CN101984050A - 用于产生诱导多能干细胞(iPS)的细胞类型及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了四种具有广泛异体移植应用前景并能有效被诱导成诱导多能干细胞(iPS)的细胞类型，其中三种细胞类型为均为胎盘组织来源的细胞，分别是羊膜间充质细胞、绒毛膜间充质细胞和脐带间充质细胞；另外一种是羊水细胞。此外，还公开了高效诱导产生诱导多能干细胞(iPS)的细胞类型的诱导重编程方法，包括如下步骤：将包含多能性干细胞因子的cDNA分别导入上述四种原代培养的细胞；在适宜培养基上分别进行被cDNA导入的四种原代细胞的培养，在获得初步的iPS后在适宜的培养基上优化iPS的质量，还可初步鉴定多能性干细胞克隆。本发明中，三种胎盘来源的间充质细胞及羊水细胞均可诱导形成iPS，其中绒毛膜间充质细胞与成纤维细胞相比，诱导重编程的效率提高超过100倍，效率约为2.3％左右，略高于角质细胞；为建立疾病模型，进行药物筛选，控制定向分化提供了更加有效且更加具有针对性的手段。

Description

用于产生诱导多能干细胞(iPS)的细胞类型及其制备方法和应用 

技术领域

本发明涉及细胞领域，特别涉及四种可诱导产生诱导多能干细胞(iPS)并具有异体移植前景的细胞类型及其制备方法和应用。 

背景技术

干细胞(stem cells)是人体及其各种组织细胞的初始来源，其最显著的生物学特征是既有自我更新和不断增殖的能力，又有多向分化的潜能。干细胞根据不同的来源分为成体干细胞(somaticstem cells)和胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)。成体干细胞包括骨髓间充质干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞等，在成体组织中存在的。 

1981年，ES细胞的分离和培养首先在小鼠中获得成功，是至今研究最广泛、最成熟的干细胞体系。而人的干细胞的代始于1998年，美国威斯康辛大学(University of Wisconsin)科学家汤姆森(James A.Thomson)带领研究团队首次从人类胚胎组织中提取培养出胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ES Cell)株，并且证实此株细胞具有全能干细胞特征，此项研究论文发表在1998年11月6日出版的顶级学术期刊Science上面。(详见：Thomson，J.A.，J.Itskovitz-Eldor，S.S.Shapiro，M.A.Waknitz，J.J.Swiergiel，V.S.Marshall，and J.M.Jones.″Embryonicstem cell lines derived from human blastocysts.″Science 282(1998)：1145-1147。Thomson等人，从人胚泡中获取胚胎干细胞系，科学，282(1998)：1145-1147。)这篇论文标志着一个时代的到来，而汤姆森也被人称作″干细胞研究之父″。 

hES(人胚胎干细胞)细胞研究的应用前景主要是再生医学领域，在组织工程学领域中以hES细胞作为种子细胞，可为临床上细胞、组织或器官的移植治疗提供大量的材料。通过控制hES细胞分化培养环境、转染能够促进ES细胞定向分化的关键分子基因等体外诱导分化策略，可获得特异性的组织细胞类型。这类 细胞用于移植治疗，将给糖尿病、帕金森氏病、脊髓损伤、白血病、心肌损伤、肾衰竭、肝硬化等疾病的治疗带来新的希望。 

然而，一直以来，hES细胞研究面临着许多难题和争议，主要包括以下几个方面：(1)供体***的来源困难，hES细胞建系效率低。此外，SCNT技术的不成熟必将需要进一步耗费更多的人类***，故而其来源难以得到保证。(2)免疫排斥反应，除非采用SCNT技术，否则患者对hES细胞分化而来的各种细胞和组织仍然存在免疫排斥反应。(3)hES细胞具有成瘤性，移植到受体的体内后有发展为肿瘤的可能性，即使采用SCNT技术、给移植细胞设置***基因等应对措施，也不一定能够很好地解决这个问题(4)体外保持hES风险。同样，慢病毒转染技术可能也存在类似的风险。 

为避开hES细胞和治疗性克隆研究的伦理学争论，需要找到一种替代途径，以便将人类的体细胞直接转化为多潜能干细胞，为患者提供“个性化”的自体干细胞。2003年，Gurdon研究小组发现，将已完全分化的小鼠胸腺细胞或成人外周血淋巴细胞的细胞核注入爪蟾***后，哺乳动物细胞核的分化标志物丧失，而哺乳动物干细胞中最具特征性的标志物Oct4则呈高表达，提示哺乳动物细胞核可直接被两栖动物***核泡所重构从而表达Oct4(Byrne JA等人，Nucleiof adult mammalian somatic cells are directly reprogrammed to oct-4 stem cell geneexpression by amphibian oocytes.Curr Biol 2003；13：1206-1213)。Byrne JA等人，成年哺乳动物体细胞核可直接被两栖动物***核泡所重构从而表达Oct4.当代生物学，2003；13：1206-1213)。 

