CN101952292A - 人磷脂酰肌醇3-激酶δ的抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抑制PI3Kδ活性的化合物,包括选择性抑制PI3Kδ活性的化合物。还公开了抑制磷脂酰肌醇3-激酶δ亚型(PI3Kδ)活性的方法,以及使用所述化合物治疗涉及PI3Kδ在白细胞功能中行使作用的疾病(例如免疫和炎症的失调)的方法。
Description
技术领域
本发明涉及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K),并且更特别地涉及PI3Kδ活性的选择性抑制剂,以及涉及使用此种抑制剂的方法。
背景技术
在多种细胞过程中均涉及经3’-磷酸化的磷酸肌醇的细胞信号,例如恶性转化(malignant transformation)、生长因子信号、炎症和免疫(见Rameh etal.,J.Biol Chem,274:8347-8350(1999))。负责产生这些磷酸化信号产物的酶是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-激酶;PI3K)。最初,PI3K被鉴定具有与病毒癌基因蛋白相关的活性和与生长因子受体酪氨酸激酶相关的活性,所述生长因子受体酪氨酸激酶能够使肌醇环的3’-羟基端的磷脂酰肌醇(PI)和它的磷酸化衍生物磷酸化(Panayotou et al.,Trends Cell Biol 2:358-60(1992))。
以多种拮抗剂处理细胞,可以增加PI3-激酶激活的初级产物(磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3))的水平。因此,认为PI3-激酶的激活涉及一系列细胞响应,包括细胞生长、分化和凋亡(Parker et al.,Current Biology,5:577-99(1995);Yao et al.,Science,267:2003-05(1995))。尽管在PI3-激酶被激活后产生的磷酸化的脂类的下游靶点不是很清楚,但是逐步显现的证据表明,当结合多种磷脂酰脂类时,含有普列克底物蛋白(pleckstrin)同源结构域和FYVE指蛋白结构域的蛋白质被激活(Sternmark et al.,J Cell Sci,112:4115-83(1999);Lemmon et al.,Trends Cell Biol,7:237-42(1997))。在体外,PIP3可以直接激活蛋白激酶C(PKC)的某些亚型(isoforms),并且PI3-激酶可以激活PKC相关的蛋白激酶PKB(Burgering et al.,Nature,376:599-602(1995))。
目前,PI3-激酶家族基于它们的底物特异性而分为三类。I类PI3Ks可以磷酸化:磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇-4-磷酸和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸,以分别产生磷脂酰肌醇-3-磷酸(PIP)、磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸。II类PI3Ks可以磷酸化:PI和磷脂酰肌醇-4-磷酸,而III类PI3Ks只可以磷酸化PI。
PI3-激酶的最初纯化和分子克隆,揭示该酶为含有p85和p110亚基的异源二聚体(Otsu et al.,Cell,65:91-104(1991);Hiles et al.,Cell,70:419-29(1992))。其后,鉴定出4个不同的I类PI3Ks,命名为PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ和PI3Kγ,它们中的每一种由不同的110kDa的催化亚基和调节亚基组成。更具体地,三种催化亚基(即p110α、p110β和p110γ)各自与相同的调节亚基p85相互作用;而p110γ与不同的调节亚基p101相互作用。如下所述,这些PI3Ks在人类细胞和组织中各自的表达模式也是不同的。尽管在通常的PI3-激酶的细胞功能方面累积了很多信息,但是个别亚型所起的作用仍然是未知的。
牛的p110α的克隆已有描述。该蛋白被鉴定与啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)蛋白Vps34p相关,Vps34p是在空泡(vacuolar)蛋白质加工中涉及到的一种蛋白质。重组的p110α产物也显示与p85α相结合,以在转染的COS-1细胞中产生PI3K活性。见Hiles等的“细胞”70,419-29(1992)。
