CN107043828A

CN107043828A - 一种高危人***瘤病毒分型检测方法与试剂盒

Info

Publication number: CN107043828A
Application number: CN201710160534.4A
Authority: CN
Inventors: 郭圣明; 吴大治; 夏懿
Original assignee: Shanghai Xingyao Medical Technology Development Co Ltd
Current assignee: Shanghai Xingyao Medical Technology Development Co Ltd
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2017-08-15

Abstract

本发明提供一种高危人***瘤病毒（HPV）分型检测方法与试剂盒，该方法采用多对引物、多条探针的荧光核酸扩增方法，并结合熔解曲线分析，可在单波长荧光通道中实现多种靶核酸序列检测。通过该方法，以HPV基因组L1段序列为靶序列设计HPV特异性引物和TaqMan探针，设计与TaqMan探针不完全互补的PCO杂交探针，杂交探针的3’端可根据目的进行荧光淬灭基团标记或者非荧光淬灭基团标记，杂交探针标记后3’端不能再延伸，由此研制了含有上述引物探针以及荧光PCR其它组分的HPV基因分型试剂盒，通过荧光PCR扩增结合单波长熔解曲线分析能鉴别HPV16、18、31、52、59型。

Description

一种高危人***瘤病毒分型检测方法与试剂盒

技术领域

本发明为一种高危人***瘤病毒分型检测方法与试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

人***瘤病毒（Human papillomavirus, HPV）属于***瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的、环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对（bp），分为3个功能区，即早期转录区（E区）、晚期转录区（L区）和非转录区（长控制区，LCR）。HPV通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，目前已分离出130多种引起人类皮肤的多种***瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。不同的型别引起不同的临床表现，根据侵犯的组织部位不同可分为：（1）皮肤低危型：包括HPV1、2、3、4、7、10、12、15等型与寻常疣、扁平疣、跖疣等相关；（2）皮肤高危型：包括HPV 5、8、14、17、20、36、38型与疣状表皮发育不良有关，其它还与可能HPV感染有关的恶性肿瘤有关，包括：外阴癌、***癌、***癌、***癌、膀胱癌；（3）黏膜低危型如HPV 6、11、13、32、34、40、42、43、44、53、54等与感染生殖器、***、口咽部、食道黏膜相关；（4）黏膜高危型HPV 16、18、30、31、33、35、39与***、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌等相关。

对于感染生殖道和***的HPV，根据各基因型别致病力大小或致癌危险性大小可分为低危型和高危型两大类。在有性生活史的女性中生殖道HPV感染具有普遍性，据统计70%～80%的女性在其一生中会有至少一次的HPV感染，但大多数感染为自限性，超过90％的感染的女性会出现一种有效的免疫应答，在没有任何长期的健康干预时在6到24个月之间可以清除感染。而持续性的高危型HPV感染则是导致宫颈上皮内瘤变及***的主要原因。全球范围的研究结果显示，在99.7%的***患者体内检测到高危型HPV DNA的存在，其中HPV16型、18型、45型和31型感染占80%。低危型HPV一般与***或低度鳞状上皮内病变相关，极少引起***。依据WHO国际癌症研究机构（IARC）及其他国际组织的研究成果，国家食品药品监督管理局相关HPV检测产品注册指导原则建议将HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68这 13种基因型列为高危型别，26、53、66、73、82等5种基因型列为中等风险型别。

高危HPV感染是***的主要致病因素，99.7%***患者存在高危型HPV感染。哈拉尔德•楚尔•豪森于1976年发现HPV是导致女性第二常见癌症——***的罪魁祸首。1995年，国际癌症研究机构讨论确认HPV感染是***的主要原因，2005年，IARC/WHO推荐HPV检测可以用于***筛查。研究表明，HPV感染阳性者有15%～28%在2年内进展为***内病变，尤其是HPV16和18型感染危险性更高。由子***内病变发展到***大约需要10～20年的时间，现在所需年限正逐渐缩短。HPV感染率高低主要取决于年龄和性行为习惯，年轻性活跃的妇女感染率最高，可达40%。大部分妇女都是短暂性的HPV感染，通常在6-12个月消失，只有少数妇女会持续感染乃至最终发展成***。多年来，国际上通用的宫颈上皮内瘤变及***的诊断主要遵循“三阶梯式”诊断程序，即宫颈细胞学、***镜及组织病理学检查。宫颈细胞学检查是普遍应用的宫颈上皮内瘤变及***的筛查方法，可发现早期病变，但宫颈细胞学检查存在其固有的局限性，并且对原位癌的检出率较低。高危型HPV感染的检测对于预防和早期发现***有非常重要的意义。

基于TaqMan探针技术的荧光定量PCR是融汇了PCR高敏感性、DNA杂交技术高特异性和光谱技术高精确定量三大技术的一种新的检测方法。TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’-末端，淬灭基团在探针3’-末端。当探针完整及其与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’-端的淬灭基团接近而被淬灭，无荧光信号产生。在进行PCR反应延伸过程时，Taq DNA聚合酶的5'→3'外切核酸酶活性将探针降解，使得荧光基团与淬灭基团分离，即产生荧光信号。每经历一个PCR反应循环，就有一分子的扩增产物生成，并伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团信号不断积累，为一个指数同步增长的过程，荧光信号的强度就代表了扩增产物的拷贝数。该技术具有特异性强、自动化程度高等特点、有效解决了PCR污染等问题。单重探针实时定量PCR，因每条探针都是针对特异的靶位点设计，具有较高的特异性，每条探针只能检测一种靶序列，如需检测多种靶序列，需要加入多条探针，由于探针荧光标记吸收波长因素的限制，基因序列检测种类受到制约限制。

