CN102103087A - 糖链抗原125化学发光定量检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于糖链抗原125检测的化学发光定量检测试剂盒,该试剂盒包括CA125检测反应板,反应板包被有抗CA125抗体。CA125检测试剂盒,还包括:酶结合物,发光底物,校准品,质控品,浓缩洗涤液。本发明可以专一的定量检测出病人血清CA125的含量,诊断卵巢癌并能根据CA125的水平判断肿瘤大小和肿瘤分型。与传统的ELISA技术相比,本发明不仅保留了ELISA技术的高度特异性,检测结果的稳定性、可靠性和操作的简便性,同时采用的化学发光法能提高检测的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于体外临床检验和化学发光免疫法技术领域,尤其涉及一种用于卵巢癌检测的反应板及试剂盒。
背景技术
近半个世纪以来,肿瘤的发病率和死亡率逐年升高,成为医学界热点中的热点。20世纪70年代,美国提出的向“肿瘤进军”反映了社会对肿瘤死亡率居高不下的焦虑,同时,在过去的几十年中,肿瘤标志在技术上和定义上有了突破,这一切都促使了肿瘤标志研究的快速发展。
糖链抗原125(Carbohydrate Antigen 125,CA125)是1981年发现的,是一种高相对分子量的糖蛋白(>200kD),含24%的碳水化合物,表达于卵巢上皮肿瘤和缪勒管来源的病理性和正常组织,但其生理学功能尚不清楚。
Bast及其同事以一个***状囊性卵巢腺癌细胞株(OVCA433)制备了单克隆抗体OC125,可识别CA125的抗原决定簇。OC125克隆与OVCA433细胞株发生反应,但不与同一个患者的B淋巴细胞株发生反应。OC125的抗原决定簇和胚胎发育期卵巢腔上皮的大相对分子质量的糖蛋白相关,能检测出常见的非黏液性卵巢上皮细胞癌,但不易检测出内膜细胞癌和透明细胞癌。
CA125是卵巢癌的标志。健康人群血清CA125含量很低,其上限为35kU/L。卵巢癌患者中,50%I期,90%的II期和超过90%的III期和IV期患者CA125水平升高,其水平和肿瘤大小、肿瘤分期相关。CA125在鉴别卵巢包块的良恶性上特别有价值。Einhorn及同事研究了100名腹腔镜诊断为附件明显肿块的患者,其中23人属于恶性肿瘤。以35kU/L为临界值,恶性肿瘤的预测值为:敏感性为78%,特异性为95%,阳性预测值为82%,阴性预测值为91%,能协助制订正确的手术方案,而且肿瘤分化不影响CA125的水平。
术前CA125水平低于65kU/L的卵巢癌患者5年生存率为42%,明显高于>65kU/L患者。术后CA125水平及下降的比例对生存率也有预测作用。正常情况下,CA125的半衰期为4.8天。CA125的半衰期为22天的患者比9天的患者对化疗的敏感性差。
利用CA125还可以判断残存肿瘤情况,CA125估计再手术的敏感性为50%,特异性为96%。第一个化疗期后,CA125水平可提示疾病的预后,如能降至原来水平的1/10,表明病情转归良好;三个化疗周期后,CA125水平持续升高预后较差。CA125预测肿瘤复发、转移的精确度为75%。从CA125升高到出现临床症状有3~4个月。80%~90%病例中,CA125与疾病的预后和转轨有关。
除了卵巢癌外,子宫内膜癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌和其他胃肠道癌症均可升高,尤其是在判断子宫内膜癌的预后中有临床价值。在某些良性疾病如肝癌、肝硬化、子宫内膜异位症、包心炎、早期妊娠、妇女黄体期也可升高,还可以用来评价晚期子***的病情。
上世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析,利用发光的化学反应分析超微量物质,特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。目前,这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段。化学发光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay,CLIA)是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合,用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫(RIA)和酶免疫(EIA)相似,不同这处是以发光物质作为底物,并藉助其自身的发光强度直接进行测定。
在化学发光免疫分析中包含两个部分,即免疫反应***和化学发光***。免疫反应***,其基本原理同酶联免疫技术(ELISA)。化学发光***的原理在于免疫反应中的酶作用于发光底物。发光底物在酶的作用下,底物发生化学反应并释放出大量的能量,产生激发态的中间体。这种激发态中间体,当其回到稳定的基态时,可同时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额,该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比。由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。
化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度,又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点,易于标准化操作。且测试中不使用有害的试剂,试剂保持期长,应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作,成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。
