CN103278651A - 一种肌红蛋白纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肌红蛋白（MYO）纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：肌红蛋白校准品；偶联有链霉亲和素的纳米磁微粒悬浮液；生物素标记的肌红蛋白抗体；肌红蛋白抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；肌红蛋白质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。另外本发明还公开了本发明试剂盒的制备方法。本发明试剂盒与现有试剂盒相比敏感性高、可测定浓度范围宽、试剂有效期长、操作简单、检测自动化程度高等优点。

Description

一种肌红蛋白纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种肌红蛋白（MYO）纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

肌红蛋白（MYO）是与血红蛋白相似的血红素蛋白质。存在于肌肉细胞内，主要功能是储存氧，在心肌内含量非常丰富。分子量16700，由一条含有153个氨基酸残基的多肽链和一个血红素辅基构成，呈紧密球形。多肽链中氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部，亲水侧链多位于分子表面，因此其水溶性较好。

由于MYO分子量小，所以在肌肉细胞损伤后较早释放入血循环，1-2h升高，12h达高峰，24h后逐渐下降，是早期诊断急性心肌梗死（AMI）的主要指标，能为AMI的诊断和抢救赢得宝贵时间。

骨骼肌疾病和肾功能障碍时血清MYO浓度也可升高，故MYO不是心肌损伤的特异性标志物。但由于其灵敏度高，一般可用于阴性诊断。如果胸痛发作后8h而MYO仍在正常范围内，则可排除AMI。

由于在AMI后患者血中MYO很快从肾脏清除，故MYO测定有助于在AMI病程中观察有无再梗死或梗死再扩展。MYO频繁增高，提示原有心肌梗死仍在延续。

MYO还是溶栓治疗中判断有无再灌注的敏感而准确的指标。

临床领域应用的MYO免疫检测方法主要有胶体金免疫层析法（Goldimmnnochromatography GICA）、酶联免疫测定法（Enzyme Immunoassay，EIA）和化学发光免疫测定（CLIA）等。

胶体金免疫层析法具备操作简便、快捷、可单份检测、便于保存、不需特殊设备等优点，但由于灵敏度不高、难以实现定量等缺点限制了这种方法的使用。

酶联免疫测定法由于具备操作简单、试剂有效期长、无污染、高于胶体金的敏感性、特异性好、结果可用仪器测定等特点得以推广，但由于敏感性相对较低，所用标记酶与底物可定量测定范围窄，及仪器测定范围窄等缺点，限制了其在微量免疫定量测定中的应用。

化学发光免疫测定其研究起步于80年代初，快速发展应用于90年代，为当今最为敏感的微量免疫测定法。主要特点是高敏感性、可测定浓度范围宽、样品无需稀释即可检测、试剂有效期长、操作简单、检测自动化成度高、数据自动生成处理能力强、测定仪器兼容性好、无环境污染等，因而得到了迅速发展与应用。但是检测灵敏度、测值准确度仍然不高。

发明内容

本发明要解决的问题是提供肌红蛋白的化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，避免了胶体金试纸条不能准确定量，酶联免疫法灵敏度差，检测范围窄等缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：肌红蛋白（MYO）纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括：肌红蛋白校准品；偶联有链霉亲和素的纳米磁微粒悬浮液；生物素标记的肌红蛋白抗体；肌红蛋白抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；肌红蛋白质控品，质控品包括浓度8-12ng/mL的低值质控品和400-600ng/mL的高值质控品；化学发光液A液和B液，A液为5mmol/L，pH8.6的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度0.7g/L鲁米诺和终浓度0.165g/L对碘酚；B液为0.675g/L过氧化脲；20倍浓缩洗液；反应管。

进一步，所述的纳米磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径10-50nm。

进一步，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

（1）肌红蛋白校准品的配制：

将肌红蛋白抗原用山羊血清配制成校准品浓储液，以企业标准品进行定标，将浓储液用山羊血清稀释至工作浓度，分别为0，5，25，100，250，1000ng/mL；

企业标准品制备方法：用山羊血清将肌红蛋白抗原按照1:10、1:10²、1:10³、1:10⁴、1:10⁵、1:10⁶、1:10⁷的比例进行稀释，使用罗氏公司肌红蛋白定量检测试剂盒（货号：12178214，规格100人份）测定，根据测定结果，建立稀释比例与测定浓度的曲线。按照曲线方程分别计算出浓度为5，25，100，250，1000ng/mL的稀释比例，按此比例配制企业标准品，使用罗氏产品进行多次测定，确定企业标准品浓度。配制的企业标准品以0.5mL/管分装，用冷冻干燥机冻干，-20℃保存。

