CN103499564B - T4化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种T4化学发光体外诊断试剂盒，本发明对于那些极性强，分子量小的半抗原无法包被于固相载体进行检测，提供了一种使用方便的试剂盒，解决了半抗原包被不佳的情况，便于快速、灵敏的进行T4的检测。

Description

T4化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种T4检测试剂盒，具体涉及一种T4化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法。

背景技术

甲状腺素(Thyroxin(e)，Thx，T4)是甲状腺滤泡细胞合成及分泌的激素，以游离形式释放入血循环中并迅速与血浆蛋白相结合。甲状腺素又称四碘甲状腺原氨酸，由两个3，5-二碘酪氨酸分子偶联而成的一种碘化的酪氨酸衍生物，是甲状腺的主要激素。甲状腺素的化学本质为四碘甲状腺原氨酸，即T4，有DL,L,D型，其中L型活性强，D型活性较小。甲状腺素无臭，无味，遇光变质，熔点231-233℃（分解），不溶于水和乙醇等普通有机溶剂，但溶于含有无机酸或碱的乙醇，也溶于氢氧化碱和碳酸碱溶液。在其酸性乙醇溶液中加入亚硝酸钠，加热即呈黄色，再加过量氨水即变为粉红色。甲状腺素可由牛、羊、猪等的甲状腺中提取，也可人工合成。甲状腺素主要控制耗氧速率和总代谢速率。甲状腺素具有促进一般组织代谢，提高神经兴奋性和身体发育的作用，可用于治疗甲状腺机能减退，粘液性水肿和克汀病等。定量测定人血清游离T4（FT4）对甲状腺疾病的诊断，甲状腺的病理、生理研究有重要意义使用。

T4以前一直用放射免疫分析（RIA），放射免疫分析它既具有免疫反应的高特异性，又具有放射性测量的高灵敏度，因此能精确测定各种具有免疫活性的极微量的物质，但是放射免疫分析存在放射线辐射和污染等问题，用ELISA方法快速简便，既有放射免疫分析的优点，同时也减少了污染。

竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和固相抗原竞争结合酶标抗体，因此结合于固相的酶标抗体量与受检抗原的量成反比。操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原。洗涤。（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗体的混合溶液，使之与固相抗原反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗体能顺利地与固相抗原结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗体以同样的机会与固相抗原结合，竞争性地占去了酶标抗体与固相载体结合的机会，使酶标抗体与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗体，保温后，酶标抗体与固相抗原的结合可达最充分的量。洗涤。（3）加发光液显色：参考管中由于结合的酶标抗体最多，信号值最高。参考管信号值与待测管信号值的大小，代表受检标本抗原的量。待测管信号值越低，表示标本中抗原含量越多。

由于半抗原都是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白耦联是很重要的。

现在T4试剂盒比较多的为酶联免疫方法测T4，ELISA法也以快速，简单实效，而被广泛应用，但是相对于化学发光，不具有发光检测的高灵敏度和检测范围。

发明内容

本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种T4化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法。本发明对于那些极性强，分子量小的半抗原无法包被于固相载体进行检测，提供了一种使用方便的试剂盒，解决了半抗原包被不佳的情况，便于快速、灵敏的进行T4的检测。

本发明的一种T4化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法技术方案为，该T4化学发光体外诊断试剂盒，包括微孔板、校准品、质控品、酶结合物、发光底物液和浓缩洗涤液；其中微孔板中含有小分子半抗原T4耦联载体蛋白得到的小分子耦联蛋白；校准品与质控品为已知浓度的T4抗原；酶结合物中含有T4酶标抗体。

发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A含有鲁米诺，发光底物液B含有辣根过氧化物酶稳定剂、过氧化氢；浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。

