CN103499564B - T4化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法 - Google Patents
T4化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种T4化学发光体外诊断试剂盒,本发明对于那些极性强,分子量小的半抗原无法包被于固相载体进行检测,提供了一种使用方便的试剂盒,解决了半抗原包被不佳的情况,便于快速、灵敏的进行T4的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种T4检测试剂盒,具体涉及一种T4化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法。
背景技术
甲状腺素(Thyroxin(e),Thx,T4)是甲状腺滤泡细胞合成及分泌的激素,以游离形式释放入血循环中并迅速与血浆蛋白相结合。甲状腺素又称四碘甲状腺原氨酸,由两个3,5-二碘酪氨酸分子偶联而成的一种碘化的酪氨酸衍生物,是甲状腺的主要激素。甲状腺素的化学本质为四碘甲状腺原氨酸,即T4,有DL,L,D型,其中L型活性强,D型活性较小。甲状腺素无臭,无味,遇光变质,熔点231-233℃(分解),不溶于水和乙醇等普通有机溶剂,但溶于含有无机酸或碱的乙醇,也溶于氢氧化碱和碳酸碱溶液。在其酸性乙醇溶液中加入亚硝酸钠,加热即呈黄色,再加过量氨水即变为粉红色。甲状腺素可由牛、羊、猪等的甲状腺中提取,也可人工合成。甲状腺素主要控制耗氧速率和总代谢速率。甲状腺素具有促进一般组织代谢,提高神经兴奋性和身体发育的作用,可用于治疗甲状腺机能减退,粘液性水肿和克汀病等。定量测定人血清游离T4(FT4)对甲状腺疾病的诊断,甲状腺的病理、生理研究有重要意义使用。
T4以前一直用放射免疫分析(RIA),放射免疫分析它既具有免疫反应的高特异性,又具有放射性测量的高灵敏度,因此能精确测定各种具有免疫活性的极微量的物质,但是放射免疫分析存在放射线辐射和污染等问题,用ELISA方法快速简便,既有放射免疫分析的优点,同时也减少了污染。
竞争法可用于测定抗原,也可用于测定抗体。以测定抗原为例,受检抗原和固相抗原竞争结合酶标抗体,因此结合于固相的酶标抗体量与受检抗原的量成反比。操作步骤如下:(1)将特异性抗原与固相载体连接,形成固相抗原。洗涤。(2)待测管中加受检标本和一定量酶标抗体的混合溶液,使之与固相抗原反应。如受检标本中无抗原,则酶标抗体能顺利地与固相抗原结合。如受检标本中含有抗原,则与酶标抗体以同样的机会与固相抗原结合,竞争性地占去了酶标抗体与固相载体结合的机会,使酶标抗体与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗体,保温后,酶标抗体与固相抗原的结合可达最充分的量。洗涤。(3)加发光液显色:参考管中由于结合的酶标抗体最多,信号值最高。参考管信号值与待测管信号值的大小,代表受检标本抗原的量。待测管信号值越低,表示标本中抗原含量越多。
由于半抗原都是小分子,本身很难具有好的抗原性,只能诱导动物产生很弱的免疫反应,因而与载体蛋白耦联是很重要的。
现在T4试剂盒比较多的为酶联免疫方法测T4,ELISA法也以快速,简单实效,而被广泛应用,但是相对于化学发光,不具有发光检测的高灵敏度和检测范围。
发明内容
本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种T4化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法。本发明对于那些极性强,分子量小的半抗原无法包被于固相载体进行检测,提供了一种使用方便的试剂盒,解决了半抗原包被不佳的情况,便于快速、灵敏的进行T4的检测。
本发明的一种T4化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法技术方案为,该T4化学发光体外诊断试剂盒,包括微孔板、校准品、质控品、酶结合物、发光底物液和浓缩洗涤液;其中微孔板中含有小分子半抗原T4耦联载体蛋白得到的小分子耦联蛋白;校准品与质控品为已知浓度的T4抗原;酶结合物中含有T4酶标抗体。
发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B,发光底物液A含有鲁米诺,发光底物液B含有辣根过氧化物酶稳定剂、过氧化氢;浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。
微孔板中含有的小分子耦联蛋白,是将小分子半抗原T4耦联载体蛋白BSA得到的小分子耦联蛋白。
