CN102533764A - Figla基因启动子序列及其构建的标记载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Figla基因启动子序列及其构建的标记载体和应用，生物信息学分析结果提示Figla基因-856bp至+69bp区域内可能包含Figla基因的核心启动子区域且参与基因的转录调控。实验结果表明，该启动子序列在多能性干细胞向雌性生殖细胞分化之后能够启动下游标记基因-EGFP的表达。进一步，可以将该启动子序列调控的荧光基因(EGFP)标记作为多能性干细胞分化成雌性生殖细胞的筛选标记。

Description

Figla基因启动子序列及其构建的标记载体和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及动物干细胞的体外增殖、分化、分离，特别涉及Figla基因启动子序列及其构建的标记载体和应用。

背景技术

干细胞和生殖细胞的发生、增殖、分化的研究是生命科学研究的重要课题之一。在动物繁殖育种中，高产、优质的遗传完全依赖于生殖细胞来完成；在人类，由于雌性生殖细胞——卵子的发生、成熟障碍等引起的***症更是困扰众多患者的一个现实问题；在基础研究中，卵子更是发育生物学研究的最重要研究对象之一；因此雌性生殖的发生、分化的研究，在畜牧业生产和生物医学研究中具有重要的意义。然而高等哺乳动物***的发生、转移、分化完全在体内完成，因此很难动态实时地检测和研究其中的分子事件(HuaJ，Sidhu KS.Recent advances in the derivation of germ cells from the embryonicstem cells[J].Stem Cells and Development，2008，17：399-411.)。

干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。胚胎干细胞(ES细胞或ESCs)是由早期胚胎内细胞团(ICM)或原始生殖细胞(PGCs)分离而来的多能性干细胞。由于胚胎干细胞的独特生物学特性，使胚胎干细胞在细胞替代治疗、组织器官修复与重建、基因治疗以及发育生物学模型、新药开发和毒理实验等，几乎所有的生命科学和生物医药领域均具有重要的意义。近年来，科学家从多种来源和采用外源基因转染等方法也获得了类似胚胎干细胞的多能性干细胞。可以将所用具有ES细胞特性的细胞通称为多能性干细胞。

近年来，Hübner等(Hübner K，Fuhrmann G，Christenson LK et al.Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells[J].Science，2003，300：1251-1256.)，Toyooka等(Toyooka Y，Tsunekawa N，Akasu R et al.Embryonicstem cells can form germ cells in vitro[J].Proc Natl Acad Sci USA，2003，100：11457-11462.)，Geijsen等(Geijsen N，Horoschak M，Kim K et al.Derivation ofembryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells[J].Nature，2004，427：148-154.)分别在《Science》和《Nature》等国际顶尖杂志上报道在ES细胞分化为类胚体(EBs)及其进一步分化的过程中，存在生殖系细胞，进一步甚至可能分化为***或***。Lacham-kaplan等(Lacham-KaplanO，Chy H，Trounson A.Testicular cell conditioned medium supportsdifferentiation of embryonic stem cells into ovarian structures containingoocytes[J].Stem Cells，2006，24：266-273.)用新生鼠睾丸细胞条件培养液培养小鼠ES细胞源的EBs，其进一步发育为含有***的卵巢样结构，表达Figlα和ZP3等***特异性标志。发现雄性小鼠ES细胞在维甲酸(RA)诱导下既可能分化为***也可能分化为***(Kerkis A，Fonseca SA，Serafim RC et al.In vitro differentiation of male mouse embryonic stem cells intoboth presumptive sperm cells and oocytes[J].Cloning Stem Cells，2007，9：535-548.)。Chen等(Chen HF，Kuo HC，Chien C-L et al.Derivation，characterization and differentiation of human embryonic stem cells：comparingserum-containing versus serum-free media and evidence of germ celldifferentiation[J].Human Reproduction，2007，22：567-577.)发现人类ES细胞在体外可能自发分化为***样结构。Hua等(Hua J，Sidhu KS.CoaxinghESC to form oocyte-like structures by co-culture with testicular extract andhormones[J].The Open Stem Cell Journal，2011，3：34-45.)运用睾丸提取物结合生殖激素诱导人类ES细胞向生殖细胞分化，可以得到一些具有***标记的细胞。然而，已有的报道诱导多能性干细胞向生殖细胞分化尤其***分化的数量有限，重复性差，其中很重要的原因在于缺少特殊的筛选标记。导致诱导过程长，效果不稳定，因此很难在体内外深入探讨相关细胞因子、微环境和一些关键基因在干细胞向生殖细胞发育分化过程中的作用和机理。

