JPH01273581A - 新規なバチルス菌株ａ２０及びａ２９及びそれを含有する殺虫剤組成物並びに植物保護法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な細菌株に関し、特に細菌バチルス・スリ
ンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅ
ｎｓｉｓ）の新規菌株及びその使用に関する。

細菌バチルス・スリンジエンシスは昆虫を殺［する結晶
蛋白質である菌体内毒素（エンドトキシンともいう）を
産生ずる。しかしながら、該菌体内毒素は哨乳動物に対
しては毒性がない。従って、該菌体内毒素は農業用殺虫
剤として特に鱗翅目昆虫に対する殺虫剤として非常に有
用であり、バチルス・スリンジエンシスの１種又Ｆｉ２
［以上の菌株は長い間農業用殺虫剤として使用されて来
た。

市販品として最も一般に使用されるバチルス・スリンジ
エンシスの菌株はＨＤ−１（米国農務省に保存されてい
るバチルス・スリンジエンシス菌株類の保存菌から入手
できる）である。この公知の菌株ＨＤ　−１の菌学的性
質ばｒ　ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｐ
ｅ５ｔｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　１
９７０−１９８０　Ｊ　（ＨＤ　Ｂｕｒｇｅｓ　編、　
Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　　（ロンドン）発行、
　１９８１年）の第３５〜４４頁［Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ　　ｏｆ　Ｈ５ｅｒｏｔｙｐｅｓ　　ｏｆ　
　Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｃｉｓ　Ｊに
記載されている。本発明者らは今般公知の菌株ＨＤ　−
１に概ね似た性質を有するが一連のｇ翅目の害虫に対し
て向上した殺虫活性を有することによってＨＤ　−１と
区別されるバチルス・スリンジエンシスの新規菌株を見
出した。

すなわち、本発明においては、ザ・ナショナル・コレク
ション・オプ・インダストリアル・アンド−マリン−バ
クテリア（ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉ
ｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ）にそれぞれ寄託番号ＮＣＩＢ
１２５７０及びＮＣＪＢ１２５７１として寄託されたバ
チルス　スリンジエンシスの新規菌株Ａ２０及びＡ２９
が提供されるものである。

本発明の別の要旨においては、前記の新規菌株Ａ２０又
はＡ２９によって産生式れたδ−菌体内毒素を含有する
ことを特徴とする新規殺虫剤組成物が提供されるもので
あり、更に昆虫の被害から植物を保護する方法であって
該昆虫を前記の新規菌株Ａ２０又はＡ２９によって産生
されたδ−菌体内毒素に接触させることからなる昆虫の
被害から植物を保護する方法が提供されるものである。

本発明の新規菌株Ａ２０はカナダ国オンタリオ州コーパ
ーグ（Ｃｏｂｕｒｇ　）　　（Ｄスゼの木の下で採取し
た土壌から単離した。本発明の新規菌株Ａ２９はコロラ
ドハムシの幼虫から単離した。本発明の新規菌株Ａ２０
及びＡ２９は形態学的性状及び−般的な生化学的性質に
おいて公知の菌株ＨＤ　−１に全般的にて類似している
。本発明の新規菌株Ａ２０及びＡ２９並びに公知の菌株
ＨＤ　−１の形態学的性状の比較を第１表で示す。

本発明の新規菌株Ａ２０及びＡ２９並びに公知の菌株Ｈ
Ｄ　−１の生化学的性質の比較を第２表〜第４表に表示
する。

マイクロタイター平板培地（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ　ｐ
ｌａｔｅ）での生化学的特性 （ト）二部公的な反応を表わす。

前記の類似性があることの点からみて、Ａ２０及びＡ２
９菌株が一連のＭ列目害虫に対してＨＤ−１菌株と比べ
て著しく向上した殺虫活性を示すことは意外である。

本発明の新規菌株はザ・ナショナル・コレクション・オ
ブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリアか
ら入手できるＮＣＩＢ１２５７０及びＮＣＩＢ１２５７
１の試料を適当な培地中で適当な条件下で培養すること
によって必要量を製造できる。培養条件及び培地は当業
者には周知である。培地は例えば一般に窒素源（例えば
魚肉蛋白）や炭水化物源例えばデンプンを含有する。適
当な培養条件としては１５〜４５°Ｃの範囲の温度とほ
ぼ中性の−１が挙げられる。培養は回分式で代表的には
１〜６日間行なうのが最も都合がよい。

