CN101377515A - 促甲状腺素化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种定量检测促甲状腺素(TSH)化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。本发明的优点在于:采用“双抗夹心法”的反应模式,有效地利用了化学发光技术结合异硫氰酸荧光素-抗异硫氰酸荧光素技术,并采用了辣根过氧化酶作为标记酶,定量检测人体血清样品中TSH的含量,确保了检测的灵敏度,大大节省了原料。本发明的试剂盒灵敏度高,重复性好,反应时间短,具有良好的稳定性,试剂效期长,能及时为临床诊断、治疗甲状腺疾病提供实验依据。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测分析领域,具体涉及到一种促甲状腺素测定试剂盒及其制备方法。本发明试剂盒结合了异硫氰酸荧光素(FITC)-抗异硫氰酸荧光素技术和化学发光免疫分析技术。
背景技术
促甲状腺素(TSH)是垂体前叶分泌的一种糖蛋白激素,其浓度受垂体分泌的促甲状腺素释放激素以及血液中的甲状腺素T4和T3的影响。它可以调节甲状腺细胞的功能,影响甲状腺激素合成,葡萄糖氧化以及蛋白合成。当甲状腺功能发生改变时,TSH水平呈现明显的波动。测定血清中TSH的浓度是判断甲状腺功能是否正常的首选指标,也是研究下丘脑-垂体-甲状腺轴反馈调节机能等的重要参数,临床上多用于甲状腺功能亢进(甲亢)和减退(甲减)的诊断、原发与继发性甲减的鉴别诊断、监视甲亢和甲减的疗效、亚临床甲亢的诊断、新生儿甲低的筛查以及垂体促甲状腺素瘤的实验室诊断等,是评价甲状腺功能一项敏感指标。
目前检测促甲状腺素的免疫学方法主要有放射免疫分析法、酶联免疫分析法、直接化学发光免疫分析法、电化学免疫分析和时间分辨荧光免疫分析法等。这些方法均具有不可避免的不足之处:放射性元素对环境的污染及半衰期短等因素限制RIA与IRMA的广泛应用;酶免疫吸附分析法的灵敏度欠佳无法满足临床要求;直接化学发光免疫分析因发光时间短,需要高精度自动分析***;电化学发光检测和时间分辨荧光检测法需要昂贵和复杂的仪器设备。因此建立便捷、高灵敏检测TSH的方法具有重大的意义。
化学发光免疫分析技术是把高灵敏的化学发光分析方法和特异性强的免疫分析方法相结合发展起来的一项具有化学发光分析的高灵敏度和免疫分析法的高选择性的新的免疫分析技术。该法具有特异性高、灵敏度高、快速、简便及无放射性污染等优点,已受到广大医学、生物和化学工作者的关注。本发明就是采用“双抗夹心”化学发光免疫分析技术测定人血清中的促甲状腺素,通过配对抗体分别与特异抗原发生反应,形成夹心复合物,从而可以迅速的从血清中高度特异的识别相应的抗原。单纯利用物理吸附把单克隆抗体包被到固相载体上(聚苯乙烯板)会存在抗体用量大,活性损失大等缺点,而采用FITC-抗FITC***可以避免这样的缺点。本发明就是利用FITC-抗FITC的反应体系,将FITC单克隆抗体包被到固相载体上,然后加入FITC标记的TSH单克隆抗体即把抗体负载到固相载体,向其中加入血清样品和标准,再加入酶标记物,与血清中的蛋白分子夹心形成特异性的结合,然后加入化学发光底物,利用化学发光仪检测相对发光强度,就可以定量分析人血清中的促甲状腺素。
异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)具有很强的免疫原性,很容易产生与半抗原结合的特异性抗体,用FITC标记的蛋白方法简便,一般不破坏标记物的生物活性,单位蛋白上可实现多个标记。该技术的新颖之处有:(1)异硫氰酸荧光素单克隆抗体容易制备,且使用单克隆抗体,可以提高反应的特异性;(2)异硫氰酸荧光素抗体的标记简单易行,对蛋白活性影响小;(3)异硫氰酸荧光素单克隆抗体的包被可以大大节省抗体的用量,降低了成本。
化学发光免疫分析结合FITC-抗FITC***体系是一种检测TSH的先进而有效的方法,无需昂贵的仪器,还可以大大节省原料,并且操作简便、适用性广,既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪,也可用于全自动的测量***,有助于促进化学发光免疫分析技术在临床检验、检测中的应用与发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种FITC-抗FITC技术结合化学发光免疫分析定量测定促甲状腺素的化学发光免疫分析测定试剂盒。
