し、それによって、問題のペプチドから精製タグを放出するために有効なプロテアーゼまたは薬品で、回収された単量体ペプチド配列を処理することができる。後者は、下記のとおりのゲル濾過及び/またはHPLCを使用してさらに精製することができる。
これらの融合タンパク質は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Haapalainen et al.,“Functional Mapping of Harpin HrpZ of Pseudomonas syringae Reveals the Sites Responsible for Protein Oligomerization、Lipid Interactions、and Plant Defence Induction,” Mol.Plant Pathol.12(2):151−66(2011)において以前に同定された、SEQ ID NO:15〜18として上記で同定されている配列を含んでいてよい。
1つの手法によれば、本発明のペプチドは、標準的なペプチド合成操作によって合成することができる。これらには、限定ではないが、Applied Biosystems 431A、433Aシンセサイザー、及びPeptide Technologies Symphonyまたは大規模SonataもしくはCEM Liberty自動固相ペプチドシンセサイザーを含む自動固相ペプチド合成機器で実施することができる、FMOC(9−フルオレニルメチルオキシ−カルボニル)及びtBoc(tert−ブチルオキシ−カルボニル)合成プロトコールの両方が含まれる。代替のペプチド合成機器の使用も企図される。固相合成を使用して調製されたペプチドは、実質的に純粋な形態で回収される。
本発明のペプチドを、組換え発現システムの使用、これに続く、組換えによって調製されたペプチドの分離及び精製によって調製してもよい。一般的に、これは、コード核酸分子を、その分子が異種である(すなわち、通常は存在しない)発現システムに挿入することを含む。本発明のペプチドをコードする1種または複数種の所望の核酸分子をベクターに挿入してもよい。適正なセンス(5’−3’)配向、ならびにプロモーター及び任意の他の5’及び3’調節分子に対して正確なリーディングフレームで、異種の核酸分子を発現システムまたはベクターに挿入する。細菌及び植物宿主における発現のための代表的なヌクレオチド配列が、下記の表17に含まれている。
(表17)
Figure 2017532981
本明細書において列挙したコードされるアミノ酸配列及び所望の形質転換生体の知識によって、日常以内の技能で、追加のコドン最適化DNA配列及びRNA配列を作製することができる。
DNAコンストラクトによる本発明のペプチドまたは融合ポリペプチドの発現(転写及び翻訳を含む)を、発現レベル、発現が起こる組織タイプ、及び/または発現の発生段階に関して調節してよい。DNAコンストラクトの発現を制御するために、いくつかの異種の制御配列(例えば、プロモーター及びエンハンサー)が利用可能である。これらには、構成、誘導性、及び制御可能プロモーター、さらには、組織−または一過性−特異的手法で発現を制御するプロモーター及びエンハンサーが含まれる。例示的な構成プロモーターには、ラズベリーE4プロモーター(それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,783,393号及び同第5,783,394号)、ノパリンシンターゼ(NOS)プロモーター(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるEbert et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84:5745−5749(1987))、オクトピンシンターゼ(OCS)プロモーター(アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の腫瘍誘導プラスミドに担持される)、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)19Sプロモーターなどのカリモウイルスプロモーター(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるLawton et al.,Plant Mol.Biol.9:315−324(1987))、及びCaMV 35Sプロモーター(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるOdell et al.,Nature 313:810−812(1985))、ゴマノハグサモザイクウイルス35S−プロモーター(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,378,619号)、リブロース−1,5−ビス−ホスファートカルボキシラーゼの小さなサブユニット(ssRUBISCO)に由来する光誘導性プロモーター、Adhプロモーター(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるWalker et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84:6624−6628(1987))、スクロースシンターゼプロモーター(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるYang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)87:4144−4148(1990))、R遺伝子複合体プロモーター(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるChandler et al.,Plant Cell 1:1175−1183(1989))、クロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子プロモーター、CsVMVプロモーター(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるVerdaguer et al.,Plant Mol Biol.,37:1055−1067(1998))、及びメロンアクチンプロモーター(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるPCT公開WO00/56863)が含まれる。例示的な組織特異的プロモーターには、トマトE4及びE8プロモーター(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,859,330号)及びトマト2AII遺伝子プロモーター(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるVan Haaren et al.,Plant Mol Bio.,21:625−640(1993))が含まれる。
好ましい一実施形態では、DNAコンストラクトの発現は、その発現が初期種子及び/または胚発生に関連する遺伝子からの制御配列の制御下にある。実際に、好ましい一実施形態では、使用するプロモーターは、種子エンハンスト(seed−enhanced)プロモーターである。そのようなプロモーターの例には、ナピンなどの遺伝子に由来する5’制御領域(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるKridl et al.,Seed Sci.Res.1:209:219(1991))、グロブリン(それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるBelanger and Kriz,Genet.129:863−872(1991)、GenBank アクセッション番号L22295)、ガンマゼインZ 27(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるLopes et al.,Mol Gen Genet.247:603−613(1995))、L3オレオシンプロモーター(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第6,433,252号)、ファセオリン(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるBustos et al.,Plant Cell 1(9):839−853(1989))、アルセリン5(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2003/0046727号)、ダイズ7Sプロモーター、7Saプロモーター(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2003/0093828号)、ダイズ7Sαβコングリシニンプロモーター、7Sαプロモーター(それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるBeachy et al.,EMBO J.4:3047(1985);Schuler et al.,Nucleic Acid Res.10(24):8225−8244(1982))、ダイズトリプシン阻害物質(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるRiggs et al.,Plant Cell 1(6):609−621(1989))、ACP(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるBaerson et al.,Plant Mol.Biol.,22(2):255−267(1993))、ステアロイル−ACPデサチュラーゼ(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるSlocombe et al.,Plant Physiol.104(4):167−176(1994))、β−コングリシニンのダイズa’サブユニット(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるChen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.83:8560−8564(1986))、Vicia faba USP(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2003/229918号)、及びZea mays L3オレオシンプロモーター(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるHong et al.,Plant Mol.Biol.,34(3):549−555(1997))が含まれる。
例えば、ホスホラミダイト方法、及び保護された2’−デオキシヌクレオシドに由来するホスホラミダイト構成単位を使用する固相合成によって、本発明のペプチドをコードする核酸分子を調製することができる。所望のオリゴヌクレオチドを得るために、構成単位を、生成物の配列が必要とする順番で、成長中のオリゴヌクレオチド鎖に順にカップリングさせる。鎖アセンブリが完了したら、生成物を固相から溶液に放出し、脱保護し、収集し、典型的にはHPLCを使用して精製する。固相合成の限界は、アミノ酸約65個またはそれ未満の規模でペプチドをコードする最高約200nt長のオリゴヌクレオチドを調製するために適している。発現ベクターへの合成オリゴヌクレオチドのライゲーションを容易にするために、特異的制限酵素切断部位を含むように、合成オリゴヌクレオチドの末端を設計することができる。
より長いペプチドでは、固相合成によって、オリゴヌクレオチドを調製し、次いで、様々な技術を使用して、合成オリゴヌクレオチド配列を一緒にライゲーションさせることができる。全合成遺伝子を作製するための組換え技術は、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるHughes et al.,“Chapter Twelve − Gene Synthesis:Methods and Applications,” Methods in Enzymology 498:277−309(2011)において概説されている。
適切な発現ベクターを選択したら、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs Laboratory,Cold Springs Harbor,N.Y.(1989)、またはCohen及びBoyerに対する米国特許第4,237,224号において記載されているとおり、当技術分野において標準的なクローニング手順を使用して、所望の核酸配列をベクターにクローニングする。次いで、ベクターを適切な宿主に導入する。
本発明のペプチドを組換え発現するために、様々な宿主−ベクターシステムを利用してよい。主に、ベクターシステムは、使用される宿主と適合可能である必要がある。宿主−ベクターシステムには、限定ではないが、次が含まれる:バクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNAを用いて形質転換された細菌;酵母ベクターを含有する酵母などの微生物;ウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど)に感染した哺乳類細胞システム;ウイルス(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞システム;及びアグロバクテリウム(Agrobacterium)に感染した植物細胞。これらのベクターの発現要素は、それらの強度及び特異性において様々である。利用する宿主−ベクターシステムに応じて、本発明のこの態様及び他の態様を実施するために、いくつかの適切な転写及び翻訳要素のいずれか1つを使用することができる。
精製ペプチドを、いくつかの方法によって得ることができる。当該ペプチドを好ましくは、慣用の技術によって、精製形態(好ましくは少なくとも約80%または85%純粋、より好ましくは少なくとも約90%または95%純粋)で生成する。組換え宿主細胞が、当該ペプチドを成長培地に分泌するように作製されているかどうかに応じて(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるBauer et al.に対する米国特許第6,596,509号を参照されたい)、遠心分離(分泌されたペプチドを含有する上清から細胞成分を分離するため)、これに続く、上清の連続硫酸アンモニウム沈殿によって、当該ペプチドを単離及び精製することができる。当該ペプチドを含有する画分を、適切にサイジングされたデキストランまたはポリアクリルアミドカラムにおけるゲル濾過に掛けて、他のタンパク質から当該ペプチドを分離する。必要な場合には、当該ペプチド画分をHPLCによってさらに精製してもよい。
別法では、問題のペプチドが分泌されなければ、標準的な単離及び精製スキームを使用して、組換え細胞から単離することができる。これは、細胞の破壊(例えば、音波処理、凍結、フレンチプレスなどによる)、次いで、細胞デブリからのペプチドの回収を含む。上記の遠心分離、沈殿、及び精製手順を使用して、精製を達成することができる。上記の精製タグを使用することで、このプロセスを簡略にすることができる。
特定の実施形態では、精製は必要ない。精製を行わない場合には、細胞デブリを除去するための遠心の後に、細胞非含有溶解産物を回収することができる。得られた細胞非含有溶解産物を、回収された画分中のあらゆる天然プロテアーゼを失活化させるために十分な量の時間にわたって熱で、例えば、10分間にわたって100℃で処理することができる。所望の場合には、1種または複数種の生物致死剤、プロテアーゼ阻害物質、及び非イオン性界面活性剤を、そのような細胞非含有調製物に導入することができる(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるWeiに対する米国特許出願公開第20100043095号を参照されたい)。
本発明のペプチドを回収したら、担体と、殺菌剤または生物致死剤、プロテアーゼ阻害物質、非イオン性界面活性剤、肥料、除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、生物学的接種物、植物調節物質、及びそれらの混合物からなる群から選択される1種または複数種の添加剤とを含む組成物を調製するために、それらを使用することができる。
特定の実施形態では、当該組成物は、ペプチド約1nM超、ペプチド約10nM超、ペプチド約20nM超、ペプチド約30nM超、ペプチド約40nM超、ペプチド約50nM超、ペプチド約60nM超、ペプチド約70nM超、ペプチド約80nM超、ペプチド約90nM超、ペプチド約100nM超、ペプチド約150nM超、ペプチド約200nM超、またはペプチド約250nM超を含む。特定の実施形態では、当該組成物は、ペプチド約1nM未満を含む。例えば、ある種のペプチドは、約2ng/ml未満、約1.75ng/ml未満、約1.5ng/ml未満、約1.25ng/ml未満、約1.0ng/ml未満、約0.75ng/ml未満、約0.5ng/ml未満、約0.25ng/ml未満、またはなお約0.1ng/ml未満の濃度で存在し得る。
適切な担体には、水、任意選択で1種または複数種の補助溶媒を含有する水溶液、スラリー、及び固体担体粒子が含まれる。例示的な固体担体には、鉱物土、例えば、シリケート、シリカゲル、タルク、カオリン、石灰石、石灰、チョーク、油粘土、黄土、粘土、ドロマイト、珪藻土、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、粉砕合成材料、及び植物由来の生成物、例えば、穀類粒、樹皮粒、木材粒及び堅果殻粒、セルロース粉末、デンプン及びデンプン誘導体、さらには、他の単糖、二糖、及び多糖が含まれる。
適切な肥料には、限定ではないが、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、及びそれらの組合せが含まれる。
適切な殺虫剤には、限定ではないが、イミジクロプリド、クロチアニジン、及びチアメトキサムなどのネオニコチド群のメンバー;クロルピリホス及びマラチオンなどのオルガノフォスファート群のメンバー;ペルメトリンなどのピレスロイド群のメンバー;ニコチン、ノルニコチン、及びピレスリンなどの他の天然殺虫剤;アルジカルブ、カルボフラン、及びカルバリルなどのカルバマート群のメンバー;様々なアバメクチン、アベルメクチン、及びイベルメクチン生成物などの大環状ラクトン群のメンバー;クロラントラニリプロール、シアントラニリプロール、及びフルベンジアミドなどのジアミド群のメンバー;キチン合成阻害物質、特に、ルフェヌロン及びジフルベンズロンなどのベンゾイル尿素群のもの;ならびに2種以上、3種以上、または4種以上の殺虫剤を含むそれらの任意の組合せが含まれる。追加の殺虫剤は、Compendium of Pesticide Common Namesにおいて列挙されており、これは、Alan Woodによって運営されているデータベースであり、alanwood.netインターネットサイトにおいて電子形態で利用可能である。