本发明提供一种高危人***瘤病毒分型检测方法与试剂盒，该方法采用多条同源上游引物、多条同源下游引物以及多条探针的方法，即在上下游引物设计位点，设计多条同源引物覆盖扩增更多的同源序列，多条探针标记可标记相同的荧光发光基团，在荧光扩增后结合熔解曲线进行多型别HPV分型。根据TaqMan引物探针设计原则，选择在人***瘤病毒基因组的L1段序列作为靶位点设计通用扩增引物和人***瘤病毒特异性的TaqMan探针，根据TaqMan探针序列设计与其不完全互补的杂交探针——PCO（partially complementary oligonucleotide，部分互补序列），杂交探针目的用于扩增后产物熔解曲线分析，杂交探针的3’端可根据目的进行荧光淬灭基团标记（即Black Hole Quencher，缩写BHQ，包括BHQ1、BHQ2、BHQ3等）或者磷酸化基团（phosphate，PHO）标记，杂交探针标记后3’端不能再延伸。同时提供一种人***瘤病毒核酸分型检测试剂盒，通过荧光PCR扩增结合单波长熔解曲线分析鉴别HPV16、18、31、52、59型。本发明还引入内源性的内参照***，用于监测样本取样质量以避免检测结果的假阴性。和现有人***瘤病毒核酸分型检测公开技术比较，本发明的检测结果稳定可靠，试剂盒使用方便，检测灵敏度高，单个波长进行荧光PCR反应即可鉴别更多的HPV基因亚型。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种高危人***瘤病毒分型检测方法，另一目的是提供一种HPV16、18、31、52、59型分型检测试剂盒。

本发明在Markus Schmitt等人（J CLIN MICROBIOL, 2008,46(3): 1050–1059）设计的通用引物BS GP5+/6+(BS)基础上，综合考虑试剂盒所覆盖检测的高危HPV型别以及荧光PCR扩增退火温度较高的特点，设计适合本试剂盒的通用引物序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9。

本发明中HPV16、18、31、52、59型检测基于L1基因，优选的靶序列分别为：SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14，并根据靶序列设计HPV16、18、31、52、59型特异性探针序列分别为：SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19，TaqMan探针5’端均标记相同的荧光基团标记（FAM、VIC/JOE/HEX、ROX或者CY5），3’端均标记相同的BHQ2淬灭基团。

在本发明中，根据TaqMan探针的互补序列进行PCO杂交探针设计，PCO杂交探针设计原则为：(1)序列与相应的TaqMan探针序列不完全互补（一般有3-6个碱基的错配）；(2)不同的TaqMan探针可以与同一条PCO探针杂交进行熔解曲线分析；(3)PCO探针3’端必须进行标记封闭，防止PCO探针3’端延伸，3’端标记的淬灭基团可以为BHQ1、BHQ2、BHQ3、PHO等；(4)PCO探针设计完成后需对其进行熔解曲线模拟分析Tm值。根据HPV特异性探针序列设计出三条PCO探针，PCO探针序列分别为：SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22，其中序列SEQ ID No.203’端以PHO标记修饰封闭，SEQ ID No.21、SEQ ID No.22 3’端以BHQ2淬灭基团修饰封闭。

本发明还提供一种人内源性内参照***，内参引物为SEQ ID No.23、SEQ IDNo.24，内参探针为SEQ ID No.25，内参探针5’端均标记与HPV目的检测探针不同的荧光基团标记（FAM、VIC/JOE/HEX、ROX或者CY5），3’端标记BHQ2淬灭基团。

本发明提供一种HPV16、18、31、52、59型分型检测试剂盒，采用荧光PCR结合熔解曲线技术对高危人***瘤病毒16、18、31、52、59型进行核酸定性检测。在使用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法纯化试剂（核酸提取及纯化试剂（产品型号：拭子DNA））对宫颈脱落细胞样本进行全自动核酸提取后，直接配制反应体系进行扩增，并通过熔解曲线进行结果分型分析，反应体系配制方便，PCR产物无需开盖分析，通过单波长的熔解曲线分析即可区分5种高危型别，并且体系中引入了dUTP-UNG酶***防止PCR产物污染。

本发明提供了一种通过荧光PCR扩增并结合单波长熔解曲线分析检测多种高危HPV亚型的方法，同时提供了一种高危人***瘤病毒16、18、31、52、59型分型检测试剂盒。

1.实时荧光PCR引物的设计

通过对文献检索确定：在Markus Schmitt等人设计的通用引物BSGP5+/6+(BS)基础上进行引物优化设计。荧光PCR扩增检测技术中引物设计的规则为：(1)避免引物自身或引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发夹结构；(2)典型的引物18-24个核苷酸长，引物需足够长，保证序列独特性,并降低非特异性；(3)Tm值在55-65℃，GC含量在40%-60%；(4)引物之间的Tm值避免相差2℃；(5)引物的3’端避免使用碱基A，引物3’端避免出现3个或者3个以上连续相同的碱基；(6) TaqMan探针技术要求片段长度在50-250bp之间；(7)引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。