研究发现，生殖系a因子(Figla)是第一个生殖细胞特异表达的转录因子，对早期卵泡发育中的关键基因进行调控，能直接影响原始卵泡的形成(Choi Y，Rajkovic A.Genetics of early mammalian folliculogenesis[J].Cellularand Molecular Life Sciences，2006，63(5)：579-590；Soyal S M，Amleh A，Dean J.FIGα，a germ cell-specific transcription factor required for ovarian follicleformatiaon[J].Development，2000，127：4645-4654.)。小鼠的Figla最早可以在13.5d的雌性胚胎的生殖嵴中找到，并且在卵泡和生殖细胞簇的发育过程中持续表达，对于Zp基因的表达、透明带的形成具有调节作用(Huntriss J，Gosden R，Hinkins M et al.Isolation，characterization and expression of thehuman Factor In the Germline alpha(FIGLA)gene in ovarian follicles andoocytes[J].Molecular Human Reproduction，2002，8(12)：1087-1095.)。对于雌性胚胎，缺乏Figla不会影响生殖细胞的迁移和增殖，生殖嵴也会正常形成出现，但是出生后***会迅速退化消失，不能形成原始卵泡。而且敲除Figla基因会导致雌鼠***(Liang L，Soyal SM，Dean J.FIGα，a germ cell specifictranscription factor involved in the coordinate expression of the zona pellucidagenes[J].Development，1997，124：4939-4949.)。人类的Figla缺失或突变可能会引起不同程度的卵巢发育或***成熟障碍，促使卵巢早衰(POF)、***的发生(Suzumori N，Pangas SA，Rajkovic A et al.Candidate genes forpremature ovarian failure[J].Current medicinal chemistry，2007，14(3)：353-357；Van Dooren MF，Bertoli-Avella AM，Oldenburg RA.Premature ovarian failureand gene polymorphisms[J].Current opinion in obstetrics & gynecology，2009，21(4)：313-317.)。

发明内容

本发明解决的问题在于Figla基因启动子序列及其构建的标记载体和应用，构建包含Figla基因启动子序列的标记基因，为多能性干细胞向***分化提供新的筛选标记。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种Figla基因启动子序列，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

基于Figla基因启动子序列构建的标记基因，在SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因启动子序列的下游连接荧光标记基因。

所述的基于Figla基因启动子序列构建的标记基因，还在荧光标记基因的下游连接抗生素筛选基因。

一种基于Figla基因启动子序列构建的表达载体，包含SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因启动子序列，在Figla基因启动子序列的下游连接荧光标记基因EGFP，在EGFP的下游连接抗生素筛选基因neor。

所述的基于Figla基因启动子序列构建的表达载体为pFigla-EGFP表达载体，通过SalI和BamHI酶切位点将Figla基因启动子克隆到pEGFP-1表达载体。

Figla基因启动子序列携带荧光标记基因后转染多能性干细胞，以其作为多能性干细胞诱导分化成雌性生殖细胞的筛选标记的应用。

一种多能性干细胞向雌性生殖细胞分化的筛选及分离纯化方法，包括以下步骤：

1)克隆如SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因启动子序列，并将Figla基因启动子序列通过SalI和BamHI酶切位点将Figla基因启动子克隆到pEGFP-1表达载体，得到pFigla-EGFP表达载体；

2)将待转染的多能性干细胞与pFigla-EGFP表达载体共同孵育，将pFigla-EGFP表达载体转染到多能性干细胞之中；

转染48h后传代，使用包含200μg/mL G418的培养液筛选G418抗性的克隆，筛选2周后，得到具有G418抗性的多能性干细胞克隆；

3)将处于对数生长期的G418抗性的多能性干细胞用胰蛋白酶消化吹打成单细胞悬液，用差速贴壁法除去饲养层细胞，用诱导基础液重悬多能性干细胞，转移到不贴壁的皿中培养2～3d，然后将其转入到铺附有明胶的培养板中，添加0.1μmol/L维甲酸贴壁诱导5～6d；