在Hu等的“分子细胞生物学”13:7677-88(1993)中,描述了第二种的人p110亚型(命名为p110β)的克隆。该亚型在细胞中与p85相结合,并广泛表达,在许多人类和小鼠组织中发现了p110β的mRNA,而且在人类脐静脉内皮细胞、Jurkat人白血病T细胞、人胚肾293细胞、小鼠3T3成纤维细胞、HeLa细胞和大鼠膀胱癌NBT2细胞中也发现有p110β的mRNA。这样广泛的表达提示出所述p110β亚型在信号通路中的广泛重要性。
在Chantry等的“生物化学”(Biol Chem,272:19236-41(1997))中,描述了PI3-激酶的p110δ亚型的鉴定。可以观察到人p110δ亚型以组织受限的方式表达。它在淋巴细胞和淋巴组织中以高水平表达,证明该蛋白可能在免疫***中PI3-激酶介导的信号中发挥作用。关于p110δ亚型的详细内容还可以在美国专利Nos.5,858,753、5,822,910和5,985,589中找到,它们均在此引用作为参考。也可参见Vanhaesebroeck等的“美国科学院院刊”(Proc NatlAcad Sci USA,94:4330-5(1997))和国际申请No WO 97/46688。
在PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ各亚型中,p85亚基的作用是通过它的SH2结构域与靶蛋白的磷酸化的酪氨酸残基(存在于合适的序列中)之间的相互作用而使PI3-激酶定位在细胞质膜上。(Rameh et al.,Cell,53:821-30(1995))。已经鉴定了两个p85亚型,p85α是广泛表达的,而p85β主要在脑和淋巴组织中发现(Volinia et al.,Oncogene,7:789-93(1992))。p85亚基与PI3-激酶p110α、p110β或p110δ催化亚基之间的结合,对于这些酶的催化活性和稳定性是必需的。另外,Ras蛋白的结合也上调PI3-激酶的活性。
p110γ的克隆揭示了PI3K酶家族内部进一步的复杂性。(Stoyanov et al.,Science,269:690-93(1995))。p110γ亚型与p110α和p110β密切相关(在催化结构域中的同一性为45-48%),但是它并不适用p85作为靶向亚基。事实上,p110γ在它的氨基末端附近含有另外的结构域,该结构域被称为“普列克底物蛋白同源结构域”。该结构域允许p110γ与异源三聚体G蛋白的βγ亚基相互作用,此种相互作用可以调节p110γ的活性。
PI3Kγ的p101调节亚基最初在猪中被克隆,随后鉴定了人类的直系同源物(Krugmann et al.,J Biol Chem,274:17152-8(1999))。p101的N末端区域与p110γ的N末端区域之间的相互作用,对于上述通过Gβγ的PI3Kγ激活作用非常关键。
在国际申请No.WO 96/25488中描述了组成型激活的PI3K多肽。该申请公开了一种嵌合融合蛋白的制备,其中,已知为中间-SH2(iSH2)区域的p85的102个残基的片段通过连接区域与小鼠p110的N末端融合。显然,P85 iSH2结构域能够以与完整p85相似的方式,激活PI3K的活性(Klippel etal.,MoI Cell Biol,74:2675-85(1994))。
由此,PI3-激酶可以由它们的氨基酸同一性或它们的活性来定义。这个正在增长的基因家族的其它成员包括相关性较远的脂类和蛋白激酶,包括啤酒酵母的(Saccharomyces cerevisiae)Vps34 TOR1、TOR2(和它们的哺乳动物同系物,例如FRAP和mTOR)、共济失调毛细血管扩张症(the ataxiatelangiectasia)基因产物(ATR)和DNA依赖的蛋白激酶的催化亚基(DNA-PK)。通常见Hunter,的“细胞”(Cell,83:1-4(1995))。
PI3-激酶还涉及到白细胞激活的多个方面。已显示,结合p85的PI3-激酶的活性,在物理上与CD28的细胞质结构域相关,CD28是激活T细胞响应抗原的重要共刺激分子(Pages et al.,Nature,369:327-29(1994);Rudd,Immunity,4:527-34(1996))。通过CD28激活T细胞可以降低由抗原激活的阈值,并增加增殖响应的大小和持续时间。这些作用与许多基因转录的增加有关,所述基因包括一种重要的T细胞生长因子-白细胞介素-2(IL2)(Fraseret al.,Science,257:313-16(1991))。不再与PI3-激酶相互作用的CD28突变体会导致不能起始IL2的产生,提示了PI3-激酶在T细胞激活中的关键作用。