所述的小分子耦联蛋白,为使用EDC将小分子半抗原T4和载体蛋白BSA进行耦联得到的小分子耦联蛋白。
将小分子半抗原T4和载体蛋白BSA进行耦联具体方法为:
①平衡EDC,NHS至室温;
②将EDC、NHS、BSA分别用活化缓冲液溶解;
③将2-4体积份的EDC溶液与5-10体积份BSA溶液混合后,加入与EDC等量的NHS溶液,室温反应10-20分钟,后再加入1-2体积份的EDC;再室温反应10-20分钟;
④加入巯基乙醇终止EDC反应,得到活化蛋白EDC-BSA;
⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的小分子半抗原T4,室温反应1.5-3小时;
⑥加入Tris终止反应,得到耦联蛋白BSA-T4;
⑦加入脱盐柱,将里面的储存液排出,然后加入PBS以同样的转速离心3-5次后,加入反应的耦联蛋白,离心后,即为耦联产物。
步骤②中活化缓冲液包括:0.1M的MES,0.5M的NACl,调节pH为6.0。
步骤②中EDC用活化缓冲液溶解,终浓度为45-55mg/mL,NHS同样用活化缓冲液溶解,终浓度为45-55mg/mL,BSA用活化缓冲液溶解,终浓度为4.5-5.5mg/mL。
步骤⑥中Tris为20-50mmol/L。
耦联好的蛋白包被方式制备试剂盒,步骤为:
①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中,37度放置2小时;
②甩干板条,加入封闭液,37度放置2小时;
③洗涤一次后,放入真空干燥箱4-6小时;
④真空封袋后,放入4度冰箱。
其中,步骤①中的包被液为,氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠的混合水溶液,其中还可以含有防腐剂。
上述的T4化学发光体外诊断试剂盒的使用方法,其特征在于,
①分别往微孔板中加入校准品、质控品和待测样本,再往微孔板中加入酶结合物,充分混匀,37℃反应50-80分钟;
②加入洗涤液洗涤3-6次,每次加洗涤液量为300-400uL;
③然后向微孔板中加入发光底物液,放入化学发光分析仪中读数,计算数据,得出待测样本中小分子半抗原T4的量。
浓缩洗涤液加纯水稀释为洗涤液(例:20×浓缩洗涤液50ml+950ml的纯水即为1×洗涤液)。
本发明的有益效果为:本发明的试剂盒使用方便,本发明运用化学发光法定量检测,可以使其检测范围更加宽广,增加其灵敏度,精密度实验也优于一般的ELISA方法。而对比市面上的化学方法定量检测试剂盒,本发明试剂盒用的为间接法,通过包被小分子半抗原,采用竞争法检测T4。
小分子抗原,又称为半抗原,这些小分子本身没有免疫原性,当与载体结合后形成大分子,可以获得免疫原性。半抗原与载体形成的免疫原,当半抗原分子量极小,或则极性较大时,小分子抗原往往不容易直接固相吸附于板条上,使用BSA偶联小分子,可以形成较大的分子量,通过疏水作用就容易吸附于固相载体上,这样的方法灵敏度高,高度的特异性和灵敏性,能使分析过程简化。
EDC将T4和载体进行耦联。EDC能与载体蛋白BSA形成一种活泼的酯结构,半抗原T4的基团上有羧基基团,能使之与BSA-EDC反应,可以形成BSA-T4偶联物。甲状腺素-牛血清白蛋白偶联物(Thyroxin(e)-BovineSerumAlbuminConjugate,Thx-BSAConjugate,T4-BSAConjugate)是甲状腺素与载体蛋白-牛血清白蛋白(BSA)经化学交联获得的偶联物,可作为抗原免疫动物用于抗体的制备,或包被于固相载体用于甲状腺素及其抗体的检测。
采用竞争法检测小分子半抗原T4,该方法的好处在于操作简单,一步完成,包被一般不会出现过量包被造成IC50值(被抑制一半时抑制剂的浓度)较高,并且游离的抗原更容易和标记的抗体进行反应,灵敏度和精确度较高。而采用包被抗体的方法很容易造成包被过量影响IC50值,并且小分子的标记通常不能采用经典的过碘酸钠法,需要采用其他的化学方法,EDC。NHS/EDC等,对酶的活性有一定的影响。
附图说明:
图1所示为竞争法原理图;
图2所示为校准品趋势图。
具体实施方式:
为了更好地理解本发明,下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案,但是本发明并不局限于此。
实施例1
材料:
活化缓冲液:0.1MMES,0.5MNACl,pH6.0;
载体蛋白:BSA;
目的蛋白:小分子半抗原T4;
NHS;巯基乙醇;脱盐柱
将小分子半抗原T4和载体蛋白进行耦联,