发明内容
本发明将化学发光技术与免疫分析技术相结合,提供了一种简便,快速,稳定的检测CA125的试剂盒。
本发明的技术方案如下:
一种糖链抗原125化学发光定量检测试剂盒,包括反应板,酶结合物,发光底物,校准品,质控品,浓缩洗涤液,所述的反应板包被有抗糖链抗原125抗体。
所述的校准品以糖链抗原125纯品配制,浓度为0、10、20、40、80、200、500U/ml。
所述的质控品以糖链抗原125纯品配制,由质控品I和质控品II两部分组成,质控品I的浓度为10~40U/ml,质控品II的浓度为100~150U/ml。
所述的质控品I的浓度优选为31.2U/ml,质控品II的浓度优选为120.6U/ml。
所述的酶结合物为HRP标记的抗糖链抗原125抗体;所述的反应板材质是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯,所述的发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物,所述的浓缩洗涤液是pH7.0~pH8.0的中性缓冲液。
本发明可以专一的定量检测出病人血清CA125的含量,诊断卵巢癌,并可根据其含量,判断肿瘤大小及肿瘤分期。同时还能判断子宫内膜癌的预后。与传统的ELISA技术相比,本发明不仅保留了ELISA技术的高度特异性,检测结果的稳定性、可靠性和操作的简便性,同时采用的化学发光法能提高检测的灵敏度。本试剂盒设计完善,包含各种应有试剂,使检测结果更为精确、可信。
附图说明
图1本发明的CA125定量检测试剂盒的血清检测结果与罗氏试剂盒检测结果的相关性。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1:
CA19-9定量检测试剂盒的制备
其步骤主要是:(1)抗CA125的抗体包被板制备(CA125检测反应板的制备);(2)酶标抗体的制备;(3)CA125校准品的制备;(4)CA125质控品的制备;(5)化学发光底物液的制备;(6)洗涤液制备;(7)半成品及成品组成
(1)抗CA125的抗体包被板制备
a.包被:取1mol/L Na2HPO4 77.4ml和1mol/L NaH2PO4 22.6ml混匀,加入去离子水定容至1000ml即成10倍包被液,临用前稀释十倍,加入适量抗CA125单抗(购自瑞典康乃格)混匀,然后加入到微孔板板孔中,100μl/孔,4℃16小时;
b.封闭:弃去包被液,在吸水纸纸上拍干,加入含有3%BSA和0.05%防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4),200μl/孔,37℃2小时;
c.封袋:弃去封闭液,在吸水纸上拍干,室温下于真空干燥箱中抽5小时,立即进行真空封袋,检查有无漏气,如有重新封袋,贴上标签后于2~8℃保存。
(2)酶标抗体的制备
抗CA125单抗用过碘酸盐氧化法与辣根过氧化物酶交联,通过方阵滴定,确定酶标抗体的使用浓度。
(3)CA125校准品的制备
用含有3%BSA和0.05%防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释CA125(购自瑞典康乃格),分装0、10、20、40、80、200、500U/ml。
(4)CA125质控品的制备
用含有3%BSA,1%海藻糖和0.05%防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释CA125配制质控品1,2。浓度分别为31.2U/ml和120.6U/ml。
(5)化学发光底物液的制备
购买(购自Thermo Fisher)商品化发光底物液进行分装。
(6)20×浓缩洗涤液制备
取NaCl 170g吐温-20 10ml加水定容至1L即成,临用前稀释20倍
(7)半成品及成品组成
上述步骤所得产品分装后即为半成品。抽检合格后组装成试剂盒成品,成品还需抽检,合格后才能出厂。
综上,本发明的研究过程中,本发明的发明人首先对本发明所用的原材料进行了筛选实验和质量鉴定,包括标记抗体及包被抗体的活性,载体的颜色、吸附性和变异大小,化学发光的发光强度、持续时间。然后对包被方法进行了研究,用不同的包被缓冲液和保护液进行了实验,选出最适合的包被缓冲液和保护液,通过抗体不同包被浓度实验,找到最佳的浓度条件,同时也对真空干燥的时间和温度也进行了研究,最后确定了干燥时间最短,稳定性最好的时间。对于HRP的标记可以有不同的方法,通过反复探索和对比实验最终找到简便,产率高,成本低,质量可靠的标记方法。
实施例2:
CA125定量检测试剂盒的使用方法
1.试剂和样本准备
(1)试剂准备
a.将试剂盒置室温(18~26℃)平衡20分钟。
b.从试剂盒中取出浓缩洗涤液,用新鲜的纯化水1∶20稀释后加入洗板机的洗液瓶中。
(2)样本准备
使用前将待测的合格血清或血浆置室温(18~26℃)平衡20分钟。
2.操作步骤
a.取出所需的CA125抗体包被微孔板置于微孔架上
b.加入校准品1~6、质控品1~2和待测样本,每孔50μl,充分混匀,置37℃恒温箱孵育90分钟。
c.手工洗涤:弃去孔内液体,洗涤液注满各孔、静置5秒,甩干,重复5此后拍干。或者洗板机洗涤:每孔350μl,重复4次,洗涤后拍干。
d.加入酶结合物,每孔50μl,充分混匀,置37℃恒温箱孵育60分钟。
e.重复步骤c。
f.加发光底物A、B每孔各50μl,充分混匀,立刻加入化学发光仪中检测信号值。
3.实验结果的计算
可以采用作图法或计算法进行结果计算