对酶家族的个别成员的特异性抑制剂,为破译各种酶的功能提供了宝贵的工具。两种化合物(LY294002和渥曼青霉素(wortmannin))已经被广泛用作PI3-激酶的抑制剂。然而,这些化合物并非特异性的PI3K抑制剂,因为它们不能区别I类PI3-激酶的4个成员。例如,渥曼青霉素对多种I类PI3-激酶的IC50的范围在1-10nM。同样地,LY294002对这些PI3-激酶的IC50约为1μM(Fruman et al.,Ann Rev Biochem,67:481-507(1998))因此,这些化合物在研究个别I类PI3-激酶的作用中的应用是有限的。
基于使用渥曼青霉素的研究,存在证据证明PI3-激酶功能对于通过G-蛋白偶联受体的白细胞信号的一些方面也是必需的(Thelen et al.,Proc NatlAcad Sci USA,91:4960-64(1994))。而且,已有显示渥曼青霉素和LY294002可以阻断嗜中性粒细胞的迁移和过氧化物的释放。然而,因为这些化合物不能区分PI3K的多个亚型,因此在这些现象中涉及到哪一个或哪几个PI3K亚型仍然不清楚。
最近的出版物证明了已知PI3Kδ的选择性抑制剂,并且它们能够治疗某些类型的失调。例如在美国专利Nos.6,518,277、6,667,300、6,949,535和6,800,620中,以及在公布的美国专利申请US 2006/0106038和PCT申请WO2005/113554、WO 2005/112935和WO 2005/113556中公开了PI3Kδ的选择性抑制剂。
WO 2005/112935公开了一种PI3Kδ的选择性抑制剂,并指出它可以用于治疗实体瘤(例如癌瘤和肉瘤)、以及包括血管***或淋巴网***在内的癌症、淋巴癌和血液学癌症(例如骨髓瘤和白血病)。证明了该PI3Kδ的选择性抑制剂可以显著地降低肿瘤的生长速率和血管形成,而且当结合放射治疗时,所述PI3Kδ的选择性抑制剂在降低肿瘤血管发育有明显的协同作用。因此,本发明的化合物可以用于通过抑制血管生成来***,并且它们可以与其它肿瘤治疗结合使用,以提供协同作用。
Puri的“通用酶抑制剂”(Current Enz.Inhibition,2,147-61(2006))公开了通过一种选择性PI3Kδ抑制剂,可以抑制急性髓系白血病细胞的增殖,而不会影响正常造血细胞的增殖。也描述了此种抑制剂在高血压的动物模型中是有效的。
Lee等的“美国实验生物学联合会会刊”(FASEB J.20,455-65(2006))描述了在小鼠哮喘模型中,抑制PI3Kδ会削弱过敏性呼吸道炎症和高反应(hyperrosponsiveness),证明PI3Kδ的选择性抑制剂可以用于治疗哮喘和过敏反应以及免疫失调。Billottet等的“致癌基因(Oncogene 1-12(2006))报道了一种小分子PI3Kδ抑制剂可以在急性髓性白血病(AML)培养物中抑制细胞增殖,并能增强一种广泛用于AML的化疗试剂VP16对AML细胞的细胞毒性作用。因此,证明了选择性PI3Kδ抑制剂可以用于治疗造血癌症,并可与其它治疗试剂协同作用。
尽管已知了一些选择性PI3Kδ抑制剂,但是仍然需要额外的治疗试剂以用于治疗增殖性失调(例如癌症)和过度或破坏性的免疫反应(例如哮喘、风湿性关节炎、多发性硬化和狼疮)。本发明提供了作为PI3Kδ抑制剂的新的化合物,该化合物对δ亚型具有高度选择性,并且对其它PI3K亚型的活性较低。这些化合物可以用于治疗与过度活性、造血细胞(尤其是淋巴细胞和白细胞)的积聚或产生相关的失调,所述失调包括淋巴瘤、白血病和过度免疫应答失调。
发明内容
本发明的一个方面提供了可以抑制人PI3Kδ的生物学活性的化合物。本发明的另一方面提供了与其它PI3K亚型相比,可以选择性抑制PI3Kδ的化合物,和提供了具有良好的生物利用度的化合物。本发明的另一方面还提供了选择性调控人PI3Kδ活性的方法,并由此促进由PI3Kδ功能或功能紊乱而介导的疾病的医学治疗。本发明的另一方面更提供了表征人PI3Kδ功能的方法。
本发明的另一方面提供了破坏白细胞功能的方法,该方法包括使白细胞与在所述白细胞中选择性抑制磷脂酰肌醇3-激酶δ(PI3Kδ)活性的化合物相接触。所述白细胞可以包括选自由嗜中性粒细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和嗜碱细胞所组成的组中的细胞。
例如,在所述白细胞包括嗜中性粒细胞的情况中,所述方法包括破坏至少一种嗜中性粒细胞的功能,所述功能选自由刺激的过氧化物释放、刺激的胞外分泌和趋化性迁移所组成的组中。优选地,所述方法不能实质上破坏所述嗜中性粒细胞的细菌吞噬作用或杀细菌作用。在所述白细胞包括B淋巴细胞的情况中,所述方法包括破坏所述B淋巴细胞的增殖或破坏所述B淋巴细胞产生抗体。在所述白细胞包括T淋巴细胞的情况中,所述方法包括破坏所述T淋巴细胞的增殖。在所述白细胞包括嗜碱细胞的情况中,所述方法包括破坏所述嗜碱细胞的组胺释放。