微孔板中含有的小分子耦联蛋白，是将小分子半抗原T4耦联载体蛋白BSA得到的小分子耦联蛋白。

所述的小分子耦联蛋白，为使用EDC将小分子半抗原T4和载体蛋白BSA进行耦联得到的小分子耦联蛋白。

将小分子半抗原T4和载体蛋白BSA进行耦联具体方法为：

①平衡EDC，NHS至室温；

②将EDC、NHS、BSA分别用活化缓冲液溶解；

③将2-4体积份的EDC溶液与5-10体积份BSA溶液混合后，加入与EDC等量的NHS溶液，室温反应10-20分钟，后再加入1-2体积份的EDC；再室温反应10-20分钟；

④加入巯基乙醇终止EDC反应，得到活化蛋白EDC-BSA；

⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的小分子半抗原T4，室温反应1.5-3小时；

⑥加入Tris终止反应，得到耦联蛋白BSA-T4；

⑦加入脱盐柱，将里面的储存液排出，然后加入PBS以同样的转速离心3-5次后，加入反应的耦联蛋白，离心后，即为耦联产物。

步骤②中活化缓冲液包括：0.1M的MES，0.5M的NACl，调节pH为6.0。

步骤②中EDC用活化缓冲液溶解，终浓度为45-55mg/mL，NHS同样用活化缓冲液溶解，终浓度为45-55mg/mL，BSA用活化缓冲液溶解，终浓度为4.5-5.5mg/mL。

步骤⑥中Tris为20-50mmol/L。

耦联好的蛋白包被方式制备试剂盒，步骤为：

①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中，37度放置2小时；

②甩干板条，加入封闭液，37度放置2小时；

③洗涤一次后，放入真空干燥箱4-6小时；

④真空封袋后，放入4度冰箱。

其中，步骤①中的包被液为，氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠的混合水溶液，其中还可以含有防腐剂。

上述的T4化学发光体外诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，

①分别往微孔板中加入校准品、质控品和待测样本，再往微孔板中加入酶结合物，充分混匀，37℃反应50-80分钟；

②加入洗涤液洗涤3-6次，每次加洗涤液量为300-400uL；

③然后向微孔板中加入发光底物液，放入化学发光分析仪中读数，计算数据，得出待测样本中小分子半抗原T4的量。

浓缩洗涤液加纯水稀释为洗涤液（例：20×浓缩洗涤液50ml+950ml的纯水即为1×洗涤液）。

本发明的有益效果为：本发明的试剂盒使用方便，本发明运用化学发光法定量检测，可以使其检测范围更加宽广，增加其灵敏度，精密度实验也优于一般的ELISA方法。而对比市面上的化学方法定量检测试剂盒，本发明试剂盒用的为间接法，通过包被小分子半抗原，采用竞争法检测T4。

小分子抗原，又称为半抗原，这些小分子本身没有免疫原性，当与载体结合后形成大分子，可以获得免疫原性。半抗原与载体形成的免疫原，当半抗原分子量极小，或则极性较大时，小分子抗原往往不容易直接固相吸附于板条上，使用BSA偶联小分子，可以形成较大的分子量，通过疏水作用就容易吸附于固相载体上，这样的方法灵敏度高，高度的特异性和灵敏性，能使分析过程简化。

EDC将T4和载体进行耦联。EDC能与载体蛋白BSA形成一种活泼的酯结构，半抗原T4的基团上有羧基基团，能使之与BSA-EDC反应，可以形成BSA-T4偶联物。甲状腺素-牛血清白蛋白偶联物(Thyroxin(e)-BovineSerumAlbuminConjugate，Thx-BSAConjugate，T4-BSAConjugate)是甲状腺素与载体蛋白-牛血清白蛋白（BSA)经化学交联获得的偶联物，可作为抗原免疫动物用于抗体的制备，或包被于固相载体用于甲状腺素及其抗体的检测。

采用竞争法检测小分子半抗原T4，该方法的好处在于操作简单，一步完成，包被一般不会出现过量包被造成IC50值（被抑制一半时抑制剂的浓度）较高，并且游离的抗原更容易和标记的抗体进行反应，灵敏度和精确度较高。而采用包被抗体的方法很容易造成包被过量影响IC50值，并且小分子的标记通常不能采用经典的过碘酸钠法，需要采用其他的化学方法，EDC。NHS/EDC等，对酶的活性有一定的影响。