2006年，日本京都大学Yamanaka研究小组采用体外基因转染技术，从24个因子中筛选出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4个转录因子，通过逆转录病毒将上述4个转录因子导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞，在小鼠ES细胞的培养条件下获得了Fbx15+的多潜能干细胞系，该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠ES细胞， 故将其命名为诱导的多能性干细胞(iPS细胞)。 

Yamanaka研究小组利用相同的技术，将上述同样的4个转录因子导入到人皮肤成纤维细胞中，也成功获得了iPS细胞。原代人类成纤维细胞样滑膜细胞和源自新生儿成纤维细胞的细胞系同样也可被重构成为iPS细胞。这类iPS细胞在细胞形态、增殖能力、表面抗原标志、基因表达谱、多潜能干细胞特异性基因的表观遗传学状态、端粒酶活性等方面与hES细胞相似，并且在体外培养时和在小鼠体内畸胎瘤形成中均可分化为3个胚层的不同细胞类型(Takahashi K et al，Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell 2007；131：861-872。Takahashi K等人，利用特定因子诱导成人成纤维细胞到多能干细胞，细胞，2007；131：861-872)。与此同时，威斯康辛大学Thomson研究小组也报道了成功诱导胎儿成纤维细胞转化为具有hES细胞基本特征的人类iPS细胞，所不同的是他们使用慢病毒作为载体，并在14个候选基因中选择了Oct4、Sox2、Nanog、Lin28等4个基因进行转导(Yu J et al，Induced pluripotentstem cell lines derived from human somatic cells.Science 2007；318：1917-1920。俞君英等人，从人的体细胞诱导成为多能干细胞系，科学，2007；318：1917-1920)。这一被学界称为生物科学“里程碑”的重大突破有望帮助科学家绕过克隆技术的伦理、道德纷争，为医学应用打开大门。 

Park IH等人(Reprogramming of human somatic cells to pluripotency withdefined factors.Nature 2008；451：141-146。利用特定因子将人的体细胞重编程为多潜能细胞，自然，2008；451：141-146)利用来自胎儿、新生儿及成人的皮肤或肺部的原代成纤维细胞，其中包括来自1名健康男性皮肤活检得到的成纤维细胞，采用Yamanaka研究小组的策略也获得了相同的结果。他们还发现Oct4和Sox2在诱导重构为iPS细胞过程中是必需的，正是这两个转录因子维持了人类iPS细胞的多潜能性，而Klf4和c-Myc的作用是改变染色质的结构，从而有利于Oct4和Sox2的结合，以提高诱导的效率。此外，这项研究的重要意义在于将取自皮肤活检的成纤维细胞诱导为iPS细胞。上述研究表明，从活检人类皮肤组 织中提取体细胞后进行诱导以制备患者特异性的干细胞是可行的，因而有望克服细胞移植治疗中存在的免疫排斥反应。2008年10月，Juan Carlos IzpisúaBelmonte领导的小组(Juan Carlos Izpisúa Belmonte et al.Efficient and rapidgeneration of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.NatureBiotechnology.2008.26：1276-1284；胡安·卡洛斯·伊兹皮索阿·贝尔蒙特等人，人的角质细胞可被高效快速地诱导为多能干细胞，自然-生物技术，2008.26：1276-1284)利用一根头发上的角质细胞成功高效诱导出iPS细胞，大大推动了iPS的医学应用进程。 

鉴于导入c-Myc基因可使嵌合体小鼠的肿瘤发生率高达20％，可能会阻碍其未来的临床应用。因此，Yamanaka研究小组新近报道，小鼠和人类皮肤成纤维细胞转染c-Myc以外的其余3个基因，在调整培养条件后也可得到iPS细胞。去除c-Myc基因尽管可使未来临床应用的安全性显著提高，但形成iPS细胞的效率却明显降低。虽然嵌合体小鼠在100天内没有肿瘤发生，但逆转录病毒的再激活仍有导致肿瘤发生的潜在风险。同样，慢病毒转染技术可能也存在类似的风险。 

针对这一风险，科学家一直在努力寻找一种可以表达外源基因但外源基因非整合到基因组上的方法。2009年3月5日，Cell报道Rudolf Jaenisch研究小组利用Cre-重组酶***使诱导成功的帕金森病人iPS细胞无外源因子，使iPS的临床应用又推进了一步，但是这种方法的缺点是仍有载体存留在基因组中(Rudolf Jaenisch等人，帕金森病人来源的诱导多能干细胞无外源因子.细胞.2009.136：964-977)。随后这一缺陷被另一组科学家克服。2009年3月26日，Science即出现俞君英等通过一种非整合质粒Episomal Vector成功诱导出无外源基因也无载体整合到基因组上的iPS(俞君英等人，无载体也无外源基因序列的人的诱导多能干细胞.科学.2009.324：797-801)。他们用一种叫做核转染的方法将这些质粒介入到人***细胞中，在质粒中的基因所表达的蛋白质会将细胞重新编程并使其成为iPS细胞。这些iPS细胞在接着的几轮细胞***中会开始失去这些质粒，这样研究人员就可以分离出不含质粒的细胞。这一发现非常重要， 它是人们向iPS细胞的临床应用迈出了关键性的一步。这一方法虽然临床应用的安全性大大提高，但是重编程过程中培养条件有待优化。不同的细胞类型在重编程效率不同，相同的细胞类型在不同的培养条件下重编程效率也不同。重编程效率太低，在以后的研究中有待克服。 