在本发明的方法中,优选所述PI3Kδ抑制剂是选择性的。优选在生化分析中,相对于其它I类PI3K的亚型,所述PI3Kδ抑制剂对PI3Kδ的抑制有至少约10倍的选择性。优选地,在生化分析中,相对于其它I类PI3K的亚型,所述化合物对PI3Kδ的抑制有至少约20倍的选择性,和更优选30倍选择性。在几个实施方式中,在生化分析中,相对于PI3Kα,所述化合物对PI3Kδ的抑制有至少约50倍的选择性。
本发明的化合物具有式(I)所示的结构,该化合物或者它们的药学上可接受的盐、药物前体、溶剂化物(例如水合物)能够抑制PI3Kδ的活性:
其中,U、V、W和Z各自独立地选自由CRa、N、NRb和O所组成的组中,
或者,U、V、W和Z中的至少一个为N,且U、V、W和Z中的其他几个选自由CRa、NRb、S和O所组成的组中,
并且,U、V、W和Z中的至少一个不是CRa,而且不是全部的U、V、W和Z均不是CRa;
A为任选取代的单环或者双环的环***,该环***含有至少两个氮原子作为环上成员,并且该***中的至少一个环是芳香族的;
X选自由C(Rc)2、C(Rc)2C(Rc)2、CH2CHRc、CHRcCHRc、CHRcCH2、CH=C(Rc)、C(Rc)=C(Rc)和C(Rc)=CH所组成的组中;
Y不存在(即,Y为键),或者Y选自由S、SO、SO2、NH、N(Rc)、O、C(=O)、OC(=O)、C(=O)O和NHC(=O)CH2S所组成的组中;
R1选自由H、取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10烯基、取代的或未取代的C2-10炔基、取代的或未取代的C1-6全氟烃基、取代的或未取代的C3-8环烷基、取代的或未取代的C3-8杂环烷基、取代的或未取代的C1-4亚烷基C3-8环烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的芳基C1-4亚烷基ORe、取代的或未取代的杂芳基C1-4亚烃基N(Rd)2、取代的或未取代的杂芳基C1-4亚烷基ORe、取代的或未取代的C1-3亚烷基杂芳基、取代的或未取代的C1-3亚烷基芳基、取代的或未取代的芳基C1-6烷基、芳基C1-4亚烷基N(Rd)2、C1-4亚烷基C(=O)C1-4亚烷基芳基、C1-4亚烷基C(=O)C1-4亚烷基杂芳基、C1-4亚烷基C(=O)杂芳基、C1-4亚烷基C(=O)N(Rd)2、C1-6亚烷基ORd、C1-4亚烷基NRaC(=O)Rd、C1-4亚烷基OC1-4亚烷基ORd、C1-4亚烷基N(Rd)2、C1-4亚烷基C(=O)ORd和C1-4亚烷基OC1-4亚烷基C(=O)ORd所组成的组中;
Ra独立地选自由H、取代的或未取代的C1-6烷基、取代的或未取代的C3-8环烷基、取代的或未取代的C3-8杂环烷基、取代的或未取代的芳基、C1-3亚烷基芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基C1-3烷基、取代的或未取代的C1-3亚烷基杂芳基、卤素、NHC(=O)C1-3亚烷基N(Rd)2、NO2、ORe、CF3、OCF3、N(Rd)2、CN、OC(=O)Rd、C(=O)Rd、C(=O)ORd、芳基ORe、NRdC(=O)C1-3亚烷基C(=O)ORd、芳基OC1-3亚烷基N(Rd)2、芳基OC(=O)Rd、C1-4亚烷基C(=O)ORd、OC1-4亚烷基C(=O)ORd、C1-4亚烷基OC1-4亚烷基C(=O)ORd、C(=O)NRdSO2Rd、C1-4亚烷基N(Rd)2、C2-6亚烷基N(Rd)2、C(=O)NRdC1-4亚烷基ORe、C(=O)NRdC1-4亚烷基杂芳基、OC1-4亚烷基N(Rd)2、OC1-4亚烷基CH(ORe)CH2N(Rd)2、OC1-4亚烷基杂芳基、OC2-4亚烷基ORe、OC2-4亚烷基NRdC(=O)ORd、NRaC1-4亚烷基N(Rd)2、NRaC(=O)Rd、NRaC(=O)N(Rd)2、N(SO2C1-4烷基)2、NRa(SO2C1-4烷基)、SO2N(Rd)2、OSO2CF3、C1-3亚烷基芳基、C1-4亚烷基杂芳基、C1-6亚烷基ORe、C(=O)N(Rd)2、NHC(=O)C1-3亚烷基芳基、芳基OC1-3亚烷基N(Rd)2、芳基OC(=O)Rd、NHC(=O)C1-3亚烷基C3-8杂环烷基、NHC(=O)C1-3亚烷基杂芳基、OC1-4亚烷基OC1-4亚烷基C(=O)ORd、C(=O)C1-4亚烷基杂芳基和NHC(=O)卤素C1-6烷基所组成的组中;
