CN101671650B - 一种可高效诱导产生诱导多能干细胞(iPS)的诱导重编程方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可高效产生诱导多能干细胞(iPS)的诱导重编程方法，该方法将骨膜细胞诱导为多能干细胞。具体包括如下步骤：将包含多能性干细胞因子的cDNA导入骨膜细胞；在适宜培养基上进行骨膜细胞培养，还可初步鉴定多能性干细胞克隆。本发明还提供了一种高效诱导产生诱导多能干细胞(iPS)的细胞类型在经诱导重编程而产生多能性干细胞中的用途。本发明中，骨膜细胞可诱导形成iPS，而且与成纤维细胞相比，诱导重编程的效率提高超过100倍，效率约为2.2％左右，略高于角质细胞；为建立疾病模型，进行药物筛选，控制定向分化提供了更加有效且更加具有针对性的手段。

Description

一种可高效诱导产生诱导多能干细胞(iPS)的诱导重编程方法

技术领域

本发明涉及细胞领域，特别涉及一种可高效诱导产生诱导多能干细胞(iPS)的诱导重编程方法。 

背景技术

干细胞(stem cells)是人体及其各种组织细胞的初始来源，其最显著的生物学特征是既有自我更新和不断增殖的能力，又有多向分化的潜能。干细胞根据不同的来源分为成体干细胞(somatic stem cells)和胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)。成体干细胞包括骨髓间充质干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞等成体组织中存在的。 

1981年，ES细胞的分离和培养首先在小鼠中获得成功，是至今研究最广泛、最成熟的干细胞体系。而人的干细胞的代始于1998年，美国威斯康辛大学(University of Wisconsin)科学家汤姆森(James A.Thomson)带领研究团队首次从人类胚胎组织中提取培养出胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ES Cell)株，并且证实此株细胞具有全能干细胞特征，此项研究论文发表在1998年11月6日出版的顶级学术期刊Science上面。(详见：Thomson，J.A.，J.Itskovitz-Eldor，S.S.Shapiro，M.A.Waknitz，J.J.Swiergiel，V.S.Marshall，and J.M.Jones.″Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.″Science 282(1998)：1145-1147。Thomson等人，从人胚泡中获取胚胎干细胞系，科学，282(1998)：1145-1147。)这篇论文标志着一个时代的到来，而汤姆森也被人称作″干细胞研究之父″。 

hES(人胚胎干细胞)细胞研究的应用前景主要是再生医学领域，在组织工程学领域中以hES细胞作为种子细胞，可为临床上细胞、组织或器官的移植治疗提供大量的材料。通过控制hES细胞分化培养环境、转染能够促进ES细胞定向分化的关键分子基因等体外诱导分化策略，可获得特异性的组织细胞类型。这类细胞用于移植治疗，将给糖尿病、帕金森氏病、脊髓损伤、白血病、心肌损伤、肾衰竭、肝硬化等疾病的治疗带来新的希望。 

然而，一直以来，hES细胞研究面临着许多难题和争议，主要包括以下几个方面：(1)供体***的来源困难，hES细胞建系效率低。此外，SCNT技术的不成熟必将需要进一步耗费更多的人类***，故而其来源难以得到保证。(2)免疫排斥反应，除非采用SCNT技术，否则患者对hES细胞分化而来的各种细胞和组织仍然存在免疫排斥反应。(3)hES细胞具有成瘤性，移植到受体的体内后有发展为肿瘤的可能性，即使采用SCNT技术、给移植细胞设置***基因等应对措施，也不一定能够很好地解决这个问题(4)体外保持hES风险。同样，慢病毒转染技术可能也存在类似的风险。 

为避开hES细胞和治疗性克隆研究的伦理学争论，需要找到一种替代途径，以便将人类的体细胞直接转化为多潜能干细胞，为患者提供“个性化”的自体干细胞。2003年，Gurdon研究小组发现，将已完全分化的小鼠胸腺细胞或成人外周血淋巴细胞的细胞核注入爪蟾***后，哺乳动物细胞核的分化标志物丧失，而哺乳动物干细胞中最具特征性的标志物Oct4则呈高表达，提示哺乳动物细胞核可直接被两栖动物***核泡所重构从而表达Oct4(Byrne JA等人，Nucleiof adult mammalian somatic cells are directly reprogrammed to oct-4 stem cell geneexpression by amphibian oocytes.Curr Biol 2003；13：1206-1213。Byrne JA等人，成年哺乳动物体细胞核可直接被两栖动物***核泡所重构从而表达Oct4.当代生物学，2003；13：1206-1213)。 