附图说明：

图1所示为竞争法原理图；

图2所示为校准品趋势图。

具体实施方式：

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

实施例1

材料：

活化缓冲液：0.1MMES，0.5MNACl，pH6.0；

载体蛋白：BSA；

目的蛋白：小分子半抗原T4；

NHS；巯基乙醇；脱盐柱

将小分子半抗原T4和载体蛋白进行耦联，

①平衡EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐），NHS（N-羟基丁二酰亚胺）至室温。

②将EDC用活化缓冲液溶解，终浓度为50mg/mL，NHS同样用活化缓冲液溶解，终浓度为50mg/mL，BSA（牛血清白蛋白）用活化缓冲液溶解，终浓度为5mg/mL。

③将200uLEDC溶液与500uLBSA溶液混合后，加入200uLNHS溶液，室温反应15分钟，后加入100uLEDC。再反应15分钟。

④加入1.4uL巯基乙醇终止EDC反应，得到活化蛋白（EDC-BSA）。

⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的蛋白（小分子半抗原T4），室温反应2小时。

⑥加入30mmol/LTris终止反应，得到耦联蛋白（BSA-T4）。

⑦加入脱盐柱，脱盐柱先以1000g，2min将里面的储存液排出，然后加入0.01MPBS以同样的转速离心4次后，加入反应的耦联蛋白，离心后，即为耦联产物。

试剂盒微孔板制备：

①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中，37度放置2小时；

②甩干板条，加入封闭液200uL。37度放置2小时。

③洗涤一次后，放入真空干燥箱5小时。

④真空封袋后，放入4度冰箱。

其中，步骤①中的包被液为，1L纯水中含有氯化钠8.5g，磷酸二氢钠0.58g，磷酸氢二钠5.8g。

校准品、质控品制备：用T4抗原、样品稀释液（1%BSA溶解于PH7.4的PBS溶液中）分别配制浓度为1、20、100、300、800、1500ng/ml的6个校准品、100、800ng/ml的2个质控品。

酶结合物制备：

用T4酶标抗体、酶稀释液（20%小牛血清混合于pH7.4的PBS溶液中）配制成一定浓度的酶结合物。

试剂盒的使用：

①分别向微孔板中加入50uL校准品、质控品和待测样本，再往微孔板中加入100uL酶标抗体，分别与校准品、质控品和待测样本充分混匀，37℃反应60分钟。

②浓缩洗涤液加纯水稀释为1×洗涤液（例：20×浓缩洗涤液50ml+950ml的纯水即为1×洗涤液），加入洗涤液洗涤四次，每次加洗涤液量为350uL。

③然后向微孔板中加入发光底物液，放入化学发光分析仪中读数，计算数据得出待测样本中T4抗原的量。

发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A含有鲁米诺，发光底物液B含有辣根过氧化物酶温度剂、过氧化氢；浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。

实验结果：

表1：校准品结果

梯度(ng/mL)	1	20	100	300	800	1500
							信号值	3108	1590	1125	534	141	108

表2：待测样本结果

样本值	信号值	本发明试剂盒检测值
			115.1	1242	106.24
79.63	1358	84.24
			164.6	1029	162.66
134.3	1189	118.12
			155.9	1075	148.37
320	659	340.93
			309.8	714	305.42
286.3	857	229.45
			45.8	1688	43.54

其中样本值为罗氏411仪器测得，cutoff=141，样本值与本发明试剂盒检测值相关性：97.86%

实施例2

材料：

活化缓冲液：0.1MMES，0.5MNACl，pH6.0

载体蛋白：BSA；

目的蛋白：小分子半抗原T4

NHS；巯基乙醇；脱盐柱

将小分子半抗原T4和载体蛋白进行耦联，

①平衡EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐），NHS（N-羟基丁二酰亚胺）至室温。

②将EDC用活化缓冲液溶解，终浓度为45mg/mL，NHS同样用活化缓冲液溶解，终浓度为55mg/mL，BSA（牛血清白蛋白）用活化缓冲液溶解，终浓度为4.5mg/mL。