Rb不存在,或者Rb选自由H、取代的或未取代的C1-6烷基、取代的或未取代的C3-8环烷基、取代的或未取代的C3-8杂环烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基C1-3烷基、C1-3亚烷基芳基、取代的或未取代的杂芳基、杂芳基C1-3烷基、取代的或未取代的C1-3亚烷基杂芳基、C(=O)Rd、C(=O)ORd、芳基ORe、芳基OC1-3亚烷基N(Rd)2、芳基OC(=O)Rd、C1-4亚烷基C(=O)ORd、C1-4亚烷基OC1-4亚烷基C(=O)ORd、C(=O)NRdSO2Rd、C1-4亚烷基N(Rd)2、C2-6亚烷基N(Rd)2、C(=O)NRdC1-4亚烷基ORe、C(=O)NRdC1-4亚烷基杂芳基、SO2N(Rd)2、C1-3亚烷基芳基、C1-4亚烷基杂芳基、C1-6亚烷基ORe、C1-3亚烷基N(Rd)2、C(=O)N(Rd)2、芳基OC1-3亚烷基N(Rd)2、芳基OC(=O)Rd和C(=O)C1-4亚烷基杂芳基所组成的组中;
Rc独立地选自由H、取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C3-8环烷基、取代的或未取代的C3-8杂环烷基、取代的或未取代的C1-4亚烷基N(Rd)2、取代的或未取代的C1-3亚烷基杂C1-3烷基、取代的或未取代的芳基杂C1-3烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的芳基C1-3烷基、取代的或未取代的杂芳基C1-3烷基、C1-3亚烷基芳基、取代的或未取代的C1-3亚烷基杂芳基、C(=O)Rd和C(=O)ORd所组成的组中;
或者在相同原子上或邻近连接的原子上的两个Rc可以环化,以形成具有3-8个环上成员的环,该环可以是任选取代的,并且可以包括选自NRd、O和S中的最多两个杂原子作为环上成员;
Rd选自由H、取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10烯基、取代的或未取代的C2-10炔基、取代的或未取代的C3-8环烷基、取代的或未取代的C3-8杂环烷基、取代的或未取代的C1-3亚烷基N(Re)2、芳基、取代的或未取代的芳基C1-3烷基、取代的或未取代的C1-3亚烷基芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基C1-3烷基和取代的或未取代C1-3亚烷基杂芳基所组成的组中;
或者两个Rd基团与跟它们连接的氮原子一起形成5元环或6元环,该5元环或6元环任选地含有第二个杂原子,该第二个杂原子为N、O或S;
Re选自由H、取代的或未取代的C1-6烷基、取代的或未取代的C3-8环烷基、取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基所组成的组中,
或者两个Re基团与跟它们连接的氮原子一起形成5元环或6元环,该5元环或6元环任选地含有第二个杂原子,该第二个杂原子为N、O或S;
所述A、R1、Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为任选地被1-3个取代基所取代,所述取代基选自由C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-8环烷基、C3-8杂环烷基、C1-6亚烷基ORe、C1-4亚烷基N(Re)2、芳基、C1-3亚烷基芳基、杂芳基、C(=O)ORe、C(=O)Re、OC(=O)Re、卤素、CN、CF3、NO2、N(Re)2、ORe、OC1-6全氟烃基、OC(=O)N(Re)2、C(=O)N(Re)2、SRe、SO2Re、SO3Re、氧代(=O)和CHO所组成的组中;以及
n为0或1。
本发明的另一方面提供了治疗由嗜中性粒细胞介导的病情的方法,该方法包括向哺乳动物按需施用治疗上有效量的化合物,该化合物可以在所述嗜中性粒细胞中选择性地抑制磷脂酰肌醇3-激酶δ(PI3Kδ)的活性。可以根据本发明的方法治疗的示例性病情包括那些特征为不需要的嗜中性粒细胞功能的情况,所述嗜中性粒细胞功能选自由刺激的过氧化物释放、刺激的胞外分泌和趋化性迁移所组成的组中。优选地,根据所述方法,所述嗜中性粒细胞的吞噬细胞活性或杀细菌活性基本上未被抑制。
本发明的另一个方面还提供了破坏破骨细胞功能的方法,该方法包括将破骨细胞与在所述破骨细胞中选择性抑制PI3Kδ活性的化合物相接触。根据所述方法,所述化合物包括优选结合到骨上的部分。