2006年，日本京都大学Yamanaka研究小组采用体外基因转染技术，从24个因子中筛选出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4个转录因子，通过逆转录病毒将上述4个转录因子导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞，在小鼠ES细胞的培养条件下获得了Fbx15+的多潜能干细胞系，该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，而 在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠ES细胞，故将其命名为诱导的多能性干细胞(iPS细胞)。 

Yamanaka研究小组利用相同的技术，将上述同样的4个转录因子导入到人皮肤成纤维细胞中，也成功获得了iPS细胞。原代人类成纤维细胞样滑膜细胞和源自新生儿成纤维细胞的细胞系同样也可被重构成为iPS细胞。这类iPS细胞在细胞形态、增殖能力、表面抗原标志、基因表达谱、多潜能干细胞特异性基因的表观遗传学状态、端粒酶活性等方面与hES细胞相似，并且在体外培养时和在小鼠体内畸胎瘤形成中均可分化为3个胚层的不同细胞类型(Takahashi K et al，Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell 2007；131：861-872。Takahashi K等人，利用特定因子诱导成人成纤维细胞到多能干细胞，细胞，2007；131：861-872)。与此同时，威斯康辛大学Thomson研究小组也报道了成功诱导胎儿成纤维细胞转化为具有hES细胞基本特征的人类iPS细胞，所不同的是他们使用慢病毒作为载体，并在14个候选基因中选择了Oct4、Sox2、Nanog、Lin28等4个基因进行转导(Yu J et al，Induced pluripotentstem cell lines derived from human somatic cells.Science 2007；318：1917-1920。俞君英等人，从人的体细胞诱导成为多能干细胞系，科学，2007；318：1917-1920)。这一被学界称为生物科学“里程碑”的重大突破有望帮助科学家绕过克隆技术的伦理、道德纷争，为医学应用打开大门。 

Park IH等人(Reprogramming of human somatic cells to pluripotency withdefined factors.Nature 2008；451：141-146。利用特定因子将人的体细胞重编程为多潜能细胞，自然，2008；451：141-146)利用来自胎儿、新生儿及成人的皮肤或肺部的原代成纤维细胞，其中包括来自1名健康男性皮肤活检得到的成纤维细胞，采用Yamanaka研究小组的策略也获得了相同的结果。他们还发现Oct4和Sox2在诱导重构为iPS细胞过程中是必需的，正是这两个转录因子维持了人类iPS细胞的多潜能性，而Klf4和c-Myc的作用是改变染色质的结构，从而有利于Oct4和Sox2的结合，以提高诱导的效率。此外，这项研究的重要意义在于将 取自皮肤活检的成纤维细胞诱导为iPS细胞。上述研究表明，从活检人类皮肤组织中提取体细胞后进行诱导以制备患者特异性的干细胞是可行的，因而有望克服细胞移植治疗中存在的免疫排斥反应。2008年10月，Juan Carlos IzpisúaBelmonte领导的小组(Juan Carlos Izpisúa Belmonte et al.Efficient and rapidgeneration of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.NatureBiotechnology.2008.26：1276-1284；胡安·卡洛斯·伊兹皮索阿·贝尔蒙特等人，人的角质细胞可被高效快速地诱导为多能干细胞，自然-生物技术，2008.26：1276-1284)利用一根头发上的角质细胞成功高效诱导出iPS细胞，大大推动了iPS的医学应用进程。 

鉴于导入c-Myc基因可使嵌合体小鼠的肿瘤发生率高达20％，可能会阻碍其未来的临床应用。因此，Yamanaka研究小组新近报道，小鼠和人类皮肤成纤维细胞转染c-Myc以外的其余3个基因，在调整培养条件后也可得到iPS细胞。去除c-Myc基因尽管可使未来临床应用的安全性显著提高，但形成iPS细胞的效率却明显降低。虽然嵌合体小鼠在100天内没有肿瘤发生，但逆转录病毒的再激活仍有导致肿瘤发生的潜在风险。同样，慢病毒转染技术可能也存在类似的风险。 