①平衡EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐),NHS(N-羟基丁二酰亚胺)至室温。
②将EDC用活化缓冲液溶解,终浓度为50mg/mL,NHS同样用活化缓冲液溶解,终浓度为50mg/mL,BSA(牛血清白蛋白)用活化缓冲液溶解,终浓度为5mg/mL。
③将200uLEDC溶液与500uLBSA溶液混合后,加入200uLNHS溶液,室温反应15分钟,后加入100uLEDC。再反应15分钟。
④加入1.4uL巯基乙醇终止EDC反应,得到活化蛋白(EDC-BSA)。
⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的蛋白(小分子半抗原T4),室温反应2小时。
⑥加入30mmol/LTris终止反应,得到耦联蛋白(BSA-T4)。
⑦加入脱盐柱,脱盐柱先以1000g,2min将里面的储存液排出,然后加入0.01MPBS以同样的转速离心4次后,加入反应的耦联蛋白,离心后,即为耦联产物。
试剂盒微孔板制备:
①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中,37度放置2小时;
②甩干板条,加入封闭液200uL。37度放置2小时。
③洗涤一次后,放入真空干燥箱5小时。
④真空封袋后,放入4度冰箱。
其中,步骤①中的包被液为,1L纯水中含有氯化钠8.5g,磷酸二氢钠0.58g,磷酸氢二钠5.8g。
校准品、质控品制备:用T4抗原、样品稀释液(1%BSA溶解于PH7.4的PBS溶液中)分别配制浓度为1、20、100、300、800、1500ng/ml的6个校准品、100、800ng/ml的2个质控品。
酶结合物制备:
用T4酶标抗体、酶稀释液(20%小牛血清混合于pH7.4的PBS溶液中)配制成一定浓度的酶结合物。
试剂盒的使用:
①分别向微孔板中加入50uL校准品、质控品和待测样本,再往微孔板中加入100uL酶标抗体,分别与校准品、质控品和待测样本充分混匀,37℃反应60分钟。
②浓缩洗涤液加纯水稀释为1×洗涤液(例:20×浓缩洗涤液50ml+950ml的纯水即为1×洗涤液),加入洗涤液洗涤四次,每次加洗涤液量为350uL。
③然后向微孔板中加入发光底物液,放入化学发光分析仪中读数,计算数据得出待测样本中T4抗原的量。
发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B,发光底物液A含有鲁米诺,发光底物液B含有辣根过氧化物酶温度剂、过氧化氢;浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。
实验结果:
表1:校准品结果
梯度(ng/mL) | 1 | 20 | 100 | 300 | 800 | 1500 |
信号值 | 3108 | 1590 | 1125 | 534 | 141 | 108 |
表2:待测样本结果
样本值 | 信号值 | 本发明试剂盒检测值 |
115.1 | 1242 | 106.24 |
79.63 | 1358 | 84.24 |
164.6 | 1029 | 162.66 |
134.3 | 1189 | 118.12 |
155.9 | 1075 | 148.37 |
320 | 659 | 340.93 |
309.8 | 714 | 305.42 |
286.3 | 857 | 229.45 |
45.8 | 1688 | 43.54 |
其中样本值为罗氏411仪器测得,cutoff=141,样本值与本发明试剂盒检测值相关性:97.86%
实施例2
材料:
活化缓冲液:0.1MMES,0.5MNACl,pH6.0
载体蛋白:BSA;
目的蛋白:小分子半抗原T4
NHS;巯基乙醇;脱盐柱
将小分子半抗原T4和载体蛋白进行耦联,
①平衡EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐),NHS(N-羟基丁二酰亚胺)至室温。
②将EDC用活化缓冲液溶解,终浓度为45mg/mL,NHS同样用活化缓冲液溶解,终浓度为55mg/mL,BSA(牛血清白蛋白)用活化缓冲液溶解,终浓度为4.5mg/mL。
③将200uLEDC溶液与500uLBSA溶液混合后,加入200uLNHS溶液,室温反应15分钟,后加入100uLEDC。再反应15分钟。
④加入1.4uL巯基乙醇终止EDC反应,得到活化蛋白(EDC-BSA)。
⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的蛋白(小分子半抗原T4),室温反应2小时。
⑥加入20mmol/LTris终止反应,得到耦联蛋白(BSA-T4)。