按照TaqMan荧光PCR设计的原则，基于BSGP5+/6+(BS)通用引物组的基础设计出本发明HPV扩增通用引物：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9，具体序列如下：

上游引物为：

5’- CAACTATTTGTTACTGTTGTTGATACTAC -3’如SEQ ID No.1所示；

5’- CAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCAC -3’如SEQ ID No.2所示；

5’- CAGTTGTTTGTCACAGTTGTGGATACCAC -3’如SEQ ID No.3所示；

5’- CAATTGTTTTTAACAGTTGTAGATCCTAC -3’，如SEQ ID No.4所示；

下游引物为：

5’- GAAATATAAACTGCAAATCAAATTCCTC-3’，如SEQ ID No.5所示；

5’- GAAAAATAAATTGTAAATCAAATTCCTC -3’，如SEQ ID No.6所示；

5’- GAAATATAAATTGTAAATCAAATTCCTC -3’，如SEQ ID No.7所示；

5’- GAAAAATAAACTGCAAATCATATTCCTC -3’，如SEQ ID No.8所示；

5’- GAAAAATAAACTGTAAATCATATTCCTC -3’，如SEQ ID No.9所示。

2.HPV分型探针的设计

TaqMan探针设计原则为：(1)探针长度应在15bp-45bp(最好20-30bp)，保证结合特异性；(2) 探针的DNA折叠和二级结构尽量避开；(3) Tm值在65-70℃,通常比引物Tm值高5-10℃(至少5℃)，以确保在退火过程中探针先于引物与目的片段结合，GC含量在40%-60%；(4)探针的5’端尽量避免使用G鸟嘌呤；(5)整条探针中碱基C的含量要明显高于G含量。HPV16、18、31、52、59型特异性探针分别以基因组L1片段序列设计，L1片段分别为：SEQ ID No.10、SEQID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14，根据L1片段设计的TaqMan探针序列分别为：SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19。

HPV16型探针序列为：

5’- TGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATATAA -3’，5’端标记FAM(6-羧基荧光素)，3’端标记BHQ2，如SEQ ID No.15所示。

HPV18型探针序列为：

5’- TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGG -3’，5’端标记FAM，3’端标记BHQ2，如SEQ IDNo.16所示。

HPV31型探针序列为：

5’- TGCTGCAATTGCAAACAGTGATACTACATTTAA -3’，5’端标记FAM，3’端标记BHQ2，如SEQID No.17所示。

HPV52型探针序列为：

5’- TGCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATATAA -3’，5’端标记FAM，3’端标记BHQ2，如SEQ IDNo.18所示。

HPV59型探针序列为：

5’- TGCTTCTACTACTTCTTCTATTCCTAATGTAC -3’，5’端标记FAM，3’端标记BHQ2，如SEQID No.19所示。

3.HPV PCO探针的设计及验证

本发明的提供一种PCO探针序列设计方法，PCO探针是一种与靶序列不完全匹配的探针，设计目的是为了在熔解曲线分析中区分不同的靶核酸序列，且一条PCO探针可以区分多条靶核酸序列。根据SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ IDNo.19探针的互补序列设计PCO探针，以TaqMan探针SEQ ID No.18为例设计其PCO探针：

SEQ ID No.18序列：5’- TGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATATAA -3’

其互补序列为：5’- TTATATGTAGTTTCTGAAGTAGATATGGCAGCA -3’

在其互补序列基础上设计5个碱基错配，经过设计错配的互补序列为：5’-TTATATGTAGTTTCAGATGTAAATATGCGAGCA -3’， 3’端标记BHQ2淬灭基团，如SEQ ID No.21所示。

SEQ IDNo.18序列（5’--->3’方向）与SEQ ID No.21序列（3’--->5’方向）互补情况如下：

SEQ ID No.21探针序列设计完成之后进行模拟探针杂交熔解曲线分析，模拟分析结果见附图1，再通过实验室或者第三方引物探针合成服务公司合成引物探针，进行实验验证，验证结果见附图2。以同样的方法设计PCO探针SEQ ID No.20和SEQ ID No.22，序列如下：

5’- TTATATGTAGTATCACTGTTAGCTATCGCAGCA -3’，3’端标记PHO，如SEQ ID No.20所示；

5’- GTATA TATTT GGTAC AGGAG ACTCT GTAGA GG -3’，3’端标记BHQ2，如SEQ IDNo.22所示；

SEQ ID No.20探针分别与SEQ ID No.15探针和SEQ ID No.17探针杂交互补，SEQ IDNo.22探针分别与SEQ ID No.16探针和SEQ ID No.19探针互补。

HPV16、18、31、52、59型的TaqMan探针分别与各自的PCO探针熔解曲线分析，结果分别见图3、4、5、2、6，之后混合到一管中进行荧光PCR扩增结合单波长熔解曲线分析验证，结果见图7～图11。

4.内参照***设计

本发明中按TaqMan探针荧光PCR原则设计了内源性内参照***，用于监测样本的取样、提取和扩增，避免检测结果假阴性，内参照***包括内参引物和探针，根据TaqMan荧光PCR设计原则，设计的引物和探针序列如下：

