CN101377500A - 游离***特异性抗原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种游离***特异性抗原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。根据本发明的试剂盒包括：1)游离***特异性抗原校准品；2)游离***特异性抗原单克隆抗体包被的固相载体；3)酶标记的抗游离***特异性抗原抗体；以及4)化学发光底物液。进一步，根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：1)配制校准品；2)以游离***特异性抗原单克隆抗体包被固相载体；3)以酶标记抗游离***特异性抗原抗体；4)分装上述校准品、酶标记物和化学发光底物液；以及5)组装为成品。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。

Description

游离***特异性抗原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种游离***特异性抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

***特异性抗原(PSA)是人体***上皮组织细胞分泌的一种分子量为30～33kDa的单链糖蛋白分子。PSA由***分泌之后，首先进入***，成为***浆的一个重要蛋白组分，浓度大约为0.5～5mg/mL。PSA通常以低浓度释放到健康男性的血液中，在人体中主要存在于男性***组织、***和血清中，有研究表明女性血清中也可以检出低浓度的PSA。

PSA在***中以游离PSA(free-PSA，f-PSA)形式存在，在其进入血液后，会和血液里的其它蛋白分子结合，形成结合态的PSA(complexed-PSA，c-PSA)。正常男性血液中的PSA水平一般低于4ng/mL，f-PSA水平一般低于2ng/mL。PSA在***癌(prostate cancer，PCa)病人血清中的浓度水平高于正常人，近年来作为一种器官特异性的肿瘤标志物，取代***酸性磷酸酶(prostate acid phosphatase，PAP)成为筛查PCa的主要指标。相关研究表明良性的***增生(benign prostatehyperplasia，BPH)病人血清中，PSA水平也会相应的升高，随着年龄的增加，人血清PSA水平也会有不同程度的升高，因此在4～10ng/mL的PSA浓度范围，就形成了“诊断灰区”。相继有学者提出不同的诊断指标来改善单一检测PSA的缺陷，诸如：***生长速率(PSAvelocity，PSAV)、***密度(PSAdensity，PSAD)和年龄特异参考值范围(age-specific reference ranges，ASR-RS)等，这些指标在***癌评价中都有应用的局限性，一直存在争议。随着对***疾病和PSA研究的不断深入，研究发现PCa病人血清中f-PSA浓度水平与BPH病人以及正常人相比，明显偏低，因此引入一个新的临床指标——游离***特异抗原百分率(free/total PSA ratio)。该参数对PCa的特异性更高，同时也降低了临床检验的假阳性率。

对f-PSA的定量分析，目前常用的是放射免疫分析(RIA)和酶联免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必须用¹²⁵I等放射性元素标记，检测设备复杂，必须用专门的仪器测定，其放射性核素的半衰期短，不能长期保存，测定结果不稳定，同时也给实验操作人员带来了放射性伤害。ELISA检测灵敏度不够高，检测范围窄，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性等缺点也不能满足临床的要求。化学发光免疫分析方法(CLIA)应运而生。

化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)于1977年问世，1985年第一代化学发光免疫分析试剂盒研制成功并投放市场。进入九十年代，化学发光免疫分析试剂盒的研制和自动化测量仪的生产取得了突破性进展，从而进入高速发展阶段。化学发光免疫分析是继荧光、放射性同位素和酶免疫分析之后发展起来的一项新的免疫分析技术，根据大量的实验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，在非放射性标记分析技术中化学发光免疫分析处于领先地位，代表了当今世界发展的方向和潮流，它不仅具有免疫反应的特异性，而且具有化学发光反应的高灵敏度(检测限度可达10^-15～10^-18mol/L)。化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、快速、准确、重复性好、效期长并安全无毒无污染等优点，成为取代放射免疫分析和酶免疫分析技术的首选。

现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒为封闭式全自动化学发光测量***，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。本发明是在酶联免疫分析的基础上应用酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，因而其灵敏度大大提高，并且操作简便适用性广，既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量***，可实现大批量快检测，使用成本低，更易推广应用。