根据本发明的试剂盒包括:TSH校准品、FITC抗体包被的聚苯乙烯微孔板、FITC标记的TSH单克隆抗体、辣根过氧化酶标记TSH单克隆抗体、上述酶所作用的化学发光底物液、以及10倍浓缩洗涤液。
本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。
根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤:
1)以TSH纯品配制校准品;
2)以FITC抗体包被聚苯乙烯微孔板;
3)FITC标记TSH单克隆抗体;
4)以辣根过氧化酶标记TSH单克隆抗体;
5)配制辣根过氧化酶所作用的化学发光底物液;
6)配制10倍浓缩洗涤液;以及
7)分装上述组分并组装为成品。
根据本发明的方法,在所述包被FITC抗体的聚苯乙烯微孔板步骤2)中,具体地包被方法包括:
所述的包被方法采用0.046M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液(包含4.44g的柠檬酸和7.3g的柠檬酸三钠去离子水溶液制成缓冲液),与适当浓度的FITC单克隆抗体混合制成包被液,负载于固相载体上;然后用PBST洗涤液洗涤两次;用封闭液(包含0.1M三羟甲基氨基甲烷、150mM氯化钠、1% BSA和0.1%生物防腐剂,pH值为7.4~7.6)封闭上述洗涤后的固相载体,干燥封板后保存备用。
根据本发明的方法,在所述以辣根过氧化酶标记TSH单克隆抗体的步骤4)中,采用改良的过碘酸钠法以辣根过氧化酶标记TSH单克隆抗体。
根据本发明的方法,所述化学发光底物液为鲁米诺-过氧化氢混合液,包含A液和B液,其中:所述化学发光底物A液,包括10mM鲁米诺、0.3mM 4-羟基联苯、0.05mM 4-碘苯硼酸、0.2M pH8.7硼酸-硼砂缓冲液,其pH值为8.0~10.0;所述化学发光底物B液,包括3.5mM过氧化脲、0.1% Tween20、0.2M pH7.2磷酸盐缓冲液,其pH值为7.0~7.6;使用时将A液与B液按1:1比例混合。
所述10倍浓缩洗涤液包含0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液、8% NaCl、0.1%Tween-20、0.1% Proclin 300,调整pH至7.2~7.4,使用时用蒸馏水稀释10倍。
本发明“促甲状腺素化学发光免疫分析测定试剂盒”可以简便快捷、高灵敏、高重现性地检测出人血清中促甲状腺素的含量,可以根据促甲状腺素含量的多少判断病情及治疗效果。本发明的试剂盒提供了一种简便快速、高灵敏、高特异定量检测TSH的测定试剂盒。
本发明采用“双抗夹心法”的反应模式,有效地利用了化学发光技术结合FITC-抗FITC包被技术原理,定量检测人体血清、血浆样品中TSH的含量,确保了检测的灵敏度。本发明的试剂盒结构简单,使用方便,价格便宜,携带便利,与市场上的酶联免疫试剂盒相比,线性表现均很好,并且临床符合率也大大提高,可为人体甲状腺功能亢进(甲亢)和减退(甲减)的诊断、原发与继发性甲减的鉴别诊断、监视甲亢和甲减的疗效、亚临床甲亢的诊断、新生儿甲低的筛查以及垂体促甲状腺素瘤的实验室诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。
附图说明
图1为实施例1所制备的试剂盒的校准曲线图(log-log标准曲线)。
图2为本发明的试剂盒同ELISA试剂盒临床血样测值比对的相关曲线。
具体实施方式
实施例1 制备本发明的TSH化学发光免疫分析测定试剂盒
一、TSH校准品的制备
用去激素人血清将TSH纯品稀释成校准品,分装0、0.1、0.5、2.5、10、40μ IU/mL共6瓶。
二、抗FITC抗体包被微孔板的制备
1)包被