⑦加入脱盐柱,脱盐柱先以1000g,2min将里面的储存液排出,然后加入0.01MPBS以同样的转速离心3次后,加入反应的耦联蛋白,离心后,即为耦联产物。
试剂盒微孔板制备:
①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中,37度放置2小时;
②甩干板条,加入封闭液200uL。37度放置2小时。
③洗涤一次后,放入真空干燥箱5小时。
④真空封袋后,放入4度冰箱。
其中,步骤①中的包被液为,1L纯水中含有氯化钠8.5g,磷酸二氢钠0.58g,磷酸氢二钠5.8g。
校准品、质控品制备和酶结合物制备同实施例1。
试剂盒的使用:
①依次往微孔板中加入50uL校准品(或样本),100uL酶标(抗原),充分混匀,37℃反应60分钟。
②洗涤五次,每次加样量为350uL。
③然后加入发光液,放入化学发光分析仪中读数,计算数据得出待测样本中T4抗原的量。
发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B,发光底物液A含有鲁米诺,发光底物液B含有辣根过氧化物酶温度剂、过氧化氢;浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。
实验结果:
表3:校准品结果
梯度(ng/mL) | 1 | 20 | 100 | 300 | 800 | 1500 |
信号值 | 3022 | 1458 | 1107 | 599 | 152 | 107 |
表4:待测样本结果
样本值 | 信号值 | 本发明试剂盒检测值 |
106.7 | 1123 | 140.72 |
514.8 | 427 | 566.11 |
411.3 | 591 | 407.80 |
166.3 | 1028 | 170.17 |
35.8 | 1874 | 31.34 |
718.7 | 336 | 679.11 |
191.2 | 982 | 186.57 |
258.9 | 886 | 226.06 |
87.36 | 1470 | 70.30 |
其中样本值为罗氏411仪器测得,cutoff=141,样本值与检测值相关性:99.18%
实施例3
材料:
活化缓冲液:0.1MMES,0.5MNACl,pH6.0
载体蛋白:BSA;
目的蛋白:小分子半抗原T4
NHS;巯基乙醇;脱盐柱
将小分子半抗原T4和载体蛋白进行耦联方法为,
①平衡EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐),NHS(N-羟基丁二酰亚胺)至室温。
②将EDC用活化缓冲液溶解,终浓度为55mg/mL,NHS同样用活化缓冲液溶解,终浓度为45mg/mL,BSA(牛血清白蛋白)用活化缓冲液溶解,终浓度为5.0mg/mL。
③将200uLEDC溶液与500uLBSA溶液混合后,加入200uLNHS溶液,室温反应15分钟,后加入100uLEDC。再反应15分钟。
④加入1.4uL巯基乙醇终止EDC反应,得到活化蛋白(EDC-BSA)。
⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的蛋白(小分子半抗原T4),室温反应2小时。
⑥加入50mmol/LTris终止反应,得到耦联蛋白(BSA-T4)。
⑦加入脱盐柱,脱盐柱先以1000g,2min将里面的储存液排出,然后加入0.01MPBS以同样的转速离心2次后,加入反应的耦联蛋白,离心后,即为耦联产物。
试剂盒微孔板制备:
①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中,37度放置2小时;
②甩干板条,加入封闭液200uL。37度放置2小时。
③洗涤一次后,放入真空干燥箱5小时。
④真空封袋后,放入4度冰箱。
其中,步骤①中的包被液为,1L纯水中含有氯化钠8.5g,磷酸二氢钠0.58g,磷酸氢二钠5.8g。
校准品、质控品制备和酶结合物制备同实施例1。
试剂盒的使用:
①依次往微孔板中加入50uL校准品(或样本),100uL酶标(抗原),充分混匀,37℃反应60分钟。
②洗涤四次,每次加样量为350uL。
③然后加入发光液,放入化学发光分析仪中读数,计算数据得出校准品或样本中T4抗原的量。
发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B,发光底物液A含有鲁米诺,发光底物液B含有辣根过氧化物酶温度剂、过氧化氢;浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。
实验结果:
表5:校准品结果
梯度(ng/mL) | 1 | 20 | 100 | 300 | 800 | 1500 |
信号值 | 3225 | 1632 | 1236 | 604 | 145 | 112 |
表6:待测样本结果
样本值 | 信号值 | 本发明试剂盒检测值 |
25.37 | 2015 | 23.75 |
112.3 | 1236 | 112.78 |
701.2 | 261 | 792.69 |
336.5 | 598 | 404.01 |
301.2 | 753 | 296.32 |
20.36 | 2341 | 12.37 |
158.4 | 1026 | 171.65 |
419.2 | 633 | 376.69 |
105.8 | 1044 | 165.58 |
其中样本值为罗氏411仪器测得,cutoff=141,样本值与检测值相关性:98.69%
由以上实施例可见,本发明试剂盒操作简单,一步完成,包被一般不会出现过量包被造成IC50值(被抑制一半时抑制剂的浓度)较高,并且游离的抗原更容易和标记的抗体进行反应,检测范围更加宽广,检测灵敏度和精确度较高。
Claims (1)
1.一种T4化学发光体外诊断试剂盒,其特征在于,包括微孔板、校准品、质控品、酶结合物、发光底物液和浓缩洗涤液;其中微孔板中含有小分子半抗原T4耦联载体蛋白得到的小分子耦联蛋白;校准品与质控品为已知浓度的T4抗原;酶结合物中含有T4酶标抗体;
发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B,发光底物液A含有鲁米诺,发光底物液B含有辣根过氧化物酶稳定剂、过氧化氢;浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20;
所述的小分子耦联蛋白,为使用EDC将小分子半抗原T4和载体蛋白BSA进行耦联得到的小分子耦联蛋白;
将小分子半抗原T4和载体蛋白BSA进行耦联具体方法为:
①平衡EDC,NHS至室温;
②将EDC、NHS、BSA分别用活化缓冲液溶解;活化缓冲液包括:0.1M的MES,0.5M的NaCl,调节pH为6.0;EDC用活化缓冲液溶解,终浓度为45-55mg/mL,NHS同样用活化缓冲液溶解,终浓度为45-55mg/mL,BSA用活化缓冲液溶解,终浓度为4.5-5.5mg/mL;
③将2-4体积份的EDC溶液与5-10体积份BSA溶液混合后,加入与EDC等量的NHS溶液,室温反应10-20分钟,后再加入1-2体积份的EDC;再室温反应10-20分钟;
④加入巯基乙醇终止EDC反应,得到活化蛋白EDC-BSA;
⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的小分子半抗原T4,室温反应1.5-3小时;
⑥加入Tris终止反应,得到耦联蛋白BSA-T4;Tris为20-50mmol/L;
⑦加入脱盐柱脱盐柱先以1000g,2min将里面的储存液排出,然后加入0.01MPBS以同样的转速离心3-5次后,加入反应的耦联蛋白,离心后,即为耦联产物;
制备试剂盒,步骤为:
①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中,37度放置2小时;
②甩干板条,加入封闭液,37度放置2小时;
③洗涤一次后,放入真空干燥箱4-6小时;
④真空封袋后,放入4度冰箱;
所述的T4化学发光体外诊断试剂盒的使用方法,其特征在于,
①分别往微孔板中加入校准品、质控品和待测样本,再往微孔板中加入酶结合物,充分混匀,37℃反应50-80分钟;
②加入洗涤液洗涤3-6次,每次加洗涤液量为300-400uL;
③然后向微孔板中加入发光底物液,放入化学发光分析仪中读数,计算数据,得出待测样本中小分子半抗原T4的量。
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Denomination of invention: T4 chemiluminescence in vitro diagnostic kit and its use method Effective date of registration: 20230113 Granted publication date: 20160224 Pledgee: China Minsheng Banking Corp Shanghai branch Pledgor: SHANGHAI YULONG MEDICAL LABORATORY CO.,LTD. Registration number: Y2023310000007 |