（2）肌红蛋白质控品的配制：

用山羊血清将上述浓储液稀释至10ng/mL和500ng/mL，将10ng/mL作为低值质控，500ng/mL作为高值质控；

（3）纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

A、四氧化三铁纳米磁微粒制备

采用沉淀法制备四氧化三铁纳米磁微粒，具体制备方法如下：1）将FeCl₃·6H₂O和FeCl₂.4H₂O以摩尔比2：1加入到蒸馏水中，剧烈搅拌溶解；2）在氮气环境下加0.5M氨水于上述铁盐溶液中，调pH9-10，反应温度65℃，反应时间45min；3）反应结束后，用蒸馏水洗涤至中性，弃上清，于60℃烘干，即得10-50nm的四氧化三铁纳米磁微粒；

B、纳米磁珠表面羧基的偶联

采用分散聚合法进行偶联，具体制备方法如下：取上述制备的纳米磁微粒超声分散在10%PEG8000溶液中，得磁流体溶液，向磁流体溶液中按体积比1：10加入无水乙醇，搅拌30min后，移入带有搅拌器，冷凝管，氮气入口的三颈瓶中，加入交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺；在氮气的保护下，升温至60±1℃，恒温搅拌30min，之后依次加入过氧化苯甲酰，用量为磁流体用量的3%，搅拌速度约为500rpm，苯乙烯体积同磁流体溶液，丙烯酸体积为磁流体溶液的1/4，保持氮气气流，其余条件保持不变,反应8-10h，所得产物静置，用蒸馏水反复洗涤，再用盐酸调节pH=1，浸泡24h，静置；再用蒸馏水反复洗涤，除去未包覆的Fe₃O₄磁粉，把沉淀下来的产品放入真空干燥箱中50℃下干燥24h，得到表面联有羧基的纳米磁微粒；

C、纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备，配制1L，方法如下：

取100mL0.1M MES缓冲液，加入10mg表面联有羧基的纳米磁微粒，室温搅拌40min，之后加入3.5mg链霉亲和素，然后加入8mg/mLEDC溶液，2-8℃反应1h后，用0.01M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01M PBS定溶至1L即可；

（4）生物素标记的肌红蛋白抗体的制备

取0.8mg肌红蛋白抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入30ug生物素，同时加入二甲基亚砜，使二甲基亚砜最终浓度5-10%，缓慢振荡，避光反应3h；在上述溶液中加入250uL1M氯化铵溶液，常温避光反应30-60min；用0.01MPBS溶液在2～8℃下透析24h，期间换液2-4次；

（5）肌红蛋白抗体酶结合物的制备

采用改良高碘酸钠氧化法将肌红蛋白抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:5000，并加入13%酶稳定剂，储存于2～8℃；

改良过碘酸钠氧化法步骤包括：

A：HRP活化

1）配置10mg/mL HRP溶液；

2）配置12.8mg/mL过碘酸钠NaIO₄溶液；

3）将上述1）和2）配制溶液按体积比1：1混匀，4℃避光反应30min；

4）配置浓度为20uL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液3）以相同体积混合，常温避光反应20min，活化即完成，放-20℃保存（保存时间不超过3个月）。

B、MYO单克隆抗体标记

1）将待标记原料装入透析袋中，用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，透析30min；

2）将标记原料与活化的HRP按质量比1:2进行混合，之后用0.05M碳酸盐缓冲液于4℃透析24h（期间换液2-3次）；

3）配置浓度为2mg/mL的NaBH₄水溶液，按1mgHRP加80uL配制好的NaBH₄水溶液的比例进行混合，并于4℃避光反应2h；

4）将上述步骤3）完成的标记液用0.01M PBS于4℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。

酶稀释液中包括10mL/L2M NaOH，15g/L NaCl，10g/LBSA，5g/L葡聚糖T-2000（Dextran T-2000），1.05g/L聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），2.5mL/L硫酸庆大霉素，1mL/L胭脂红（胭脂红为粉末固体，配制成浓度40mg/mL以后使用），2g/L Tween-20（购自Sigma公司），1mL/L ProClin300（购自Sigma公司）；

（6）20倍浓缩洗液的配制

20倍浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和2%Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；