采用1000mL的0.046M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液(包含4.44g的柠檬酸和7.3g的柠檬酸三钠去离子水溶液制成缓冲液),与适当浓度的抗FITC单克隆抗体混合制成包被液,并将其负载于微孔板上;
2)用PBST洗涤液洗涤上述微孔板;以及
3)封闭
配制封闭液,所述封闭液包含0.1M三羟甲基氨基甲烷、150mM氯化钠、1%BSA和0.1%生物防腐剂,所述封闭液的pH值为7.4~7.6,然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的微孔板上,室温干燥密封保存。
三、FITC标记的TSH单克隆抗体的制备
FITC可以与抗体的伯氨基直接反应。将适量抗TSH单克隆抗体置于透析袋在50mM NaHCO3缓冲液(pH9.3)中过夜透析后,置入溶有适量FITC的50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)中,在4℃下搅拌反应16~20小时。更换透析液,以0.01MPBS液(pH7.4)为透析液,每隔4~6小时更换一次,共更换4~5次。之后提取反应液于离心管中,3000rpm离心30min,弃去沉淀。标记物中加入等体积甘油后,置-20℃下保存待用。
四、辣根过氧化酶标记的TSH单克隆抗体的制备
以辣根过氧化酶标记TSH单克隆抗体采用改良的过碘酸钠法,具体标记过程如下:
称取5.0mg HRP溶解于0.5mL蒸馏水中,向溶液中加入0.5mL新配的0.1M NaIO4溶液,混匀,4℃静置30分钟后,加入0.16M乙二醇水溶液0.5mL,混匀,静置30分钟;加入等量TSH单克隆抗体溶液1mL,混匀装入透析袋,pH9.5碳酸盐缓冲液透析,4℃过夜。在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃ 1h;然后用0.15moL/L pH7.4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),离心30min去除沉淀,上清液即为酶结合物,加入等体积甘油,混匀后,密闭冷冻保存。采用方阵法选择酶标记物的工作浓度范围为1:2000~4000。
五、化学发光底物A液
鲁米诺 10mM 1.7716g
4-羟基联苯 0.3mM 0.051g
4-碘苯硼酸 0.05mM 0.012g
硼酸 11.4g
硼砂 4.9g
蒸馏水 定溶 1000mL
pH 8.0~10.0
六、化学发光底物B液
过氧化脲 3.5mM 0.329g
Tween20 0.1% 1mL
Na2HPO4·12H2O 51.58g
NaH2PO4·2H2O 8.74g
蒸馏水 定溶 1000mL
pH 8.0~10.0
使用时A液与B液等比例混合。
七、10倍浓缩洗涤缓冲液
Na2HPO4·12H2O 29g
NaH2PO4·2H2O 1g
NaCl 80g
Tween-20 1mL
Proclin 300 1mL
蒸馏水 定溶至1000mL
调整pH至7.2~7.4
使用时用蒸馏水稀释10倍。
八、半成品及成品组成
分装上述各组分,检验合格后组装成品试剂盒。利用本发明的试剂盒进行检测,灵敏度高,特异性强,操作简单,无放射性污染,试剂盒成本低,临床适用性强,更适用于我国临床检测筛查。
实施例2 本发明试剂盒的使用方法
一、样品前处理
取人的空腹晨血清样品,3000rpm离心5min,取上层血清进行分析。
二、检测方法
使用本试剂盒按照如下步骤操作:
1)洗涤缓冲液配制:将试剂盒提供的洗涤液缓冲液加蒸馏水10倍稀释;
2)将校准品、抗体包被的微孔板、FITC标记物和酶标记物从4℃冰箱中取出,放置15min,平衡至室温;
3)反应孔中分别加FITC标记的TSH单克隆抗体50μL,然后加入待测样品、各浓度校准品每孔加0、0.1、0.5、2.5、10、40μ IU/mL各25μL,最后加辣根过氧化酶标记的TSH单克隆抗体溶液50μL,振匀,37℃反应45min;
4)反应后弃去孔中溶液,用PBST洗液,洗涤5次,在吸水纸上拍干;
5)每孔加化学发光底物混合液100μL,充分混匀,暗处放置10min;
6)在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU),测量时间1S/孔;