诱导基础液为H-DMEM培养基+0.1mmol/L β-巯基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1％体积浓度的非必需氨基酸+15％体积浓度的胎牛血清；

诱导5～6d后，通过流式细胞仪分选纯化出GFP阳性细胞，通过RT-PCR进行生殖特异性基因表达的检测，筛选的GFP阳性细胞即为分化的雌性生殖细胞。

所述的传代为将多能性干细胞接种到以10μg/mL丝裂霉素C处理2h的2～5代小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层的细胞培养板上，37℃、5％ CO₂饱和湿度条件下培养，待克隆增殖到65～70％时融合时传代；

培养液为H-DMEM培养液+0.1mmol/L β-巯基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1％体积浓度的非必需氨基酸+10ng/mL白血病抑制因子+15％体积浓度的FBS。

所述的多能性干细胞包括胚胎干细胞、诱导型多能性干细胞或成年组织来源的具有胚胎干细胞特性的多能性干细胞。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明提供了Figla基因的启动子区的序列，FirstEF online分析该区域存在1个CpG岛，位于-155～-58bp。生物信息学分析结果提示Figla基因-856bp至+69bp区域内可能包含Figla基因的核心启动子区域且参与基因的转录调控。实验结果表明，该启动子序列在多能性干细胞分化成雌性生殖细胞之后能够启动下游基因的表达。进一步，可以将该启动子序列用荧光蛋白基因标记后作为多能性干细胞分化成雌性生殖干细胞的筛选标记。

2、本发明构建了pFigla-EGFP表达载体，将pFigla-EGFP转染小鼠卵巢原代细胞，标记基因GFP(fluorescent green protein)表达，而转染MEF细胞未发现GFP阳性细胞，表明该表达载体具有雌性生殖细胞特异性启动的特点，是一种启动子特异性启动表达的载体。

3、本发明将pFigla-EGFP转染mESCs，构建了携带pFigla-EGFP的mES细胞系，此mESCs的生长特性未发生变化，克隆致密，边缘光滑，呈碱性磷酸酶阳性，表达多能性标记基因Oct4，Sox2，Klf4，Nanog和C-myc。悬浮培养3d可形成EBs，具有三胚层分化潜能，可形成畸胎瘤。

4、携带pFigla-EGFP的mESCs可进行体外分化，将悬浮培养3d的EBs移至铺有明胶的培养皿内，多数EBs可在24h内贴壁生长。经RA诱导，第2～3d时，在EBs生长晕周围出现较多的圆形细胞，体积较大，为类原始生殖细胞。此时在荧光显微镜下可观察到部分细胞表达GFP，通过免疫荧光染色发现，GFP阳性细胞同时表达生殖细胞标记基因Vasa和减数***特异性基因Scp3，第6d时，通过流式细胞仪分选纯化出GFP阳性细胞(5.2％)，进行RT-PCR检测，发现其表达Figla和GFP，而对照组不表达。生殖特异性基因Vasa，减数***特异性基因Scp3和Stra8，以及雌性生殖细胞特异性基因Figla和Zp3在GFP阳性细胞的表达显著高于未分化的mESCs。

5、携带pFigla-EGFP的mESCs可进行体内分化，在与卵巢细胞共培养的微环境下，携带pFigla-EGFP的mESCs在体内可以向生殖细胞分化。石蜡组织切片免疫荧光染色显示，在移植物中存在GFP阳性细胞，且同时表达Vasa，Stra8和Scp3等生殖细胞的标记基因，部分mESCs可分化发育为体积较大的类***，表达Figla和Zp3。

附图说明

图1是Figla基因启动子区结构示意图；

图2是重组质粒pFigla-EGFP的质粒图谱；

图3是SalI和BamHI双酶切鉴定阳性重组质粒pFigla-EGFP；

图4-1～4-2分别是荧光显微镜观察重组质粒pFigla-EGFP的报告基因在MEF和卵巢原代细胞的表达结果；

图5是转染pFigla-EGFP的mESCs显微观察图；

图6-1是转染pFigla-EGFP的mESCs形成的EBs的显微观察，图6-2为扩增其三胚层基因之后的琼脂糖凝胶电泳的检测结果图；

图7-1是荧光显微镜观察转染了pFigla-EGFP的mESCs诱导后的报告基因GFP的表达结果；图7-2是其mRNA的GFP基因扩增之后的琼脂糖凝胶电泳的检测结果图；