尽管已经证明了病毒转导一系列外源因子可以使得人的成纤维细胞的后生和转录状态重置成多能胚胎干细胞(ES细胞)的状态(Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by definedfactors.Cell.2007；131：861-872。Yu Junying，James A.Thomson et al，Science.2007；318：1917-1920；)，并且随着科学的发展，无外源因子整合到基因组和既无载体也无外源因子整合的基因组的人iPS技术出现(Rudolf Jaenisch等人，帕金森病人来源的诱导多能干细胞无外源因子，《细胞》，2009.136：964-977)，但是由人成纤维细胞得到的iPS细胞效率极低，整合型外源因子得到的iPS细胞的效率约0.01-0.02％；非整合型如俞君英最新的报道无外源因子也无载体序列***基因组得到的iPS的效率更低，约百万分之三到六。于是人们开始寻找具有更高重编程能力的细胞类型，2008年10月，Juan Carlos Izpisúa Belmonte领导的小组利用一根头发上的角质细胞成功高效诱导出iPS细胞，报道称其效率较成纤维细胞提高约100倍。 

发明内容

本发明的第一个目的在于提供具有异体移植前景的细胞类型，本发明提供的该细胞类型共有四种，为羊水细胞和三种胎盘来源的间充质细胞——羊膜间充质细胞，绒毛膜间充质细胞及脐带间充质细胞。 

本发明的第二个目的在于提供既具有异体移植前景的，又能相对高效产生诱导多能干细胞(iPS)的细胞类型，该细胞类型为胎盘来源的绒毛膜间充质细胞。同时，提供其诱导重编程方法，包括如下步骤： 

(a)将包含多能性干细胞因子的cDNA分别导入胎盘来源的三种间充质细胞； 

(b)在适宜步骤(a)中所述的胎盘来源细胞生长的培养基上进行培养。 

上述诱导重编程方法，还可以包括如下步骤：(c)初步鉴定多能性干细胞克隆。 

优选的，上述步骤(a)中的cDNA通过病毒载体感染所述胎盘来源的三种间充质细胞。 

优选的，所述病毒载体为逆转录病毒载体。 

更优选的，所述逆转录病毒载体为pMX。 

优选的，上述步骤(a)中的多能性干细胞因子包括Sox2、Oct4和Klf4。 

更优选的，上述步骤(a)中的多能性干细胞因子为Sox2、Oct4、C-myc和Klf4。 

优选的，所述羊水细胞和胎盘来源的三种间充质细胞(羊膜间充质细胞、绒毛膜间充质细胞及脐带间充质细胞)为人的羊水细胞和人的胎盘来源的细胞。 

上述过程中应用的培养基有两种情况：一种是以含有特级胎牛血清(Defined Fetal Boyine Serum，D-FBS)的人胚胎干细胞培养基为基础，加入抗氧化剂(Antioxidant，A)，也可以再加上丙戊酸(valproic acid，VPA)，适用于绒毛膜间充质细胞；另一种是以血清替代品(Knockout SerumReplacement，KSR)为基础，加入碱性成纤维细胞生长因子(basic FibroblastGrowth Factor，bFGF)，也可以再加上丙戊酸。该情况适用于所有的三种细胞类型。 

其中，优选的，所述抗氧化剂包括维生素B1、维生素C、还原型谷胱甘肽或***钠，或者前三者，或者仅含维生素C。 

本发明的第三个目的在于，提供四种具有异体移植前景并可产生诱导多能干细胞(iPS)的细胞类型在经诱导重编程获得多能性干细胞后的用途。 

上述多能性因子可以是任何来源的，优选为人的多能性因子以及其变体，如Sox2，NCBI登录号为NM_003106.2(SEQ ID NO：1)；Oct4，NCBI登录号为NM_002701.4(SEQ ID NO：2)；Klf4，NCBI登录号为NM_004235.4(SEQ ID NO： 3)；c-Myc，NCBI登录号为NM_002467.3(SEQ ID NO：4)。 