7)分别对校准品浓度和对应RLU取对数,在双对数坐标图上建立标准曲线,以校准品浓度的Log值为横坐标,RLU的Log值为纵坐标绘出标准曲线,以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清促甲状腺素的浓度,其中,RLU为发光强度,Concentration为TSH浓度(单位为μ IU/mL),见附图1;
8)打印检测结果报告。
实施例3 本发明的试剂盒的方法学检定
按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定,本发明对试剂盒的精密度、准确度、灵敏度、特异性以及稳定性等都进行了检定,结果如下:
1、试剂盒精密度测定
将实施例1中制备的试剂盒分别取三批进行精密度实验,分别测定低、中、高三种不用浓度的血清,10孔平行测定,重复3次,得出每次分析的批内和多次分析的批间变异(表1)。其批内和批间变异系数均小于10%。
表1 方法精密度考察
2、试剂盒准确度测定
准确性是指测量值接近真值的程度,通常用回收率表示。选用三份人血清,在最佳实验条件下测定浓度,然后分别向血清内加入低、中、高三种不同浓度的TSH校准品,对每个浓度做3个平行,计算回收率。结果如表2所示,表明TSH的加标回收率在91.7%~105.3%之间。
表2 样品回收率测定
3、试剂盒灵敏度实验
灵敏度是在一给定的显著性水平上可与零剂量相区别的剂量,是指分析方法的最小检出量(记为零标准点的平均减去2SD)。平均测定10个S0标准点,计算其发光强度的平均值和标准偏差,带入线性方程,计算出对应的浓度值,并重复该操作5次,得到该方法的最低检出限为0.01μIU/mL。并与其它方法比对,见表3。
表3 方法灵敏度实验
4、试剂盒稳定性实验
对实施例1试剂盒中的固相抗体、酶结合物、标准品、发光底物液等在4℃和37℃下放置3d、7d、10d后进行实验,测定试剂盒的最大、最低发光强度、待测物的加标回收率以及灵敏度等结果表明实施例1的试剂盒指标均在正常范围之内,各项指标完全符合要求。不同条件对实验结果均没有明显的影响,则说明该产品的稳定性很好。
经过大量的实验证明,本发明的试剂盒方法学指标如下:
检测范围:0~50μ IU/mL;
灵敏度:最小检出限为0.01μ IU/mL;
精密度:小于10%(n=5);
准确性:平均回收率在91.7%~105.3%之间;
特异性:与HCG、LH、FSH等其他类似物均无交叉;
稳定性:各试剂组分置4℃和37℃,考察3d、7d、10d后,各组分仍稳定。
以上结果说明“促甲状腺素化学发光免疫分析测定试剂盒”的临床检测范围、灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性是完全合格的。
利用本发明方法进行检测,灵敏度高,特异性强,操作简单,无放射性污染,试剂盒成本低,临床适用性强,更适用于我国临床检测实验。因此本发明试剂盒可为甲状腺功能亢进(甲亢)和减退(甲减)的诊断、原发与继发性甲减的鉴别诊断、监视甲亢和甲减的疗效、亚临床甲亢的诊断、新生儿甲低的筛查以及垂体促甲状腺素瘤的实验室诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。
实施例4 本发明的试剂盒同ELISA试剂盒临床血样测值比对
用本发明的试剂盒和ELISA试剂盒对58份临床血清样品同时进行检测。其检测结果见附图2,以本发明方法测定的血样TSH结果为横坐标,以ELISA测定的结果为纵坐标作回归分析,相关方程为:Y=0.9623X+0.0515,相关系数r=0.9858。经统计学处理结果表明,本发明方法同ELISA试剂盒临床血样测值的相关性良好。
Claims (9)
1、一种促甲状腺素(TSH)化学发光免疫分析测定试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:TSH校准品、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)抗体包被的聚苯乙烯微孔板、FITC标记的TSH单克隆抗体、辣根过氧化酶标记的TSH单克隆抗体、上述辣根过氧化酶所作用的化学发光底物液、以及10倍浓缩洗涤液。