图8是免疫荧光染色显示转染了pFigla-EGFP的mESCs体外分化后GFP及生殖细胞标记基因的表达结果；

图9是对转染了pFigla-EGFP的mESCs诱导后进行流式细胞分选的结果；

图10是定量PCR检测流式细胞仪分选的GFP阳性细胞的生殖细胞标记基因表达的结果；

图11是免疫荧光染色显示转染了pFigla-EGFP的mESCs体内分化后GFP及生殖细胞标记基因的表达结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例证对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、Figla基因启动子序列的克隆

1)Figla基因5’端调控区生物信息学分析

以Figla基因翻译起始密码子ATG的第一个碱基A为+1，选取5′端上游2000bp的DNA片段作为CpG岛分析、转录起始位点分析、启动子分析及转录因子结合位点分析用序列。并利用在线启动子分析软件(Promoter2.0，Promoter ScanII，BDGP)获取基因启动子区数据信息。

Promoter 2.0 Prediction(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)预测Figla基因转录起始位点位于-300bp；

PROMOTER SCAN(http://thr.cit.nih.gov/molbio/proscan/)查询结果显示上述Figla基因调控区存在保守的潜在转录因子结合位点，包括AP-2，T-Ag，Sp1，USF和RXR-α，Figla启动子区结构示意如图1所示。

FirstEF online(http://rulai.cshl.org/tools/FirstEF/)分析该区域存在1个CpG岛，位于-155～-58bp(参见图1)；

综合上述各生物信息学分析结果，提示-856bp至+69bp区域内可能包含Figla基因的核心启动子区域且参与基因的转录调控。

2)Figla启动子区报告基因载体构建

利用Primer Premier 5.0引物设计软件设计扩增包含启动子的-856bp区域与+69bp区域之间的序列，设计上、下游引物并选择合适的限制性内切酶，具体设计以下引物：

上游引物：5′CGGTCGACCCCCATCTAGCCTCCACACG 3′

下游引物：5′GCGGATCCGTCAAGACCACGGGCAGCAG 3′

上游引物中划线部分为SalI酶切位点，下游引物中下划线部分为BamHI酶切位点；

Figla基因PCR扩增反应体系为15μL，其中包括：10×buffer 1.5μL，MgCl₂(25mmol/L)1.6μL，dNTP(2.5mmol/L)1.2μL，Taq DNA聚合酶0.1μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.3μL，0.5μL小鼠基因组DNA(基因组提取试剂盒提取的小鼠皮肤组织，获得基因组DNA作为模板)，ddH₂O9.5μL。

反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环，最后72℃补延伸10min，4℃保存。

回收并纯化PCR产物，得到Figla启动子片段，然后将PCR产物、pEGFP-1真核表达载体分别用SalI和BamHI双酶切后连接，将其克隆入pEGFP-1真核表达载体，构建重组质粒pFigla-EGFP。

将重组载体pFigla-EGFP进行SalI和BamHI双酶切鉴定，产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在925bp和4130bp处出现特异性条带。

所构建的pFigla-EGFP载体的质粒图谱如图2所示，可以看到Figla启动子序列之后连接有EGFP绿色荧光蛋白基因，并且还带有抗生素筛选基因nero。

pFigla-EGFP载体的SalI和BamHI双酶切鉴定结果如3所示，可以看到克隆到的Figla启动子目标片段和剩余的pEGFP-1载体骨架。

测序后得到Figla启动子序列，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2、Figla启动子序列的特异性启动

将pFigla-EGFP转染原代小鼠卵巢细胞，报告基因GFP(fluorescent greenprotein)表达(图4-2所示)，而转染MEF，未发现GFP阳性细胞(图4-1所示)，表明启动子特异性启动表达，启动子载体构建成功。转染方法为：待转染的原代小鼠卵巢细胞和MEF以1×10⁵的密度接种于6孔板内培养，24h后按照Fermentas公司的TurboFect^TM转染说明书进行pFigla-EGFP重组质粒的转染。将6μg质粒加入1ml opti-MEM培养液中，再加入12μl TurboFect转染试剂，温和混匀。室温孵育20min后，将TurboFect/DNA混合物均匀加入培养皿内。转染后3-4h，更换为H-DMEM+0.1mmol/L β-巯基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+15％体积浓度的胎牛血清。