適切な殺真菌剤には、限定ではないが、アゾキシストロビン、ピラクロストロビン、トリフロキシストロビン、ピコキシストロビン、及びフルオキサストロビンなどのストロビルリン群のメンバー;イプコナゾール、メトコナゾール、テブコナゾール、トリチコナゾール、テトラコナゾール、ジフェノコナゾール、フルトリアホール、プロピコナゾールアゾール、及びプロチオコナゾールなどのトリアゾール群のメンバー;カルボキシン、フルキサピロキサド、ボスカリド、及びセダキサンなどのコハク酸デヒドロゲナーゼ群のメンバー:メタラキシル、メフェノキサム、ベナラキシル、及びオキサジキシルなどのフェニルアミド群のメンバー;フルジオキソニルなどのフェニルピロール群のメンバー;カプタンなどのフタルイミド群のメンバー;マンコゼブ及びチラムなどのジチオカルバマート群のメンバー;チアベンダゾールなどのベンゾイミダゾール群のメンバー;ならびに2種以上、3種以上、または4種以上の殺真菌剤を含むそれらの任意の組合せが含まれる。追加の殺真菌剤は、Compendium of Pesticide Common Namesにおいて列挙されており、これは、Alan Woodによって運営されているデータベースであり、alanwood.netインターネットサイトにおいて電子形態で利用可能である。
適切な殺線虫剤には、限定ではないが、アルジカルブ、アルドキシカルブ、オキサミル、カルボフラン、及びクレオトカルブ(cleothocarb)などのカルバマート群の薬品;ならびにチオナジン、エトプロホス、フェナミホス、フェンスルホチオン、テルブホス、イサゾホス、及びエブホスなどのオルガノフォスファート群の薬品が含まれる。追加の殺線虫剤は、Compendium of Pesticide Common Namesにおいて列挙されており、これは、Alan Woodによって運営されているデータベースであり、alanwood.netインターネットサイトにおいて電子形態で利用可能である。
適切な殺菌剤には、限定ではないが、ジクロロフェン及びベンジルアルコールヘミホルマールに基づくもの(ICI製のProxel(登録商標)、またはThor Chemie製のActicide(登録商標)RS、及びRohm & Haas製のKathon(登録商標)MK)、ならびにアルキルイソチアゾリノン及びベンゾイソチアゾリノンなどのイソチアゾリノン誘導体(Thor Chemie製のActicide(登録商標)MBS;ICI製のProxel(登録商標)GXL)が含まれる。追加の殺菌剤は、Compendium of Pesticide Common Namesにおいて列挙されており、これは、Alan Woodによって運営されているデータベースであり、alanwood.netインターネットサイトにおいて電子形態で利用可能である。
適切な接種物には、限定ではないが、ブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)属、特に、ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobium japonicum)(BASF Vault(登録商標)製品)、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・フィルムス(Bacillus firmus)、バチルス・プミリス(Bacillus pumilis)、ストレプトマイセス・リディカス(Streptomyces lydicus)、トリコデルマ(Trichoderma)属、パスツリア(Pasteuria)属、根粒菌細胞の他の培養物(BASF Nodulator(登録商標)及びRhizo−Flo(登録商標))、ならびに2種以上、3種以上、または4種以上の接種物を含むそれらの任意の組合せが含まれる。
植物調節物質は、植物生化学的シグナル伝達を刺激または阻害する天然また合成の化学物質である。これらは、もっぱらではないが、通常、細胞表面上の受容体によって認識されて、細胞において反応カスケードを引き起こす。適切な植物調節物質には、限定ではないが、エテホン;エチレン;サリチル酸;アセチルサリチル酸;ジャスモン酸;ジャスモン酸メチル;ジヒドロジャスモン酸メチル;キチン;キトサン;アブシジン酸;これらだけに限定されないが(4−クロロフェノキシ)酢酸、(2,4−ジクロロフェノキシ)酢酸、及び2,3,5−トリヨード安息香酸を含む任意のオーキシン化合物または阻害物質;これらだけに限定されないが、カイネチン及びゼアチンを含む任意のサイトキニン;ジベレリン;ブラシノリド;ならびに2種以上、3種以上、または4種以上の調節物質の組合せを含むそれらの任意の組合せが含まれる。
他の適切な添加剤には、緩衝剤、湿潤剤、コーティング剤、及び研磨剤が含まれる。これらの物質を使用して、本発明による組成物の適用を容易にすることができる。加えて、当該組成物を、他の従来の種子用配合物、ならびに粘土及び多糖を含む処理物質と共に、植物種子に適用することができる。
植物種子を処理するために使用される組成物またはシステムは、本発明のペプチドの1種または複数種、専らではないが、好ましくは、ペプチドp4−14s−9a(SEQ ID NO:57)、p4−14s−12d(SEQ ID NO:59)、p14(SEQ ID NO:113)、p14a(SEQ ID NO:114)、p14−22E,26E(SEQ ID NO:23)、p1−29(SEQ ID NO:130)、及びp4−14S−16S(SEQ ID NO:55)の1種または複数種を、複数種の殺虫剤、または複数種の殺線虫剤、複数種の殺真菌薬、複数種の他の接種物、または複数種の植物調節物質の組合せを含む1種または複数種の殺虫剤、殺線虫剤、殺真菌薬、他の接種物、または他の植物調節物質と組み合わせて含む。これらの併用処理のための適切な殺虫剤、殺線虫剤、殺真菌薬、接種物、及び植物調節物質には、上記で同定したものが含まれる。これらの組成物を、種子処理のときに単一の組成物の形態で提供する。対照的に、種子処理のために使用されるシステムは、複数回の処理を伴うことがあり、例えば、当該ペプチドを含有する組成物を1回の処理において使用し、かつ1種または複数種の殺虫剤、殺線虫剤、殺真菌薬、植物調節物質、及び/または殺菌剤を含有する組成物を別の処理において使用する。後者の実施形態では、これらの処理を両方とも、ほぼ同時に、すなわち、植付け前に、またはほぼ植付け時に実施する。
そのような一例は、ペプチドp4−14s−9a(SEQ ID NO:57)、p4−14s−12d(SEQ ID NO:59)、p14(SEQ ID NO:113)、p14a(SEQ ID NO:114)、p14−22E,26E(SEQ ID NO:23)、p1−29(SEQ ID NO:130)、及びp4−14S−16S(SEQ ID NO:55)の1種または複数種(限定ではない)を含む1種または複数種の本発明のペプチドを、Bayer Crop Scienceから入手可能なPoncho(商標)(クロチアニジン)、Bayer Crop Scienceから入手可能なPoncho(商標)VOTiVO(クロチアニジン及びバチルス・フィルムス生物学的殺線虫剤)、及びBayer Crop Scienceから入手可能なGaucho(商標)(イミジクロプリド)の1種と組み合わせて含む。
別の例は、ペプチドp4−14s−9a(SEQ ID NO:57)、p4−14s−12d(SEQ ID NO:59)、p14(SEQ ID NO:113)、p14a(SEQ ID NO:114)、p14−22E,26E(SEQ ID NO:23)、p1−29(SEQ ID NO:130)、及びp4−14S−16S(SEQ ID NO:55)の1種または複数種(限定ではない)を含む1種または複数種の本発明のペプチドを、Syngentaから入手可能なCruiser(商標)(チアメトキサム)、Syngentaから入手可能なCruiserMaxx(商標)(チアメトキサム、メフェノキサム、及びフルジオキシニル)、Syngentaから入手可能なCruiser Extreme(商標)(チアメトキサム、メフェノキサム、フルジオキシニル、及びアゾオキシストロビン)、Syngentaから入手可能なAvicta(商標)(チアメトキサム及びアバメクチン)、及びAvicta(商標)Complete(チアメトキサム、アバメクチン、及びSyngentaから入手可能な、パスツリア・ニシザワ(Pasteuria nishizawae)−Pn1生物学的接種物を含有するClariva Complete(商標))、及びSyngentaから入手可能なAvicta Complete(商標)Corn(チアメトキサム、メフェノキサム、フルジオキシニル、アゾキシストロビン、チアベンダゾール、及びアバメクチン)の1種と組み合わせて含む。
別の例は、ペプチドp4−14s−9a(SEQ ID NO:57)、p4−14s−12d(SEQ ID NO:59)、p14(SEQ ID NO:113)、p14a(SEQ ID NO:114)、p14−22E,26E(SEQ ID NO:23)、p1−29(SEQ ID NO:130)、及びp4−14S−16S(SEQ ID NO:55)の1種または複数種(限定ではない)を含む1種または複数種の本発明のペプチドを、BASFから入手可能なVault Liquid plus Integral(ブラディリゾビウム属及び枯草菌株MBI 600接種物)、BASFから入手可能なVault NP(ブラディリゾビウム・ジャポニクム接種物)、及びBASFから入手可能なSubtilex NG(枯草菌生物学的接種物)の1種と組み合わせて含む。
本発明はさらに、植物に病害抵抗性を付与し、植物成長を増進させ、害虫制御を行い(昆虫及び線虫を含む)、植物に生物的もしくは非生物的ストレス耐性を付与し、かつ/または植物生化学的シグナル伝達をモジュレートする方法に関する。これらの方法は、有効量の本発明の単離されたペプチド、または本発明の組成物を、植物もしくは植物種子にまたは植物が成長している場所もしくは成長すると予測される場所に適用することを含む。そのような適用の結果として、当該ペプチドは、植物の細胞または植物種子と接触し、植物または植物種子から成長する植物において病害抵抗性、成長増進、生物的ストレスに対する耐性、非生物的ストレスに対する耐性、または生化学的シグナル伝達の変化を誘導する。別法では、そのような植物から回収された種子自体も、病害抵抗性を植物において付与し、植物成長を増進させ、昆虫制御に影響を及ぼし、生物的もしくは非生物的ストレスに対する耐性を付与し、かつ/または生化学的シグナル伝達をモジュレートすることができるように、本発明のペプチドまたは組成物を植物に適用することができる。
これらの実施形態では、本発明の単離されたペプチドまたは組成物を適用する植物もしくは植物種子、または場所を選択することも可能である。例えば、高い線虫含量を含むことが分かっている用地では、本明細書に記載のとおりの本発明の単離されたペプチドまたは組成物を適用することによって、そのような用地において成長させる植物もしくは植物種子、または用地(場所)を選択的に処理することができるが;低い線虫含量を含む用地で成長させる植物または植物種子では、そのような処理は必要ないことがある。同様に、潅漑の少ない用地では、本明細書に記載のとおりの本発明の単離されたペプチドまたは組成物を適用することによって、そのような用地で成長させる植物もしくは植物種子、または用地(場所)を選択的に処理することができるが;適切な潅漑を有する用地で成長させる植物または植物種子では、そのような処理は必要ないことがある。同様に、灌水を受けやすい用地では、本明細書に記載のとおりの本発明の単離されたペプチドまたは組成物を適用することによって、そのような用地で成長させる植物もしくは植物種子、または用地(場所)を選択的に処理することができるが;灌水を受けにくい用地で成長させる植物または植物種子では、そのような処理は必要ないことがある。そのような選択のまた別の例として、成長期の特定期間に昆虫の攻撃を受けやすい用地では、本明細書に記載のとおりの本発明の単離されたペプチドまたは組成物を適用することによって、そのような用地で成長させる植物もしくは植物種子、または用地(場所)を選択的に処理することができるが;その同じ用地を、成長期の無効な期間には処理しなくてよいか、またはそのような攻撃を受けにくい他の用地は、未処理でよい。本明細書に記載の使用方法、すなわち、植物に病害抵抗性を付与し、植物成長を増進させ、害虫制御を行い(昆虫及び線虫を含む)、植物に生物的もしくは非生物的ストレス耐性を付与し、かつ/または植物生化学的シグナル伝達をモジュレートする方法のそれぞれを実施するときに、そのような選択ステップを実施することができる。
植物に病害抵抗性を付与し、植物成長をもたらし、昆虫を制御し、ストレス抵抗性を付与し、かつ/または植物または種子から成長した植物に対する生化学的シグナル伝達をモジュレートするために、単離されたペプチドまたはそれを含有する組成物を植物または植物種子に適用する代わりに、形質転換植物または植物種子を利用することができる。形質転換植物を利用する場合には、これは、本発明のペプチドをコードするDNA分子を用いて形質転換された形質転換植物を提供すること、及び、植物にそのDNA分子が病害抵抗性を付与し、植物成長を増進させ、昆虫を制御し、かつ/または生物的もしくは非生物的ストレスに対する耐性を付与することを可能にするために有効な条件下で、その植物を成長させることを含む。別法では、本発明のペプチドをコードするDNA分子を用いて形質転換された形質転換植物種子を提供し、土壌に植え付けることができる。次いで、そのDNA分子が当該ペプチドを発現しかつそれによって、形質転換植物に病害抵抗性を付与することを可能にするため、植物成長を増進させることを可能にするため、昆虫を制御することを可能にするため、及び/または生物的もしくは非生物的ストレスに対する耐性を付与することを可能にするために有効な条件下で、植え付けられた種子から植物を繁殖させる。
これらの実施形態では、本発明を実施するために形質転換植物または植物種子を選択することもできる。例えば、高い線虫含量を含むことが分かっている用地では、当該形質転換植物または植物種子をそのような用地で選択的に成長させることができるが;低い線虫含量分を含む用地では、非形質転換植物または植物種子を成長させることができる。同様に、潅漑の少ない用地では、当該形質転換植物または植物種子をそのような用地で選択的に成長させることができるが;適切な潅漑を有する用地では、非形質転換植物または植物種子を成長させることができる。同様に、灌水を受けやすい用地では、当該形質転換植物または植物種子をそのような用地で成長させることができるが;灌水を受けにくい用地では、非形質転換植物または植物種子を成長させることができる。そのような選択のまた別の例として、成長期の特定期間に昆虫の攻撃を受けやすい用地では、当該形質転換植物または植物種子をそのような用地で成長させることができるが;そのような昆虫の攻撃を受けにくい用地では、非形質転換植物または植物種子を成長させることができる。本明細書に記載の使用方法、すなわち、植物に病害抵抗性を付与し、植物成長を増進させ、害虫制御を行い(昆虫及び線虫を含む)、植物に生物的もしくは非生物的ストレス耐性を付与し、かつ/または植物生化学的シグナル伝達をモジュレートする方法のそれぞれを実施するときに、そのような選択ステップを実施することができる。
本発明はさらに、観賞植物から取り出された切り出し部分での乾燥抵抗性、植物から収穫された果実もしくは野菜への収穫後病害抵抗性もしくは収穫後乾燥抵抗性、及び/または植物から収穫された果実もしくは野菜についての果実もしくは野菜の成熟の寿命の改善を改善する方法に関する。これらの方法は、有効量の本発明の単離されたペプチドまたは本発明による組成物を、植物または植物が成長している場所に適用することを含む。そのような適用の結果として、当該ペプチドは、植物の細胞または植物種子と接触し、観賞植物から取り出された切り出し部分での乾燥抵抗性、植物から収穫された果実もしくは野菜への収穫後病害抵抗性もしくは収穫後乾燥抵抗性、及び/または植物から収穫された果実もしくは野菜についての果実もしくは野菜の成熟の寿命の改善を誘導する。別法では、有効量の本発明の単離されたペプチドまたは本発明による組成物を、収穫された果実または野菜に適用することができる。そのような適用の結果として、当該ペプチドは、収穫された果実または野菜の細胞に接触し、かつ処理された果実もしくは野菜への収穫後病害抵抗性もしくは収穫後乾燥抵抗性、及び/または処理された果実もしくは野菜についての果実もしくは野菜の成熟の寿命の改善を誘導する。
これらの実施形態では、本発明の単離されたペプチドまたは組成物を適用する植物、切り出し部分、果実、野菜、または場所を選択することも可能である。例えば、長距離輸送されるかまたは長期貯蔵される、収穫された切り出し部分または果実もしくは野菜では、これらを、本明細書に記載のとおりの本発明の単離されたペプチドまたは組成物を適用することによって選択的に処理することができるが;現地輸送され、実質的に貯蔵期間なしで消費されることが意図されている収穫された切り出し部分または果実もしくは野菜では、そのような処理を排除することができる。
観賞植物から取り出された切り出し部分への乾燥抵抗性、植物から収穫された果実もしくは野菜への収穫後病害抵抗性もしくは収穫後乾燥抵抗性、及び/または植物から収穫された果実もしくは野菜についての果実もしくは野菜の成熟の寿命の改善を誘導するために、単離されたペプチドまたはそれを含有する組成物を植物または植物種子に適用する代わりに、形質転換植物または植物種子を利用することができる。形質転換植物を利用する場合には、これは、本発明のペプチドをコードするDNA分子を用いて形質転換された形質転換植物を提供すること、及びそのDNA分子が、観賞植物から取り出された切り出し部分での乾燥抵抗性、形質転換植物から収穫された果実もしくは野菜への収穫後病害抵抗性もしくは収穫後乾燥抵抗性、及び/または形質転換植物から収穫された果実もしくは野菜についての果実もしくは野菜の成熟の寿命の改善を誘導することを可能にするために有効な条件下で、その植物を成長させることを含む。別法では、本発明のペプチドをコードするDNA分子を用いて形質転換された形質転換植物種子を提供し、土壌に植え付けることができる。次いで、そのDNA分子が当該ペプチドを発現しかつそれによって、観賞植物から取り出された切り出し部分での乾燥抵抗性、形質転換植物から収穫された果実もしくは野菜への収穫後病害抵抗性もしくは収穫後乾燥抵抗性、及び/または形質転換植物から収穫された果実もしくは野菜についての果実もしくは野菜の成熟の寿命の改善を誘導することを可能にするために有効な条件下で、植え付けられた種子から植物を繁殖させる。
これらの実施形態では、本発明を実施するために、形質転換植物または植物種子を選択することも可能である。例えば、収穫された切り出し部分または果実もしくは野菜が長距離輸送されることまたは収穫後に長期貯蔵されることが意図されていることが分かっている場合には、形質転換植物または植物種子を成長のために選択することができるが;収穫された切り出し部分または果実もしくは野菜が現地輸送され、かつ/または実質的に貯蔵期間なしで消費されることが意図されていることが分かっている場合には、非形質転換植物または植物種子を成長のために選択することができる。