与现有技术公开的其它可以被诱导为iPS的细胞不同，胎盘组织来源的细胞不仅可以诱导形成iPS，而且绒毛膜间充质细胞诱导重编程的效率大于成纤维细胞，该细胞类型在转录人的四个外源因子Sox2，Oct4，Klf4，c-Myc后，在DFBS+A+VPA培养基上后可以高效诱导为iPS细胞，效率约为2.3％左右，与成纤维细胞相比效率提高超过100倍，略高于角质细胞；而且产生的这些诱导多能性干细胞多能性标记物的表达水平与人胚胎干细胞相近，同时外源因子沉默。这对于今后通过使用诱导的多能性细胞，而非直接从人体提取的胚胎干细胞，利用组织再生医学建立疾病模型，进行药物筛选，控制定向分化提供了更加有效且更加具有针对性的手段。本发明发现略高于已报道的角质细胞。 

本申请的发明点在于用于诱导iPS的细胞——羊水细胞、绒毛膜间充质细胞、羊膜间充质细胞和脐带间充质细胞。所述的四种细胞，其中三种来自人的胎盘组织，另外一种细胞是来源羊水的羊水细胞。胎盘组织和羊水都容易得到，易于处理，不需要侵入性操作，对其研究不会涉及伦理道德问题，因此目前已成为寻找人类干细胞来源的研究热点。 

胎盘(placenta)是后兽类和真兽类哺乳动物妊娠期间由胚胎的胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间交换物质的过渡性器官。胎儿在子宫中发育，依靠胎盘从母体取得营养，而双方保持相当的独立性。胎盘还产生多种维持妊娠的激素，是一个重要的内分泌器官。人类胎盘是胎儿与母体之间进行物质交换的器官。由羊膜、叶状绒毛膜(也称丛密绒毛膜)和底蜕膜构成。 

1.羊膜构成胎盘的胎儿部分，是胎盘的最内层。羊膜光滑医学教育网，无血管、神经及淋巴，具有一定的弹性。 

2.叶状绒毛膜构成胎盘的胎儿部分，是胎盘的主要部分。胚胎发育至13～21日时，胎盘的主要结构-绒毛逐渐形成。约在受精后第3周，当绒毛内血管形成时，建立起胎儿胎盘循环。 

多数绒毛呈游离状态，浸浴在血池的母血之中，少数绒毛与底蜕膜融合起 固定作用。绒毛由中轴的间质和被覆的滋养层形成，在绒毛间质中含有丰富的毛细血管，它们与脐动脉及脐静肪相连，是属于胎儿血循环***。由于母血与儿血之间间隔着毛细血管壁、绒毛间质以及绒毛表面的滋养层细胞，因此正常情况下母血与儿血不能直接相通。当胎儿与母体血液进行物质交换时，这些物质也必须透过这几层结构。正常足月妊娠时胎盘重约500克，呈扁圆形，一面光滑，附有脐带与胎儿相连，另一面粗糙，和母体的子宫内膜相连。胎盘是维持胎儿生长发育的重要器官，有很重要的生理功能。通过胎盘绒毛间隙内母子血液间的物质交换，供应胎儿所需要的营养物质如氧、葡萄糖、氨基酸、脂肪酸、维生素、无机盐及水分等，运走胎儿不需要的代谢废物如二氧化碳、尿酸及肌酐等。胎盘也是重要的内分泌器官，可分泌多种激素，主要有绒毛膜***、胎盘促生长激素、***和孕激素等。 

培养的胎盘来源的三种间充质细胞的形态学特征和骨髓基质细胞相近，均呈梭形锥形及多角形，为典型的成纤维细胞样，并呈漩涡状生长。胎盘来源的间充质细胞与骨髓基质细胞类似，均表达CD9、CD29、CD44、CD105、CD106、人类白细胞抗原ABC(human leucocyte antigen ABC，HLA-ABC)，不表达CD34、CD40L和HLA-DR；但与骨髓基质细胞相比，胎盘来源的间充质细胞还阶段特异表达的胚胎抗原1(stage-specific embryonic antigen 1，SSEA-1)、SSEA-3、SSEA-4、肿瘤排斥抗原(tumor rejection autigen，TRA)-1-60、TRA-1-81表达更高。 