针对这一风险，科学家一直在努力寻找一种可以表达外源基因但外源基因非整合到基因组上的方法。2009年3月5日，Cell报道Rudolf Jaenisch研究小组利用Cre-重组酶***使诱导成功的帕金森病人iPS细胞无外源因子，使iPS的临床应用又推进了一步，但是这种方法的缺点是仍有载体存留在基因组中(Rudolf Jaenisch等人，帕金森病人来源的诱导多能干细胞无外源因子.细胞.2009.136：964-977)。随后这一缺陷被另一组科学家克服。2009年3月26日，Science即出现俞君英等通过一种非整合质粒Episomal Vector成功诱导出无外源基因也无载体整合到基因组上的iPS(俞君英等人，无载体也无外源基因序列的人的诱导多能干细胞.科学.2009.324：797-801)。他们用一种叫做核转染的方法将这些质粒介入到人***细胞中，在质粒中的基因所表达的蛋白质会将细胞重新编程并使其成为iPS细胞。这些iPS细胞在接着的几轮细胞***中会开始失去这些质粒，这样研究人员就可以分离出不含质粒的细胞。这一发现非常重要，它是人们向iPS细胞的临床应用迈出了关键性的一步。这一方法虽然临床应用的安全性大大提高，但是重编程过程中培养条件有待优化。不同的细胞类型在重编程效率不同，相同的细胞类型在不同的培养条件下重编程效率也不同。重编程效率太低，在以后的研究中有待克服。 

尽管已经证明了病毒转导一系列外源因子可以使得人的成纤维细胞的后生和转录状态重置成多能胚胎干细胞(ES细胞)的状态(Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by definedfactors.Cell.2007；131：861-872。Takahashi K和Yamanaka S等人，利用特定因子诱导成人成纤维细胞到多能干细胞，细胞，2007；131：861-872。Yu Junying，JamesA.Thomson et al，Science.2007；318：1917-1920；俞君英，汤姆森等人，从人的体细胞诱导成为多能干细胞系，科学，2007；318：1917-1920)，并且随着科学的发展，无外源因子整合到基因组和既无载体也无外源因子整合的基因组的人iPS技术出现(Rudolf Jaenisch等人，帕金森病人来源的诱导多能干细胞无外源因子.细胞.2009.136：964-977；)，但是由人成纤维细胞得到的iPS细胞效率极低，整合型外源因子得到的iPS细胞的效率约0.01-0.02％；非整合型如俞君英最新的报道无外源因子也无载体序列***基因组得到的iPS的效率更低，约百万分之三到六。于是人们开始寻找具有更高重编程能力的细胞类型，2008年10月，JuanCarlos Izpisúa Belmonte领导的小组利用一根头发上的角质细胞成功高效诱导出iPS细胞，报道称其效率较成纤维细胞提高约100倍。 