適切な植物には、天然形態または遺伝的に改変された形態であってもなくても、農業用植物、造林用植物、観賞植物、及び園芸用植物を含む双子葉植物及び単子葉植物が含まれる。例示的な植物には、限定ではないが、アルファルファ、リンゴ、アプリコット、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ、ブナ(ファーグス(Fagus)種)、ベゴニア、カバノキ、ブラックベリー、ブルーベリー、キャベツ、クスノキ(camphor)、キャノーラ、ニンジン、トウゴマ、サクラ、ニッケイ、柑橘類、ココア豆、コーヒー、トウモロコシ、綿、キュウリ、ウリ、ユーカリ、モミ、亜麻、飼料ビート、フクシア、ニンニク、フウロソウ、ブドウ、ラッカセイ、***、ホップ、ザイフリボク、ジュンセア(juncea)(セイヨウカラシナ(Brassica juncea))、黄麻、レンズマメ、レタス、アマニ、メロン、マスタード、ネクタリン、オーク、オートムギ、アブラヤシ、アブラナ、オリーブ、タマネギ、パプリカ、エンドウ、モモ、セイヨウナシ、ペラルゴニウム、コショウ、ペチュニア、パイン(ピヌス(Pinus)種)、プラム、ポプラ(ポプルス(Populus)種)、仁果類、ジャガイモ、セイヨウアブラナ、ラズベリー、イネ、ゴムノキ、ライ麦、モロコシ、ダイズ、ホウレンソウ、トウヒ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、チャノキ、チークノキ、タバコ、トマト、ライコムギ、芝生、スイカ、コムギ及びヤナギ(サリクス(Salix)種)、アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)、セントポーリア、ポインセチア、キク、カーネーション、及びジニアが含まれる。
生化学的シグナル伝達の変更に関して、これは、ある種の植物生化学経路の増強及びある種の他の植物生化学経路の減弱の両方を含む。本発明によって変更することができる生化学的シグナル伝達経路には、遺伝子発現及びタンパク質産生、代謝産物の産生、及びシグナル伝達分子/二次代謝産物の産生が含まれる。例示的な生化学的シグナル伝達経路及びそれらの変更には、限定ではないが、酸化窒素産生、過酸化物産生、及び他の二次代謝産物の誘導;エチレンシグナル伝達経路のアゴニスト及びエチレン応答遺伝子発現の誘導(それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるDong et al.,Plant Phys.136:3628−3638(2004);Li et al.,Planta 239:831−46(2014);Chang et al.,PLoS One 10,e0125498(2015)を参照されたい);サリチル酸シグナル伝達経路のアゴニスト及びサリチル酸応答遺伝子発現の誘導(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるDong et al.,Plant J.20:207−215(1999)を参照されたい);アブシジン酸経路のアゴニスト及びアブシジン酸応答遺伝子発現の誘導(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるDong et al.,Planta 221:313−327(2005)を参照されたい);ジベレリンシグナル伝達経路のアゴニスト及びジベレリン応答遺伝子発現の誘導(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるLi et al.,Planta 239:831−46(2014)を参照されたい);ジャスモン酸シグナル伝達のアンタゴニスト及びジャスモン酸応答遺伝子の発現の阻害(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるDong et al.,Plant Phys.136:3628−3638(2004)を参照されたい);プロテアーゼ阻害物質発現の誘導(それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるLaluk and Mengiste,Plant J.68:480−494(2011);Xia et al.,Chin.Sci.Bull 56:2351−2358(2011)を参照されたい);植物組織における活性酸素種産生の誘導;限定ではないが、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、キチナーゼ、及びβ−1,3−グルカナーゼなどの免疫関連ペプチド及び抗微生物ペプチドの産生の誘導(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるWang et al.,J.Agric.Food Chem.59:12527−12533(2011));ならびにエキスパンシンの遺伝子発現及び産生の誘導(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるLi et al.,Planta 239:831−46(2014)を参照されたい)が含まれる。
病害抵抗性に関して、感染に対する絶対免疫は与えられ得ないが、病害の重症度は低下し、症状の発生は遅延する。病変数、病変サイズ、及び真菌病原体の胞子形成の規模がすべて減少する。病害抵抗性を付与するこの方法は、以前は処理できなかった病害を処理し、経費のために別々に処理されことができなかった病害を組織的に処理し、かつ感染因子または環境的に有害な物質の使用を回避する可能性を有する。
本発明による、植物に病原体抵抗性を付与する方法は、ウイルス、細菌、及び真菌を含む広範囲の様々な病原体に対する抵抗性を付与する際に有用である。特に、本発明の方法によって、次のウイルスに対する抵抗性を達成することができる:タバコモザイクウイルス及びトマトモザイクウイルス。本発明の方法によれば、特に次の細菌に対する抵抗性も植物に付与することができる:病原性シュードモナス属、病原性エルウィニア属、病原性キサントモナス属、及び病原性ラルストニア属。本発明の方法を使用することによって、植物を、特に次の真菌に対して抵抗性にすることができる:フザリウム(Fusarium)属及びフィトフトラ(Phytophthora)属。
植物成長を増進させる本発明のペプチドまたは組成物の使用に関して、植物成長の増進または促進の様々な形態を達成することができる。これを、植物成長が種子から始まる初期に、または植物寿命の後期に起こすことができる。例えば、本発明による植物成長は、より多い収量、植物活力の増大、実生活力の増大(すなわち、発芽後)、植物重量の増加、生物量の増加、植物1個当たりの花数の増加、より多い穀物及び/または果実収量、生じる種子数の上昇、発芽種子のパーセンテージの上昇、発芽速度の上昇、植物サイズの増大、植物高さの減少(小麦で)、より大きな生物量、より多く大きな果実、より早い果実の着色、より早い蕾、果実及び植物の成熟、より多い分げつまたは側枝(side shoot)、より大きな葉、葉の老化の遅延、シュート成長の増大、根成長の増大、根/シュート配置の変化、タンパク質含量の増加、油含量の増加、炭水化物含量の増加、色素含量の増加、クロロフィル含量の増加、総光合成の増大、光合成効率の増大、呼吸の減少(より少ないO利用)、収量低下処理の補償、茎の耐久性の増大(及び茎倒伏に対する抵抗性)、根の耐久性の増大(及び根倒伏に対する抵抗性)、少ない光条件下でのより良好な植物成長、及びそれらの組合せを包含する。結果として、本発明は、著しい経済的な利益を栽培者にもたらす。例えば、早い発芽及び早い成熟は、そうでなければ、その地域では短い成長期間によって、それらの成長が不可能であろう地域で、作物が成長することを可能にする。種子発芽のパーセンテージの上昇は、作物の株立ち(crop stand)の改善及びより効率的な種子の使用をもたらす。より多い収量、サイズの増大、及び生物量生成の増大は、所定の一区画の土地から、より大きな収入の発生を可能にする。
害虫(これらだけに限定されないが、生物的ストレッサーである昆虫及び線虫を含む)を制御するための本発明のペプチドまたは組成物の使用に関して、そのような害虫制御には、害虫が本発明のペプチドまたは組成物を適用されている植物と接触することを予防すること、食害による植物への直接的な損害を予防すること、害虫をそのような植物から離れさせること、そのような植物の近くで害虫を死滅させること、そのような植物を食べる昆虫の幼虫に干渉すること、害虫が宿主植物に住みつくのを予防すること、住みついた昆虫が植物毒素を放出することを予防すること、宿主植物上での卵の付着に干渉することなどが包含される。本発明はまた、害虫感染から生じる植物へのその後の病害損害を予防する。
本発明は、広範囲の様々な昆虫(生物的ストレッサー)に対して有効である。ヨーロッパアワノメイガは、トウモロコシ(デントコーン(dent corn)及びスイートコーン)の主な害虫であるが、他にも、サヤインゲン、インゲンマメ、及びライマビーンならびに食用大豆、コショウ、ジャガイモ、ならびにトマト、さらに、多くの雑草種を含む200種を超える植物種を食べる。広範囲の様々な野菜作物に損害を与える追加の昆虫幼虫の摂食害虫には、次のものが含まれる:ビートアワヨトウ、イラクサギンウワバ、アメリカタバコガ、ツマジロクサヨトウ、コナガ、キャベツハナバエ、タマネギバエ、タネバエ、ピックルワーム(メロンワーム)、ペッパーマゴット(pepper maggot)、及びトマト蟯虫(tomato pinworm)。総じて、この群の昆虫害虫は、全世界で野菜生産にとって最も経済的に重要な群の害虫である。本発明は、別の群の経済的に重要な生物的ストレッサーである線虫に対しても有効である。ダイズシスト線虫(ヘテロデラ・グリシネス(Heterodera glycines))は、ダイズの主な害虫である。レニフォーム線虫(Reniform Nematode)(ロチレンクラス・レニフォルミス(Rotylenchulus reniformis))は、綿の主な害虫であり、同様に、追加の作物種、特にダイズ及びトウモロコシに寄生し得る。追加の線虫害虫には、メロイドジーネ(Meloidogyne)属のネコブセンチュウ(特に、綿、コムギ、及びオオムギにおいて)、ヘテロデラ属のムギシストセンチュウ(特に、ダイズ、コムギ、及びオオムギにおいて)、プラチレンクス(Pratylenchus)属のネグサレセンチュウ、アングイナ(Anguina)属のタネコブセンチュウ(特に、コムギ、オオムギ、及びライムギ)、及びディチレンクス(Ditylenchus)属のクキセンチュウが含まれる。他の生物的ストレッサーには、クモ類、雑草、及びそれらの組合せが含まれる。
植物に非生物的ストレス抵抗性を付与するための本発明のペプチドまたは組成物の使用に関して、そのような非生物的ストレスには、植物生理学及び発生に対して有害作用を有する任意の環境因子が包含される。そのような環境ストレスの例には、気候関連ストレス(例えば、干ばつ、洪水、霜、低温、高温、過剰な光、及び光不足)、大気汚染ストレス(例えば、二酸化炭素、一酸化炭素、二酸化硫黄、NO、炭化水素、オゾン、紫外線照射、酸性雨)、薬品(例えば、殺虫剤、殺真菌薬、除草剤、重金属)、栄養ストレス(例えば、肥料、微量栄養素、多量栄養素、特に、カリウム、窒素誘導体、及びリン誘導体の過剰または不足)、及び傷に対する治癒応答の改善が含まれる。本発明のペプチドの使用は、植物にそのような形態の環境ストレスに対する抵抗性を付与する。
本発明のさらなる一態様は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるMannに対する米国特許出願公開第20150218099号において記載されているとおりの、水域において水性雑草を制御するための、1種または複数種の活性薬剤と組み合わせた毒性緩和剤としての本発明のペプチドの使用(すなわち、1種の組成物で、または別々の組成物で)に関する。
本発明のまた別の態様は、水潅漑が減少した条件下で育てられる植物に適用するための組成物中での、植物増強剤(plant strengthener)としての本発明のペプチドの使用に関し、その組成物はまた、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるRees et al.に対する米国特許出願公開第20130116119号において記載されているとおり、少なくとも1種の抗酸化剤及び少なくとも1種の照射管理剤(radiation manager)、及び任意選択で、少なくとも1種の植物成長調節物質を含む。
当該ペプチドまたは組成物の適用を含む本発明の方法は、葉、茎、根、栄養分体(例えば、切り出し部分)、果実などを含む植物の全体または一部を処理する場合には、様々な手順を介して実施することができる。これは、植物へのペプチドのインフィルトレーションを含んでもよい(ただし、必ずではない)。適切な適用方法には、高圧または低圧噴霧、注入、及びペプチド適用を行う付近での葉の研磨が含まれる。植物種子を処理する場合には、本発明の適用実施形態では、過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドを、低圧または高圧噴霧、コーティング、浸漬(例えば、ソーキング)、または注入によって適用することができる。当業者であれば、他の適切な適用手順を想像することができるが、ただし、過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質と、植物の細胞または植物種子とを効果的に接触させることができることを条件とする。本発明のペプチドまたは組成物で処理したら、種子を天然土壌または合成土壌に植え付け、かつ従来の手順を使用して栽培して、野菜を生産することができる。植物を、本発明によって処理された種子から繁殖させた後に、その植物を、本発明のペプチドまたは組成物の1回または複数回の適用で処理して、植物に病害抵抗性を付与し、植物成長を増進させ、植物上で昆虫を制御し、生物的もしくは非生物的ストレス耐性を付与し、取り出された切り出し部分の乾燥抵抗性を改善し、収穫された果実または野菜に収穫後病害抵抗性もしくは収穫後乾燥抵抗性を付与し、かつ/または収穫された果実もしくは野菜についての果実もしくは野菜の成熟の寿命を改善してよい。
本発明のペプチドまたは組成物は、本発明によって単独で、または他の物質との混合物で、植物または植物種子に適用することができる。別法では、当該ペプチドまたは組成物を、植物に別に適用することができ、他の物質を異なるときに適用する。
形質転換植物及び形質転換種子の使用を含む本発明の代替の実施形態では、本発明のペプチドを、局所的に植物または種子に適用する必要はない。代わりに、本発明のペプチドをコードするDNA分子を用いて形質転換された形質転換植物を、当技術分野において周知の手順によって生産する。組換えDNAを機械的に移すための微量ピペットを使用することによって、植物において発現させるために適したベクター(すなわち、植物において操作可能な翻訳及び転写調節配列を含む)を植物細胞に直接微量注入することができる。その全体が参照によって本明細書に組み込まれるCrossway,Mol.Gen.Genetics,202:179−85(1985)。ポリエチレングリコールを使用して、当該遺伝物質を植物細胞に移してもよい。その全体が参照によって本明細書に組み込まれるKrens,et al.,Nature,296:72−74(1982)。
本発明のペプチドをコードする遺伝子で植物細胞を形質転換するための別の手法は、宿主細胞の粒子衝撃(バイオリスティック形質転換(biolistic transformation)としても公知)である。これは、複数の方法の1つで達成することができる。その第1のものは、不活性かまたは生物学的に活性な粒子を細胞に推進することを含む。この技術は、参照によって本明細書に組み込まれるすべてSanford et al.に対する米国特許第4,945,050号、同第5,036,006号、及び同第5,100,792号において開示されている。一般的に、この手順は、細胞の外表面を貫通し、その内部に組み込むために有効な条件下で、不活性かまたは生物学的に活性な粒子を細胞に推進することを含む。不活性な粒子を利用する場合には、当該ベクターを、異種DNAを含有するベクターで粒子をコーティングすることによって、細胞に導入することができる。別法では、粒子の伴流によって当該ベクターが細胞に運び込まれるように、当該ターゲット細胞を当該ベクターで取り囲むことができる。生物学的に活性な粒子(例えば、ベクター及び異種DNAを含有する乾燥させた細菌細胞)を、植物細胞に推進することもできる。
導入のまた別の方法は、プロトプラストと他の実体、ミニ細胞、細胞、リソソーム、または他の可融製脂質表面体のいずれかとの融合である。その全体が参照によって本明細書に組み込まれるFraley、et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA、79:1859−63(1982)。
当該DNA分子を、電気穿孔によって植物細胞に導入してもよい。その全体が参照によって本明細書に組み込まれるFromm et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:5824(1985)。この技術では、植物プロトプラストを、発現カセットを含有するプラスミドの存在下で電気穿孔する。高電界強度の導電性インパルスは、生体膜を可逆性に易透化して、プラスミドの導入を可能にする。電気穿孔された植物プロトプラストは、細胞壁を改質し、分割し、再生する。
植物細胞にDNA分子を導入する別の方法は、植物細胞を、当該遺伝子で予め形質転換しておいたアグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはA. リゾジェネス(A.rhizogenes)に感染させることである。当技術分野で公知の適切な条件下で、形質転換させた植物細胞を成長させて、シュートまたは根を形成し、さらに植物へと生育する。一般的に、この手順は、植物組織に細菌の懸濁液を接種し、その組織を再生培地上で、抗生物質を用いることなく25〜28℃で48〜72時間にわたってインキュベートすることを含む。アグロバクテリウムは、グラム陰性ファミリーリゾビウム(Rhizobiaceae)の代表的な属である。その属は、クラウンゴール(A. ツメファシエンス(A.tumefaciens))及び毛状根病(A. リゾジェネス)の原因である。クラウンゴール腫瘍及び毛状根病中の植物細胞は、オピンとして公知のアミノ酸誘導体を産生するように誘導され、そのオピンは、その細菌によってのみ分解される。オピンの発現を担う細菌遺伝子は、キメラ発現カセットのための制御要素の簡便な供給源である。加えて、オピンの存在についてのアッセイを使用して、形質転換組織を同定することができる。A. ツメファシエンスのTiプラスミドまたはA. リゾジェネスのRiプラスミドを用いて、異種の遺伝的配列を適切な植物細胞に導入することができる。アグロバクテリウムによる感染で、TiまたはRiプラスミドは植物細胞に伝達され、植物ゲノムへと安定的に組み込まれる。その全体が参照によって本明細書に組み込まれるJ.Schell,Science,237:1176−83(1987)。