近年来，产前诊断的技术发展迅速，取材来源更趋于多样化，研究发现在孕中期运用羊水细胞学检查进行产前诊断是比较具有临床价值的。从羊水细胞染色体核型可以判断染色体是否异常，从而了解孕中期异常核型出现的频率，类型及与各种产前诊断指征之间的关系。事实上，研究证实羊水细胞具有了很大的治疗性应用前景。2003年，奥地利学者首先从羊水中分离出干细胞)，这些细胞除了表达人干细胞标记分子之一Oct4以外，还表达干细胞相关标记vimentin和alkaline phosphatase。2004年，研究人员报道羊水细胞还表达神经 干细胞的表面标记和端粒酶及Oct-4、等多能干细胞的表面标记。随后，羊水干细胞被发现也表达间充质干细胞相同的表面标记。2007年，美国研究人员从人和鼠的羊水中分离出多能干细胞(这些干细胞可以分化为多种类型的细胞)。羊水中分离出有胚胎干细胞和成体干细胞表达标志物的羊水干细胞(AmnioticFluid-derived Stem-cell，AFS)，发现羊水干细胞具有良好的多能性。通过逆转录病毒标记的克隆人体细胞系可以被诱导分化成胚胎各胚层的细胞类型，包括脂肪细胞、骨细胞、肌细胞、内皮细胞、神经元细胞和肝细胞系。人羊水干细胞来源的分化细胞表现出特定的功能，包括神经元细胞系可分泌神经递质，肝细胞系产生尿素，骨细胞系可形成组织工程骨骼。这项研究表明羊水干细胞界于胚胎干细胞和成体干细胞之间，同时也证实了羊水干细胞具有很大的治疗潜力，是干细胞研究的一大突破。另外，羊水细胞通过羊水穿刺获取的简易途径，以及羊水干细胞表现出相对低的免疫原性，使其被认为是获取干细胞提供了第三种路径，也被认为其将更有利于进行同种异体之间的移植，具有很大的治疗性应用前景。一些使用羊水干细胞开展的人体组织试验性研究也正在进行中。日前，瑞士学者在美国心脏学会(AHA)科学年会上报告，他们从羊水中提取干细胞，并用其成功培育出人类心脏瓣膜。由于该瓣膜来源于胎儿的自体细胞，因此移植后不会产生排斥反应，而且瓣膜还可以和机体同步生长，基本上与自体瓣膜无异。这项研究结果提示，将来或许可以在先天性瓣膜疾病胎儿出生前就利用其干细胞预制出心脏瓣膜，在其出生时直接进行瓣膜移植以彻底治愈疾病。不过，这种组织工程心脏瓣膜尚处于研究起步阶段，离真正的临床应用尚有差距。由于人们仍不能确定羊水干细胞到底能培育出多少种类型的细胞，而且研究还在初步阶段，广泛开展临床试验可能还需要数年时间。 

附图说明

图1是显微镜下观察三种胎盘组织来源的间充质细胞(A：AMCs，B：CMCs，C：UBCs)、羊水细胞(D：Amniocytes)及其诱导得到的hES样克隆形态图；放大倍数100倍。 

图2是三种胎盘组织来源的iPS细胞AP染色结果及其中绒毛膜间充质细胞在两种不同培养基中(DFBS+A，0.4％；DFBS+A+VPA，2.3％)诱导iPS细胞效率计算； 

图3是三种胎盘组织来源iPS hES标志物表达水平鉴定及外源因子表达水平检测结果图。 

具体实施方式

1.定义和技术 

除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。参见分子克隆实验指南，第3版(2002)，Sambrook，Fritsch和Maniatis编著；现代分子生物学实验方法(F.M.Ausubel等人编著(1987))；酶学方法(Academic Press，Inc.)；PCR2：实用方法，M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编著，(1995)；抗体，Harlow和Lane编著，(1988)；动物细胞培养实验室手册，R.I.Freshney编著，(1987)；干细胞手册，卷2，W.FrenchAnderson等人编著。 

本文中使用的一些术语具有下列定义的含义。 

在说明书和权利要求书中使用的，单数型“一个”，和“这个”包括复数参考，除非上下文另有清楚的表述。例如，术语“(一个)细胞”包括复数的细胞，包括其混合物。 

所有的数字标识，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，其以0.1的增量变动(+)或(-)。要了解，虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语“约”。也要了解，虽然不总是明确的叙述，本文中描述的试剂仅仅是示例，其等价物是本领域已知的。 

本文所述的“诱导的多能性干细胞(iPS细胞)”是这样的细胞，其在ES细胞培养条件下，与ES细胞在细胞形态、生长特性、表面标志物表达、移植到皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与人ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态等方面也与人ES细胞几乎完 全相似。 

本文所述的胎盘组织来源的三种间充质细胞来源于人，通过产妇分娩后废弃物中分离得到。而羊水细胞则是通过对怀孕18-22周的孕妇进行羊水穿刺获取。 

本文所述的术语“诱导重编程”是指将体细胞去分化为多能性干细胞的过程。优选地，通过将维持干细胞多能性所需的多能性因子cDNA导入体细胞可以诱导体细胞去分化成为多能性干细胞(Takahashi K和Yamanaka S等人，利用特定因子诱导成人成纤维细胞到多能干细胞.细胞2007；131：861-872；俞君英等人，从人的体细胞诱导成为多能干细胞系.科学.2007；318：1917-1920)。其中，优选地，所述的多能性因子包括Oct4、Sox2、C-myc，以及Klf4。具体地，所述多能性因子为Sox2，NCBI登录号为NM_003106.2；Oct4，NCBI登录号为NM_002701.4；Klf4，NCBI登录号为NM_004235.4；c-Myc，NCBI登录号为NM_002467.3。 