③将200uLEDC溶液与500uLBSA溶液混合后，加入200uLNHS溶液，室温反应15分钟，后加入100uLEDC。再反应15分钟。

④加入1.4uL巯基乙醇终止EDC反应，得到活化蛋白（EDC-BSA）。

⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的蛋白（小分子半抗原T4），室温反应2小时。

⑥加入20mmol/LTris终止反应，得到耦联蛋白（BSA-T4）。

⑦加入脱盐柱，脱盐柱先以1000g，2min将里面的储存液排出，然后加入0.01MPBS以同样的转速离心3次后，加入反应的耦联蛋白，离心后，即为耦联产物。

试剂盒微孔板制备：

①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中，37度放置2小时；

②甩干板条，加入封闭液200uL。37度放置2小时。

③洗涤一次后，放入真空干燥箱5小时。

④真空封袋后，放入4度冰箱。

其中，步骤①中的包被液为，1L纯水中含有氯化钠8.5g，磷酸二氢钠0.58g，磷酸氢二钠5.8g。

校准品、质控品制备和酶结合物制备同实施例1。

试剂盒的使用：

①依次往微孔板中加入50uL校准品（或样本），100uL酶标（抗原），充分混匀，37℃反应60分钟。

②洗涤五次，每次加样量为350uL。

③然后加入发光液，放入化学发光分析仪中读数，计算数据得出待测样本中T4抗原的量。

发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A含有鲁米诺，发光底物液B含有辣根过氧化物酶温度剂、过氧化氢；浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。

实验结果：

表3：校准品结果

梯度(ng/mL)	1	20	100	300	800	1500
							信号值	3022	1458	1107	599	152	107

表4：待测样本结果

样本值	信号值	本发明试剂盒检测值
			106.7	1123	140.72
514.8	427	566.11
			411.3	591	407.80
166.3	1028	170.17
			35.8	1874	31.34
718.7	336	679.11
			191.2	982	186.57
258.9	886	226.06
			87.36	1470	70.30

其中样本值为罗氏411仪器测得，cutoff=141，样本值与检测值相关性：99.18%

实施例3

材料：

活化缓冲液：0.1MMES，0.5MNACl，pH6.0

载体蛋白：BSA；

目的蛋白：小分子半抗原T4

NHS；巯基乙醇；脱盐柱

将小分子半抗原T4和载体蛋白进行耦联方法为，

①平衡EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐），NHS（N-羟基丁二酰亚胺）至室温。

②将EDC用活化缓冲液溶解，终浓度为55mg/mL，NHS同样用活化缓冲液溶解，终浓度为45mg/mL，BSA（牛血清白蛋白）用活化缓冲液溶解，终浓度为5.0mg/mL。

③将200uLEDC溶液与500uLBSA溶液混合后，加入200uLNHS溶液，室温反应15分钟，后加入100uLEDC。再反应15分钟。

④加入1.4uL巯基乙醇终止EDC反应，得到活化蛋白（EDC-BSA）。

⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的蛋白（小分子半抗原T4），室温反应2小时。

⑥加入50mmol/LTris终止反应，得到耦联蛋白（BSA-T4）。

⑦加入脱盐柱，脱盐柱先以1000g，2min将里面的储存液排出，然后加入0.01MPBS以同样的转速离心2次后，加入反应的耦联蛋白，离心后，即为耦联产物。

试剂盒微孔板制备：

①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中，37度放置2小时；

②甩干板条，加入封闭液200uL。37度放置2小时。

③洗涤一次后，放入真空干燥箱5小时。

④真空封袋后，放入4度冰箱。

其中，步骤①中的包被液为，1L纯水中含有氯化钠8.5g，磷酸二氢钠0.58g，磷酸氢二钠5.8g。

校准品、质控品制备和酶结合物制备同实施例1。

试剂盒的使用：

①依次往微孔板中加入50uL校准品（或样本），100uL酶标（抗原），充分混匀，37℃反应60分钟。

②洗涤四次，每次加样量为350uL。

③然后加入发光液，放入化学发光分析仪中读数，计算数据得出校准品或样本中T4抗原的量。

发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A含有鲁米诺，发光底物液B含有辣根过氧化物酶温度剂、过氧化氢；浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。