形質転換の後に、形質転換植物細胞を再生する必要がある。培養プロトプラストからの植物の再生は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるEvans et al.,Handbook of Plant Cell Cultures,Vol.1:(MacMillan Publishing Co.,New York,1983);及びNasil I.R.(ed.),Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,Acad.Press,Orlando,Vol.1,1984,and Vol.Ill(1986)において記載されている。
実際的にすべての植物を培養細胞または組織から再生させることができることは公知である。再生の手段は、植物の種ごとに様々であるが、一般的に、形質転換プロトプラストの懸濁液、または形質転換外植体を含有するペトリ皿を初めに得る。カルス組織が形成され、シュートがカルスから誘導され得、その後、根付く。別法では、胚形成を、カルス組織において誘導することができる。これらの胚は、植物を形成するための天然胚として発芽する。培養培地は一般的に、オーキシン及びサイトカイニンなどの様々なアミノ酸及びホルモンを含有する。特に、トウモロコシ及びアルファルファなどの種では、グルタミン酸及びプロリンを培地に加えることも有利である。効率的な再生は、培地、遺伝子型、及び培養履歴に依存する。これら3種の変項を制御すれば、再生は通常、再生可能及び繰り返し可能である。
発現カセットを、形質転換植物に安定的に組み込んだ後に、雌雄交配(sexual crossing)によって他の植物に移すことができる。交配させる種に応じて、いくつかの標準的な育種技術のいずれかを使用することができる。
この種の形質転換植物を生産したら、病害抵抗性、植物成長の増進、植物での昆虫の制御、非生物的もしくは生物的ストレス耐性、取り出された切り出し部分の乾燥抵抗性の改善、収穫された果実もしくは野菜における収穫後病害抵抗性もしくは収穫後乾燥抵抗性、及び/または収穫された果実もしくは野菜についての果実もしくは野菜の成熟の寿命の改善をもたらす過敏感反応エリシターをコードする遺伝子の存在下で、従来の手順に従って、その植物自体を栽培することができる。
別法では、形質転換種子を形質転換植物から回収する。次いで、これらの種子を土壌に植え付け、従来の手順を使用して栽培して、形質転換植物を生産することができる。植物に病害抵抗性を付与し、植物成長を増進させ、昆虫を制御し、非生物的もしくは生物的ストレス耐性を付与し、取り出された切り出し部分の乾燥抵抗性を改善し、収穫された果実もしくは野菜において収穫後病害抵抗性もしくは収穫後乾燥抵抗性を付与し、かつ/または収穫された果実もしくは野菜についての果実もしくは野菜の成熟の寿命の改善を付与するために有効な条件下で、形質転換植物を、植え付けた形質転換種子から繁殖させる。
形質転換植物及び植物種子を本発明に従って使用する場合、追加的にこれらを、本発明のペプチドまたは本発明の組成物を適用する植物及び種子を処理するために使用するのと同じ物質で処理することができる。本発明のペプチドまたは組成物を含むこれらの他の物質を、高圧または低圧噴霧、注射、コーティング、及び浸漬を含む上述の手順によって形質転換植物及び植物種子に適用することができる。同様に、植物を形質転換植物種子から繁殖させた後に、その植物を本発明のペプチドまたは組成物の1回または複数回の適用で処理して、病害抵抗性、成長の増進、昆虫の制御、非生物的もしくは生物的ストレス耐性、取り出された切り出し部分の乾燥抵抗性、収穫された果実もしくは野菜における収穫後病害抵抗性もしくは収穫後乾燥抵抗性、及び/または収穫された果実もしくは野菜についての果実もしくは野菜の成熟の寿命の改善を付与してよい。
そのような形質転換植物を、上記のとおり、従来の植物処理剤、例えば、殺菌剤または生物致死剤、プロテアーゼ阻害物質、非イオン性界面活性剤、肥料、除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、生物学的接種物、植物調節物質、及びそれらの混合物で処理してもよい。
次の実施例は、本発明の実施形態を例示するために提供するものであって、本発明の範囲を限定することを意図したものではまったくない。
実施例1−過敏感反応分析
その全体が参照によって本明細書に組み込まれるWei、Science 257:85−88(1992)において記載されているとおりに、タバコにおけるHRを試験した。簡単には、ペプチドを水溶液中に500μg/mlの濃度で溶解した。等体積の水を用いて、4回の系列希釈を行って、500、250、125、62.5、31.25μg/mlペプチド溶液でペプチドサンプルを得た。ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)栽培品種キサンティ(xanthi)植物を5〜7週齢(開花前)で使用した。葉を、中央部の葉のパネルで、つまようじを用いて軽く穿刺した。次いで、ペプチド溶液を、無針シリンジを介して創傷部に注入して、そのパネルに満たした。各ペプチドサンプルを、2つの異なる植物の葉に注入した。葉を観察し、続いての48時間にわたって、プログラム細胞死の典型的な病変である萎れ及び褐変についてスコアリングした。
過敏感反応試験を多くのペプチドにおいて実施して、陰性であると判定した。いくつかのペプチドは、未だ試験しておらず、下記の表18において「未測定であるが測定予定」すなわち「TBD」と記しているが、密接に関係するペプチドに関する結果に基づいてHR陰性であると予期される。
(表18)過敏感反応結果のまとめ
Figure 2017532981
TBD=未測定であるが測定予定
実施例2−過酸化物反応分析
過酸化水素に関する鉄−キシレノールオレンジ錯体アッセイ法(Gay et al.,Analytical Biochemistry 273:149−55(1999)、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を使用して、植物の葉組織による過酸化物産生を測定した。簡単には、試薬Aを、水によって1mLの総体積で、10mgの硫酸第一鉄アンモニウムを133uLの硫酸と混合することによって調製した。試薬Bを、80mlの水中、2gのソルビトールを9.34mgのキシレノールオレンジと混合することによって調製した。1M塩酸を、溶液が黄色に変わるまでゆっくりと添加した。次いで、溶液を100mLの総体積まで水によって希釈し、暗色瓶において4℃で保存した。
タバコ植物(本葉6枚まで成長した植物)またはダイズ植物(本葉6枚まで成長した植物)のいずれかからの葉をアッセイ法に使用した。葉をまず植物から取り出し、ペーパータオル上に置いた。次いで、0.5cmの葉組織の円周を、レザーパンチツールを使用して取り除いた。次いで、これらのディスクを96ウエルプレートのウエル内に置いた。250mlの水を各ディスクに添加した。プレートをパラフィルムで覆い、暗所で12時間放置した。次いで、過剰の水を取り除き、ウエルを追加の250uLの水で洗浄した。次いで、洗浄水をウエルから取り除き、概して4倍にした、105uLの、0.5ug/mlのペプチドの水溶液または水ブランク溶液で置き換えた。ペプチドの溶解性が問題であるときには、pH緩衝液をブランク及びペプチドサンプルの両方に添加した。葉ディスクを、蛍光灯下、ペプチドとともに1時間インキュベートした。各々の葉サンプルから50ulの溶液を取り除き、化学分析用の新たなウエルに入れた。
分析の直前に、試薬A及びBを1:100の比で新たに混合し、アッセイ試薬を作製した。200ulのこの混合物を、50ulの葉処理溶液を含有する各ウエルに添加した。プレートを暗所中で20分間インキュベートし、595nmにおける吸光度を検出した。結果を、両側スチューデントT検定を使用して分析した。結果をいくつかの反応群に分割した。XR++は、陰性対照を上回る吸光度>0.05単位及びスチューデントt検定p<0.05である陽性反応を示した。XR+は、ブランクを上回る吸光度<0.05単位及びスチューデントT検定p<0.05を示した。XR弱は、陰性対照を上回る反応>0.02単位を示し、p値は有意ではなかった。XR−は、陰性対照の0.02単位を超えない吸光度を示した。植物の齢による過酸化物反応、葉内のディスクの位置、及び他の因子において有意な生物学的変動があり得ることに注意されるべきである。結果として、T検定からのp値は、規準であり、絶対的な試験対象基準ではない。
これらの研究の結果を下記の表19にまとめる。
(表19)過酸化物反応のまとめ
Figure 2017532981
(表19)過酸化物反応のまとめ
Figure 2017532981
ND:未測定
概して、ペプチドの大部分は、ダイズにおいてXR+の結果であった。しかし、タバコは、より特異的であった。HR+配列からの単一変異である大部分のペプチドは、タバコにおいてXR+であった。二次変異でさえも、依然として、多くの場合、結果としてXR+表現型をもたらした。しかし、p14バリアントでの試験は、3個のロイシン残基のアラニンへの変異が、XR誘発の損失を一般に結果として生じさせたことを示した。同様に、p15のC末端短縮バリアント(p15−62及びp15−63)は、タバコにおいてXR−であった。
実施例3−根及びシュートの成長の分析
シュート(地上)及び根(地下)への成長資源の分配に対する生物学的効果について、ペプチドを試験した。脱イオン水100mlの総体積で、ペプチドを0.2、2、または5μg/mlで溶解した。次いで、トウモロコシまたはダイズ種子をそのペプチド溶液に1時間にわたって浸漬した。未処理対照(UTC)植物を脱イオン水に浸漬した。底部に十字のマークを入れ、その底部を同等の四半分に分割して、透明なプラスチック製300ml飲料用カップ(Solo(登録商標)、Dart Container Corporation)を植付けのために準備した。次いで、そのカップに、1/4インチまでふるいにかけしたSunshine Mix #1土壌(SunGro Horticulture)を充填した。その土壌に水100mlを加えた。次いで、土壌の上部に種子を軽く押し込むことによって、処理した種子を植え付けた。次いで、種子を追加の粗い土壌50mlで覆った。種子を発芽させ、12〜14日間にわたって成長させた。
各植物について、土壌から一番上の葉の軽く伸ばした先端部までの距離として、シュートの長さを測定した。発芽できなかったか、または成長不全を示した植物は、試験から外した。成長不全は、データ収集時点で本葉が完全に展開していないこと、または処理群の平均葉面積の<1/2であると肉眼で判断される展開した本葉を有することと定義した。一般的に、処理群1つ当たり30個の種子を植え付け、15〜25の植物がデータ収集のために使用された。
一次根がカップ底部の四半分マークと交差する回数を数えることによって、根成長を推定した。これらは多くの場合に、カップの底部周縁部に沿って観察されたが、一部は、容器側面に沿って見え、四半分線の垂直伸長部と交差する場合には、それらを同様に数えた。この数を4で割って、根成長指数を生成した。この指数は、測定された一次根全長(根から土壌をすすぎ落とし、直接測定した後のすべての一次根の長さの総計)と約90%相関することが見出された。
これらの研究の結果を下記の表20にまとめる。各数字は、未処理対照値に対する増大のパーセンテージを示す。アスタリスクは、差異が、スチューデントT検定によってp<0.05であると決定されて統計的に有意であったことを示している。
(表20)根及びシュートの成長のまとめ
Figure 2017532981
根成長の増大(p4−14s−16s、p14、及びp14aに示す)は、植物の水収集能を増大させ、干ばつ及び潅水抵抗性を増大させる。反対に、シュート成長の増大(0.2μg/mlでのp4−14s−9a、p4−14s−20s、及びp14aダイズにおけるような)は、光の収集及びエネルギー変換を増大させる。p14aは、用量に応じて根またはシュートのいずれかの成長の増大を引き起こし得ることに留意されたい。P4−14s−16sは、根成長に対する資源の分配の強いシフトを引き起こす。
実施例4−成長試験
ダイズ種子(または示したトウモロコシ種子)を温室施設のフラット(flat)内で、セル1つ当たり種子2つでフラットに植え付けた。その種子を発芽させ、小さい方の植物を摘み取り、セル1つ当たり1つの植物を残した。第1の本葉が完全に開き、かつ第2の葉が開き始めたら、植物を最初に高さについて測定した。これを、最も高い葉を上に伸ばし、土壌までの距離を測定することによって行った。ペプチドを、指示濃度(下記表21)で水に溶解した。次いで、液体が葉から滴下するまで、広く入手可能なスプレーボトルを使用して葉面散布することで、植物を処理した。植物14個のフラット6個のそれぞれを条件ごとに処理した(ペプチドまたは対照)。表記した未処理の対照植物を水でスプレーした。植物を14日間にわたって成長させた。植物の高さを再び測定し、元の高さと比較して、成長を定量化した。最後に、シュート(全ての地上部材料)を取り除くことによって植物を採取した。いくつかの実験では、これを採取の際に秤量して、新鮮質量(水の重量を含む)を決定した。次いで、シュートを70℃で72時間にわたって乾燥させ、乾燥生物量を決定するために秤量した。この方法は、上記の実施例3と同様の尺度(成長)を使用しているが、処理方法は異なる(種子浸漬対葉面散布)。結果として、実験結果は不定になる場合がある。
(表21)成長の測定のまとめ
Figure 2017532981
ND:未測定
研究したペプチドのいくつかは、成長及び乾燥生物量の増大を引き起こした(p4−14s−9a、p14、p14a、及びp14−32)。加えて、いくつかのペプチドは、試験完了時に干ばつストレスを被ったUTC植物と比較して水の保存の増大を引き起こした。保存された水分は、例えば、p14a−及びp14−32−処理植物において見られるように、>10%の新鮮質量の増大が示された。成長効果は、ダイズに限定されず;トウモロコシもまた、p1−29でのペプチド処理の際の適度な成長の利益を示した。
留意すべきことに、短縮化されたC末端を組み込んだP14−dc4は、p14について観察された有意な成長、乾燥生物量、及び新鮮質量の利益を損失しているようである。比較すると、P14のN末端配列(P14aサンプル)の除去は、3つの全ての尺度の増大をさらに結果として生じさせる。
実施例5−タバコモザイクウイルスに対する抵抗性の誘導
タバコにおいて、ペプチドをタバコモザイクウイルス(TMV)に対する抵抗性の誘導について試験した。簡単には、1群当たり3つの6〜8週齢のタバコ植物を選択した(サンプル及び対照)。植物の一番下の葉を覆い、植物に、水(陰性対照)、ペプチド、またはプロアクト(Proact)(陽性対照)の溶液を噴霧した。葉が十分に湿って、葉からの液体の滴下が示されるまで、スプレーを適用した。次いで、植物を乾燥させ、葉の覆いを外した。
次いで、処理の3日後に、植物の予め覆っておいた葉に及び反対側の葉に珪藻土を軽く散布し、1.7ug/mlの精製タバコモザイクウイルス溶液20ulを適用した。次いで、葉の表面全体に溶液及び珪藻土を軽くこすることによって、TMV溶液を葉の表面全体に広げた。接種から2分後に、水で珪藻土を葉からすすぎ落した。TMV接種から3日後に、観察されたTMV病変の数に基づき、葉をスコアリングした。罹患した葉の黄変及び萎れを含む過敏感反応の徴候についても、葉をスコアリングした。
表22において記載されている有効性は、処理植物とUTC植物とのTMV病変の低下%に関する。被覆された葉でのTMVの減少は、植物における全身免疫反応を示す一方で、覆われなかった葉での減少は、局所反応を示す。アステリスクは、T検定に由来するP値が<0.05であったことを示している。
(表22)TMV抵抗性のまとめ
Figure 2017532981
(表22)TMV抵抗性のまとめ
Figure 2017532981
(表22)TMV抵抗性のまとめ
Figure 2017532981
いくつかのHR陰性ペプチドは、有意な局所及び全身反応を引き起こす:P4−14S−9A、P4−14S−17A、P4−14S−12D、及びP4−14S−16Vは、最も良好な結果を生じた。一般に、大部分のペプチドが、いくらかの抗TMV活性を示した。しかし、無傷のHRボックス(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、2015年10月1日に提出された、PCT出願PCT/US15/53387号、タイトル“Hypersensitive Response Elicitor Peptides and Use Thereof”を参照されたい)(例えば、p4−116、P14−dc4)と比較してより長いC末端が短縮化されたペプチドは、TMV感染に対しての有効性の低減を示す。より短いC末端の短縮化は、一般に、僅かに低い率(50〜75%対照)でTMV抵抗性を誘発した。P4−d10,14,18における離間している残基のより大きな破壊もまた、TMV感染に対する有効性の中程度の低減を示した。また、いくつかのロイシン位の変異も、より弱いTMV反応に関連しているようであった:P19min−13S、P18min−7D、P18min−11S、P14d−18D、P4−14S−20V、P4−14S−20S、P4−14s−16A。留意すべきことに、いくつかの疎水性配列を含有しているが、P25−14は、TMV感染のより弱い制御を示す。いくつかのHR誘発配列に対する重要なロイシン及びイソロイシン残基の変異の系統的な調査により、いくつかの位置における変異が、免疫反応の低下を引き起こし得ることが明らかになった。第1の疎水性残基の変異(p14d−7S、p18min−7D、及びp25−9Dにおける)は、覆われた葉での効能の低下を引き起し得、このことは、全身免疫反応の低下を示唆している。P15b−12Sもまた、覆われた葉での全身反応の同様の低下を示す。P19min−13Sは、低い免疫活性を示す。抗TMV活性(例えば、P1−31及びP1−111における)をなお可能にした、最後の疎水性ダブレット(hydrophobic doublet)を除去することができる。しかし、さらに短縮された疎水性配列は、P4−116及びP14−dc4によって実証されているように、TMVに対する活性の低下に関連する。
本発明の基本的な概念をこのように記載してきたが、当業者には、上述の詳細な開示は、単に例として提供することが意図されており、限定ではないことがむしろ明らかであろう。本明細書において明示されていなくても、当業者には、様々な変更形態、改良形態、及び改変形態が想起され、かつ意図されるであろう。これらの変更形態、改善形態、及び改変形態は、本明細書によって示唆されていることが意図されており、本発明の意図及び範囲内である。加えて、処理要素もしくは配列の記載されている順番、または数、文字、もしくは他の記号の使用はしたがって、特許請求の範囲において指定されていない限り、特許請求の範囲に記載のプロセスを、いずれかの順序に限定することを意図したものではない。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲及びその同等物によってのみ限定される。

Claims (192)

  1. Figure 2017532981
    のアミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、ここで、
    前記ペプチドがシステイン及びメチオニンを含まず;
    2、3、7、8、12、及び13位の各Xが、任意選択であり、かつ、存在する場合には任意のアミノ酸であり;
    4、9、及び14位の各Xが、任意のアミノ酸であり;
    1、5、6、10、11、15、及び16位のJの1〜3個が、非疎水性アミノ酸またはAであり、かつ他の全てのJが、L、I、V、またはFであり;かつ