5’- CTAAG CAGAA CTCTT CCCCA T-3’，如SEQ ID No.23所示；

5’- CTCAG CCAGT CCTCC ACAT-3’，如SEQ ID No.24所示；

5’- TCTGC CTATG GCTTG ACCAG GCAG-3’，5’端标记Cy5荧光基团，3’端标记BHQ2，如SEQ ID No.25所示。

5. 试剂盒制备

含有上述引物和探针的人***瘤病毒16、18、31、52、59型核酸分型检测试剂盒 (荧光PCR法)(32人份)，其主要组分如下：

(1)PCR缓冲液，288μl

配制方法：在14.2mL超纯水中依次加入10*PCR Buffer（含100mM pH8.3的Tris-HCl、500mM KCl） 30.0ml，5mM dNTPs（包括dATP、dGTP、dCTP、dUTP）各12mL，0.05mol/L MgCl₂33ml，10mg/mL BSA 0.8mL，振荡混匀，终体积为90.0 ml，以288μl/管分装后即为试剂盒中PCR缓冲液。

(2)引物探针，256μl

配制方法：在76.31mL灭菌超纯水中分别加入156μl 200pmol/μl引物SEQ ID No.1，156μl 200pmol/μl引物SEQ ID No.2，156μl 200pmol/μl引物SEQ ID No.3，156μl 200pmol/μl引物SEQ ID No.4，156μl 200pmol/μl引物SEQ ID No.5，156μl 200pmol/μl引物SEQ IDNo.6，156μl 200pmol/μl引物SEQ ID No.7，156μl 200pmol/μl引物SEQ ID No.8，156μl200pmol/μl引物SEQ ID No.9，112.5μl 200pmol/μl引物SEQ ID No.15，139.5μl 200pmol/μl引物SEQ ID No.16，84μl 200pmol/μl引物SEQ ID No.17，97.5μl 200pmol/μl引物SEQID No.18，84μl 200pmol/μl引物SEQ ID No.19，555μl 200pmol/μl引物SEQ ID No.20，284.8μl 200pmol/μl引物SEQ ID No.21，474μl 200pmol/μl引物SEQ ID No.22，60μl200pmol/μl引物SEQ ID No. 23，90μl 200pmol/μl引物SEQ ID No. 24，300μl 200pmol/μl引物SEQ ID No.25，震荡混匀后以256μl/管分装，即为试剂盒中引物探针。

(3)DNA聚合酶，96μl

配制方法：在24.8ml酶稀释液（从上海宏谊生物技术有限公司外购）中加入Taq-DNA聚合酶（5U/μl）1.5 ml和UNG酶（1U/μl）3.7mL，颠倒多次混匀，终体积为30.0ml，以96μl/管分装即为试剂盒DNA聚合酶。

(4)阴性对照，400μl

用含有0.9% NaCl，1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl和0.1% Triton X-100的缓冲液稀释正常人类基因组DNA至10ng/mL，以400μl/管分装即为阴性对照。

(5)阳性对照和临界阳性对照，各400μL

用含有0.9% NaCl，1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl、0.1% Triton X-100和10ng/mL正常人类基因组DNA的缓冲液分别稀释HPV阳性质粒至10⁴ copies/µL、10² copies/µL，旋涡震荡混匀10分钟，以400μl/管分装后即为阳性对照和临界阳性对照。

将上述组分(1)～(5)分别进行抽检，检验合格后进行包装。

上述组装的试剂盒在-20℃保存，冻融次数应小于3次。

由(1)～(3)及模板配制的30μl反应体系，每个反应中加入PCR缓冲液9μL、引物探针8μL以及DNA聚合酶3μL，或者按比例配制公共体系后以20μL/反应进行分装，分装后每管中加入10μL提取的核酸样本。

3.试剂盒使用方法

本发明试剂盒在样本检测过程中使用方法之一如下：

(1)样本提取

取临床采集的宫颈脱落细胞样本，吸取含有宫颈脱落细胞的细胞保存液200μl置于上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法纯化试剂（核酸提取及纯化试剂（产品型号：拭子DNA））96孔核酸提取板的A1-H1、A7-H7孔中，按照提取试剂盒说明书的要求设置自动提取程序进行核酸提取，提取板的A5-H5、A11-H11孔为提取的核酸用于荧光PCR扩增检测。试剂盒阴性、临界阳性对照和阳性对照处理方法和样品液相同。

(2)扩增检测

按照发明内容中的方法，启封试剂盒，将各组分冻融振荡混匀后配制反应预混液，其配制方法如下：

a 按反应样本数（反应样本数＝待检样品数＋对照品3个＋1）n配制反应液：取PCR反应液n×9μl、引物探针n×8μl、DNA聚合酶n×3μl于一离心管中混匀；低速离心数秒，按20μl/管分装到反应管中，再分别加入10μl提取待检测的核酸。

b 取样本提取物、对照品提取物各10μl分别加入反应管中，低速离心数秒，取出置全自动荧光PCR仪上。

c 荧光PCR反应程序如下：

[1] 50℃ 2 min

[2] 95℃ 3 min

[3] 95℃ 6 s

[4] 66℃ 45 s

[5] Go to [3] ，9 cycles

[6] 95℃ 3 s

[7] 60℃ 33 s

[8] 63℃ 15 s

[9] Go to [6] ，42 cycles

在第[7]步采集FAM和CY5通道荧光信号

[10] 95℃ 15 s

[11] 25℃ 1 min

[12] 25℃——75℃熔解曲线分析

[13] 75℃ 15 s

[14] End。

注：Roche LightCycler 480 荧光PCR仪上反应程序具体参数设置要求如下：

1) 检测模式选择“Multi Color Hydrolysis Probe”，且同时选择FAM及Cy5通道；

2) 扩增及荧光采集步骤，选择在60℃采集荧光；

3) 熔解曲线步骤，熔解温度范围25～75℃，其中参数“Rape Rate（℃/s）”选择0.03，“Acquisitions (per ℃)”选择5，并且连续采集FAM及Cy5通道的荧光。

d 仪器PCR程序运行完成后按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析。对照图7-11进行熔解曲线分型分析。