将所述多能性因子cDNA导入体细胞的方法可以是本领域技术人员熟知的多种技术，包括病毒感染、脂质体转染、电穿孔、粒子轰击等各种将DNA转入细胞的方法。优选地，使用包含cDNA的病毒载体进行转染，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体等多种病毒载体。优选地逆转录病毒载体(例如pMX载体)，如实施例中所述的。 

本文所述的“适宜被导入多能性干细胞因子cDNA的胎盘来源的三种细胞和羊水细胞的生长条件”是本领域的常规干细胞培养条件，并且包括一些适宜各个具体细胞系，但是不影响细胞基本性质的修饰，培养方法以及培养条件参见W.French Anderson等人，干细胞手册，卷2。 

本文所述的抗氧化剂及工作浓度优选为：维生素C 50ug/ml；还原型谷胱甘肽10uM；***钠：20nM。 

本发明用人胎盘组织来源的三种间充质细胞和羊水细胞生成诱导的多能性干细胞的方案优选实施例的过程如下，图1为胎盘来源的三种细胞及其诱导得 到的hES样克隆形态；图2为为胎盘来源的三种细胞诱导获得的iPS细胞AP染色结果及诱导iPS细胞效率计算；图3为通过Real-Time的方法检测胎盘来源的iPS hES标志物表达水平鉴定及外源因子表达水平。 

2.实施例 

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。 

下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例，根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。 

实施例1. 

细胞的制备和培养 

对于羊水细胞，通过对进行产检的孕妇进行羊水穿刺获取一定量的羊水。将其离心后获得沉淀物重悬于羊水培养基进行培养3-4天后，换新鲜羊水培养基继续培养。 

对于胎盘来源的三种细胞，在无菌条件下取正常足月剖腹产废弃物中分离得到的胎盘组织和脐带，1×PBS洗涤若干次，用镊子将羊膜和绒毛膜剥离开并分开放置于PBS中，然后用外科手术剪将羊膜和绒毛膜分别剪成约1mm³的小组织块。(1)为了得到羊膜间充质细胞，在羊膜碎片中加入胰酶37℃消化30-45分钟，共3次，然后加入终浓度1.2U/ml Dispase，37℃消化60分钟，在体视镜下用镊子将羊膜上皮层和羊膜间充质层分开。取羊膜间充质层，加入终浓度为2mg/ml的I型胶原酶，37℃消化30-45分钟，收集细胞平铺于60mm或100mm培养皿中[用0.1％的明胶(Gelatin)预包被处理]，用含10％胎牛血清(FBS，HyClone公司)、成纤维生长因子(8ng/ml)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的高葡萄糖DMEM(Dulbcco′s Modifed Eagle Medium)混合F12 培养基(HyClone公司)进行培养和纯化，所得到的细胞即羊膜间充质细胞。(2)为了得到绒毛膜间充质细胞，在绒毛膜碎片中加入终浓度为2.4U/ml的Dispase，37℃消化10-15分钟，然后加入终浓度为2mg/ml的I型胶原酶，37℃消化30分钟，再加入胰酶，37℃消化15分钟，通过40微米的细胞滤膜收集细胞，用上述培养羊膜间充质细胞的培养基进行培养和纯化，所获得的细胞即绒毛膜间充质细胞。(3)为了得到脐带间充质细胞，先将2厘米长的脐带在干的培养皿里剪成尽可能小的碎末，加入终浓度为2mg/ml的I型胶原酶，37℃消化4小时，再加入终浓度为1mg/ml的I型DNA聚合酶，37℃消化10-20分钟，再加入胰酶，37℃消化10-15分钟，通过40微米的细胞滤膜收集细胞，用上述培养基进行培养和纯化，所获得的细胞即脐带间充质细胞。 

在多能干细胞诱导过程中使用DFBS培养基、DFBS+A培养基、或者DFBS+A+VPA培养基。所述的DFBS+A培养基包含高葡萄糖DMEM培养基(4.5g/L的葡萄糖，HyClone公司)，20％特级胎牛血清(FBS Defined，Gibco)，4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Invitrogen)、青霉素/链霉素、1％L-谷氨酰胺(Gibco)、0.1mM β-巯基乙醇(Sigma)和1％非必需氨基酸(Gibco)；所述的DFBS+A培养基为在DFBS基础上添加如下组分，50ug/ml维生素C，10uM还原型谷胱甘肽，20nM***钠。 

将人胚胎干细胞(hES)和用于扩增的诱导的多能干细胞(induced pluripotentstem cells，iPS细胞)培养在用丝裂霉素(10μg/ml)处理的MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)上，并且培养在KSR培养基中：DMEM F12(Gibco公司)，20％血清替代物(KSR，Gibco公司)，8ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Invitrogen)、青霉素/链霉素、1％L-谷氨酰胺(Gibco)、0.1mM β-巯基乙醇(Sigma)和1％非必需氨基酸(Gibco)。 

在纯化RNA或DNA之前，去除滋养层细胞，在Matrigel上传2代，此过程用mTeSR^TM1(StemCell公司)培养。 

实施例2. 