    前記ペプチドが、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない、
    前記単離されたペプチド。
  2. Figure 2017532981
    のアミノ酸配列を含まず、かつ前記アミノ酸配列からなるものではない、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  3. 100個未満のアミノ酸長であるかまたは12〜50個のアミノ酸長である、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  4. (i)水または水溶液に溶解された場合に安定していること、(ii)殺生物剤を含有する水性緩衝液に溶解された場合に、化学的分解に対して抵抗性を有すること、(iii)水中または水溶液中約0.1%超の溶解度
    のうちの1つまたは複数を特徴とする、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  5. 1、5、6、10、11、15、及び16位のJの2個以下が非疎水性である、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  6. 1、5、6、10、11、15、及び16位のJの1個以下が非疎水性である、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  7. 2及び3位のXの1個が存在しないか、7及び8位のXの1個が存在しないか、または2及び3位のXの1個と7及び8位のXの1個の両方が存在しない、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  8. 2、3、7、及び8位の各Xが存在する、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  9. 12位、13位、または両方の位置のXが存在しない、請求項1または7に記載の単離されたペプチド。
  10. 12位のXが存在する、請求項1または8に記載の単離されたペプチド。
  11. 12及び13位のXが存在する、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  12. 2、3、7、8、及び12位の各Xが、存在する場合には、G、A、S、T、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、Rからなる群から選択され;かつ
    4、9、及び13位の各Xが、G、A、S、T、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、Rからなる群から選択される、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  13. 前記ペプチドによって誘導された前記活性な植物反応が、過酸化物誘導、成長の増進、病原体抵抗、害虫抵抗、及び生物的または非生物的ストレス抵抗からなる群から選択される、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  14. SEQ ID NO:19〜46のうちの1つのアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  15. SEQ ID NO:19〜46のうちの1つのアミノ酸配列から本質的になる、請求項14に記載の単離されたペプチド。
  16. SEQ ID NO:19〜46のうちの1つのアミノ酸配列からなる、請求項14に記載の単離されたペプチド。
  17. SEQ ID NO:47〜68及び164のうちの1つのアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  18. SEQ ID NO:47〜68またはSEQ ID NO:164のうちの1つのアミノ酸配列から本質的になる、請求項17に記載の単離されたペプチド。
  19. SEQ ID NO:47〜68またはSEQ ID NO:164のうちの1つのアミノ酸配列からなる、請求項17に記載の単離されたペプチド。
  20. SEQ ID NO:69〜84のうちの1つのアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  21. SEQ ID NO:69〜84のうちの1つのアミノ酸配列から本質的になる、請求項20に記載の単離されたペプチド。
  22. SEQ ID NO:69〜84のうちの1つのアミノ酸配列からなる、請求項20に記載の単離されたペプチド。
  23. SEQ ID NO:85〜98のうちの1つのアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  24. SEQ ID NO:85〜98のうちの1つのアミノ酸配列から本質的になる、請求項23に記載の単離されたペプチド。
  25. SEQ ID NO:85〜98のうちの1つのアミノ酸配列からなる、請求項23に記載の単離されたペプチド。
  26. SEQ ID NO:99〜112のうちの1つのアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離されたペプチド。
  27. SEQ ID NO:99〜112のうちの1つのアミノ酸配列から本質的になる、請求項26に記載の単離されたペプチド。
  28. SEQ ID NO:99〜112のうちの1つのアミノ酸配列からなる、請求項26に記載の単離されたペプチド。
  29. SEQ ID NO:113、114、117〜123、127、133〜138、140〜142、144、145、148〜150、及び153〜155のうちの1つのアミノ配列を含む、単離されたペプチド。
  30. SEQ ID NO:113、114、117〜123、127、133〜138、140〜142、144、145、148〜150、及び153〜155のうちの1つのアミノ酸配列から本質的になる、請求項29に記載の単離されたペプチド。
  31. SEQ ID NO:113、114、117〜123、127、133〜138、140〜142、144、145、148〜150、及び153〜155のうちの1つのアミノ酸配列からなる、請求項29に記載の単離されたペプチド。
  32. Figure 2017532981
    (SEQ ID NO:2、修飾P1/P4コンセンサス)のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドであって、ここで、
    1位のXが、任意選択であり、かつS、N、D、イソD、G、A、またはSであり得;
    2位のXが、任意選択であり、かつQ、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり得;
    8位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
    9位のXが、M、L、I、F、もしくはV、または非疎水性アミノ酸であり;
    10位のXが、任意選択であり、かつDまたはイソDであり得;
    11位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
    12位のXが、M、L、I、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;
    13位のXが、M、L、もしくはI、または非疎水性アミノ酸であり;
    14位のXが、任意選択であり、かつ任意の親水性アミノ酸であり得;
    15位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、S、K、またはIであり;
    16位のXが、M、L、I、V、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;
    17位のXが、M、L、I、A、もしくはV、または非疎水性アミノ酸であり;
    18位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、S、M、T、またはKであり;
    19位のXが、A、D、イソD、S、V、T、K、R、E、H、またはGであり;
    20位のXが、M、L、またはIであり;
    21位のXが、M、L、I、V、S、もしくはFであるか、またはセリン以外の非疎水性アミノ酸であり;
    22位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、Sであり;
    23位のXが、P、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;かつ
    9、12、13、16、17、及び20位の残基の少なくとも1つが、非疎水性アミノ酸であるか、または21位の残基が、セリン以外の非疎水性アミノ酸であり、かつ
    前記ペプチドが、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない、
    前記単離されたペプチド。
  33. Figure 2017532981
    (SEQ ID NO:3 修飾P4コンセンサス)のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドであって、ここで、
    2位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
    8位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
    9位のXが、M、S、L、A、I、V、もしくはFであるか、またはセリン以外の非疎水性アミノ酸であり;
    11位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
    12位のXが、L、I、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;
    13位のXが、L、A、I、V、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;
    14位のXが、任意の親水性アミノ酸であり;
    15位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、S、K、またはIであり;
    16位のXが、L、A、I、V、M、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;
    17位のXが、M、I、S、もしくはFであるか、またはセリン以外の非疎水性アミノ酸であり;
    18位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
    20位のXが、M、L、I、V、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;
    21位のXが、M、L、もしくはF、または非疎水性アミノ酸であり;かつ
    22位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり、
    9、12、13、16、20、及び21位の残基の1個が、非疎水性アミノ酸もしくはAであるか、または17位の残基が、セリン以外の非疎水性アミノ酸であり、かつ
    前記ペプチドが、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない、
    前記単離されたペプチド。
  34. SEQ ID NO:48〜56、58、59、61、及び161〜163のうちの1つのアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の単離されたペプチド。
  35. SEQ ID NO:48〜56、58、59、61、及び161〜163のうちの1つのアミノ酸配列から本質的になる、請求項34に記載の単離されたペプチド。
  36. SEQ ID NO:48〜56、58、59、61、及び161〜163のうちの1つのアミノ酸配列からなる、請求項34に記載の単離されたペプチド。
  37. Figure 2017532981
    (SEQ ID NO:4、修飾P1コンセンサス)のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドであって、ここで、
    1位のXが、N、D、イソD、G、A、またはSであり;
    2位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
    8位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
    11位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
    15位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
    18位のXが、M、T、K、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
    22位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
    23位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
    9、12、13、16、17、20、及び21位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、及びFから選択される疎水性アミノ酸であり、
    前記ペプチドが、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない、
    前記単離されたペプチド。
  38. SEQ ID NO:164及び166〜179のうちの1つのアミノ酸配列を含む、請求項37に記載の単離されたペプチド。
  39. SEQ ID NO:164及び166〜179のうちの1つのアミノ酸配列から本質的になる、請求項37に記載の単離されたペプチド。
  40. SEQ ID NO:164及び166〜179のうちの1つのアミノ酸配列からなる、請求項37に記載の単離されたペプチド。
  41. (i)3位のXが、N、D、またはイソDであり;
    6位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
    8位のXが、N、D、またはイソDであり;
    15位のXが、任意選択であり、かつ任意のアミノ酸であり得;
    18位のXが、M、E、g−グルタマート、G、A、S、T、またはKであり;
    22位のXが、任意選択であり、かつQ、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり得;かつ
    9、12、13、16、17、20、及び21位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、及びFから選択される疎水性アミノ酸である、
    Figure 2017532981
    (SEQ ID NO:5、修飾P15b/P20コンセンサス)、
    あるいは
    (ii)7位のXが、任意選択であり、かつ任意のアミノ酸であり得;
    10位のXが、M、E、g−グルタマート、G、A、S、T、またはKであり;
    14位のXが、任意選択であり、かつQ、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり得;かつ
    1、4、5、8、9、12、及び13位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、及びFから選択される疎水性アミノ酸である、
    Figure 2017532981
    (SEQ ID NO:6、修飾P15/20minコンセンサス)
    のアミノ酸配列を含み、かつ
    植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない、単離されたペプチド。
  42. SEQ ID NO:180〜193のうちの1つのアミノ酸配列を含む、請求項41に記載の単離されたペプチド。
  43. SEQ ID NO:180〜193のうちの1つのアミノ酸配列から本質的になる、請求項42に記載の単離されたペプチド。
  44. SEQ ID NO:180〜193のうちの1つのアミノ酸配列からなる、請求項42に記載の単離されたペプチド。
  45. Figure 2017532981
    (SEQ ID NO:7、修飾P6/6aコンセンサス)のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドであって、ここで、
    6位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
    9位のXが、M、E、g−グルタマート、G、A、S、T、またはKであり;
    10位のXが、HまたはNであり;
    14位のXが、E、g−グルタマート、D、またはイソDであり;
    17位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;
    19位のXが、Q、E、g−グルタマート、G、A、またはSであり;かつ
    4、7、8、11、12、15、及び16位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、M、及びFから選択される疎水性アミノ酸であり、
    前記ペプチドが、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない、
    前記単離されたペプチド。
  46. SEQ ID NO:194〜207のうちの1つのアミノ酸配列を含む、請求項45に記載の単離されたペプチド。
  47. SEQ ID NO:194〜207のうちの1つのアミノ酸配列から本質的になる、請求項45に記載の単離されたペプチド。
  48. SEQ ID NO:194〜207のうちの1つのアミノ酸配列からなる、請求項45に記載の単離されたペプチド。
  49. (i)1位のXが、Q、N、D、E、g−グルタマート、イソD、またはSであり得;
    2位のXが、D、E、g−グルタマート、イソDであり得;
    3位のXが、P、D、E、イソD、またはg−グルタマートであり得;
    4位のXが、M、A、S、D、E、イソD、またはg−グルタマートであり得;
    5位のXが、Q、E、またはg−グルタマートであり得;
    6位のXが、A、E、またはg−グルタマートであり得;
    8位のXが、M、L、E、Q、D、N、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