作图法:以标准品抗原含量的1g值为横坐标(X),以其对应的信号值为纵坐标(Y)绘制出标准曲线,然后根据检测样本测得的信号值在标准曲线上查出相应的抗原含量1g值,在计算出抗原含量。
计算法:以标准品抗原含量的1g值为自变量(X),以其对应的信号值为因变量(Y),求出回归方程,将待测标本的信号值带入回归方程,求得相应的抗原含量。
实施例3:
CA125定量检测试剂盒的方法学鉴定
按照本领域中常规的制造及鉴定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定结果如下:
1.准确性
将已知含量样品用本发明实施例1中制备的试剂盒进行检测,计算回收率(回收率=回收量/加入量×100%),样本量不低于10,结果如下:
加入量(U/ml) | 10 | 10 | 20 | 20 | 40 | 40 | 80 | 80 | 200 | 200 |
回收量(U/ml) | 9.6 | 9.8 | 20.4 | 20.2 | 39.6 | 39.8 | 79.7 | 81.2 | 198.2 | 200.5 |
回收率(%) | 96 | 98 | 102 | 101 | 99 | 99.5 | 99.6 | 101.5 | 99.1 | 100.3 |
2.特异性
将已知含量类似物用本发明实施例中制备的试剂盒进行检测,计算交叉反应率(交叉反应率=检测值/加入量×100%),结果如下:
名称 | AFP(ng/ml) | CEA(ng/ml) | tPSA(ng/ml | CA19-9(U/ml) | CA15-3(U/ml) | SCC(ng/ml) | CYFR21-1(ng/ml) | NSE(ng/ml) |
加入量 | 1000 | 200 | 100 | 1000 | 500 | 200 | 200 | 500 |
检测值 | 0.22 | 0.18 | 0.14 | 0.86 | 0.43 | 0.25 | 0.12 | 0.56 |
交叉反应率(%) | 0.022 | 0.09 | 0.07 | 0.086 | 0.086 | 0.025 | 0.06 | 0.112 |
3.精密性
将质控品1和质控品2分别做10个平行孔,计算检测值的标准CV(CV=标准偏差/平均值×100%),结果如下:
4.灵敏度
标准品1做10个平行孔,计算其“浓度”均值x及标准差sd。按95%可信限,确定其“浓度”均值加2倍标准差(x+2sd)即为本试剂盒的灵敏度,结果如下:
5.稳定性
试剂盒中各组分置4℃和置37℃三天后同时进行实验,OD值下降不超过10%,结果如下:
标准品和质控品 | 标准品1 | 标准品2 | 标准品3 | 标准品4 | 标准品5 | 标准品6 | 标准品7 | 质控品1 | 质控品2 |
4℃放置试剂盒检测信号值 | 3 | 48 | 78 | 314 | 483 | 1076 | 2501 | 192 | 643 |
37℃放置3天后试剂盒检测信号值 | 2 | 42 | 72 | 289 | 478 | 1038 | 2369 | 178 | 622 |
将以上结果汇总得出:
检测项目 | 检验标准 | 检验结果 |
准确性 | 回收率在95%~110% | 符合标准 |
特异性 | 与类似物的交叉反应率≤0.2% | 符合标准 |
精密性CV(%) | ≤10%(n=10) | 符合标准 |
灵敏度 | 0.5U/ml | 符合标准 |
稳定性 | 试剂盒中各组分置37℃至少三天 | 符合标准 |
说明本试剂盒各项性能指标均合格。
实施例4:
正常人的CA125的含量和临界值的确定
随机取300例健康人血清用实施例1中的制备的CA125定量检测试剂盒进行测定,汇总所有测定值,以百分位数法确定其临界值(97.5%位数的参考限),最终确定其临界值为35U/ml。
实施例5:
本发明的CA125试剂盒测定结果与罗氏试剂盒测定结果的相关性如图1所示。临床血清的收集。
收集临床肿瘤病人血清20份,10份正常人血清。
使用CA125试剂盒和罗氏试剂盒同时检测上述血清比较两种检测结果。
方法:
收集的血清样本分别使用本发明实施例1的糖链抗原125定量检测试剂盒,按实施例2的步骤进行操作,和罗氏试剂盒(按其操作说明书进行操作),经统计学处理结果确定两种方法检测结果相关的相关性。
结果:
结果如图1显示,两种方法检测结果相关性为0.9982,两种方法检测的结果高度相关,说明两种方法具有同等使用价值。
Claims (5)
1.一种糖链抗原125化学发光定量检测试剂盒,其特征在于,包括反应板,酶结合物,发光底物,校准品,质控品,浓缩洗涤液,所述的反应板包被有抗糖链抗原125抗体。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的校准品以糖链抗原125纯品配制,浓度为0、10、20、40、80、200、500U/ml。
3.如权利要求1所述的定量检测试剂盒,其特征在于,所述的质控品以糖链抗原125纯品配制,由质控品I和质控品II两部分组成,质控品I的浓度为10-50U/ml,质控品II的浓度为100-150U/ml。
4.如权利要求3所述的定量检测试剂盒,其特征在于,所述的质控品I的浓度为31.2U/ml,质控品II的浓度为120.6U/ml。
5.如权利要求1所述的定量检测试剂盒,其特征在于,所述的酶结合物为HRP标记的抗糖链抗原125抗体;所述的反应板材质是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯,所述的发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物,所述的浓缩洗涤液是pH7.0-pH8.0的中性缓冲液。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110622 |