本発明の殺虫剤組成物は新規菌株Ａ２０又はＡ２９の培
養液を濃縮することによって、例えば遠心分離するか又
＃ｉｔ’過し、次いで所望の適当な配合剤を加えること
によって製造することができる。

有用であり得る配合剤としては、例えば界面活性剤、例
えば湿潤剤、固体希釈剤、分散剤及び紫外線安定剤が挙
げられる。所望ならば、固体製剤は公知の方法で製造す
ることができる。

本発明の鱗翅目の昆虫による虫害から植物を保護する方
法は一般に、昆虫が蔓延した植物又は蔓延しそうな植物
に水のような希釈剤で希釈した上記の殺虫剤組成物を噴
霧することによって行なう。

該殺虫剤は有毒な菌体内！！素である。所望ならば、該
殺虫剤は有毒な菌体内毒素を産生ずる細菌とけ関係なく
、植物に又は他物に蔓延する昆虫に施用することができ
るが、細菌から結晶性蛋白を分離することは一般的に必
要がない。

本発明の鱗翅目の昆虫による被害から植物を保護する方
法を実施する一つの方法は、昆虫の被害に感受性の植物
がその生体内の現場でδ−菌体内毒素を産生ずるように
植物を調整することである。

これは新規菌株ＮＣＩＢ１２５７０又は１２５７１の何
れか一方からのδ−菌体内毒素の遺伝子を公知の方法で
クローニングし、植物内に該遺伝子の発現（ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ　）　　を生起させる適当なプロモータ−（
例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）を該遺伝子に具備
させ、次いで該植物を公知の方法（例えばＴｉプラスミ
ドの使用）で形質転換することによって行なわれる。上
記のことを具現させるような方法は欧州特許出願（ＥＰ
Ａ　）第１４２９２４号明細書（Ａｇｒｉｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ社）により詳しく記載宮れており、その開示は本明
細書に引用される。

本発明の方法によって最も有効に撲滅できる昆虫はｖｉ
翅目例えば以下の第５表に挙げた昆虫である。

本発明の方法は鱗翅目昆虫が蔓延しやすい広範囲の植物
を保護するのに使用する仁とができる。

本発明の方法で保護される市販の重要な植物の具体例は
トウモロコシ及び球果植物、並びに稲、小穀粒穀物例え
ば小麦や大麦、及びレタス、トマト。

テンサイを含めた野菜類である。

本発明を以下の実施例によって説明する。

実施例１ カナダ国オンタリオ州コーパーグのスギの木の下で見つ
けて採取した土壌試料を取シ、その０．５ｇを、０．０
５％はプトン水４５プを入れた希釈ピンに装入し、希釈
し１０　　希釈液を得た。次いでこの希釈液試料を６０
°Ｃの水浴に１０分間移すことによって熱処理した。次
いで更に希釈するために上記の希釈液試料０．５ｄを採
取し、それを０．０５％はプトン水４，５ｄに加えるこ
とによって更に希釈した希釈液を調製した（例えば上記
の１０　　希釈液０．５４をペプトン希釈剤４．５−に
加えることによって１０　　　希釈液を得る）。希釈は
１０　　　希釈液が得られる迄繰り返した。バチルス・
セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　）選択培
地〔パチルｘ−セレウス寒天基剤、カナダ国オキソイド
（０ｘｏｉｄ　）　社からコード（Ｃｏｄｅ　）　ＣＭ
　６１７として入手できる〕とエスクリン（ｅｓｃｕｌ
ｉｎ　）寒天（水１を当シのＩ数：エスクリン１．０ｇ
ｐクエン酸第二鉄０．５ｇ；にブトｙ　１０　ｇ；Ｎａ
Ｃｊ　ｓｇｊ寒天２０りを１０−３〜１０　　　希釈液
を平板培養するのに使用した。平板にした試料は３０°
Ｃで５日間培養し、次いで潜在シテいるバチルス・スリ
ンジエンシスのコロニー（集落ともいう）を調べた。ス
ミルノフ（Ｓｍ１ｒｎｏｆｆ　）　　染色法を用いて選
択したコロニーのスライド（５ｌｉｄｅ　）ガラス試料
を作成し、顕微鏡（油浸レンズを使用し１０００倍の倍
高で）で黒く染色されたバラ胞子体の結晶（ｐａｒａｓ
ｐｏｒａｌｃｒｙｓｔａｌｇ　）　　の存在を調べた。

バラ胞子体の結晶は通常は両角錐状であるが必ずしも両
角錐（ｂｉｐｙｒａｍｉｄａｌ　）形の形状とは限らな
い。結晶が認められた陽性（ｃｒｙｓｔａｌ　−ｐｏｓ
ｉ’ｔｉｖｅ　）　　のコ。