本发明的另一方面提供了在哺乳动物中按需改进骨再吸收失调的方法,该方法包括向所述哺乳动物施用治疗上有效量的化合物,该化合物能在所述哺乳动物的破骨细胞中抑制PI3Kδ活性。可以根据所述方法治疗的骨再吸收失调优选为骨质疏松症。
本发明的另一方面提供了在哺乳动物中按需改进过度或不希望的免疫应答的方法,该方法包括向所述哺乳动物施用治疗上有效量的化合物,该化合物能在所述哺乳动物的破骨细胞中抑制PI3Kδ活性。使用式(I)的化合物治疗的过度或不希望的免疫应答的实例包括(但不限于):哮喘、风湿性关节炎、红斑狼疮和多发性硬化。其它此类失调包括:例如自身免疫性甲状腺炎、多发性硬化、某些形式的糖尿病和雷诺氏综合症的失调;移植抗拒性失调,例如GVHD和同种异体移植抗拒;慢性肾小球肾炎;炎症性肠病,例如慢性炎症性肠病(CIBD)、克罗恩氏病、溃疡大肠炎和坏死性小肠结肠炎;炎症性皮肤病,例如接触性皮炎、遗传过敏性皮炎、牛皮癣或风疹;由感染引起的发热和肌肉痛。
本发明的另一方面还提供了抑制造血起源的癌细胞的生长或增殖的方法,该方法包括使所述癌细胞与能在所述癌细胞中选择性抑制PI3Kδ活性的化合物相接触。所述方法可以有利地抑制选自由淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病所组成的组中的癌的生长或增殖。
本发明的另一方面提供抑制PI3Kδ多肽的激酶活性的方法,该方法包括使所述PI3Kδ多肽与具有结构式(I)的化合物相接触。
本发明的另一方面还提供了破坏白细胞功能的方法,该方法包括使白细胞与具有结构式(I)的化合物相接触。
本发明的另一方面提供了在生化分析和基于细胞的分析中能抑制PI3Kδ活性的具有结构式(I)的化合物,以及呈现了在治疗具有过度或不需要的PI3Kδ活性的病情中的治疗优势。
本发明的这些和其它方面和优势将通过下面对选择性实施方式的详细描述而清楚地显示出来,所述选择性实施方式用于增进对本发明的理解,而不限制本发明的范围。
具体实施方式
本发明提供了选择性抑制PI3Kδ活性的化合物。本发明还提供抑制PI3Kδ活性的方法,包括在细胞中选择性调控PI3Kδ同功酶活性的方法,所述细胞尤其是白细胞、破骨细胞和癌细胞。所述方法包括体外(in vitro)、体内(in vivo)和活体外(ex vivo)的应用。
特别有益的方法是在临床上选择性调控PI3Kδ的活性,以改善由PI3Kδ活性介导的疾病或失调。因此,以过度或不适当的PI3Kδ活性为特征的疾病或失调可以通过施用PI3Kδ的选择性调控剂来治疗。
而且,本发明提供含有选择性PI3Kδ抑制剂的药物组合物。还提供产品目录,包括选择性PI3Kδ的抑制剂化合物(或含有该化合物的药物组合物)和使用所述化合物的说明书。本发明的其它方法包括所述同功酶的生理作用的进一步表征。
本发明描述的方法受益于使用在细胞中可以选择性抑制(优选特异性抑制)PI3Kδ活性的化合物,所述细胞包括体外(in vitro)细胞、体内(in vivo)细胞、或活体外(ex vivo)细胞。以本发明的方法处理的细胞包括:表达内源PI3Kδ的细胞,其中,内源表示在不向细胞中重组引入一种或多种编码PI3Kδ多肽或其生物学活性片段的多核苷酸的情况下,所述细胞能表达PI3Kδ。本发明还包括所述表达内源PI3Kδ的细胞的应用,其中,使用重组方法,向所述细胞中引入一种或多种编码PI3Kδ或其生物学活性片段的多核苷酸。
所述细胞可以是体内的,即在活的物体中,例如哺乳动物(包括人类),其中,在所述物体中,可以以治疗目的使用PI3Kδ的抑制剂,来抑制PI3Kδ的活性。可选择地,所述细胞可以作为独立的细胞分离出来或者处于组织中,例如活体外(ex vivo)或体外(in vitro)方法。本发明的体外方法包括使PI3Kδ酶或其生物活性片段与本发明的抑制剂化合物相接触的步骤。所述PI3Kδ酶包括纯化的酶和分离的酶,其中,该酶从天然来源分离(例如不通过重组技术修饰而在正常情况下表达PI3Kδ多肽的细胞或组织),或者该酶从通过重组技术修饰以表达外源酶的细胞中分离。
此处所用的术语“选择性PI3Kδ抑制剂”指对PI3Kδ同功酶的抑制比对PI3K家族的其它同功酶的抑制更有效的化合物。“选择性PI3Kδ抑制剂”化合物应理解为与常规和一般设计的PI3K抑制剂(例如渥曼青霉素或LY294002)相比,对PI3Kδ更有选择性。伴随地,认为渥曼青霉素和LY294002是“非选择性PI3K抑制剂”。而且,本发明的化合物选择性地负调控PI3Kδ的表达或活性,并具有可接受的药理学性质以用于本发明的治疗方法。