（9）对采用该方法制备的试剂盒进行物理检查，对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

本发明的原理是，采用双抗体夹心法测定血清或血浆中的MYO，在亲和素-纳米磁微粒悬浮液中加入生物素-MYO抗体结合物，通过亲和素和生物素的亲和反应，形成磁微粒-亲和素-生物素-MYO抗体复合物，加入样本和酶，通过抗原抗体反应，形成磁微粒-亲和素-生物素-MYO抗体-MYO抗原-MYO抗体-HRP复合物，用磁场将复合物吸附在试管底部，清洗掉游离的成分，加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP催化鲁米诺生成处于激发态的氨基邻苯二甲酸离子，其恢复到基态时，释放出425nm的光子，于第5分钟测定各加样孔的发光值RLU。样本的RLU与样本MYO浓度呈正相关。样本中的MYO浓度依据由校准品MYO浓度和对应的RLU建立的Log（X）-Log（Y）数学模型进行定量，从而检测人血清、血浆中的MYO含量。

本专利发明的肌红蛋白纳米磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒，具有以下优点：

（1）灵敏度高，本试剂盒的分析灵敏度不高于1ng/mL。

（2）特异性良好，本产品对血红蛋白（10mg/mL）未出现交叉反应。

（3）精密性良好，批内不精密度不高于5%，批间不精密度不高于10%。

（4）成本低，与市场上同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有临床应用价值。

（5）稳定性良好，本产品在37℃可存放7天以上，在2～8℃可存放1年。

附图说明

图1是本发明的试剂盒测定肌红蛋白与罗氏测定肌红蛋白的测定结果比较图，其中纵坐标为本试剂盒测得的肌红蛋白值，横坐标为罗氏试剂盒测定肌红蛋白值，两种方法相关系数（r）=0.9771，直线方程y=0.8974x+1.288。

具体实施方式

实施例1：制备肌红蛋白纳米磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒

（1）肌红蛋白校准品的配制：

将肌红蛋白抗原（购自Fitzgerald公司）用山羊血清（郑州益康生物工程有限公司）配制成校准品浓储液，以企业标准品进行定标，将浓储液用山羊血清稀释至工作浓度，分别为0，5，25，100，250，1000ng/mL；

（2）肌红蛋白质控品的配制：

用山羊血清将上述浓储液稀释至10ng/mL和500ng/mL，将10ng/mL作为低值质控，500ng/mL作为高值质控；

（3）纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

A、四氧化三铁纳米磁微粒制备

采用沉淀法制备四氧化三铁纳米磁微粒，具体制备方法如下：1）将FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O以摩尔比2：1加入到蒸馏水中，剧烈搅拌溶解；2）在氮气环境下加0.5M氨水于上述铁盐溶液中，调pH9-10，反应温度65℃，反应时间45min；3）反应结束后，用蒸馏水洗涤至中性，弃上清，于60℃烘干，即得10-50nm的四氧化三铁纳米磁微粒；

B、纳米磁珠表面羧基的偶联

采用分散聚合法进行偶联，具体制备方法如下：取上述制备的纳米磁微粒超声分散在10%聚乙二醇（PEG8000）溶液中，得磁流体溶液，向磁流体溶液中按体积比1：10加入无水乙醇，搅拌30min后，移入带有搅拌器，冷凝管，氮气入口的三颈瓶中，加入交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺；在氮气的保护下，升温至60±1℃，恒温搅拌30min，之后依次加入过氧化苯甲酰，用量为磁流体用量的3%，搅拌速度约为500rpm，苯乙烯体积同磁流体溶液，丙烯酸体积为磁流体溶液的1/4，保持氮气气流,其余条件保持不变,反应8-10h，所得产物静置，用蒸馏水反复洗涤，再用盐酸调节pH=1，浸泡24h，静置；再用蒸馏水反复洗涤，除去未包覆的Fe₃O₄磁粉，把沉淀下来的产品放入真空干燥箱中50℃下干燥24h，得到表面联有羧基的纳米磁微粒；

C、纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备，配制1L，方法如下：

取100mL0.1M2-吗啉乙磺酸（MES）缓冲液，加入10mg表面联有羧基的纳米磁微粒，室温搅拌40min，之后加入3.5mg链霉亲和素，然后加入8mg/mL碳二亚胺（EDC）溶液，2-8℃反应1h后，用0.01M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01M PBS定溶至1L即可；

（4）生物素标记的肌红蛋白抗体的制备

取0.8mg肌红蛋白抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入30ug生物素，同时加入二甲基亚砜，使二甲基亚砜最终浓度5-10%，缓慢振荡，避光反应3h；在上述溶液中加入250uL1M氯化铵溶液，常温避光反应30-60min；用0.01MPBS溶液在2～8℃下透析24h，期间换液2-4次；