ニーは純培養物を確実に収得するために普通寒天上に画
線塗床し、次いで６０°Ｃで５日間培養した。

結晶の存在を確認し且つ純度を調べるためにスミルノフ
染色法を反復した。純化したコロニーは普通寒天斜面に
移植し、別途使用のために４０°Ｃの冷蔵庫中で保存し
た。

実施例２ Ａ２９の単離 本発明のバチルス・スリンジエンシスＡ２９菌株の採取
源はコロラドハムシ（Ｃｏ１ｏｒａｄｏ　Ｐｏｔａｔ。

ｂｅｅｔｌｅ　）　　の幼虫の死去であった。コロラド
ハムシ幼虫を少量のはプトン希釈剤と共に殺菌した乳鉢
と乳棒で磨砕した。得られた液体を・ぞスラールビはッ
トを用いて採取し、はプトン希釈剤（０，０５％はプト
ン水）４．５−を入れた試験管に加え、これを１０　　
　希釈液とした。次いで、これを６０°Ｃの水浴に移す
ことによって試料を１０分間熱処理した。次いで、更に
希釈するためにこの希釈液試科ｏ、　ｓ　ｒｒｔｌを採
取し、０．０５％ペプトン水４．５　ｍｌ　ニ加えるこ
とによって更に希釈した希釈液を調製した（例えば、１
０　　　希釈液１．５ｍＪをにプトン希釈剤４．５−に
加えると１０　　　希釈液が得られる）。

希釈は１０　　　希釈液が得られる迄反りした。・寸チ
ルス・セレウス選択培地〔バチルス・セレウス寒天基剤
、カナダ国オキソイド社からコードＣＭ６１７として入
手できる〕とエスクリン寒天（水１Ｌ当りのｇ数：エス
クリン１．０．９　；クエン酸第二鉄Ｏ，Ｓｇ；ペプト
ン１０ｇ；ＮａＣｌ３１！；寒天２０ｇ）とを１０　〜
１０　　希釈液を平板培養するのに使用した。平板にし
た試料は３０°Ｃで５日間培養し、次いで潜在している
バチルス・スリンジエンシスのコロニーを調べた。スミ
ルノフ染色法を用いて選択したコロニーのスライドガラ
ス試料を作成し、顕微鏡（油浸レンズを使用し、１００
０倍の倍率で）黒く染色されたパラ胞子体の結晶の存在
を調べた。

・署う胞子体の結晶は通常は両角錐状であるが必ずしも
両角錐形の形状とは限らない。結晶性の陽性コロニーは
純培養を確実にするために普通寒天上に画線し、更（７
Ｉ：３０°Ｃで５日間培養した。スミルノフ染色を反復
し結晶の存在を確碌し次いで純度を調べた。純化したコ
ロニーは普通寒天斜面に移植し、別途使用のために４０
°Ｃの冷蔵庫中で保存した。

実施例３ ■増殖 接ね試料Ａ２０菌株を寒天斜面培養物から１００ｄのＣ
ＲＬＡ１培地（水１を当りのＩ数又はゴ数：普通ブイヨ
ン８ｇニゲルコース６ｇ；酵母エキス５！ｑ；キシロー
ス０．５ｇ；綿実粉エキス３０ゴ；コーン浸液１２Ｒ／
；マリ−メンデルの塩混合物１ｄ）　を入れた２５０ｒ
Ｌｌエルレンマイヤーフラスコに移植し、３００　ｒｐ
ｍで攪拌しなから３０’Ｃで培養した。２４時間後この
培養液の全量１００ｍｊを使用して上記と同じ培地１ｔ
を入れた２ｔフラスコに接種した。これを５０　Ｏｒｐ
ｍで攪拌しながら６０°Ｃで５日間培養した。

菌株Ａ２９を同じ方法で増殖させた。

実施例４ 前記の培養サイクルの完了時に、培養液からまずバチル
ス・スリンジエンシスの胞子及び結晶を分離し、次いで
遠心分離するか又はミクロｒ遇することによってＡ２０
菌株を集菌した。集菌した胞子と結晶を水１００ｍｊに
再懸濁し、次いでこれにモルウェット（Ｐ、（ｏｒｗｅ
ｔ　）　Ｄ　−４２５（分散剤）４．９，９．Ｗ−ガム
（Ｖｃｅｇｕｍ　）　ＨＶ　（懸濁斉Ｊ）４．９Ｉ、ラ
イ−７（Ｔｗｅｅｎ　）　８０　　（ＨＡ潤剤）４．９
ｍ及びソルボ（５ｏｒｂｏ　）　（凍結防止剤）２４．
４１ｎＩ！を加えることによって濃厚液剤に製剤した。