发明内容

本发明的发明人为了解决上述问题提出并完成了本发明，即将化学发光技术与f-PSA的免疫分析学有效地结合，同时使用了发光信号强、持续时间长、更高信噪比的自制化学发光底物液，提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测f-PSA的试剂盒。本发明的试剂盒采用的方法比酶免疫分析法灵敏度高，可以缩短检测窗口期，使本试剂盒适于在产业上有效地推广应用。

本发明的目的是提供一种游离***特异性抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒。

本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。

根据本发明的游离***特异性抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒包括：

1)游离***特异性抗原校准品；

2)游离***特异性抗原单克隆抗体包被的固相载体；

3)酶标记的抗游离***特异性抗原抗体；以及

4)上述酶所作用的化学发光底物液。

根据本发明的试剂盒，其中，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。

根据本发明的试剂盒，其中，所述标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

根据本发明的试剂盒，其中，所述化学发光底物液为鲁米诺、异鲁米诺或1，2-二氧乙烷类衍生物。

优选地，上述试剂盒中，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

优选地，上述试剂盒中，所述化学发光底物液包含A液和B液，其中，

A液是在双蒸水中加入Tris和浓HCl配成0.1M pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，包含4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的对碘苯酚；

B液是在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成0.1M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液，包含200mg/mL的过氧化氢溶液；

或者，

所述化学发光底物液包含24g Tris、160g NaCl、4g KCl、15mL HCl、200mL3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、1mL Proclin300、1000mL双蒸水。

本发明提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤：

1)配制游离***特异性抗原校准品；

2)以游离***特异性抗原单克隆抗体包被固相载体；

3)以酶标记抗游离***特异性抗原抗体；

4)分装上述游离***特异性抗原校准品、酶标记的抗游离***特异性抗原抗体和该酶所作用的化学发光底物液；以及

5)组装为成品。

根据本发明的方法，优选，所述包被固相载体的步骤2)包括以下步骤：

I)包被

采用0.05M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液或0.046M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的游离***特异性抗原单克隆抗体混合制成包被液，并将其负载于固相载体上；

II)用生理盐水洗涤上述固相载体；以及

III)封闭

配制封闭液，基于1000mL所述封闭液包含0.2g NaH₂PO₄·2H₂O、2.9gNaH₂PO₄·12H₂O、10g BSA和1mL生物防腐剂，所述封闭液的pH值为7.0～7.6，然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。

具体地，所述包被方法可以包括：

I)包被

采用1000mL的0.05M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液包含1.59g的无水碳酸钠和2.94g的碳酸氢钠去离子水溶液，或1000mL的0.046M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液包含4.44g的柠檬酸和7.3g的柠檬酸三钠去离子水溶液制成缓冲液，与适当浓度的游离***特异性抗原单克隆抗体混合制成包被液，并将其负载于固相载体上；

II)用生理盐水洗涤上述固相载体；以及

III)封闭

配制封闭液，基于1000mL所述封闭液包含0.2g NaH₂PO₄·2H₂O、2.9gNaH₂PO₄·12H₂O、10g BSA和1mL生物防腐剂，所述封闭液的pH值为7.0～7.6，然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。

在上述方法中，优选，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。

在上述方法中，优选，所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

在上述方法中，优选，所述化学发光底物液为鲁米诺、异鲁米诺或1，2-二氧乙烷类衍生物。

在上述方法中，优选，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

在上述方法中，优选，所述化学发光底物液包含A液和B液，其中，

A液是在双蒸水中加入Tris和浓HCl配成0.1M pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，包含4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的对碘苯酚；

B液是在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成0.1M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液，包含200mg/mL的过氧化氢溶液；

或者，

所述化学发光底物液包含24g Tris、160g NaCl、4g KCl、15mL HCl、200mL3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、1mL Proclin300、1000mL双蒸水。