（5）肌红蛋白抗体酶结合物的制备

采用改良高碘酸钠氧化法将肌红蛋白抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:5000，并加入13%酶稳定剂，储存于2～8℃；

酶稀释液中包括10mL/L2M NaOH，15g/L NaCl，10g/LBSA，5g/L Dextran T-2000（购自Sigma公司），1.05g/L Triton X-100（购自Sigma公司），2.5mL/L硫酸庆大霉素，1mL/L胭脂红（胭脂红为粉末固体，配制成浓度40mg/mL以后使用），2g/L Tween-20（购自Sigma公司），1mL/L ProClin300（购自Sigma公司）

（6）20倍浓缩洗液的配制

20倍浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和2%Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；

（9）对采用该方法制备的试剂盒进行物理检查，对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

实施例2：本发明试剂盒的检查

（1）物理检查：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。

（2）准确性：试剂盒校准品与国家标准品系列同时进行分析测定，用双对数数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不明显偏离平行（t检验，|t|<2.447）；以肌红蛋白企业标准品为对照品，用双对数数学模型拟合，试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平均值应在0.90～1.10范围内。

（3）剂量-反应曲线的线性：用双对数数学模型拟合，剂量-反应曲线在5-1000ng/mL浓度范围内相关系数r绝对值不低于0.9900。

（4）分析灵敏度：试剂盒分析灵敏度不高于1ng/mL。

（5）精密度：10孔平行测定高值和低值质控品，计算测定结果的平均浓度

与标准差（SD），批内不精密度使用3批产品进行3次试验，计算测定结果的平均浓度（

）与标准差（SD），批间不精密度

结果应符合批内不精密度（CV%）应不高于5%；批间不精密度（CV%）应不高于10%。（6）质控品的测定值：平行测定10孔高值和低值的质控品，用Log(X)-Log(Y)数学模型拟合，质控品测值应在允许范围内，低值质控品测值在8-12ng/mL，高值质控品测值在400-600ng/mL。

（7）特异性：

交叉反应符合下表要求：

（8.）稳定性：37℃放置7天，测定值应符合上述各项要求。

实施例3：本发明试剂盒的使用方法

（1）将待检试剂盒在室温（18～25℃）下平衡30分钟。

（2）配制洗液：用蒸馏水将浓缩洗液按1:20稀释（1mL洗液加19mL蒸馏水）。若浓缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃，待结晶溶解后再进行稀释。

（3）配制发光液：使用前5分钟取适量发光液A与发光液B等体积混合。

（4）将反应管编号，向试管中依次加入25uL校准品或血清标本、50uL磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液、50uL生物素-肌红蛋白抗体结合物、100uL肌红蛋白抗体酶结合物，37℃下振荡反应30min，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒出上清液，加入500uL洗液，充分混匀后，于磁分离器上分离，倒出洗液，重复3次，在各管中加入化学发光底物液100uL，充分混匀，暗置5min，在管式化学发光仪上测定各管的发光值（RLU），以校准品浓度的Log值为横坐标，以发光值的Log为纵坐标，绘制标准曲线，根据血清标本的发光值即可计算出肌红蛋白的浓度。

实施例4：本试剂盒的方法学评价结果

检测范围：范围为5-1000ng/mL，对于浓度大于1000ng/mL的标本应先进行稀释后再进行测定。

灵敏度：1ng/mL。

精密度：小于5%。

准确性：回收率的平均值在0.90～1.10范围内。

特异性：血红蛋白交叉反应系数小于1%。

质控品测值：低值质控品QcL和高值质控品QcH的测值均在允许范围内，低值质控品测值在8-12ng/mL，高值质控品测值在400-600ng/mL。

稳定性：将试剂盒中各试剂组分于37℃下放置7d，稳定性良好。

实施例5：本试剂盒的临床对比实验

本专利发明的试剂盒已进行了临床考核，本次临床试验的样本总数120例，先以肌红蛋白罗氏检测试剂盒测试后，再用本专利发明的试剂盒（化学发光）进行测定，结果表明，直线方程为y=0.8974x+1.288，相关系数R=0.9771。可见本方法制备的试剂盒与医院测值有较好的一致性。以SPSS13.0统计分析软件对相关系数进行t检验（检验水准α=0.05），P<0.001，两种方法测定的肌红蛋白值的相关密切程度是显著性的，可见两种方法测定的肌红蛋白值密切相关，说明试剂盒的诊断能力较强，可推广临床应用。