病毒载体感染胎盘组织来源的三种细胞和羊水细胞 

根据实施例1所述的方法，在p6孔培养板中分别按每孔约4×10⁴个细胞接种人的胎盘来源的三种细胞，对于羊水细胞则按每孔约8×10⁴个细胞接种，在37℃、5％CO₂的常规培养条件下培养过夜(如图1)，用收集的病毒上清液分别感染培养的胎盘来源的三种细胞和羊水细胞。所述病毒上清液是通过用包含人Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的cDNA的反转录病毒pMX载体(Addgene公司)按常规方法转染293T细胞(Lipofectamine 2000，Invitrogen公司)获得的(参见Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002))。 

实施例3. 

感染细胞的继续培养和克隆筛选 

在感染后第2天，将感染后的胎盘来源的三种细胞和羊水细胞的培养基，替换为实施例1中所述的DFBS培养基，在37℃、5％CO₂的常规培养条件下培养4天，每天更换一次培养基，用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)于37℃消化为单细胞悬液，将消化后的细胞按每培养皿约10000个细胞的密度接种到100mm培养皿中，所述培养皿按实施例1中描述的方法，预先用滋养层细胞包被。接种后的细胞在37℃、5％CO₂的常规培养条件下培养15-30天之间，显微镜检可见ES样克隆(如图2所示为绒毛膜间充质细胞在感染SKOM后28天在滋养层上形成典型的hES样克隆形态)。hES样克隆挑取至新的滋养层上传代扩增仍保持很好的hES样形态，如图1为传代3-4代后的形态，使用KSR培养基(AMCs，羊膜间充质细胞；CMCs，绒毛膜间充质细胞；UBCs，脐带间充质细胞；Amniocytes，羊水细胞)。 

使用玻璃针分割边缘光滑，细胞核清晰，人胚胎干细胞样的单个克隆(见图1)，然后用玻璃管吸取这些分割开的克隆接种到12孔板的单个孔中，每个孔接种一个ES样克隆，一共挑取12个。所述12孔板按实施例1中描述的方法，预先用滋养层细胞包被。接种后的细胞在KSR培养基中，37℃、5％CO₂的常规培养条件下培养。 

这些挑取出的克隆具有典型的hES致密形态，在12孔板培养一周后，每孔选择部分克隆进行AP染色，结果为100％AP染色阳性(图2，以绒毛膜间充质细胞为例，未显示所有细胞类型的克隆)。其中，A，B图是绒毛膜间充质细胞感染SKOM 28天后分别在DFBS+A和DFBS+A+VPA培养基形成hES样克隆(100mm培养皿)，AP染色阳性。A’，B’为光镜下的hES样克隆形态；A”，B”为A’，B’中所示同一克隆AP染色阳性图。计数100mm培养皿绒毛膜间充质细胞形成的AP阳性克隆数目在DFBS+A和DFBS+A+VPA培养基分别为50个和230个，根据第6天时向100mm培养皿共种下10000个SKOM感染的绒毛膜间充质细胞，计算诱导iPS细胞效率分别为50/10000＝0.5％和230/10000＝2.3％。因此，与传统用成纤维细胞KSR培养基培养的0.01～0.02％的效率相比超过100倍，与角质细胞得到的效率相近。C和D分别为羊膜间充质细胞和脐带间充质细胞感染SKOM 34天后的AP染色形态。在所述的各种细胞类型的iPS克隆候选中，我们各选择了2-4个克隆候选进行进一步分析鉴定。 

实施例4 

实时定量Real-Time PCR鉴定iPS中hES标志物的表达 

使用Trizol(Takara公司)试剂，按照制造商说明提取总RNA。用M-MLV(Takara公司)试剂盒进行逆转录，并使用 

Premix Ex Taq^TM试剂盒(Takara公司)，ABI 7300荧光定量PCR仪(ABI公司)进行Real-Time PCR。所有上述PCR条件均使用常规PCR条件，按照制造商说明进行。其中鉴定hES各标志物使用引物列表如表1所示，表1为鉴定hES标志物表达Real-Time PCR所用引物。 

表1 

SEQ ID NO：	引物名称  (前：因子名称)  F：正向；R反向	引物序列
			SEQ ID NO：30	hREX1-Fo	TCGCTGAGCTGAAACAAATG

SEQ ID NO：31

hREX1-Re

CCCTTCTTGAAGGTTTACAC

SEQ ID NO：32	hNANOG-Fo	TGAACCTCAGCTACAAACAG
			SEQ ID NO：33	hNANOG-Re	TGGTGGTAGGAAGAGTAAAG

如图3-A，B所示，以绒毛膜间充质细胞和羊膜间充质细胞为例，使用本申请的方法获得的iPS表达与胚胎干细胞H9均表达相同的多能性因子，包括内源性的Oct4与Sox2。 