CY5通道检测结果应符合下表要求：32<Ct_CY5

4. 有益效果

本发明根据在Markus Schmitt等人设计的通用引物BSGP5+/6+(BS)基础上进行引物优化设计，设计适合本试剂盒的引物组合，在人***瘤病毒特异的TaqMan探针的互补序列基础上设计PCO探针，通过模拟验证和实验验证，最后组研制出人***瘤病毒16、18、31、52、59型核酸分型检测试剂盒(荧光PCR法)，其主要特点如下：

(1) 采用人***瘤病毒保守L1片段序列，根据文献报道优化设计引物。

(2) 根据TaqMan探针的互补序列设计PCO探针，根据PCO探针和TaqMan探针进行熔解曲线分析进行分型检测HPV16、18、31、52、59型核酸，以相同荧光标记的TaqMan探针单管单波长定性检测不同HPV型别，试剂盒检测灵敏度高，结果稳定可靠。

(2) 引入内源性内参照***，可以监测提取和扩增整个过程，可以尽可能的避免假阳性和假阴性结果。

(3)扩增体系中的 dUTP-UNG 酶***更进一步避免了因扩增产物污染导致的结果假阳性。

本发明方法原理是基于TaqMan水解探针荧光PCR原理，结合探针杂交熔解曲线分析技术，以人***瘤病毒L1段基因序列为靶序列，采用相同荧光标记的HPV16、18、31、52、59型特异的探针，经荧光PCR扩增结合熔解曲线分析，可快速、准确的判断HPV16、18、31、52、59型核酸有无并进行分型鉴别。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明。

图1 SEQ ID No.18探针与SEQ ID No.21探针在终浓度分别为0.1mM、0.2mM，Na⁺浓度0.1M，Mg²⁺浓度为4.5mM条件下模拟熔解曲线结果。模拟结果为：Tm(Conc) 61.8°C，ΔG12.9 kcal/mol，ΔH 123.5 kcal/mol，ΔS 374.6 cal/mol/K，Tm(Cp) 61.8°C，Tm(Ext1)60.1°C，Tm(Ext2) 58.4°C。

图2 SEQ ID No.18探针与SEQ ID No.21探针进行复孔熔解曲线试验分析。

图3 SEQ ID No.15探针与SEQ ID No.20探针进行复孔熔解曲线试验分析。

图4 SEQ ID No.16探针与SEQ ID No.22探针进行复孔熔解曲线试验分析。

图5 SEQ ID No.17探针与SEQ ID No.20探针进行复孔熔解曲线试验分析。

图6 SEQ ID No.19探针与SEQ ID No.22探针进行复孔熔解曲线试验分析。

图7A为引物探针混合后复孔进行熔解曲线分析。

图7B为试剂盒HPV16型熔解曲线分型结果，圆圈位置标示曲线为HPV16型特征峰。

图8 HPV18型熔解曲线分型结果，圆圈位置标示曲线为HPV18型特征峰。

图9 HPV31型熔解曲线分型结果，圆圈位置标示曲线为HPV31型特征峰。

图10 HPV52型熔解曲线分型结果，圆圈位置标示曲线为HPV52型特征峰。

图11 HPV59型熔解曲线分型结果，圆圈位置标示曲线为HPV59型特征峰。

具体实施方式

以下为该发明结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1人***瘤病毒16、18、31、52、59型核酸分型检测试剂盒(荧光PCR法)

1.引物探针合成

委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成引物探针，合成的引物探针序列具体如下：

上游引物为：

5’- CAACTATTTGTTACTGTTGTTGATACTAC -3’如SEQ ID No.1所示；

5’- CAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCAC -3’如SEQ ID No.2所示；

5’- CAGTTGTTTGTCACAGTTGTGGATACCAC -3’如SEQ ID No.3所示；

5’- CAATTGTTTTTAACAGTTGTAGATCCTAC -3’，如SEQ ID No.4所示；

下游引物为：

5’- GAAATATAAACTGCAAATCAAATTCCTC-3’，如SEQ ID No.5所示；

5’- GAAAAATAAATTGTAAATCAAATTCCTC -3’，如SEQ ID No.6所示；

5’- GAAATATAAATTGTAAATCAAATTCCTC -3’，如SEQ ID No.7所示；

5’- GAAAAATAAACTGCAAATCATATTCCTC -3’，如SEQ ID No.8所示；

5’- GAAAAATAAACTGTAAATCATATTCCTC -3’，如SEQ ID No.9所示。

TaqMan探针序列为：

5’- TGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATATAA -3’，5’端标记FAM，3’端标记BHQ2，如SEQID No.15所示。