2、如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述化学发光底物液为鲁米诺-过氧化氢混合液,包含A液和B液,其中:
所述化学发光底物A液,包括10mM鲁米诺、0.3mM 4-羟基联苯、0.05mM 4-碘苯硼酸、0.2M pH8.7硼酸-硼砂缓冲液,其pH值为8.0~10.0;
所述化学发光底物B液,包括3.5mM过氧化脲、0.1% Tween20、0.2M pH7.2磷酸盐缓冲液,其pH值为7.0~7.6;
使用前将A液与B液按1:1比例混合。
3、如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述10倍浓缩洗涤液包含0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液、8% NaCl、0.1% Tween-20、0.1% Proclin 300,调整pH至7.2~7.4,使用时用蒸馏水稀释10倍。
4、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法,其特征在于包括以下步骤:
1)以TSH纯品配制校准品;2)以FITC抗体包被聚苯乙烯微孔板;3)以FITC标记TSH单克隆抗体;4)以辣根过氧化酶标记TSH单克隆抗体;5)配制辣根过氧化酶所作用的化学发光底物液;6)配制浓缩洗涤液;7)分装上述组分并组装为成品。
5、如权利要求4所述的方法,其特征在于,在所述包被FITC抗体的聚苯乙烯微孔板步骤2)中,具体地包被方法采用0.046M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液(包含4.44g的柠檬酸和7.3g的柠檬酸三钠去离子水溶液制成缓冲液),与适当浓度的FITC单克隆抗体混合制成包被液,负载于固相载体上;然后用PBST洗涤液洗涤两次;用封闭液(包含0.1M三羟甲基氨基甲烷、150mM氯化钠、1% BSA和0.1%Proclin 300,pH值为7.4~7.6)封闭上述洗涤后的固相载体,干燥封袋后保存备用。
6、如权利要求4所述的方法,其特征在于,在所述制备FITC标记TSH单克隆抗体的具体方法是:将适量抗TSH单克隆抗体置于透析袋在50mM NaHCO3缓冲液(pH9.3)中过夜透析后,置入溶有适量FITC的50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)中,在4℃下搅拌反应16~20小时。更换透析液,以0.01M PBS液(pH7.4)为透析液,每隔4~6小时更换一次,共更换4~5次。之后提取反应液于离心管中,3000rpm离心30min,弃去沉淀。
7、如权利要求4所述的方法,其特征在于,在所述以辣根过氧化酶标记TSH单克隆抗体的步骤4)中,采用改良的过碘酸钠法以辣根过氧化酶标记TSH单克隆抗体。
8、如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述化学发光底物液为鲁米诺-过氧化氢混合液,包含A液和B液,其中:
所述化学发光底物A液,包括10mM鲁米诺、0.3mM 4-羟基联苯、0.05mM 4-碘苯硼酸、0.2M pH8.7硼酸-硼砂缓冲液,其pH值为8.0~10.0;
所述化学发光底物B液,包括3.5mM过氧化脲、0.1% Tween20、0.2M pH7.4磷酸盐缓冲液,其pH值为7.0~7.6;
使用前将A液与B液按1:1比例混合。
9、如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述10倍浓缩洗涤液步骤6)包含0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液、8% NaCl、0.1% Tween-20、0.1% Proclin 300,调整pH至7.2~7.4,使用时用蒸馏水稀释10倍。
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