发明内容

为克服上述诱导iPS效率极低的问题，本发明的目的在于提供一种可以高效产生诱导多能干细胞(iPS)的诱导重编程方法，该方法为将骨膜细胞诱导为多能干细胞。。 

该诱导重编程方法具体包括如下步骤： 

(a)将包含多能性干细胞因子的cDNA导入骨膜细胞； 

(b)在适宜步骤(a)中所述的骨膜细胞生长的培养基上进行骨膜细胞培养。上述诱导重编程方法，还可以包括如下步骤：(c)初步鉴定多能性干细胞克隆。 

优选的，上述步骤(a)中的cDNA通过病毒载体感染所述骨膜细胞。 

优选的，所述病毒载体为逆转录病毒载体。 

更优选的，所述逆转录病毒载体为pMX。 

优选的，上述步骤(a)中的多能性干细胞因子包括Sox2、Oct4和Klf4，其中，所述Sox2可以替换为Sox1，所述K1f4可以替换为Klf5或Klf2。 

所述多能性干细胞因子还包括C-myc、L-Myc或N-Myc中的任一种。 

更优选的，上述步骤(a)中的多能性干细胞因子为Sox2、Oct4、C-myc和Klf4。 

优选的，所述骨膜细胞为哺乳动物骨膜细胞。 

更优选的，所述骨膜细胞为人骨膜细胞。 

上述多能性因子可以是任何来源的，优选为人的多能性因子以及其变体，如Sox2，NCBI登录号为NM_003106.2；Oct4，NCBI登录号为NM_002701.4；Klf4，NCBI登录号为NM_004235.4；c-Myc，NCBI登录号为NM_002467.3；Sox1，NCBI登录号为NM_005986.2；K1f2，NCBI登录号为NM_016270.2；K1f5，NCBI登录号为NM_001730.3。C-Myc还可以被换为其突变体l-myc(登录号为NM_001033081.1)；或者n-Myc(登录号为NM_005378.4)。 

与现有技术公开的其它可以被诱导为iPS的细胞不同，骨膜细胞不仅可以诱导形成iPS，而且诱导重编程的效率远大于成纤维细胞，人骨膜细胞在转录人的四个外源因子Sox2，Oct4，Klf4，c-Myc后，可以高效诱导为iPS细胞，效率约为2.2％左右，与成纤维细胞相比效率提高超过100倍，略高于角质细胞；而且产生的这些诱导多能性干细胞多能性标记物的表达水平与人胚胎干细胞相近，同时外源因子沉默。这对于今后通过使用诱导的多能性细胞，而非直接从人体提取的胚胎干细胞，利用组织再生医学建立疾病模型，进行药物筛选，控制定向分化提供了更加有效且更加具有针对性的手段。本发明发现略高于已报道的角质细胞。 

附图说明

图1是显微镜下观察骨膜细胞及其诱导得到的hES样克隆形态图； 

图2是骨膜iPS细胞AP染色结果及诱导iPS细胞效率计算； 

图3是骨膜iPS hES标志物表达水平鉴定及外源因子表达水平检测结果图，图3-A是骨膜iPS中人胚胎干细胞标志物(Oct4，Sox2，Nanog，Lin28，Sall4，TDGF1，DPPA4)的表达水平检测结果图；图3-B是骨膜iPS中人胚胎干细胞标志物(Rex1，TERT，DPPA2，NODAL，LEFTY1)表达水平检测结果图；图3-C是骨膜iPS中外源因子(Sox2，Klf4，Oct4，c-Myc)表达水平检测结果图。 

具体实施方式

1.定义和技术：除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。参见分子克隆实验指南，第3版(2002)，Sambrook，Fritsch和Maniatis编著；现代分子生物学实验方法(F.M.Ausubel等人编著(1987))；酶学方法(AcademicPress，Inc.)；PCR2：实用方法，M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编著，(1995)；抗体，Harlow和Lane编著，(1988)；动物细胞培养实验室手册，R.I.Freshney编著，(1987)；干细胞手册，卷2，W.French Anderson等人编著。 

本发明中使用的一些术语具有下列定义的含义：在说明书和权利要求书中使用的，单数型“一个”，和“这个”包括复数参考，除非上下文另有清楚的表述。例如，术语“(一个)细胞”包括复数的细胞，包括其混合物。 

所有的数字标识，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，其以0.1的增量变动(+)或(-)。要了解，虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语“约”。也要了解，虽然不总是明确的叙述，本发明中描述的试剂仅仅是示例，其等价物是本领域已知的。 

本发明所述的“诱导的多能性干细胞(iPS细胞)”是这样的细胞，其在ES细胞培养条件下，与ES细胞在细胞形态、生长特性、表面标志物表达、移植到皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与人ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态等方面也与人ES细胞几乎完全相似。 

本发明所述的骨膜细胞是来自哺乳动物的骨膜细胞，其来自骨膜。骨膜覆盖骨表面，是一种非均质***结构，具有骨受伤后促进骨形成的潜能。骨膜分为外部“纤维层(fibrous layer)”和内部“生发层(cambium layer)”(或“成骨层”)。纤维层含有成纤维细胞，而生发层则含有骨祖细胞。 

培养的骨膜细胞的形态学特征呈梭形锥形及多角形，作为成骨细胞特征的表形标志，富含碱性磷酸酶活性，合成I型胶原，表达骨钙素和骨桥蛋白基因等典型特征。这些特征可作为成骨细胞的鉴定及其成骨作用和发挥代谢调节作用的评价标准。 