本发明针对临床检验实验室提供了一种即可手工操作，也可适用于一些标准半自动检测仪器的检测手段，建立了定量分析人血清中游离***特异性抗原(f-PSA)的方法。采用96/48孔聚苯乙烯微孔板或者包被试管，或者磁性微粒子为固相载体，以辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(ALP)为标记酶，以Luminol或者AMPPD为主要成分的发光底物的酶促化学发光检测体系，对人血清中游离***特异性抗原(f-PSA)进行定量分析。

该游离***特异性抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒的各项指标均达到同类进口试剂盒的分析法水平。利用本发明方法进行检测，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，无放射性污染，试剂盒成本低，临床适用性强，更适用于我国临床检测筛查实验室。

根据本发明的试剂盒，酶标记的抗体与载体上包被的抗体和被测样品的游离***特异性抗原形成“包被抗体-抗原-抗体-酶”的夹心复合物结构，因此本发明采用的“双抗体夹心一步法”反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理，又在酶联免疫分析的基础上应用酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，因而其灵敏度大大提高。另外，这种模式还便于操作和生产。

附图说明

图1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图

图2为本发明的试剂盒同国外试剂盒临床血样测值比对结果

具体实施方式

实施例1 制备本发明的游离***特异性抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒

一、酶标记的游离***特异性抗原单克隆抗体的制备

(1)辣根过氧化物酶标记游离***特异性抗原单克隆抗体的制备

溶解4.4mg HRP于1mL蒸馏水中，加入0.4mL过碘酸钠(50mmol/L)室温搅拌20min，经1mmol/L醋酸钠缓冲液，pH4.4透析后加入8mg的游离***特异性抗原单克隆抗体，搅拌2h，最后用200mmol/L的NaBH₄进行还原，经0.02MPB缓冲液透析后，加等体积甘油，—20℃以下保存。

(2)碱性磷酸酶标记游离***特异性抗原单克隆抗体的制备

游离***特异性抗原单克隆抗体用戊二醛法与碱性磷酸酶偶联，对PBS充分透析，加等体积甘油，—20℃以下保存。

二、酶标抗体浓度选定

试验证明，采用方阵法选择酶标抗体的工作浓度范围为1:500～50000。

三、游离***特异性抗原校准品的制备

以小牛血清为基质，将提纯的人***浆浓原料以国家标准品为准系列稀释而成。分装浓度范围为：0、0.5、1、2.5、5.0、10ng/mL的校准品共6瓶。

四、以游离***特异性抗原单克隆抗体包被固相载体

(1)包被

采用0.05M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液或0.046M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的游离***特异性抗原单克隆抗体混合制成包被液，并将其负载于固相载体上；

具体地，所述包被方法可以包括：

无水碳酸钠       1.59g

碳酸氢钠         2.94g

去离子水         1000mL

溶解混匀后，调整pH值至9.6，加入5.0mg游离***特异性抗原单克隆抗体混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔110μL，4℃过夜。

或者，

柠檬酸              4.44g

柠檬酸三钠          7.3g

去离子水            1000mL

溶解混匀后，调整pH值至4.6，加入5.0mg游离***特异性抗原单克隆抗体混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔110μL，4℃过夜。

(2)洗涤：用生理盐水洗三次。

(3)封闭

NaH₂PO₄·2H₂O        0.2g

Na₂HPO₄·12H₂O       2.9g

BSA                 10g

Proclin 300         1mL

双蒸水              定容至1000mL

将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水定容，溶解混匀，测定pH值为7.0。

每孔分别加入封闭液300μL，室温放置3小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时。立即进行真空封袋。封袋后放置15分钟检查无漏气，如果有漏气需重新封袋。贴签后置2～8℃保存。

五、酶标单抗稀释液

Tris            12.120g

BSA             5g

Proclin         1mL

双蒸水          1000mL

六、化学发光底物

本发明所使用的辣根过氧化物酶(HRP)的化学发光底物液的配制方法：

A液：在双蒸水中加入Tris和浓HCl配成0.1M pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液。在此缓冲液中加入4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的对碘苯酚。