5’- TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGG -3’，5’端标记FAM，3’端标记BHQ2，如SEQID No.16所示。

5’- TGCTGCAATTGCAAACAGTGATACTACATTTAA -3’，5’端标记FAM，3’端标记BHQ2，如SEQ ID No.17所示。

5’- TGCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATATAA -3’，5’端标记FAM，3’端标记BHQ2，如SEQID No.18所示。

5’- TGCTTCTACTACTTCTTCTATTCCTAATGTAC -3’，5’端标记FAM，3’端标记BHQ2，如SEQ ID No.19所示。

PCO探针序列为：

5’- TTATATGTAGTATCACTGTTAGCTATCGCAGCA -3’，3’端标记PHO，如SEQ ID No.20所示。

5’- TTATATGTAGTTTCAGATGTAAATATGCGAGCA -3’，如3’端标记BHQ2淬灭基团，如SEQ ID No.21所示。

5’- GTATA TATTT GGTAC AGGAG ACTCT GTAGA GG -3’，3’端标记BHQ2，如SEQ IDNo.22所示。

合成后用无菌双蒸水溶解至浓度为200μM或者500μM，-20℃保存。

2.PCR缓冲液，288μl

3.引物探针，256μl

4.DNA聚合酶，96μl

5.阴性对照，400μl

用含有0.9% NaCl，1mmol/L EDTA, 10mmol/L Tris-HCl和0.1% Triton X-100的缓冲液稀释正常人类基因组DNA至10ng/mL，以400μl/管分装即为阴性对照。

6.阳性对照和临界阳性对照各400μL

用含有0.9% NaCl，1mmol/L EDTA, 10mmol/L Tris-HCl、0.1% Triton X-100和10ng/mL正常人类基因组DNA的缓冲液分别稀释HPV阳性质粒至10⁴ copies/µL、10² copies/µL，旋涡震荡混匀10分钟，以400μl/管分装后即为阳性对照和临界阳性对照。

将上述组分2-6分别进行抽样检验，检验合格后进行包装。

上述组装的试剂盒在-20℃保存，冻融次数应小于3次。

试剂盒制备工艺简述如下：

(1)合成的引物探针定量配制、浓度检测、抽样质检。

(2)将PCR缓冲液、Taq酶、核酸提取液、内参照无菌分装，抽样质检。

(3)将阴性、阳性对照品进行浓度测定、分装，抽样质检。

(4)组装成品试剂盒，保存于-20℃。

实施例2人***瘤病毒16、18、31、52、59型核酸分型检测试剂盒(荧光PCR法)的应用

采用本发明所得试剂盒对20例临床样本进行测试，同时用艾康生物技术有限公司生产的人***瘤病毒基因分型（25型）检测试剂盒（PCR-反向点杂交法）进行平行对比试验，评价试剂盒效果。

1.人***瘤病毒16、18、31、52、59型核酸分型检测试剂盒(荧光PCR法)检测临床样本

(1) 试剂配制

按样本数n（样本数=待检样本数+对照品3个+1）配制反应液：

取PCR缓冲液n×9 μL、酶混合液n×3 μL、引物探针n×8 μL于一离心管中混匀；低速离心数秒，按20 μL/管分装到反应管中。分装后反应管可在2～8℃放置3小时。

(2) 核酸提取

将取样管中的宫颈刷充分振荡洗涤，取400μL洗涤液，采用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法纯化试剂（核酸提取及纯化试剂（产品型号：拭子DNA））进行核酸提取。

核酸提取完成后，核酸提取液用于PCR检测，或将核酸提取液转移到离心管中于-20℃保存。

(3) 样本及对照品加样

取阴性对照、阳性对照、临界阳性对照以及待检样本核酸提取液各10 μL分别加入反应管中，低速离心数秒，取出置实时荧光定量PCR仪上。

(4) PCR扩增及熔解曲线分析

将 PCR扩增管按顺序放入PCR仪，设置如下图的反应程序

[1] 50℃ 2 min

[2] 95℃ 3 min

[3] 95℃ 6 s

[4] 66℃ 45 s

[5] Go to [3] ，9 cycles

[6] 95℃ 3 s

[7] 60℃ 33 s

[8] 63℃ 15 s

[9] Go to [6] ，42 cycles

在第[7]步采集FAM和CY5通道荧光信号

[10] 95℃ 15 s

[11] 25℃ 1 min

[12] 25℃——75℃熔解曲线分析

[13] 75℃ 15 s

[14] End。

1）检测模式选择“Multi Color Hydrolysis Probe”，且同时选择FAM及Cy5通道；

2）扩增及荧光采集步骤，选择在60℃采集荧光；

3）熔解曲线步骤，熔解温度范围25～75℃，其中参数“Rape Rate（℃/s）”选择0.03，“Acquisitions (per ℃)”选择5，并且连续采集FAM及Cy5通道的荧光。

2. 人***瘤病毒基因分型（25型）检测试剂盒（PCR-反向点杂交法）检测临床样本

临床操作方法见艾康生物技术有限公司生产的人***瘤病毒基因分型（25型）检测试剂盒（PCR-反向点杂交法）说明书。

3. 结果分析

对比人***瘤病毒16、18、31、52、59型核酸分型检测试剂盒(荧光PCR法)和人***瘤病毒基因分型（25型）检测试剂盒（PCR-反向点杂交法）检测20例临床样本结果，检测结果显示两种试剂盒对HPV16、18、31、52、59型的分型结果相同，采用本发明试剂盒具有操作步骤少、检测时间短的优点。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海星耀医学科技发展有限公司