为了确定本试剂盒的临床参考值，对256份正常人血清、血浆样本采用本试剂盒进行了检测，结果表明本试剂盒的参考值（参考范围）为0-100ng/mL。

Claims (5)

1.一种肌红蛋白纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1）肌红蛋白校准品，浓度为0，5，25，100，250，1000ng/mL；

2）偶联有链霉亲和素的纳米磁微粒悬浮液；

3）生物素标记的肌红蛋白抗体，所述抗体为单克隆抗体；

4）肌红蛋白抗体酶结合物，所用抗体为单克隆抗体，与生物素标记的肌红蛋白抗体不为同一株，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；

5）肌红蛋白质控品；质控品包括浓度8-12ng/mL的低值质控品和400-600ng/mL的高值质控品；

6）化学发光液A液和B液；A液为5mmol/L，pH8.6的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度0.7g/L鲁米诺和终浓度0.165g/L对碘酚；B液为0.675g/L过氧化脲；

7）20倍浓缩洗液；

8）反应管。

2.根据权利要求1所述的肌红蛋白纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的肌红蛋白质控品，低值质控品优选10ng/mL，高值质控品优选500ng/mL。

3.根据权利要求1所述的肌红蛋白纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的纳米磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径10-50nm。

4.根据权利要求1所述的肌红蛋白纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

5.一种制备所述权利要求1-3任一权利要求所述的试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）肌红蛋白校准品的配制：

将肌红蛋白抗原用山羊血清配制成校准品浓储液，以企业标准品进行定标，将浓储液用山羊血清稀释至工作浓度，分别为0，5，25，100，250，1000ng/mL；

（2）肌红蛋白质控品的配制：

用山羊血清将上述浓储液稀释至10ng/mL和500ng/mL，将10ng/mL作为低值质控，500ng/mL作为高值质控；

（3）纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

A、四氧化三铁纳米磁微粒制备

采用沉淀法制备四氧化三铁纳米磁微粒，具体制备方法如下：1）将FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O以摩尔比2：1加入到蒸馏水中，剧烈搅拌溶解；2）在氮气环境下加0.5M氨水于上述铁盐溶液中，调pH9-10，反应温度65℃，反应时间45min；3）反应结束后，用蒸馏水洗涤至中性，弃上清，于60℃烘干，即得10-50nm的四氧化三铁纳米磁微粒；

B、纳米磁珠表面羧基的偶联

采用分散聚合法进行偶联，具体制备方法如下：取上述制备的纳米磁微粒超声分散在10%PEG8000溶液中，得磁流体溶液，向磁流体溶液中按体积比1：10加入无水乙醇，搅拌30min后，移入带有搅拌器，冷凝管，氮气入口的三颈瓶中，加入交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺；在氮气的保护下，升温至60±1℃，恒温搅拌30min，之后依次加入过氧化苯甲酰，用量为磁流体用量的3%，搅拌速度约为500rpm，苯乙烯体积同磁流体溶液，丙烯酸体积为磁流体溶液的1/4，保持氮气气流,其余条件保持不变,反应8-10h，所得产物静置，用蒸馏水反复洗涤，再用盐酸调节pH=1，浸泡24h，静置；再用蒸馏水反复洗涤，除去未包覆的Fe₃O₄磁粉，把沉淀下来的产品放入真空干燥箱中50℃下干燥24h，得到表面联有羧基的纳米磁微粒；

C、纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备，配制1L，方法如下：

取100mL0.1M MES缓冲液，加入10mg表面联有羧基的纳米磁微粒，室温搅拌40min，之后加入3.5mg链霉亲和素，然后加入8mg/mLEDC溶液，2-8℃反应1h后，用0.01M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01M PBS定溶至1L即可；

（4）生物素标记的肌红蛋白抗体的制备

取0.8mg肌红蛋白抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入30ug生物素，同时加入二甲基亚砜，使二甲基亚砜最终浓度5-10%，缓慢振荡，避光反应3h；在上述溶液中加入250uL1M氯化铵溶液，常温避光反应30-60min；用0.01MPBS溶液在2～8℃下透析24h，期间换液2-4次；

（5）肌红蛋白抗体酶结合物的制备

采用改良高碘酸钠氧化法将肌红蛋白抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:5000，并加入13%酶稳定剂，储存于2～8℃；

（6）20倍浓缩洗液的配制

20倍浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和2%Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；

（9）对采用该方法制备的试剂盒进行物理检查，对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。