本发明所述的骨膜细胞可以来源于任何动物(包括人)，优选是哺乳动物，更优选是人。各种动物来源的骨膜细胞可以从动物中容易地分离，例如从新生小鼠中分离；或者从人骨相关手术后的骨废弃物中分离得到； 

本发明所述的术语“诱导重编程”是指将体细胞去分化为多能性干细胞的过程。优选地，通过将维持干细胞多能性所需的多能性因子cDNA导入体细胞可以诱导体细胞去分化成为多能性干细胞(Takahashi K和Yamanaka S等人，利用特定因子诱导成人成纤维细胞到多能干细胞.细胞2007；131：861-872；俞君英等人，从人的体细胞诱导成为多能干细胞系.科学.2007；318：1917-1920)。其中，优选地，所述的多能性因子包括Oct4、Sox2(任选地，Sox1)、C-myc(任选地L-Myc或N-Myc)，以及Klf4(任选地，Klf5或Klf2)。最优选地，所述多能性 因子为Oct4、Sox2、C-myc以及Klf4。具体地，所述多能性因子为Sox2，NCBI登录号为NM_003106.2；Oct4，NCBI登录号为NM_002701.4；Klf4，NCBI登录号为NM_004235.4；c-Myc，NCBI登录号为NM_002467.3；Sox1，NCBI登录号为NM_005986.2；Klf2，NCBI登录号为NM_016270.2；Klf5，NCBI登录号为NM_001730.3。C-Myc还可以被换为其突变体L-myc(登录号为NM_001033081.1)；或者N-Myc(登录号为NM_005378.4)。 

将所述多能性因子cDNA导入体细胞的方法可以是本领域技术人员熟知的多种技术，包括病毒感染、脂质体转染、电穿孔、粒子轰击等各种将DNA转入细胞的方法。优选地，使用包含cDNA的病毒载体进行转染，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体等多种病毒载体。优选地逆转录病毒载体(例如pMX载体)，如实施例中所述的。 

本发明所述的“适宜被导入多能性干细胞因子cDNA的骨膜细胞的生长条件”是本领域的常规干细胞培养条件，并且包括一些适宜各个具体细胞系，但是不影响细胞基本性质的修饰，培养方法以及培养条件参见W.French Anderson等人，干细胞手册，卷2。 

本发明的用人骨膜细胞高效生成诱导的多能性干细胞的方案优选实施例的过程如下，图1为骨膜细胞及其诱导得到的hES样克隆形态；图2为为骨膜iPS细胞AP染色结果及诱导iPS细胞效率计算；图3为通过Real-Time的方法检测骨膜iPS hES标志物表达水平鉴定及外源因子表达水平。 

2.实施例 

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。 

下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例，根据本发明公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个 领域的常规技术。 

实施例1. 

细胞的制备和培养 

由外科手术得到废弃物中分离骨膜，1×PBS洗涤一次，然后用外科手术剪将骨膜剪成约1mm³的小组织块，平铺于60mm培养皿中，所述培养皿用0.1％的明胶(Gelatin)预包被处理。用高葡萄糖DMEM(Dulbcco′s Modifed EagleMedium)培养基(4.5g/L的葡萄糖，HyClone公司)培养所得到的细胞，培养基中包含10％胎牛血清(HyClone公司)、非必须氨基酸(1％，Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco公司)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)。 

在多能干细胞诱导过程中使用人胚胎干细胞培养基。 

将人胚胎干细胞(hES)和用于扩增的诱导的多能干细胞(induced pluripotentstem cells，iPS细胞)培养在用丝裂霉素(10μg/ml)处理的MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)上，并且培养在含20％血清替代物(KSR)的人胚胎干细胞培养基中。 

在纯化RNA或DNA之前，去除滋养层细胞，在Matrigel上传2代，此过程用mTeSR^TM1(StemCell公司)培养。 

实施例2. 

病毒载体感染骨膜细胞 

根据实施例1所述的方法，在p6孔培养板中按每孔约6×10⁴个细胞接种人的骨膜细胞，在37℃、5％CO₂的常规培养条件下培养过夜，用收集的病毒上清液感染培养的骨膜细胞。所述病毒上清液是通过用包含人Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的cDNA的反转录病毒pMX载体(Addgene公司)按常规方法转染293T细胞(Lipofectamine 2000，Invitrogen公司)获得的(参见Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002))。 

实施例3. 