<120> 一种高危人***瘤病毒分型检测方法与试剂盒

<160> 25

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.1

<222> (1)..(29)

<400> 1

caactatttg ttactgttgt tgatactac 29

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.2

<222> (1)..(29)

<400> 2

caattatttg ttactgtggt agataccac 29

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.3

<222> (1)..(29)

<400> 3

cagttgtttg tcacagttgt ggataccac 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.4

<222> (1)..(29)

<400> 4

caattgtttt taacagttgt agatcctac 29

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.5

<222> (1)..(28)

<400> 5

gaaatataaa ctgcaaatca aattcctc 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.6

<222> (1)..(28)

<400> 6

gaaaaataaa ttgtaaatca aattcctc 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.7

<222> (1)..(28)

<400> 7

gaaatataaa ttgtaaatca aattcctc 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.8

<222> (1)..(28)

<400> 8

gaaaaataaa ctgcaaatca tattcctc 28

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.9

<222> (1)..(28)

<400> 9

gaaaaataaa ctgtaaatca tattcctc 28

<210> 10

<211> 277

<212> DNA

<213> Human papillomavirus type 16

<220>

<221> SEQ ID No.10

<222> (1)..(277)

<400> 10

ctgatgccca aatattcaat aaaccttatt ggttacaacg agcacagggc cacaataatg 60

gcatttgttg gggtaaccaa ctatttgtta ctgttgttga tactacacgc agtacaaata 120

tgtcattatg tgctgccata tctacttcag aaactacata taaaaatact aactttaagg 180

agtacctacg acatggggag gaatatgatt tacagtttat ttttcaactg tgcaaaataa 240

ccttaactgc agacgttatg acatacatac attctat 277

<210> 11

<211> 281

<212> DNA

<213> Human papillomavirus type 18

<220>

<221> SEQ ID No.11

<222> (1)..(281)

<400> 11

gctctattgt tacctctgac tcccagttgt ttaataaacc atattggtta cataaggcac 60

agggtcataa caatggtgtt tgctggcata atcaattatt tgttactgtg gtagatacca 120

ctcccagtac caatttaaca atatgtgctt ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg 180

atgctaccaa atttaagcag tatagcagac atgttgagga atatgatttg cagtttattt 240

ttcagttgtg tactattact ttaactgcag atgttatgtc c 281

<210> 12

<211> 259

<212> DNA

<213> Human papillomavirus type 31

<220>

<221> SEQ ID No.12

<222> (1)..(259)

<400> 12

caaattttta ataaaccata ttggatgcaa cgtgctcagg gacacaataa tggtatttgt 60

tggggcaatc agttatttgt tactgtggta gataccacac gtagtaccaa tatgtctgtt 120

tgtgctgcaa ttgcaaacag tgatactaca tttaaaagta gtaattttaa agagtattta 180

agacatggtg aggaatttga tttacaattt atatttcagt tatgcaaaat aacattatct 240

gcagacataa tgacatata 259

<210> 13

<211> 262

<212> DNA

<213> Human papillomavirus type 52

<220>

<221> SEQ ID No.13

<222> (1)..(262)

<400> 13

aaaccgtact ggttacaacg tgcgcagggc cacaataatg gcatatgttg gggcaatcag 60

ttgtttgtca cagttgtgga taccactcgt agcactaaca tgactttatg tgctgaggtt 120

aaaaaggaaa gcacatataa aaatgaaaat tttaaggaat accttcgtca tggcgaggaa 180

tttgatttac aatttatttt tcaattgtgc aaaattacat taacagctga tgttatgaca 240

tacattcata agatggatgc ca 262

<210> 14

<211> 308

<212> DNA

<213> Human papillomavirus type 59

<220>

<221> SEQ ID No.14

<222> (1)..(308)

<400> 14

atttaataaa ccatattggc tgcacaaggc tcagggttta aacaatggta tatgttggca 60

caatcaattg tttttaacag ttgtagatcc tactcgcagc accaatcttt ctgtgtgtgc 120

ttctactact tcttctattc ctaatgtaca cacacctacc agttttaaag aatatgccag 180

acatgtggag gaatttgatt tgcagtttat atttcaactg tgtaaaataa cattaactac 240

agaggtaatg tcatacattc ataatatgaa taccactatt ttggaggatt ggaattttgg 300

tgttacac 308

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.15

<222> (2)..(34)

<223> b=FAM,d=BHQ2

<400> 15

btgctgccat atctacttca gaaactacat ataad 35

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.16

<222> (2)..(29)

<223> b=FAM,d=BHQ2

<400> 16

btgcttctac acagtctcct gtacctgggd 30

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.17

<222> (2)..(34)

<223> b=FAM,d=BHQ2

<400> 17

btgctgcaat tgcaaacagt gatactacat ttaad 35

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.18

<222> (2)..(31)

<223> b=FAM,d=BHQ2

<400> 18

btgctgaggt taaaaaggaa agcacatata ad 32

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.19

<222> (2)..(33)