この製剤は使用に先豆って４０°Ｃで保持した。Ａ２９
菌株及びＨＤ−ＩＷ株を使用して同様の製剤″Ｉｔ調剤
した。後者（）ＩＤ　−１）　　は対照例として使用し
た。

実施例５ 実施例４に記載した各製剤を使用して実施例３に記載し
たようにして得たバチルス・スリンジエンシス菌株Ａ２
０及びＡ２９の胞子と結晶の混合物を茎葉試験でハマキ
ガ幼虫に対して試験した。

ハマキガ幼虫（４ｍ５令期幼虫）を自然に蔓延させたモ
ミの木の枝にパックバック（ｂａｃｋｐａｃｋ　）式噴
霧機、型式Ｍ　ＲＹ　−２ＣＨａｒｔｖｉｇ　Ｊｅｎｓ
ｅｎ　＆Ｃｏ　　社（デンマーク国）から市販のもの〕
を使用して噴霧した。菌株Ａ２Ｑと公知の菌株Ｉ（Ｄ　
−１については、霧滴の大きさ（直径で）は平均３２細
　で２０〜１２０Ｒｎの範囲であった。菌株Ａ２９につ
いては霧滴の直径は平均３２μｍで２０〜６０μｍの範
囲であった。いずれの場合も針（ｎｅｅｄｌｅ）当り約
１１滴であった。いずれの菌株も３０×１０９国際単位
（ＩＵ）／ヘクタールの濃度でＩ！Ｘ霧した。薬剤噴霧
処理したモミの木の枝は飼育室でサナギになる迄飼育し
た。得られた結果は死去率（イ）〔（（死去数）／（死
去数）＋（生虫数）　）　Ｘ　１００　］で表わした。

木　製剤に使用したバチルス・スリンジエンシスの量■
で死去惠を割った値を表わす。

本実施例で、それらの効果比より菌株Ａ−２０は菌株Ｈ
Ｄ　−１よりも５．１倍活性が高かく、菌株Ａ２９は菌
株ＨＤ　−１よりも６．５６倍活性が高かった。

実施例６ 実施例６で５日間培養を行なった後、その細胞。

胞子及び結晶を遠心分離とアセトン沈澱によって集菌し
た。得られた粉末を供試昆虫に適した人工食餌に配合し
た。食餌を供試昆虫に与え、標準法を使用して死去率を
記録した。公知の菌株ＨＤ−１を使用して比較試験を行
なった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、スコットランドのザ・ナショナル・コレクション・
   オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア
   にそれぞれ寄託番号ＮＣＩＢ１２５７０及び１２５７１
   として寄託されてあるバチルス・スリンジエンシス（Ｂ
   ａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｃｉｓ）の新規
   菌株Ａ２０及びＡ２９。 ２、前記の新規菌株Ａ２０及びＡ２１のうちの一つによ
   つて産生された殺虫性δ−菌体内毒素を有効成分として
   含有する鱗翅目害虫防除用殺虫剤組成物。 ３、さらに固体希釈剤又は界面活性剤を含有する請求項
   ２記載の殺虫剤組成物。 ４、鱗翅目の昆虫による被害から植物を保護する方法で
   あつて、該鱗翅目昆虫を請求項１記載の新規菌株Ａ２０
   及びＡ２９のうちの一つによつて産生されたδ−菌体内
   毒素に接触させることからなる、鱗翅目の昆虫による被
   害から植物を保護する方法。 ５、鱗翅目の昆虫の被害を受ける前に又は被害を受けて
   いる間に植物に請求項２又は３のいずれかに記載の組成
   物の殺虫有効量を噴霧することからなる請求項４記載の
   方法。 ６、前記のδ−菌体内毒素が請求項１記載の新規菌株Ａ
   ２０及びＡ２７のいずれかから誘導された遺伝子によつ
   て植物体内に産生されたものである請求項４記載の方法
   。 ７、前記の植物がトウモロコシ又は球果植物である請求
   項４〜６のいずれかに記載の方法。 ８、前記の昆虫がハマキガ幼虫又はマイマイガである請
   求項７記載の方法。 ９、前記のδ−菌体内毒素が菌株Ａ２０から誘導された
   ものである請求項４〜９のいずれかに記載の方法。