3、mESCs的培养及pFigla-EGFP的转染

1)小鼠胚胎干细胞(mESCs)的培养和转染pFigla-EGFP

将小鼠胚胎干细胞(mESCs)接种到以10μg/mL丝裂霉素C处理2h的2～5代小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)作为饲养层(密度为1～2×10⁵个/mL)的细胞培养板上，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养，待mESCs克隆增殖约70％融合时传代；

培养液成分为H-DMEM+0.1mmol/L β-巯基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+10ng/mL白血病抑制因子+15％体积浓度的胎牛血清；

待转染的mESCs细胞以1×10⁵的密度接种于6孔板内培养，24h后按照Fermentas公司的TurboFect^TM转染说明书进行pFigla-EGFP重组质粒的转染。具体为：将6μg质粒加入1ml opti-MEM培养液中，再加入12μl TurboFect转染试剂，温和混匀。室温孵育20min后，将TurboFect/DNA混合物均匀加入培养皿内。转染后3-4h，更换为H-DMEM+0.1mmol/L β-巯基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+10ng/mL白血病抑制因子+15％FBS培养。

转染48h后传代，使用200μg/mL G418对转染后的细胞进行筛选，筛选2周得到G418抗性克隆(在筛选前3代，有大量细胞死亡，集落也不致密，随着继续筛选，死亡细胞减少，集落形态逐渐与野生型ESCs接近：集落***，细胞排列紧密，呈椭圆形或鸟巢状，边缘清楚，折光性强)。

将G418抗性克隆消化后以单个细胞接种96孔板，扩增培养后得到单克隆的携带pFigla-EGFP重组质粒的mESCs。转染pFigla-EGFP的mESCs显微观察图如图5所示。

4、携带pFigla-EGFP的小鼠胚胎干细胞(mESCs)的诱导分化

将处于对数生长期重组的mESCs用0.05％胰蛋白酶消化吹打成单细胞悬液，用差速贴壁法除去MEF饲养层细胞，1500r/min离心5min，用诱导基础液重悬ESCs，转移到不贴壁的皿中培养3d，以形成类胚体(EBs)；多数EBs可在24h内贴壁生长。随着培养时间的延长，EBs周围的细胞逐渐向外移行生长；图6-1是转染pFigla-EGFP的mESCs形成的EBs的显微观察，图6-2为扩增其三胚层基因之后的琼脂糖凝胶电泳的检测结果图；

诱导液成分为H-DMEM培养液+0.1mmol/L β-巯基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+15％体积浓度的胎牛血清；

将经过悬浮培养3d后的EBs以吸胚管转入铺有0.1％明胶铺附的48孔培养板中，添加维甲酸(RA)贴壁诱导。

经RA诱导，第2～3d时，在EBs生长晕周围出现较多的圆形细胞，体积较大，为类原始生殖细胞，此时在荧光显微镜下可观察到部分细胞表达GFP，具体如图7-1所示，由于Figla是特异性的在雌性生殖细胞进行启动表达，EGFP基因被表达就表明是Figla启动子序列启动了EGFP基因的表达，那么发出荧光的细胞就是已分化的雌性生殖细胞；图7-2是其mRNA水平的GFP(上游引物：gacgggaactacaagacacg，下游引物：cgaaagggca gattgtgtg)和Figla(上游引物：ctctgctgcc cgtggtctt，下游引物：ctgctctgtg gtagaaacgg c)基因扩增之后的琼脂糖凝胶电泳的检测结果图；结果显示经RA诱导细胞表达Figla和GFP，而作为对照的未发出荧光的mESCs组不表达Figla和GFP。

进一步对于GFP阳性细胞进行免疫荧光染色，结果表明GFP阳性细胞同时表达生殖细胞标记基因Vasa和减数***特异性基因Scp3(参见图8)；

在RA诱导第6d时，通过流式细胞仪分选纯化出5.2％的GFP阳性细胞，其具体的结果如9所示，结果表明mESCs在向生殖细胞诱导后，5.2％的细胞启动了Figla基因的表达；进一步进行RT-PCR检测，发现生殖特异性基因Vasa，减数***特异性基因Scp3和Stra8，以及雌性生殖细胞特异性基因Figla和Zp3在GFP阳性细胞的表达显著高于未分化的mESCs，上述检测结果如图10所示。