<223> b=FAM,d=BHQ2

<400> 19

btgcttctac tacttcttct attcctaatg tacd 34

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.20

<222> (1)..(33)

<223> d=PHO

<400> 20

ttatatgtag tatcactgtt agctatcgca gcad 34

<210> 21

<211> 34

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.21

<222> (1)..(33)

<223> d=BHQ2

<400> 21

ttatatgtag tttcagatgt aaatatgcga gcad 34

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.22

<222> (1)..(32)

<223> d=BHQ2

<400> 22

gtatatattt ggtacaggag actctgtaga ggd 33

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.23

<222> (1)..(21)

<400> 23

ctaagcagaa ctcttcccca t 21

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.24

<222> (1)..(19)

<400> 24

ctcagccagt cctccacat 19

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> artifical

<220>

<221> SEQ ID No.25

<222> (2)..(25)

<223> b=Cy5,d=BHQ2

<400> 25

btctgcctat ggcttgacca ggcagd 26

Claims

1.一种高危人***瘤病毒基因分型检测方法与试剂盒，其特征在于，采用人***瘤病毒通用引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8以及SEQ ID No.9，和人***瘤病毒16、18、31、52、59型特异性TaqMan探针SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18和SEQ IDNo.19，以及在上述TaqMan探针互补序列基础上设计且与探针序列不完全配对的PCO探针SEQ ID No.20、SEQ ID No.21和SEQ ID No.22，要求TaqMan探针和PCO探针标记相同荧光发光基团、TaqMan探针3’端标记荧光淬灭基团、PCO探针3’端进行封闭标记，通过荧光PCR扩增技术结合单波长熔解曲线分析技术在单管反应中实现人***瘤病毒16、18、31、52、59型核酸分型检测。

2.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，所用人***瘤病毒16、18、31、52、59型检测靶序列为SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14，设计的通用引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.9能扩增SEQ ID No. 10～SEQ ID No.14靶序列连续130～180个核苷酸，根据序列优化设计后的引物能扩增其连续90-98个核苷酸。

3.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，分别基于SEQ ID No.10～SEQIDNo.14靶序列设计的型特异性TaqMan探针SEQ ID No.15～SEQ ID No.19，长度为24～35个核苷酸， 5’端均标记相同的荧光发光基团、3’端标记荧光淬灭基团。

4.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，根据SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18和SEQ ID No.19探针的互补序列，设计3～6个碱基的错配或者不互补，优化设计出PCO探针SEQ ID No.20、SEQ ID No.21和SEQ ID No.22，3’端标记PHO或BHQ。

5.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，试剂盒所用的人***瘤病毒分型通用引物序列可以为和SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8以及SEQ ID No.9同源性大于85％以上的序列，TaqMan荧光探针可以为SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18和SEQ ID No.19同源性大于85％以上序列，探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ2淬灭基团。

6.如权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，引入了一个内参照***用于避免检测结果假阴性，内参照***包括内参引物SEQ ID No.23和SEQ ID No.24、内参探针SEQ IDNo.25，其中探针SEQ ID No.25 5’端标记CY5荧光基团、3’端标记BHQ2淬灭基团，内参探针也可以是和SEQ ID No.25序列同源性大于85％以上的序列。

7.如权利要求1所述方法与试剂盒，其特征在于，试剂盒包括PCR缓冲液、引物探针、DNA聚合酶、阴性对照、阳性对照以及临界阳性对照。

8.如权利要求1所述方法与试剂盒，其特征在于，按照以下浓度配制成的反应体系进行扩增反应：pH 8.3的Tris-HCl 10mM，KCl 50mM，BSA 90mg/L，dATP、dGTP、dCTP、dUTP各1.5mM，MgCl₂ 5.5mM，SEQ ID No.1～SEQ ID No.9引物各0.104μM， SEQ ID No.15 0.075μM，SEQ ID No.16 0.093μM，SEQ ID No.17 0.056μM，SEQ ID No.18 0.065μM，SEQ ID No.190.056μM ，SEQ ID No.20 0.37μM，SEQ ID No.21 0.463μM，SEQ ID No.22 0.925μM，SEQ IDNo.23 0.04μM，SEQ ID No.24 0.06μM ，SEQ ID No.25 0.03μM， Taq DNA聚合酶1.2U，UNG酶0.05U。

9.如权利要求1所述试剂盒在人宫颈脱落样本中快速分型鉴定HPV16、18、31、52、59型核酸中应用，包括以下步骤：(1)样本处理提取模板DNA，样本为包含人宫颈脱落的细胞保存液；(2)模板DNA扩增检测，以荧光PCR仪上两个检测通道扩增模板的荧光信号强弱和循环阈值来判断样品中HPV16、18、31、52、59型核酸的存在，通过单波长熔解曲线分析进行分型检测，从而检测样品中HPV16、18、31、52、59型各个型别的存在，所用荧光定量PCR反应程序为：

【1】50℃ 2 min

【2】95℃ 3 min

【3】95℃ 6 s

【4】66℃ 45 s

【5】Go to [3] ，9 cycles

【6】95℃ 3 s

【7】60℃ 33 s

【8】63℃ 15 s

【9】Go to [6] ，42 cycles

在第七步采集FAM和CY5通道荧光信号

【10】95℃ 15 s

【11】25℃ 1 min

【12】25℃——75℃熔解曲线分析

【13】75℃ 15 s

【14】End。