通过确定化合物将活性抑制到预先确定的程度时的所述化合物的浓度,可以建立化合物作为酶活性(或其它生物学活性)抑制剂的相对效能,然后比较结果。通常,优选测定在生化分析中抑制50%活性的浓度,即50%抑制浓度或“IC50”。可以使用本领域已知的常规技术来测定IC50。通常,可以通过测量研究中存在一系列浓度的抑制剂时给定酶的活性,来测定IC50。然后以实验获得的酶活性值对使用的抑制剂浓度作图。显示50%酶活性(与未加任何抑制剂的活性相比)的抑制剂浓度即为IC50值。类似地,可以通过适当的活性测定来定义其它抑制浓度。例如,在某些情况中,需要建立90%抑制浓度,即IC90。
本发明的化合物对PI3Kδ展现的IC50值约为10μM或更少。在几个实施方式中,所述化合物对PI3Kδ的IC50值小于5μM。在其它实施方式中,所述化合物对PI3Kδ的IC50值小于1μM,例如低至1nm。
相应地,“选择性PI3Kδ抑制剂”可选择地理解为指对PI3Kδ的50%抑制浓度(IC50)比对任意或所有其它I类PI3K家族成员的IC50值低至少10倍、优选至少20倍、和更优选至少30倍的化合物。术语“特异性PI3Kδ抑制剂”可以理解为指对PI3Kδ的IC50值比对任意或所有其它I类PI3K家族成员的IC50值低至少50倍、优选至少100倍、更优选至少200倍、以及更优选至少500倍的选择性PI3Kδ抑制剂化合物。
因此,最优选本发明的化合物对PI3Kδ具有低的IC50值(即为有效地抑制剂),并且与其它PI3K亚型相比,本发明的化合物选择性地抑制PI3Kδ。
在一个实施方式中,本发明提供了抑制白细胞功能的方法。更具体地,本发明提供抑制或阻抑嗜中性粒细胞以及T淋巴细胞和B淋巴细胞的功能的方法。对于嗜中性粒细胞,出乎意料地发现抑制PI3Kδ活性,会阻抑嗜中性粒细胞的功能。例如,观察到本发明的化合物能够抑制典型的嗜中性粒细胞的功能,例如刺激的过氧化物释放、刺激的胞外分泌、以及趋化性迁移。然而,还观察到本发明的方法可以消除嗜中性粒细胞的特定功能,而基本不影响这些细胞的其它功能。例如,观察到本发明的选择性PI3Kδ抑制剂化合物基本上不抑制嗜中性粒细胞的细菌吞噬作用。
因此,本发明包括抑制嗜中性粒细胞的功能而基本不抑制细菌吞噬作用的方法。根据本发明的方法适合抑制的嗜中性粒细胞的功能包括:各种由PI3Kδ活性或表达介导的功能。此类功能包括(但不限于):刺激的过氧化物释放、刺激的胞外分泌或细胞脱粒、趋化性迁移、对血管内皮的粘附(例如嗜中性粒细胞的束缚/旋转、嗜中性粒细胞活性的触发、和/或嗜中性粒细胞对内皮的闭锁(latching))、透壁血球渗出、或通过内皮移出到外周组织。通常,由于这些功能典型地涉及嗜中性粒细胞对炎症的响应,因此这些功能可以共同地称为“炎症功能”。所述嗜中性粒细胞的炎症功能可以与这些细胞呈现的杀细菌功能(例如吞噬作用和杀细菌)区分开来。相应地,本发明还包括治疗疾病状态的方法,在所述疾病状态中,嗜中性粒细胞的一种或多种炎症功能是异常的或不需要的。
进一步,PI3Kδ在刺激淋巴细胞(包括B细胞和T细胞)增殖中起作用。而且,PI3Kδ能够在由B细胞刺激的抗体分泌中起作用。使用本发明的选择性PI3Kδ抑制剂化合物,发现这些现象可以通过抑制PI3Kδ而被消除。因此,本发明包括抑制淋巴细胞增殖的方法,以及抑制通过B淋巴细胞的抗体的产生。本发明的其它方法包括治疗疾病状态的方法,在所述疾病状态中,这些淋巴细胞功能的一种或几种是异常的或不需要的。
目前已经确定可以选择性地或特异性地抑制PI3Kδ活性,以促进对PI3Kδ介导的疾病的治疗,而减少或消除典型与其它I类PI3-激酶活性的伴随抑制相关联的并发症。为了说明本实施方式,使用一类能选择性抑制PI3Kδ(相对于其它PI3K亚型)的化合物的成员来实施本发明的方法。
可以使用具有通用结构式(I)的化合物来实施本发明的方法。优选的方法使用已测定对PI3Kδ比对其它PI3K亚型具有至少10倍的选择性抑制的化合物。
例如,可以使用以下化合物和它们的混合物来实施所述方法:
6-[1-(6-氨基-嘌呤-9-基)-乙基]-3-溴-1-甲基-5-苯基-1,5-二氢-吡唑[3,4-d]嘧啶-4-酮;
3-溴-1-甲基-5-苯基-6-[(1-(9H-嘌呤-6-基硫烷基)-乙基]-1,5-二氢-吡唑[3,4-d]嘧啶-4-酮;
3-甲基-5-苯基-6-(9H-嘌呤-6-基硫甲基)-5H-异噁唑[5,4-d]嘧啶-4-酮;
6-(6-氨基-嘌呤-6-基甲基)-3-甲基-5-苯基-5H-异噁唑[5,4-d]嘧啶-4-酮;
2-[1-(4-氨基-苯并咪唑-1-基)-乙基]-3-苯基-3H-吡啶[3,2-d]嘧啶-4-酮;
3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-吡啶[3,2-d]-嘧啶-4-酮。
对于具有不对称中心的结构式(I)的化合物,可以使用所述化合物的外消旋混合物或特异对映体来实践本发明的方法。当X代表手性中心(例如CHRc)而Rc不是H时,优选S对映体。