感染细胞的继续培养和克隆筛选 

在感染后第2天，将感染后的骨膜细胞的培养基，替换为实施例1中所述 的人胚胎干细胞培养基，在37℃、5％CO₂的常规培养条件下培养7天，每天更换一次培养基，用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)于37℃消化为单细胞悬液，将消化后的细胞按每培养皿约10000个细胞的密度接种到100mm培养皿中，所述培养皿按实施例1中描述的方法，预先用滋养层细胞包被。接种后的细胞在37℃、5％CO₂的常规培养条件下培养14天，显微镜检可见ES样克隆(如图1所示)，其中A为骨膜细胞感染SKOM前的形态，B和B′为骨膜细胞在感染SKOM后26天在滋养层上形成典型的hES样克隆形态，B′为B图放大16倍后的形态，下同；C和C′为骨膜细胞hES样克隆挑取至新的滋养层上传代扩增仍保持很好的hES样形态，该图为传代2代后的形态，使用KSR培养基；D和D′是骨膜细胞hES样克隆在Matrigel预包被的6孔平板上生长形态，此处所用培养基为mTeSR^TM1。 

使用玻璃针分割边缘光滑，细胞核清晰，人胚胎干细胞样的单个克隆(见图1)，然后用玻璃管吸取这些分割开的克隆接种到12孔板的单个孔中，每个孔接种一个ES样克隆，一共挑取12个。所述12孔板按实施例1中描述的方法，预先用滋养层细胞包被。接种后的细胞在KSR培养基中，37℃、5％CO₂的常规培养条件下培养。 

这些挑取出的克隆具有典型的hES致密形态，在12孔板培养一周后，每孔选择部分克隆进行AP染色，结果为100％AP染色阳性(图2，未显示所有克隆)。其中，A图是骨膜细胞感染SKOM 26天后形成hES样克隆，AP染色阳性。B图是挑取hES样克隆传代扩增，培养一周后AP染色阳性；C和D分别为骨膜细胞感染SKOM 34和38天后，将100mm培养皿AP染色，计数AP阳性克隆数目为分别219个和212个，第7天时向100mm培养皿共种下10000个SKOM感染的骨膜细胞，计算诱导iPS细胞效率分别为219/10000＝2.19和212/10000＝2.12％；E和F示例计数时选择的克隆在显微镜下的形态。AP染色后，依据克隆形态及AP结果对hES样的克隆计数，我们这种方法的总体效率为大约2.2％，与传统用成纤维细胞KSR培养基培养的0.01～0.02％的效率相比超过 100倍，与角质细胞得到的效率相近。在这12个骨膜iPS克隆候选中，我们选择了6个做进一步分析。 

实施例4 

实时定量Real-Time PCR鉴定iPS中hES标志物的表达 

使用Trizol(Takara公司)试剂，按照制造商说明提取总RNA。用M-MLV(Takara公司)试剂盒进行逆转录，并使用 

Premix Ex Taq^TM试剂盒(Takara公司)，ABI 7300荧光定量PCR仪(ABI公司)进行Real-Time PCR。所有上述PCR条件均使用常规PCR条件，按照制造商说明进行。其中鉴定hES各标志物使用引物列表如表1所示，表1为鉴定hES标志物表达Real-Time PCR所用引物。 

表1 

SEQ ID NO：	引物名称  (前：因子名称)  F：正向；R反向	引物序列
			SEQ ID NO：1	HsDPPA2-F	GCCTTTTTGATGCAAGCC
SEQ ID NO：2	HsDPPA2-R	ATGGGAAAATGCAGGCAG
			SEQ ID NO：3	HsDPPA4-F1	TGGAGAAGGCAAAAGGCA
SEQ ID NO：4	HsDPPA4-R1	TGCTGATGTTCCTGGCAA
			SEQ ID NO：5	HsFGF4-F	TCTATGGCTCGCCCTTCTT
SEQ ID NO：6	HsFGF4-R	AACATGCCGGGGTACTTGT
			SEQ ID NO：7	HsGATA6-F	AACCCGTGTGCAATGCTT
SEQ ID NO：8	HsGATA6-R	TTGGAGTCATGGGAATGGA
			SEQ ID NO：9	HsleftY1-F	TTGGGGACTATGGAGCTCAG
SEQ ID NO：10	HsleftY1-R	AGTTCTCGGCCCACTTCAT
			SEQ ID NO：11	HsLIN28-F	GCGGCCAAAAGGAAAGA
SEQ ID NO：12	HsLIN28-R	AGCTTGCATTCCTTGGCA
			SEQ ID NO：13	HsNODAL-F	TCCTGTTGGGGAGGAGTTT