    9位のXが、Q、N、E、D、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
    12位のXが、Q、N、E、D、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
    13位のXが、Q、N、E、D、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
    16位のXが、K、Q、N、E、D、R、G、A、またはSであり得;かつ
    7、10、11、14、15、17、及び18位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、及びFから選択される疎水性アミノ酸である、
    Figure 2017532981
    (SEQ ID NO:8、修飾P14dコンセンサス)、あるいは
    (ii)2位のXが、M、L、E、Q、D、N、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
    3位のXが、Q、N、E、D、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
    6位のXが、Q、N、E、D、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
    7位のXが、Q、N、E、D、G、A、S、イソD、またはg−グルタマートであり得;
    10位のXが、K、Q、N、E、D、R、G、A、またはSであり得;かつ
    1、4、5、8、9、11、及び12位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、及びFから選択される疎水性アミノ酸である、
    Figure 2017532981
    (SEQ ID NO:9、修飾P14d minコンセンサス)
    のアミノ酸配列を含み、
    植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない、単離されたペプチド。
  50. SEQ ID NO:208〜221のうちの1つのアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の単離されたペプチド。
  51. SEQ ID NO:208〜221のうちの1つのアミノ酸配列から本質的になる、請求項49に記載の単離されたペプチド。
  52. SEQ ID NO:208〜221のうちの1つのアミノ酸配列からなる、請求項49に記載の単離されたペプチド。
  53. (i)2位のXが、Q、N、E、g−グルタマート、D、イソD、T、S、A、またはGであり得;
    3位のXが、K、Q、N、E、g−グルタマート、D、イソD、T、S、A、またはGであり得;
    6位のXが、K、Q、N、E、g−グルタマート、D、イソD、T、S、A、またはGであり得;
    9位のXが、E、g−グルタマート、D、イソD、Q、N、T、S、A、またはGであり得;
    10位のXが、A、G、S、T、E、g−グルタマート、D、イソD、Q、またはNであり得;かつ
    1、4、5、7、8、10、及び11位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、F、及びMから選択される疎水性アミノ酸である、
    Figure 2017532981
    (SEQ ID NO:10、修飾P25コンセンサス)、あるいは
    (ii)2位のXが、T、S、A、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、またはNであり得;
    3位のXが、G、T、S、A、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、またはNであり得;
    6位のXが、Q、N、E、g−グルタマート、D、イソD、T、S、A、またはGであり得;
    7位のXが、K、Q、N、E、g−グルタマート、D、イソD、T、S、A、またはGであり得;
    10位のXが、K、Q、N、E、g−グルタマート、D、イソD、T、S、A、またはGであり得;
    13位のXが、E、g−グルタマート、D、イソD、Q、N、T、S、A、またはGであり得;
    14位のXが、A、G、S、T、E、g−グルタマート、D、イソD、Q、またはNであり得;
    1、4、5、8、9、11、12、及び15位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、F、及びMから選択される疎水性アミノ酸であり;かつ
    16位のJが、任意選択であり、かつL、V、I、及びFから選択される疎水性アミノ酸である、
    Figure 2017532981
    (SEQ ID NO:11、修飾P25コンセンサス)
    のアミノ酸配列を含み、
    植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない、単離されたペプチド。
  54. SEQ ID NO:222〜239のうちの1つのアミノ酸配列を含む、請求項53に記載の単離されたペプチド。
  55. SEQ ID NO:222〜239のうちの1つのアミノ酸配列から本質的になる、請求項53に記載の単離されたペプチド。
  56. SEQ ID NO:222〜239のうちの1つのアミノ酸配列から本質的になる、請求項53に記載の単離されたペプチド。
  57. (i)1位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
    2位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
    3位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはP、Q、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
    4位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはI、Q、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、N、イソD、K、またはRであり得;
    5位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはD、イソD、S、E、g−グルタマート、A、T、G、N、Q、K、またはRであり得;
    6位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはR、Q、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、またはKであり得;
    7位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
    8位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはT、Q、S、E、g−グルタマート、A、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
    9位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはI、Q、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
    10位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはE、g−グルタマート、Q、S、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
    11位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、S、E、g−グルタマート、A、T、G、D、イソD、N、K、またはRであり得;
    13位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはA、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
    14位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、N、K、またはRであり得;
    17位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはA、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
    18位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、N、K、またはRであり得;
    21位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり得;
    22位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはS、A、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
    25位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはS、A、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
    26位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはP、S、A、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
    27位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、S、A、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、N、K、またはRであり得;かつ
    12、15、16、19、20、23、及び24位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、F、及びMから選択される疎水性アミノ酸である、
    Figure 2017532981
    (SEQ ID NO:12、修飾P17/18)、
    あるいは
    (ii)2位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはA、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
    3位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、N、K、またはRであり得;
    6位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはA、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
    7位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはQ、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、N、K、またはRであり得;
    10位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり得;
    11位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはS、A、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;かつ
    1、4、5、8、9、12、及び13位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、F、及びMから選択される疎水性アミノ酸である、
    Figure 2017532981
    (SEQ ID NO:13、修飾P17/18minコンセンサス)
    のアミノ酸配列を含み、
    植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない、単離されたペプチド。
  58. SEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:13のアミノ酸配列から本質的になる、請求項57に記載の単離されたペプチド。
  59. SEQ ID NO:12またはSEQ ID NO:13のアミノ酸配列からなる、請求項57に記載の単離されたペプチド。
  60. Figure 2017532981
    (SEQ ID NO:14、修飾P19コンセンサス)のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドであって、ここで、
    1位のXが、任意選択であり、かつL、I、V、F、またはMであり得;
    3位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり得;
    4位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはA、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
    7位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはK、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはRであり得;
    10位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはA、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、またはRであり得;
    11位のXが、任意のアミノ酸、ただし、好ましくはR、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、またはKであり得;かつ
    2、5、6、8、9、12、及び13位のJが、これらの位置のアミノ酸のうちの少なくとも1つが非疎水性アミノ酸またはAであることを除いては、L、V、I、F、及びMから選択される疎水性アミノ酸であり、
    前記ペプチドが、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない、
    前記単離されたペプチド。
  61. SEQ ID NO:14のアミノ酸配列から本質的になる、請求項60に記載の単離されたペプチド。
  62. SEQ ID NO:14のアミノ酸配列からなる、請求項60に記載の単離されたペプチド。
  63. Figure 2017532981
    のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドであって、ここで、
    前記ペプチドが、システイン及びメチオニンを含まず;
    2、3、6、7位の各Xが、任意のアミノ酸であり、かつ
    前記ペプチドが、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない、
    前記単離されたペプチド。
  64. Figure 2017532981
    のアミノ酸配列を含まず、かつ前記アミノ酸配列からなるものではなく、ここで、2、3、6、7、10、11位の各Xが、任意のアミノ酸である、請求項63に記載の単離されたペプチド。
  65. 100個未満のアミノ酸長であるかまたは12〜50個のアミノ酸長である、請求項63に記載の単離されたペプチド。
  66. 2、3、6、及び7位の1つまたは複数におけるXが、非疎水性アミノ酸である、請求項63に記載の単離されたペプチド。
  67. 2、3、6、及び7位の各々におけるXが、非疎水性アミノ酸である、請求項63に記載の単離されたペプチド。
  68. 2、3、6、及び7位の各々におけるXが、G、A、S、T、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、K、及びRからなる群から独立に選択される、請求項63に記載の単離されたペプチド。
  69. SEQ ID NO:115、124、128〜132、139、143、146、147、151、152、及び160のうちの1つのアミノ酸配列を含む、請求項63に記載の単離されたペプチド。
  70. SEQ ID NO:115、124、128〜132、139、143、146、147、151、152、及び160のうちの1つのアミノ酸配列から本質的になる、請求項63に記載の単離されたペプチド。
  71. SEQ ID NO:115、124、128〜132、139、143、146、147、151、152、及び160のうちの1つのアミノ酸配列からなる、請求項63に記載の単離されたペプチド。
  72. Figure 2017532981
    (SEQ ID NO:126、P3ミニマム(minimum))のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドであって、ここで、
    3位のXが、任意の親水性アミノ酸であり;
    6位のXが、任意の親水性アミノ酸であり;
    7位のXが、任意の親水性アミノ酸であり;かつ
    及びZの一方が存在し、ZがLXX−を含み、ここで各Xが親水性アミノ酸であり、かつZが−XXLFを含み、ここで各Xが親水性アミノ酸であり、
    前記ペプチドが、植物組織に適用されたときに、活性な植物反応を誘導するが過敏感反応を誘導しない、
    前記単離されたペプチド。
  73. が存在する、請求項72に記載の単離されたペプチド。
  74. が存在する、請求項72に記載の単離されたペプチド。
  75. またはZにおける各Xが、K、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、及びRから独立に選択される、請求項73または74に記載の単離されたペプチド。
  76. 3、6、及び7位のXが、K、A、S、T、G、D、イソD、E、g−グルタマート、Q、N、及びRから独立に選択される、請求項72に記載の単離されたペプチド。
  77. 12〜50個のアミノ酸長である、請求項72に記載の単離されたペプチド。
  78. SEQ ID NO:156〜159のうちの1つのアミノ酸配列を含む、請求項72に記載の単離されたペプチド。
  79. SEQ ID NO:156〜159のうちの1つのアミノ酸配列から本質的になる、請求項63に記載の単離されたペプチド。
  80. SEQ ID NO:156〜159のうちの1つのアミノ酸配列からなる、請求項63に記載の単離されたペプチド。
  81. (i)水または水溶液に溶解された場合に安定していること、(ii)殺生物剤を含有する水性緩衝液に溶解された場合に、化学的分解に対して抵抗性を有すること、(iii)水中または水溶液中約0.1%超の溶解度