B液：在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成0.1M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液，在此溶液中加入200mg/mL的过氧化氢溶液。

使用方法：使用前将A液与B液按1：1比例混合后使用。

本发明所使用的碱性磷酸酶(ALP)的化学发光底物液的配制方法：

Tris            24g

NaCl            160g

KCl             4g

HCl             15mL

双蒸水          1000mL

Proclin 300     1mL

AMPPD           200mL

七、洗涤缓冲液

Tris          24g

NaCl          160g

KCl           4g

HCl           15mL

去离子水      1000mL

调整pH值至7.4。

八、半成品及成品组成

上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成f-PSA定量测定试剂盒。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。

本发明试剂盒中的固相抗体为提前包被好的，不需要现场包被；校准品为液体；标记抗体也是已经稀释到工作浓度的工作溶液，均可以直接使用。校准品/待测样品，酶标记抗体溶液以及发光底物加样体积均为50μL，实验过程中，不需要调节加样体积，最大程度的方便使用。以本发明上述测试方法按上述程序进行测定，所用时间短，方便，快速。

实施例2～3制备本发明的游离***特异性抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒

除以分别以塑料珠、磁性颗粒作为载体外，其余均以与实施例1相同的方法制备f-PSA化学发光免疫分析定量测定试剂盒。

实施例4 本发明的试剂盒的使用方法

使用本试剂盒进行实验前，需先取出固相抗体、校准品/检测样品、标记抗体溶液在室温放置15～30分钟，使它们平衡到室温；之后，将恒温温箱或者水浴锅调至37℃；再后，准备好合适的微量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪以及辅助仪器，如洗板机等，是否正常工作。

使用本试剂盒按照实施例1的方法进行实验的具体操作步骤如下：

1)将实验需要的板条(已包被好抗体，96/48孔可拆为12/6*8*1孔)放置在板架上；

2)反应孔中分别加待测样品和各浓度校准品，校准品每孔加0、0.5、1、2.5、5.0、10ng/mL各50μL，每次试验设空白1孔，然后除空白孔外各孔加酶标记抗体溶液50μL；

3)微量振荡器上振荡30秒混匀；

4)37℃恒温温育60分钟；

5)弃去孔中溶液，用Tris-HCl洗液，自动洗板机或者手工洗板5次，在吸水纸上拍干；

6)每孔加发光底物50μL，振荡混匀，室温(22～28℃)反应30～90分钟；

7)用化学发光仪测相对发光值(RLU)，测量时间1秒/孔；

8)分别对校准品浓度和对应RLU取对数，在建立的双对数曲线上建立标准曲线，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的f-PSA的浓度，计算检测结果(参见附图1)；

9)打印检测结果报告。

实施例5 本发明的试剂盒的方法学鉴定

按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行鉴定，经过大量的实验证明，本发明的试剂盒在用于f-PSA浓度水平测定时，该方法学指标如下：

检测范围：0～10ng/mL；

灵敏度：最小检出限为0.01ng/mL；

精密度：分析内精密度(高、中、低三个质量控制范围)均小于7％(n＝10)，分析间精密度(高、中、低三个质量控制范围)均小于7％(n＝10)；

准确性：加标回收率在90～110％之间；

特异性：与CA199、CEA、AFP等常见的肿瘤标志物的交叉反应率小于0.1％；

稳定性：各试剂组分置37℃，考察6天后，各组分仍稳定。

本发明的试剂盒所用样品量少，一次检测只要50μL，体外检测对测试对象没有任何毒副作用。同时本发明采用的化学发光酶免疫分析方法，不产生放射性污染，各指标也优于目前广泛应用的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)。利用本发明方法进行检测，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，无放射性污染，试剂盒成本低，临床适用性强，更适用于我国临床检测筛查实验室。因此本发明为临床检测游离***特异性抗原(f-PSA)，辅助诊断***癌以及手术后观察提供了一种更准确，特异，方便，快捷的方法。