SEQ ID NO：14	HsNODAL-R	TTCACTGGGGCACAACAA
			SEQ ID NO：15	HsSALL4-F	AAGCAACATGGCTGCACA
SEQ ID NO：16	HsSALL4-R	TTATTGTTCGCCCCGTGT
			SEQ ID NO：17	HsTDGF1-F2	TCCTTTGGCTGTTTTGGC
SEQ ID NO：18	HsTDGF1-R2	CCGGCAACTAATCCCAGTT
			SEQ ID NO：19	HsTERT-F2	ACATTTTTCCTGCGCGTC
SEQ ID NO：20	HsTERT-R2	TCAGCTTGAGCAGGAATGC
			SEQ ID NO：21	hREX1-Fo	TCGCTGAGCTGAAACAAATG
SEQ ID NO：22	hREX1-Re	CCCTTCTTGAAGGTTTACAC
			SEQ ID NO：23	hNANOG-Fo	TGAACCTCAGCTACAAACAG
SEQ ID NO：24	hNANOG-Re	TGGTGGTAGGAAGAGTAAAG

如图3-A，B所示，使用本申请的方法获得的iPS表达与胚胎干细胞H1均表达相同的多能性因子，包括内源性的Oct4与Sox2，而这些因子在未经诱导的骨膜细胞中均没有可检测到的表达或较低表达。 

实施例5 

实时定量Real-Time PCR检测iPS中外源因子的表达水平 

所有RNA提取及Real-Time PCR操作均同实施例4.检测外源因子表达水平的Real-Time引物如表2所示。其中pMXRTFn2(SEQ ID NO：38)为位于逆转录载体上的引物，hSox2exoRTR1(SEQ ID NO：35)，hKlf4exoRTR1(SEQ IDNO：36)，hOct4exoRTR1(SEQ ID NO：34)，hcMycexoRTR1(SEQ ID NO：37)分别为位于四个外源因子SKOM上的引物。 

表2 

SEQ ID NO：	引物名称(前：因子名  称)F：正向；R反向	引物序列
			SEQ ID NO：25	hOct4exoRTR1	CCAGGTCCGAGGATCAAC
SEQ ID NO：26	hSox2exoRTR1	GGGCTGTTTTTCTGGTTG
			SEQ ID NO：27	hKlf4exoRTR1	GGAAGTCGCTTCATGTGG
SEQ ID NO：28	hcMycexoRTR1	CCTCGTCGCAGTAGAAATAC
			SEQ ID NO：29	pMXRTFn2	GGGTGGACCATCCTCTAGAC

结果如图3-C所示。由图3-C可见，所选的6个iPS克隆在内源因子被激活之后，外源因子基本沉默，其中iPS-4，5，6接近完全沉默。 

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。 

序列表 

<120>一种可高效诱导产生诱导多能干细胞(iPS)的细胞类型及其制备方法和应用 

<160>29 

<170>PatentIn version 3.2 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>HsDPPA2-F 

<400>1 

gcctttttga tgcaagcc    18 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>HsDPPA2-R 

<400>2 

atgggaaaat gcaggcag    18 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>HsDPPA4-F1 

<400>3 

tggagaaggc aaaaggca    18 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>HsDPPA4-R1 

<400>4 

tgctgatgtt cctggcaa     18 

<210>1 

<211>19 

<212>DNA 

<213>HsFGF4-F 

<400>5 

tctatggctc gcccttctt    19 

<210>1 

<211>19 

<212>DNA 

<213>HsFGF4-R 

<400>6 

aacatgccgg ggtacttgt    19 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>HsGATA6-F 