    のうちの1つまたは複数を特徴とする、請求項32から80のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
  82. 前記ペプチドによって誘導された前記活性な植物反応が、過酸化物誘導、成長の増進、病原体抵抗、生物的または非生物的ストレス抵抗、及び生化学的シグナル伝達の改変からなる群から選択される、請求項32から80のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
  83. 少なくとも90%純粋である、請求項1から82のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
  84. ペプチド結合を介して前記アミノ酸配列にカップリングしている第2のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである、請求項1から14、17、20、23、26、29、32から34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、60、63、66から69、及び72から78のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
  85. 前記第2のアミノ酸配列が精製タグを含む、請求項84に記載の単離されたペプチド。
  86. 前記第2のアミノ酸配列が、前記精製タグと前記アミノ酸配列との間に切断可能なリンカー配列をさらに含む、請求項85に記載の単離されたペプチド。
  87. 前記ペプチドの第2のアミノ酸配列に連結された前記ペプチドの第1のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである、請求項84に記載の単離されたペプチド。
  88. 前記第2のアミノ酸配列が、N末端またはC末端親水性アミノ酸配列を含む、請求項84に記載の単離されたペプチド。
  89. 前記親水性アミノ酸配列が、複数のGlu(E)アミノ酸残基を含む、請求項88に記載の単離されたペプチド。
  90. 一緒に連続して連結された複数のアミノ酸配列を含み、前記複数のアミノ酸配列のそれぞれが、請求項1から14、17、20、23、26、29、32から34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、60、63、66から69、及び72から78のいずれか一項に記載のペプチドを含む、融合ポリペプチド。
  91. 前記複数のアミノ酸配列が、切断可能なリンカー配列によって一緒に連結されている、請求項90に記載の融合ポリペプチド。
  92. 前記複数のアミノ酸配列がそれぞれ、精製タグ、N末端もしくはC末端親水性アミノ酸配列、またはその両方を含む、請求項90に記載の融合ポリペプチド。
  93. 請求項1から89のいずれか一項に記載の1種もしくは複数種のペプチドまたは請求項90から92のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドと担体とを含む、組成物。
  94. 清澄化された細胞抽出物である、請求項93に記載の組成物。
  95. 肥料、除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、殺菌剤、生物学的接種物、植物調節物質、及びそれらの混合物からなる群から選択される添加剤をさらに含む、請求項93に記載の組成物。
  96. 前記殺虫剤が、ネオニコチド殺虫剤、オルガノフォスファート殺虫剤、ピレスロイド殺虫剤、大環状ラクトン殺虫剤、カルバマート殺虫剤、ジアミド殺虫剤、アベルメクチン殺虫剤、キチン合成阻害物質、またはそれらの任意の組合せである、請求項95に記載の組成物。
  97. 前記殺真菌剤が、ストロビルリン殺真菌剤、トリアゾール殺真菌剤、コハク酸デヒドロゲナーゼ殺真菌剤、フェニルアミド殺真菌剤、フェニルピロール殺真菌剤、フタルイミド殺真菌剤、ジチオカルバマート殺真菌剤、ベンゾイミダゾール殺真菌剤、またはそれらの任意の組合せである、請求項95に記載の組成物。
  98. 前記殺線虫剤がカルバマート殺線虫剤である、請求項95に記載の組成物。
  99. 前記殺菌剤が、ジクロロフェン及びベンジルアルコールヘミホルマール殺菌剤、イソチアゾリノン殺菌剤、またはそれらの組合せである、請求項95に記載の組成物。
  100. 生物学的接種物が、ブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)属、バチルス(Bacillus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、トリコデルマ(Trichoderma)属、パスツリア(Pasteuria)属、またはそれらの任意の組合せである、請求項95に記載の組成物。
  101. ペプチドp4−14s−9a(SEQ ID NO:57)、p41−4s−12d(SEQ ID NO:59)、p14(SEQ ID NO:113)、p14a(SEQ ID NO:114)、p14−22E,26E(SEQ ID NO:23)、p1−29(SEQ ID NO:130)、p4−14S−16S(SEQ ID NO:55)の1種または複数種、ならびに
    クロチアニジン、クロチアニジン及びバチルス・フィルムス(Bacillus firmus)の組合せ、イミジクロプリド、またはイミジクロプリド及びバチルス・フィルムスの組合せ
    を含む、請求項95に記載の組成物。
  102. ペプチドp4−14s−9a(SEQ ID NO:57)、p41−4s−12d(SEQ ID NO:59)、p14(SEQ ID NO:113)、p14a(SEQ ID NO:114)、p14−22E,26E(SEQ ID NO:23)、p1−29(SEQ ID NO:130)、p4−14S−16S(SEQ ID NO:55)の1種または複数種、ならびに
    チアメトキサム;チアメトキサム、メフェノキサム、及びフルジオキシニルの組合せ;チアメトキサム、メフェノキサム、フルジオキシニル、及びアゾキシストロビンの組合せ;チアメトキサム及びアバメクチンの組合せ;チアメトキサム、アバメクチン、及びパスツリア殺線虫剤の組合せ;またはチアメトキサム、メフェノキサム、フルジオキシニル、アゾキシストロビン、チアベンダゾール、及びアバメクチンの組合せ
    を含む、請求項95に記載の組成物。
  103. ペプチドp4−14s−9a(SEQ ID NO:57)、p41−4s−12d(SEQ ID NO:59)、p14(SEQ ID NO:113)、p14a(SEQ ID NO:114)、p14−22E,26E(SEQ ID NO:23)、p1−29(SEQ ID NO:130)、p4−14S−16S(SEQ ID NO:55)の1種または複数種、ならびに
    ブラディリゾビウム属、バチルス属、及びそれらの組合せを含む生物学的接種物
    を含む、請求項95に記載の組成物。
  104. 前記担体が水性担体である、請求項93に記載の組成物。
  105. 前記水性担体が、殺菌剤、プロテアーゼ阻害物質、非イオン性界面活性剤、またはそれらの組合せの1種または複数種をさらに含む、請求項104に記載の組成物。
  106. 前記担体が、微粒子形態の固体担体である、請求項93に記載の組成物。
  107. 前記固体担体が乾燥粉末である、請求項106に記載の組成物。
  108. Figure 2017532981
    からなる群から選択される、単離されたペプチド。
  109. 一緒に連続して連結された複数のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列のうちの1つが、請求項108に記載のペプチドを含み、かつ前記アミノ酸配列のうちの別の1つが、請求項1から14、17、20、23、26、29、32から34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、60、63、66から69、72から78、及び108のいずれか一項に記載のペプチドまたは溶解性もしくは精製タグを含む、融合ポリペプチド。
  110. 請求項108に記載の1種もしくは複数種のペプチドまたは請求項109に記載の融合ポリペプチドと担体とを含む、組成物。
  111. 有効量の、請求項1から89及び108のいずれか一項に記載の単離されたペプチド、請求項90から92及び109のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、または請求項93から107及び110のいずれか一項に記載の組成物を、植物もしくは植物種子にまたは前記植物が成長している場所もしくは成長すると予測される場所に適用すること
    を含み、前記適用が病害抵抗性を付与するために有効である、植物に病害抵抗性を付与する方法。
  112. 前記病害が、ウイルス性病害、細菌性病害、または真菌性病害である、請求項111に記載の方法。
  113. 前記適用することが植物を用いて実施される、請求項111に記載の方法。
  114. 前記植物が、少なくとも1種の除草剤に対して耐性を有する、請求項113に記載の方法。
  115. 前記適用することが植物種子を用いて実施され、前記方法が、前記ペプチドまたは前記組成物で処理された前記種子を天然土壌また合成土壌に植え付けること、及び、前記土壌に植え付けた前記種子から植物を繁殖させることをさらに含む、請求項111に記載の方法。
  116. 前記適用することが、前記植物が成長している場所または成長すると予測される場所で実施される、請求項111に記載の方法。
  117. 前記植物が、それぞれその天然形態または遺伝的に改変された形態の農業用植物、造林用植物、観賞植物、及び園芸用植物から選択される、請求項111に記載の方法。
  118. 前記植物が遺伝的に改変された植物である、請求項111に記載の方法。
  119. 処理する前記植物が、アルファルファ、リンゴ、アプリコット、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ、ブナ(ファーグス(Fagus)種)、ベゴニア、カバノキ、ブラックベリー、ブルーベリー、キャベツ、クスノキ(camphor)、キャノーラ、ニンジン、トウゴマ、サクラ、ニッケイ、柑橘類、ココア豆、コーヒー、トウモロコシ、綿、キュウリ、ウリ、ユーカリ、モミ、亜麻、飼料ビート、フクシア、ニンニク、フウロソウ、ブドウ、ラッカセイ、***、ホップ、ザイフリボク、ジュンセア(juncea)(セイヨウカラシナ(Brassica juncea))、黄麻、レンズマメ、レタス、アマニ、メロン、マスタード、オーク、オートムギ、アブラヤシ、アブラナ、オリーブ、タマネギ、パプリカ、エンドウ、モモ、セイヨウナシ、ペラルゴニウム、コショウ、ペチュニア、マツ(ピヌス(Pinus)種)、ポプラ(ポプルス(Populus)種)、仁果類、ジャガイモ、セイヨウアブラナ、ラズベリー、イネ、ゴムノキ、ライ麦、モロコシ、ダイズ、ホウレンソウ、トウヒ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、チャノキ、チークノキ、タバコ、トマト、ライコムギ、芝生、スイカ、コムギ、及びヤナギ(サリクス(Salix)種)からなる群から選択される、請求項111に記載の方法。
  120. 有効量の、請求項1から89及び108のいずれか一項に記載の単離されたペプチド、請求項90から92及び109のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、または請求項93から107及び110のいずれか一項に記載の組成物を、植物もしくは植物種子にまたは前記植物が成長している場所もしくは成長すると予測される場所に適用すること
    を含み、前記適用が植物成長を増進させるために有効である、植物成長を増進させる方法。
  121. 成長の増進が、植物活力の向上、植物重量の増加、生物量の増加、植物1個当たりの花数の増加、より多い穀物及び/または果実の収量、より多い分げつまたは側枝(side shoot)、より大きな葉、シュート成長の増大、タンパク質含量の増加、油含量の増加、デンプン含量の増加、色素含量の増加、クロロフィル含量の増加、ならびにそれらの組合せを含む、請求項120に記載の方法。
  122. 前記適用することが植物を用いて実施される、請求項120に記載の方法。
  123. 前記植物が、少なくとも1種の除草剤に対して耐性を有する、請求項122に記載の方法。
  124. 前記適用することが植物種子を用いて実施され、前記方法が、前記ペプチドまたは前記組成物で処理された前記種子を天然土壌または合成土壌に植え付けること、及び、前記土壌に植え付けた前記種子から植物を繁殖させることをさらに含む、請求項120に記載の方法。
  125. 前記適用することが、前記植物が成長している場所または成長すると予測される場所で実施される、請求項120に記載の方法。
  126. 前記植物が、それぞれその天然形態または遺伝的に改変された形態の農業用植物、造林用植物、観賞植物、及び園芸用植物から選択される、請求項120に記載の方法。
  127. 前記植物が遺伝的に改変された植物である、請求項120に記載の方法。
  128. 処理する前記植物が、アルファルファ、リンゴ、アプリコット、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ、ブナ(ファーグス種)、ベゴニア、カバノキ、ブラックベリー、ブルーベリー、キャベツ、クスノキ、キャノーラ、ニンジン、トウゴマ、サクラ、ニッケイ、柑橘類、ココア豆、コーヒー、トウモロコシ、綿、キュウリ、ウリ、ユーカリ、モミ、亜麻、飼料ビート、フクシア、ニンニク、フウロソウ、ブドウ、ラッカセイ、***、ホップ、ザイフリボク、ジュンセア(セイヨウカラシナ)、黄麻、レンズマメ、レタス、アマニ、メロン、マスタード、オーク、オートムギ、アブラヤシ、アブラナ、オリーブ、タマネギ、パプリカ、エンドウ、モモ、セイヨウナシ、ペラルゴニウム、コショウ、ペチュニア、マツ(ピヌス種)、ポプラ(ポプルス種)、仁果類、ジャガイモ、セイヨウアブラナ、ラズベリー、イネ、ゴムノキ、ライ麦、モロコシ、ダイズ、ホウレンソウ、トウヒ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、チャノキ、チークノキ、タバコ、トマト、ライコムギ、芝生、スイカ、コムギ、及びヤナギ(サリクス種)からなる群から選択される、請求項120に記載の方法。
  129. 有効量の、請求項1から89及び108のいずれか一項に記載の単離されたペプチド、請求項90から92及び109のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、または請求項93から107及び110のいずれか一項に記載の組成物を、植物もしくは植物種子にまたは前記植物が成長している場所もしくは成長すると予測される場所に適用すること
    を含み、前記適用が、昆虫、クモ類、線虫、雑草、及びそれらの組合せからなる群から選択される生物的ストレス因子に対する植物の耐性及び抵抗性を増大させるために有効である、生物的ストレスに対する植物の耐性及び抵抗性を増大させる方法。
  130. 前記適用することが植物を用いて実施される、請求項129に記載の方法。
  131. 前記植物が、少なくとも1種の除草剤に対して耐性を有する、請求項130に記載の方法。
  132. 前記適用することが植物種子を用いて実施され、前記方法が、前記ペプチドまたは前記組成物で処理された前記種子を天然土壌また合成土壌に植え付けること、及び前記土壌に植え付けた前記種子から植物を繁殖させることをさらに含む、請求項129に記載の方法。
  133. 前記適用することが、前記植物が成長している場所または成長すると予測される場所で実施される、請求項129に記載の方法。
  134. 前記植物が、それぞれその天然形態または遺伝的に改変された形態の農業用植物、造林用植物、観賞植物、及び園芸用植物から選択される、請求項129に記載の方法。
  135. 前記植物が遺伝的に改変された植物である、請求項129に記載の方法。
  136. 処理する前記植物が、アルファルファ、リンゴ、アプリコット、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ、ブナ(ファーグス種)、ベゴニア、カバノキ、ブラックベリー、ブルーベリー、キャベツ、クスノキ、キャノーラ、ニンジン、トウゴマ、サクラ、ニッケイ、柑橘類、ココア豆、コーヒー、トウモロコシ、綿、キュウリ、ウリ、ユーカリ、モミ、亜麻、飼料ビート、フクシア、ニンニク、フウロソウ、ブドウ、ラッカセイ、***、ホップ、ザイフリボク、ジュンセア(セイヨウカラシナ)、黄麻、レンズマメ、レタス、アマニ、メロン、マスタード、オーク、オートムギ、アブラヤシ、アブラナ、オリーブ、タマネギ、パプリカ、エンドウ、モモ、セイヨウナシ、ペラルゴニウム、コショウ、ペチュニア、マツ(ピヌス種)、ポプラ(ポプルス種)、仁果類、ジャガイモ、セイヨウアブラナ、ラズベリー、イネ、ゴムノキ、ライ麦、モロコシ、ダイズ、ホウレンソウ、トウヒ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、チャノキ、チークノキ、タバコ、トマト、ライコムギ、芝生、スイカ、コムギ、及びヤナギ(サリクス種)からなる群から選択される、請求項129に記載の方法。
  137. 有効量の、請求項1から89及び108のいずれか一項に記載の単離されたペプチド、請求項90から92及び109のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、または請求項93から107及び110のいずれか一項に記載の組成物を、植物もしくは植物種子にまたは前記植物が成長している場所もしくは成長すると予測される場所に適用すること
    を含み、前記適用が、塩ストレス、水ストレス、オゾンストレス、重金属ストレス、低温ストレス、高温ストレス、栄養ストレス、及びそれらの組合せからなる群から選択される非生物的ストレス因子に対する前記植物の耐性を増大させるために有効である、非生物的ストレスに対する植物の耐性を増大させる方法。
  138. 前記適用することが植物を用いて実施される、請求項137に記載の方法。
  139. 前記植物が、少なくとも1種の除草剤に対して耐性を有する、請求項138に記載の方法。
  140. 前記適用することが植物種子を用いて実施され、前記方法が、前記ペプチドまたは前記組成物で処理された前記種子を天然土壌また合成土壌に植え付けること、及び前記土壌に植え付けた前記種子から植物を繁殖させることをさらに含む、請求項137に記載の方法。
  141. 前記適用することが、前記植物が成長している場所または成長すると予測される場所で実施される、請求項137に記載の方法。
  142. 前記植物が、それぞれその天然形態または遺伝的に改変された形態の農業用植物、造林用植物、観賞植物、及び園芸用植物から選択される、請求項137に記載の方法。
  143. 前記植物が遺伝的に改変された植物である、請求項137に記載の方法。