实验结果：

表5：校准品结果

梯度(ng/mL)	1	20	100	300	800	1500
							信号值	3225	1632	1236	604	145	112

表6：待测样本结果

样本值	信号值	本发明试剂盒检测值
			25.37	2015	23.75
112.3	1236	112.78
			701.2	261	792.69
336.5	598	404.01
			301.2	753	296.32
20.36	2341	12.37
			158.4	1026	171.65
419.2	633	376.69
			105.8	1044	165.58

其中样本值为罗氏411仪器测得，cutoff=141，样本值与检测值相关性：98.69%

由以上实施例可见，本发明试剂盒操作简单，一步完成，包被一般不会出现过量包被造成IC50值（被抑制一半时抑制剂的浓度）较高，并且游离的抗原更容易和标记的抗体进行反应，检测范围更加宽广，检测灵敏度和精确度较高。

Claims (1)

1.一种T4化学发光体外诊断试剂盒，其特征在于，包括微孔板、校准品、质控品、酶结合物、发光底物液和浓缩洗涤液；其中微孔板中含有小分子半抗原T4耦联载体蛋白得到的小分子耦联蛋白；校准品与质控品为已知浓度的T4抗原；酶结合物中含有T4酶标抗体；

发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A含有鲁米诺，发光底物液B含有辣根过氧化物酶稳定剂、过氧化氢；浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20；

所述的小分子耦联蛋白，为使用EDC将小分子半抗原T4和载体蛋白BSA进行耦联得到的小分子耦联蛋白；

将小分子半抗原T4和载体蛋白BSA进行耦联具体方法为：

①平衡EDC，NHS至室温；

②将EDC、NHS、BSA分别用活化缓冲液溶解；活化缓冲液包括：0.1M的MES，0.5M的NaCl，调节pH为6.0；EDC用活化缓冲液溶解，终浓度为45-55mg/mL，NHS同样用活化缓冲液溶解，终浓度为45-55mg/mL，BSA用活化缓冲液溶解，终浓度为4.5-5.5mg/mL；

③将2-4体积份的EDC溶液与5-10体积份BSA溶液混合后，加入与EDC等量的NHS溶液，室温反应10-20分钟，后再加入1-2体积份的EDC；再室温反应10-20分钟；

④加入巯基乙醇终止EDC反应，得到活化蛋白EDC-BSA；

⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的小分子半抗原T4，室温反应1.5-3小时；

⑥加入Tris终止反应，得到耦联蛋白BSA-T4；Tris为20-50mmol/L；

⑦加入脱盐柱脱盐柱先以1000g，2min将里面的储存液排出，然后加入0.01MPBS以同样的转速离心3-5次后，加入反应的耦联蛋白，离心后，即为耦联产物；

制备试剂盒，步骤为：

①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中，37度放置2小时；

②甩干板条，加入封闭液，37度放置2小时；

③洗涤一次后，放入真空干燥箱4-6小时；

④真空封袋后，放入4度冰箱；

所述的T4化学发光体外诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，

①分别往微孔板中加入校准品、质控品和待测样本，再往微孔板中加入酶结合物，充分混匀，37℃反应50-80分钟；

②加入洗涤液洗涤3-6次，每次加洗涤液量为300-400uL；

③然后向微孔板中加入发光底物液，放入化学发光分析仪中读数，计算数据，得出待测样本中小分子半抗原T4的量。