<400>7 

aacccgtgtg caatgctt     18 

<210>1 

<211>19 

<212>DNA 

<213>HsGATA6-R 

<400>8 

ttggagtcat gggaatgga    19 

<210>1 

<211>20 

<212>DNA 

<213>HsLEFTY1-F 

<400>9 

ttggggacta tggagctcag   20 

<210>1 

<211>19 

<212>DNA 

<213>HsLEFTY1-R 

<400>10 

agttctcggc ccacttcat    19 

<210>1 

<211>17 

<212>DNA 

<213>HsLIN28-F 

<400>11 

gcggccaaaa ggaaaga      17 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>HsLIN28-R 

<400>12 

agcttgcatt ccttggca     18 

<210>1 

<211>19 

<212>DNA 

<213>HsNODAL-F 

<400>13 

tcctgttggg gaggagttt   19 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>HsNODAL-R 

<400>14 

ttcactgggg cacaacaa    18 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>HsSALL4-F 

<400>15 

aagcaacatg gctgcaca    18 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>HsSALL4-R 

<400>16 

ttattgttcg ccccgtgt    18 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>HsTDGF1-F2 

<400>17 

tcctttggct gttttggc     18 

<210>1 

<211>19 

<212>DNA 

<213>HsTDGF1-R2 

<400>18 

ccggcaacta atcccagtt    19 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>HsTERT-F2 

<400>19 

acatttttcc tgcgcgtc     18 

<210>1 

<211>19 

<212>DNA 

<213>HsTERT-R2 

<400>20 

tcagcttgag caggaatgc    19 

<210>1 

<211>20 

<212>DNA 

<213>hREX1-Fo 

<400>21 

tcgctgagct gaaacaaatg    20 

<210>1 

<211> 

<212>DNA 

<213>hREX1-Re 

<400>22 

cccttcttga aggtttacac    20 

<210>1 

<211>20 

<212>DNA 

<213>hNANOG-Fo 

<400>23 

tgaacctcag ctacaaacag    20 

<210>1 

<211>20 

<212>DNA 

<213>hNANOG-Re 

<400>24 

tggtggtagg aagagtaaag    20 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>hOct4exoRTR1 

<400>25 

ccaggtccga ggatcaac      18 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>hSox2exoRTR1 

<400>26 

gggctgtttt tctggttg      18 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>hKlf4exoRTR1 

<400>27 

ggaagtcgct tcatgtgg      18 

<210>1 

<211>20 

<212>DNA 

<213>hcMycexoRTR1 

<400>28 

cctcgtcgca gtagaaatac    20 

<210>1 

<211>20 

<212>DNA 

<213>pMXRTFn2 

<400>29 

gggtggacca tcctctagac    20 

Claims (10)

1.一种可高效诱导产生诱导多能干细胞(iPS)的诱导重编程方法，其特征在于，所述方法为将骨膜细胞诱导为多能干细胞。

2.根据权利要求1所述的诱导重编程方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)将包含多能性干细胞因子的cDNA导入骨膜细胞；

(b)在适宜步骤(a)中所述的骨膜细胞生长的培养基上进行骨膜细胞培养；所述多能性干细胞因子包括Sox2、Oct4和Klf4。

3.如权利要求2所述的诱导重编程方法，其特征在于，还包括如下步骤：

(c)初步鉴定多能性干细胞克隆。

4.如权利要求2所述的诱导重编程方法，其特征在于，所述步骤(a)中的cDNA通过病毒载体导入所述骨膜细胞。

5.如权利要求4所述的诱导重编程方法，其特征在于，所述病毒载体为逆转录病毒载体。

6.如权利要求5所述的诱导重编程方法，其特征在于，所述逆转录病毒载体为pMX。

7.如权利要求2所述的诱导重编程方法，其特征在于，所述多能性干细胞因子还包括c-Myc、L-Myc或N-Myc中的任一种。

8.如权利要求2所述的诱导重编程方法，其特征在于，所述步骤(a)中的多能性干细胞因子为Sox2、Oct4、Klf4和c-Myc。

9.如权利要求2所述的诱导重编程方法，其特征在于，所述骨膜细胞为哺乳动物骨膜细胞。

10.如权利要求2所述的诱导重编程方法，其特征在于，所述骨膜细胞为人骨膜细胞。

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