  144. 処理する前記植物が、アルファルファ、リンゴ、アプリコット、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ、ブナ(ファーグス種)、ベゴニア、カバノキ、ブラックベリー、ブルーベリー、キャベツ、クスノキ、キャノーラ、ニンジン、トウゴマ、サクラ、ニッケイ、柑橘類、ココア豆、コーヒー、トウモロコシ、綿、キュウリ、ウリ、ユーカリ、モミ、亜麻、飼料ビート、フクシア、ニンニク、フウロソウ、ブドウ、ラッカセイ、***、ホップ、ザイフリボク、ジュンセア(セイヨウカラシナ)、黄麻、レンズマメ、レタス、アマニ、メロン、マスタード、オーク、オートムギ、アブラヤシ、アブラナ、オリーブ、タマネギ、パプリカ、エンドウ、モモ、セイヨウナシ、ペラルゴニウム、コショウ、ペチュニア、マツ(ピヌス種)、ポプラ(ポプルス種)、仁果類、ジャガイモ、セイヨウアブラナ、ラズベリー、イネ、ゴムノキ、ライ麦、モロコシ、ダイズ、ホウレンソウ、トウヒ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、チャノキ、チークノキ、タバコ、トマト、ライコムギ、芝生、スイカ、コムギ、及びヤナギ(サリクス種)からなる群から選択される、請求項137に記載の方法。
  145. 有効量の、請求項1から89及び108のいずれか一項に記載の単離されたペプチド、請求項90から92及び109のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、または請求項93から107及び110のいずれか一項に記載の組成物を、植物にまたは前記植物が成長している場所に適用すること
    を含み、前記適用が観賞植物から取り出された切り出し部分に乾燥抵抗性を付与するために有効である、前記観賞植物から取り出された切り出し部分に乾燥抵抗性を付与する方法。
  146. 前記適用することが観賞植物を用いて実施される、請求項145に記載の方法。
  147. 前記適用することが、前記観賞植物が成長している場所で実施される、請求項145に記載の方法。
  148. 前記観賞植物が遺伝的に改変された観賞植物である、請求項145に記載の方法。
  149. 処理する前記植物が、ブナ(ファーグス種)、ベゴニア、カバノキ、ハボタン(ornamental cabbage)、モミ、フクシア、ニンニク、フウロソウ、オーク、観賞用タマネギ、ペラルゴニウム、ペチュニア、マツ(ピヌス種)、ポプラ(ポプルス種)、ヒマワリ、チークノキ、タバコ、芝生、及びヤナギ(サリクス種)からなる群から選択される、請求項145に記載の方法。
  150. 有効量の、請求項1から89及び108のいずれか一項に記載の単離されたペプチド、請求項90から92及び109のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、または請求項93から107及び110のいずれか一項に記載の組成物を、果実もしくは野菜を含む植物にまたは前記植物が成長している場所に適用すること、または
    有効量の前記単離されたペプチドもしくは前記組成物を、収穫された果実もしくは野菜に適用すること
    を含み、
    前記適用が前記果実または前記野菜に収穫後病害抵抗性または収穫後乾燥抵抗性を付与するために有効である、果実または野菜に収穫後病害抵抗性または収穫後乾燥抵抗性を付与する方法。
  151. 前記適用することが植物を用いて実施される、請求項150に記載の方法。
  152. 前記植物が、少なくとも1種の除草剤に対して耐性を有する、請求項151に記載の方法。
  153. 前記適用することが、前記植物が成長している場所で実施される、請求項150に記載の方法。
  154. 前記適用することが、収穫された果実または野菜を用いて実施される、請求項150に記載の方法。
  155. 前記植物が遺伝的に改変された植物である、請求項150に記載の方法。
  156. 前記植物が、リンゴ、アプリコット、アスパラガス、アボカド、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、キャベツ、ニンジン、サクラ、柑橘類、トウモロコシ、キュウリ、ウリ、飼料ビート、ニンニク、ブドウ、ザイフリボク、ジュンセア(セイヨウカラシナ)、レタス、メロン、マスタード、オリーブ、タマネギ、エンドウ、モモ、セイヨウナシ、コショウ、仁果類、ジャガイモ、セイヨウアブラナ、ラズベリー、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、チャノキ、トマト、ライコムギ、及びスイカからなる群から選択される、請求項150に記載の方法。
  157. 有効量の、請求項1から89及び108のいずれか一項に記載の単離されたペプチド、請求項90から92及び109のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、または請求項93から107及び110のいずれか一項に記載の組成物を、果実もしくは野菜を含む植物にまたは前記植物が成長している場所に適用すること、または
    有効量の前記単離されたペプチドもしくは前記組成物を、収穫された果実もしくは野菜に適用すること
    を含み、
    前記適用が果実または野菜の成熟の寿命を延ばすために有効である、果実または野菜の成熟の寿命を延ばす方法。
  158. 前記適用することが植物を用いて実施される、請求項157に記載の方法。
  159. 前記植物が、少なくとも1種の除草剤に対して耐性を有する、請求項157に記載の方法。
  160. 前記適用することが、前記植物が成長している場所で実施される、請求項157に記載の方法。
  161. 前記適用することが、収穫された果実または野菜を用いて実施される、請求項157に記載の方法。
  162. 前記植物が遺伝的に改変された植物である、請求項157に記載の方法。
  163. 前記植物が、リンゴ、アプリコット、アスパラガス、アボカド、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、キャベツ、ニンジン、サクラ、柑橘類、トウモロコシ、キュウリ、ウリ、飼料ビート、ニンニク、ブドウ、ザイフリボク、ジュンセア(セイヨウカラシナ)、レタス、メロン、マスタード、オリーブ、タマネギ、エンドウ、モモ、セイヨウナシ、コショウ、仁果類、ジャガイモ、セイヨウアブラナ、ラズベリー、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、チャノキ、トマト、ライコムギ、及びスイカからなる群から選択される、請求項157に記載の方法。
  164. 有効量の、請求項1から89及び108のいずれか一項に記載の単離されたペプチド、請求項90から92及び109のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、または請求項93から107及び110のいずれか一項に記載の組成物を、植物もしくは植物種子にまたは前記植物が成長している場所もしくは成長すると予測される場所に適用すること
    を含み、前記適用が植物生化学的シグナル伝達をモジュレートするために有効である、植物生化学的シグナル伝達をモジュレートする方法。
  165. 前記植物生化学的シグナル伝達が、酸化窒素産生、過酸化物産生、または二次代謝産物の誘導;エチレンシグナル伝達経路のアゴニストモジュレーション、及びエチレン応答遺伝子発現の誘導;サリチル酸シグナル伝達経路のアゴニストモジュレーション、及びサリチル酸応答遺伝子発現の誘導;アブシジン酸経路のアゴニストモジュレーション、及びアブシジン酸応答遺伝子発現の誘導;ジベレリンシグナル伝達経路のアゴニストモジュレーション、及びジベレリン応答遺伝子発現の誘導;ジャスモン酸シグナル伝達のアンタゴニストモジュレーション、及びジャスモン酸応答遺伝子の発現の阻害;プロテアーゼ阻害物質発現の誘導;植物組織における活性酸素種産生の誘導;免疫関連ペプチド及び抗微生物ペプチドの産生の誘導;ならびにエキスパンシンの遺伝子発現及び産生の誘導からなる群から選択される、請求項164に記載の方法。
  166. 請求項1から89及び108のいずれか一項に記載のポリペプチドの単離されたペプチドまたは請求項90から92及び109のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする第1の核酸分子と、前記第1の核酸分子に作動可能にカップリングしたプロモーターとして有効な(promoter−effective)核酸分子とを含む、DNAコンストラクト。
  167. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを含む、組換え発現ベクター。
  168. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを含む、組換え宿主細胞。
  169. 植物プロトプラストである、請求項168に記載の組換え宿主細胞。
  170. 細菌である、請求項168に記載の組換え宿主細胞。
  171. 請求項168に記載の組換え宿主細胞を含む、形質転換植物。
  172. 請求項168に記載の組換え宿主細胞を含む、形質転換植物種子。
  173. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを含む、形質転換植物。
  174. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを含む、形質転換植物種子。
  175. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物を提供すること;及び
    前記DNAコンストラクトが前記ペプチドまたは前記融合ポリペプチドを発現して病害抵抗性を付与することを可能にするために有効な条件下で、前記植物を成長させること
    を含む、植物に病害抵抗性を付与する方法。
  176. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物を提供すること;及び
    前記DNAコンストラクトが前記ペプチドまたは前記融合ポリペプチドを発現して植物成長を増進させることを可能にするために有効な条件下で、前記植物を成長させること
    を含む、植物成長を増進させる方法。
  177. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物を提供すること;及び
    前記DNAコンストラクトが前記ペプチドまたは前記融合ポリペプチドを発現して病害抵抗性を付与することを可能にするために有効な条件下で、前記植物を成長させること
    を含む、植物に病害抵抗性を付与する方法。
  178. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物を提供すること;ならびに
    前記DNAコンストラクトが前記ペプチドまたは前記融合ポリペプチドを発現して昆虫、クモ類、線虫、雑草、及びそれらの組合せからなる群から選択される生物的ストレス因子に対する前記植物の耐性及び抵抗性を増大させることを可能にするために有効な条件下で、前記植物を成長させること
    を含む、生物的ストレスに対する植物の耐性及び抵抗性を増大させる方法。
  179. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物を提供すること;ならびに
    前記DNAコンストラクトが前記ペプチドまたは前記融合ポリペプチドを発現して塩ストレス、水ストレス、オゾンストレス、重金属ストレス、低温ストレス、高温ストレス、栄養ストレス、及びそれらの組合せからなる群から選択される非生物的ストレス因子に対する前記植物の耐性を増大させることを可能にするために有効な条件下で、前記植物を成長させること
    を含む、非生物的ストレスに対する植物の耐性を増大させる方法。
  180. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換観賞植物を提供すること;及び
    前記DNAコンストラクトが前記ペプチドまたは前記融合ポリペプチドを発現して前記形質転換観賞植物から取り出された切り出し部分に乾燥抵抗性を付与することを可能にするために有効な条件下で、前記植物を成長させること
    を含む、観賞植物から取り出された切り出し部分に乾燥抵抗性を付与する方法。
  181. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物を提供すること;及び
    前記DNAコンストラクトが前記ペプチドまたは前記融合ポリペプチドを発現して前記形質転換植物から採られた果実または野菜に収穫後病害抵抗性または収穫後乾燥抵抗性を付与することを可能にするために有効な条件下で、前記植物を成長させること
    を含む、果実または野菜に収穫後病害抵抗性または収穫後乾燥抵抗性を付与する方法。
  182. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物を提供すること;及び
    前記DNAコンストラクトが前記ペプチドまたは前記融合ポリペプチドを発現して前記形質転換植物から採られた果実または野菜についての成熟の寿命を延ばすことを可能にするために有効な条件下で、前記植物を成長させること
    を含む、果実または野菜の成熟の寿命を延ばす方法。
  183. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物種子を提供すること;
    前記形質転換植物種子を土壌に植え付けること;及び
    前記DNAコンストラクトが前記ペプチドまたは前記融合ポリペプチドを発現して病害抵抗性を付与することを可能にするために、前記形質転換植物種子から形質転換植物を繁殖させること
    を含む、植物に病害抵抗性を付与する方法。
  184. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物種子を提供すること;
    前記形質転換植物種子を土壌に植え付けること;及び
    前記DNAコンストラクトが前記ペプチドまたは前記融合ポリペプチドを発現して植物成長を増進させることを可能にするために、前記形質転換植物種子から形質転換植物を繁殖させること
    を含む、植物成長を増進させる方法。
  185. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物種子を提供すること;
    前記形質転換植物種子を土壌に植え付けること;及び
    前記DNAコンストラクトが前記ペプチドまたは前記融合ポリペプチドを発現して病害抵抗性を付与することを可能にするために、前記形質転換植物種子から形質転換植物を繁殖させること
    を含む、植物に病害抵抗性を付与する方法。
  186. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物種子を提供すること;
    前記形質転換植物種子を土壌に植え付けること;及び
    前記DNAコンストラクトが前記ペプチドまたは前記融合ポリペプチドを発現して昆虫、クモ類、線虫、雑草、及びそれらの組合せからなる群から選択される生物的ストレス因子に対する前記植物の耐性及び抵抗性を増大させることを可能にするために、前記形質転換植物種子から形質転換植物を繁殖させること
    を含む、生物的ストレスに対する植物の耐性及び抵抗性を増大させる方法。
  187. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物種子を提供すること;
    前記形質転換植物種子を土壌に植え付けること;及び
    前記DNAコンストラクトが前記ペプチドまたは前記融合ポリペプチドを発現して塩ストレス、水ストレス、オゾンストレス、重金属ストレス、低温ストレス、高温ストレス、栄養ストレス、及びそれらの組合せからなる群から選択される非生物的ストレス因子に対する前記植物の耐性を増大させることを可能にするために、前記形質転換植物種子から形質転換植物を繁殖させること
    を含む、非生物的ストレスに対する植物の耐性を増大させる方法。
  188. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換観賞植物種子を提供すること;
    前記形質転換観賞植物種子を土壌に植え付けること;及び
    前記DNAコンストラクトが前記ペプチドまたは前記融合ポリペプチドを発現して形質転換観賞植物から取り出された切り出し部分に乾燥抵抗性を付与することを可能にするために、前記形質転換観賞植物種子から前記形質転換観賞植物を繁殖させること
    を含む、観賞植物から取り出された切り出し部分に乾燥抵抗性を付与する方法。
  189. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物種子を提供すること;
    前記形質転換植物種子を土壌に植え付けること;及び
    前記DNAコンストラクトが前記ペプチドまたは前記融合ポリペプチドを発現して形質転換植物から採られた果実または野菜に収穫後病害抵抗性または収穫後乾燥抵抗性を付与することを可能にするために、前記形質転換植物種子から前記形質転換植物を繁殖させること
    を含む、果実または野菜に収穫後病害抵抗性または収穫後乾燥抵抗性を付与する方法。
  190. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物種子を提供すること;
    前記形質転換植物種子を土壌に植え付けること;及び
    前記DNAコンストラクトが前記ペプチドまたは前記融合ポリペプチドを発現して形質転換植物から採られた果実または野菜についての成熟の寿命を延ばすことを可能にするために、前記形質転換植物種子から前記形質転換植物を繁殖させること
    を含む、果実または野菜の成熟の寿命を延ばす方法。
  191. 請求項166に記載のDNAコンストラクトを用いて形質転換された形質転換植物種子を提供すること;
    前記形質転換植物種子を土壌に植え付けること;及び
    前記DNAコンストラクトが前記ペプチドまたは前記融合ポリペプチドを発現して植物生化学的シグナル伝達をモジュレートすることを可能にするために、前記形質転換植物種子から形質転換植物を繁殖させること
    を含む、植物生化学的シグナル伝達をモジュレートする方法。
  192. 前記植物生化学的シグナル伝達が、酸化窒素産生、過酸化物産生、または二次代謝産物の誘導;エチレンシグナル伝達経路のアゴニストモジュレーション、及びエチレン応答遺伝子発現の誘導;サリチル酸シグナル伝達経路のアゴニストモジュレーション、及びサリチル酸応答遺伝子発現の誘導;アブシジン酸経路のアゴニストモジュレーション、及びアブシジン酸応答遺伝子発現の誘導;ジベレリンシグナル伝達経路のアゴニストモジュレーション、及びジベレリン応答遺伝子発現の誘導;ジャスモン酸シグナル伝達のアンタゴニストモジュレーション、及びジャスモン酸応答遺伝子の発現の阻害;プロテアーゼ阻害物質発現の誘導;植物組織における活性酸素種産生の誘導;免疫関連ペプチド及び抗微生物ペプチドの産生の誘導;ならびにエキスパンシンの遺伝子発現及び産生の誘導からなる群から選択される、請求項191に記載の方法。
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