这表明携带pFigla-EGFP的mESCs可进行体外分化，而且能够分化成GFP表达的类雌性生殖细胞。这些表达GFP的细胞表达生殖细胞特异基因，证实GFP阳性细胞为类雌性生殖细胞。

5、携带pFigla-EGFP的mESCs的体内移植

将消化收集到的mESCs与原代小鼠卵巢细胞混合，离心形成细胞团块，移至6～8周龄白消安药物处理的小鼠左侧肾被膜下，1个月后处死小鼠，收集移植的细胞团块。

移植的细胞团块经石蜡组织切片染色及免疫荧光染色显示，在移植物中存在GFP阳性细胞，且同时表达Vasa，Stra8和Scp3，部分mESCs可分化发育为体积较大的类***，表达Figla和Zp3。表明转染pFigla-EGFP的mESCs在体内与卵巢细胞共培养的微环境下可向雌性生殖细胞分化，上述检测结果如图11所示。

Claims (9)

1.一种Figla基因启动子序列，其特征在于，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.一种基于Figla基因启动子序列构建的标记基因，其特征在于，在SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因启动子序列的下游连接荧光标记基因。

3.如权利要求2所述的基于Figla基因启动子序列构建的标记基因，其特征在于，还在荧光标记基因的下游连接抗生素筛选基因。

4.一种基于Figla基因启动子序列构建的表达载体，其特征在于，包含SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因启动子序列，在Figla基因启动子序列的下游连接荧光标记基因EGFP，在EGFP的下游连接抗生素筛选基因neor。

5.如权利要求4所述的基于Figla基因启动子序列构建的表达载体，其特征在于，该表达载体为pFigla-EGFP表达载体，通过SalI和BamHI酶切位点将Figla基因启动子克隆到pEGFP-1表达载体。

6.Figla基因启动子序列携带荧光标记基因后转染多能性干细胞，以其作为多能性干细胞诱导分化成雌性生殖细胞的筛选标记的应用。

7.一种多能性干细胞向雌性生殖细胞分化的筛选及分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)克隆如SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因启动子序列，并将Figla基因启动子序列通过SalI和BamHI酶切位点将Figla基因启动子克隆到pEGFP-1表达载体，得到pFigla-EGFP表达载体；

2)将待转染的多能性干细胞与pFigla-EGFP表达载体共同孵育，将pFigla-EGFP表达载体转染到多能性干细胞之中；

转染48h后传代，使用包含200μg/mL G418的培养液筛选G418抗性的克隆，筛选2周后，得到具有G418抗性的多能性干细胞克隆；

3)将处于对数生长期的G418抗性的多能性干细胞用胰蛋白酶消化吹打成单细胞悬液，用差速贴壁法除去饲养层细胞，用诱导基础液重悬多能性干细胞，转移到不贴壁的皿中培养2～3d，然后将其转入到铺附有明胶的培养板中，添加0.1μmol/L维甲酸贴壁诱导5～6d；

诱导基础液为H-DMEM培养基+0.1mmol/L β-巯基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1％体积浓度的非必需氨基酸+15％体积浓度的胎牛血清(FBS)；

诱导5～6d后，通过流式细胞仪分选纯化出GFP阳性细胞，通过RT-PCR进行生殖特异性基因表达的检测，筛选的GFP阳性细胞即为分化的雌性生殖细胞。

8.如权利要求7所述的多能性干细胞向雌性生殖细胞分化的筛选及分离纯化方法，其特征在于，所述的传代为将多能性干细胞接种到以10μg/mL丝裂霉素C处理2h的2～5代小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层的细胞培养板上，37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养，待克隆增殖到65～70％时融合时传代；

培养液为H-DMEM培养液+0.1mmol/L β-巯基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1％体积浓度的非必需氨基酸+10ng/mL白血病抑制因子+15％体积浓度的FBS。

9.如权利要求7所述的多能性干细胞向雌性生殖细胞分化的筛选及分离纯化方法，其特征在于，所述的多能性干细胞包括胚胎干细胞、诱导型多能性干细胞或成年组织来源的具有胚胎干细胞特性的多能性干细胞。

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