实施例6 本发明的试剂盒同国外试剂盒临床血样测值比对

本发明的试剂和Monobind游离***特异性抗原化学发光试剂对102份临床血清样品同时进行检测，检测结果见附图2，本发明方法测定的血样f-PSA结果为横坐标，以Monobind测定的结果为纵坐标作回归分析，相关方程为：Y＝1.1182X—0.0309，相关系数r＝0.9918。本发明方法同国外试剂盒临床血样测值相关性良好。

本实施例采用临床血样102份中，临床诊断***癌(PCA)样本21例，***良性疾病30例，正常人样本51例，同时测定样本的PSA和f-PSA水平，在PSA水平4～10ng/ml范围内时，计算游离***特异性抗原百分率，以20％作为临床诊断参考值，测定结果如表1所示：

表1：对102例临床诊断血样的测定结果

如果仅用PSA水平大于4.0ng/ml作为临界值来判断，就会带来由于***增生等良性病人的假阳性，表2则为仅用PSA水平大于4.0ng/ml作为阳性判断标准的结果：

表2：对102例临床诊断血样的测定结果

两种评判标准相比，本发明试剂盒提供的方法和评判标准，可以明显的区分开PSA在4～10ng/ml范围内的***癌和良性***疾病病人样本，大大提高***癌的临床诊断率，避免出现假阳性，此结果和国外同类进口试剂检测结果符合率及相关性均良好。

从所列试剂检测结果数据分析，本发明试剂盒的灵敏度、特异性、准确性与同类进口试剂盒无明显差异；便于推广应用，安全可靠。

Claims (13)

1、一种游离***特异性抗原化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)游离***特异性抗原校准品；

2)游离***特异性抗原单克隆抗体包被的固相载体；

3)酶标记的抗游离***特异性抗原抗体；以及

4)上述酶所作用的化学发光底物液。

2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。

3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

4、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液为鲁米诺、异鲁米诺或1，2-二氧乙烷类衍生物。

5、如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

6、如权利要求1、4或5所述的试剂盒，其特征在于，

所述化学发光底物液包含A液和B液，其中，

A液是在双蒸水中加入Tris和浓HCl配成0.1M pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，包含4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的对碘苯酚；

B液是在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成0.1M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液，包含200mg/mL的过氧化氢溶液；

或者，

所述化学发光底物液包含24g Tris、160g NaCl、4g KCl、15mL HCl、200mL3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、1mLProclin300、1000mL双蒸水。

7、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)配制游离***特异性抗原校准品；

2)以游离***特异性抗原单克隆抗体包被固相载体；

3)以酶标记抗游离***特异性抗原抗体；

4)分装上述游离***特异性抗原校准品、酶标记的抗游离***特异性抗原抗体和该酶所作用的化学发光底物液；以及

5)组装为成品。

8、如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述包被固相载体的步骤2)采用以下方法：

I)包被

采用0.05M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液或0.046M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的游离***特异性抗原单克隆抗体混合制成包被液，并将其负载于固相载体上；

II)用生理盐水洗涤上述固相载体；以及

III)封闭

配制封闭液，基于1000mL所述封闭液包含0.2g NaH₂PO₄·2H₂O、2.9gNaH₂PO₄·12H₂O、10g BSA和1mL生物防腐剂，所述封闭液的pH值为7.0～7.6，然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。

9、如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。

10、如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

11、如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物液为鲁米诺、异鲁米诺或1，2-二氧乙烷类衍生物。

12、如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

13、如权利要求7、11或12所述的方法，其特征在于，

所述化学发光底物液包含A液和B液，其中，

A液是在双蒸水中加入Tris和浓HCl配成0.1M pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，包含4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的对碘苯酚；

B液是在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成0.1M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液，包含200mg/mL的过氧化氢溶液；

或者，

所述化学发光底物液包含24g Tris、160g NaCl、4g KCl、15mL HCl、200mL3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、1mL Proclin300、1000mL双蒸水。

Images