实施例5 

实时定量Real-Time PCR检测iPS中外源因子的表达水平 

所有RNA提取及Real-Time PCR操作均同实施例4.检测外源因子表达水平的Real-Time引物如表2所示。其中pMXRTFn2(SEQ ID NO：38)为位于逆转录载体上的引物，hSox2exoRTR1(SEQ ID NO：35)，hKlf4exoRTR1(SEQ IDNO：36)，hOct4exoRTR1(SEQ ID NO：34)，hcMycexoRTR1(SEQ ID NO：37)分别为位于四个外源因子SKOM上的引物。 

表2 

SEQ ID NO：	引物名称(前：因子名  称)F：正向；R反向	引物序列
			SEQ ID NO：34	hOct4exoRTR1	CCAGGTCCGAGGATCAAC
SEQ ID NO：35	hSox2exoRTR1	GGGCTGTTTTTCTGGTTG
			SEQ ID NO：36	hKlf4exoRTR1	GGAAGTCGCTTCATGTGG
SEQ ID NO：37	hcMycexoRTR1	CCTCGTCGCAGTAGAAATAC
			SEQ ID NO：38	pMXRTFn2	GGGTGGACCATCCTCTAGAC

结果如图3-C，D所示。以绒毛膜间充质细胞和羊膜间充质细胞为例，所选的iPS克隆在内源因子被激活之后，外源因子基本沉默或接近完全沉默。 

序列表 

<110>中国科学院广州生物医药与健康研究院 

<120>用于产生诱导多能干细胞(iPS)的细胞类型及其制备方法和应用 

<130>参考 

<160>9 

<210>1 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列hREX1-Fo 

<400>1 

tcgctgagct gaaacaaatg    20 

<210>1 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列hREX1-Re 

<400>2 

cccttcttga aggtttacac    20 

<210>1 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列hNANOG-Fo 

<400>3 

tgaacctcag ctacaaacag    20 

<210>1 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列hNANOG-Re 

<400>4 

tggtggtagg aagagtaaag    20 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>人工序列hOct4exoRTR1 

<400>5 

ccaggtccga ggatcaac    18 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>人工序列hSox2exoRTR1 

<400>6 

gggctgtttt tctggttg    18 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>人工序列hKlf4exoRTR1 

<400>7 

ggaagtcgct tcatgtgg    18 

<210>1 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列hcMycexoRTR1 

<400>8 

cctcgtcgca gtagaaatac    20 

<210>1 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列pMXRTFn2 

<400>9 

gggtggacca tcctctagac    20 

Claims (10)

1.四种可用来诱导产生诱导多能干细胞(iPS)的细胞类型，其特征在于细胞来源于胎盘组织和羊水细胞。目前多数的临床治疗都需要考虑移植后的免疫排斥问题，因此多数研究致力于寻求自体移植的方法，而上述四种细胞根据其细胞特性，具有广泛临床异体移植应用的前景，所述来源胎盘组织的细胞为羊膜间充质细胞、绒毛膜间充质细胞和脐带间充质细胞。

2.一种诱导产生诱导多能干细胞的诱导重编程方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)将包含多能性干细胞因子的cDNA分别导入羊水细胞或胎盘组织来源的三种间充质细胞中的任一种；

(b)在适宜步骤(a)中所述的羊水细胞或胎盘来源的间充质细胞生长的培养基上进行培养。

3.如权利要求2所述的诱导重编程方法，其特征在于，还包括如下步骤：

(c)初步鉴定多能性干细胞克隆。

4.如权利要求2所述的诱导重编程方法，其特征在于，所述步骤(a)中的cDNA通过病毒载体分别导入所述四种细胞。

5.如权利要求4所述的诱导重编程方法，其特征在于，所述病毒载体为逆转录病毒载体。

6.如权利要求5所述的诱导重编程方法，其特征在于，所述逆转录病毒载体为pMX。 

7.如权利要求2所述的诱导重编程方法，其特征在于，所述步骤(a)中的多能性干细胞因子包括Sox2、Oct4和K1f4。

8.如权利要求2所述的诱导重编程方法，其特征在于，所述步骤(a)中的多能性干细胞因子为Sox2、Oct4、K1f4和C-myc。

9.如权利要求2所述的诱导重编程方法，其使用的相关培养基如下，

(a)对于羊膜间充质细胞，所述培养基为KSR；

(b)对于绒毛膜间充质细胞，所述培养基为DFBS+A，或DFBS+A+VPA，或KSR+VPA；

(c)对于脐带间充质细胞，所述培养基为KSR；

(d)对于羊水细胞，所述培养基为DFBS+A+VPA。

10.如权利要求9所述的诱导重编程方法使用的培养基，其特征在于，所述培养基中含有抗氧化剂(A)是：

(a)包含四种成分：维生素B1、维生素C、还原型谷胱甘肽和***钠；

(b)包含(a)中的前三种成分；

(c)仅含有维生素C。 

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