可以使用一类呈现PI3Kδ抑制活性的化合物的成员来实施本发明的方法,由此在由PI3Kδ介导的疾病中促进PI3Kδ活性的抑制。特别地,可以使用具有通用结构式(I)的化合物或者它们的药学上可接受的盐、药物前体、或溶剂化物(例如水合物)来实施本发明的方法:
其中,U、V、W和Z各自独立地选自由CRa、N、NRb和O所组成的组中,
或者U、V、W和Z中的至少一个为N,且U、V、W和Z中的其他几个选自由CRa、NRb、S和O所组成的组中,
并且,U、V、W和Z中的至少一个不是CRa,而且不是全部的U、V、W和Z均不是CRa;
A为任选取代的单环或者双环的环***,该环***含有至少两个氮原子作为环上成员,并且该***中的至少一个环是芳香族的;
X选自由C(Rc)2、C(Rc)2C(Rc)2、CH2CHRc、CHRcCHRc、CHRcCH2、CH=C(Rc)、C(Rc)=C(Rc)和C(Rc)=CH所组成的组中;
Y不存在(即,键),或者Y选自由S、SO、SO2、NH、N(Rc)、O、C(=O)、OC(=O)、C(=O)O和NHC(=O)CH2S所组成的组中;
R1选自由H、取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10烯基、取代的或未取代的C2-10炔基、取代的或未取代的C1-6全氟烃基、取代的或未取代的C3-8环烷基、取代的或未取代的C3-8杂环烷基、取代的或未取代的C1-4亚烷基C3-8环烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的芳基C1-4亚烷基ORe、取代的或未取代的杂芳基C1-4亚烃基N(Rd)2、取代的或未取代的杂芳基C1-4亚烷基ORe、取代的或未取代的C1-3亚烷基杂芳基、取代的或未取代的C1-3亚烷基芳基、取代的或未取代的芳基C1-6烷基、芳基C1-4亚烷基N(Rd)2、C1-4亚烷基C(=O)C1-4亚烷基芳基、C1-4亚烷基C(=O)C1-4亚烷基杂芳基、C1-4亚烷基C(=O)杂芳基、C1-4亚烷基C(=O)N(Rd)2、C1-6亚烷基ORd、C1-4亚烷基NRaC(=O)Rd、C1-4亚烷基OC1-4亚烷基ORd、C1-4亚烷基N(Rd)2、C1-4亚烷基C(=O)ORd和C1-4亚烷基OC1-4亚烷基C(=O)ORd所组成的组中;
Ra独立地选自由H、取代的或未取代的C1-6烷基、取代的或未取代的C3-8环烷基、取代的或未取代的C3-8杂环烷基、取代的或未取代的芳基、C1-3亚烷基芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基C1-3烷基、取代的或未取代的C1-3亚烷基杂芳基、卤素、NHC(=O)C1-3亚烷基N(Rd)2、NO2、ORe、CF3、OCF3、N(Rd)2、CN、OC(=O)Rd、C(=O)Rd、C(=O)ORd、芳基ORe、NRdC(=O)C1-3亚烷基C(=O)ORd、芳基OC1-3亚烷基N(Rd)2、芳基OC(=O)Rd、C1-4亚烷基C(=O)ORd、OC1-4亚烷基C(=O)ORd、C1-4亚烷基OC1-4亚烷基C(=O)ORd、C(=O)NRdSO2Rd、C1-4亚烷基N(Rd)2、C2-6亚烷基N(Rd)2、C(=O)NRdC1-4亚烷基ORe、C(=O)NRdC1-4亚烷基杂芳基、OC1-4亚烷基N(Rd)2、OC1-4亚烷基CH(ORe)CH2N(Rd)2、OC1-4亚烷基杂芳基、OC2-4亚烷基ORe、OC2-4亚烷基NRdC(=O)ORd、NRaC1-4亚烷基N(Rd)2、NRaC(=O)Rd、NRaC(=O)N(Rd)2、N(SO2C1-4烷基)2、NRa(SO2C1-4烷基)、SO2N(Rd)2、OSO2CF3、C1-3亚烷基芳基、C1-4亚烷基杂芳基、C1-6亚烷基ORe、C(=O)N(Rd)2、NHC(=O)C1-3亚烷基芳基、芳基OC1-3亚烷基N(Rd)2、芳基OC(=O)Rd、NHC(=O)C1-3亚烷基C3-8杂环烷基、NHC(=O)C1-3亚烷基杂芳基、OC1-4亚烷基OC1-4亚烷基C(=O)ORd、C(=O)C1-4亚烷基杂芳基和NHC(=O)卤素C1-6烷基所组成的组中;
Rb不存在,或者Rb选自由H、取代的或未取代的C1-6烷基、取代的或未取代的C3-8环烷基、取代的或未取代的C3-8杂环烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基C1-3烷基、C1-3亚烷基芳基、取代的或未取代的杂芳基、杂芳基C1-3烷基、取代的或未取代的C1-3亚烷基杂芳基、C(=O)Rd、C(=O)ORd、芳基ORe、芳基OC1-3亚烷基N(Rd)2、芳基OC(=O)Rd、C1-4亚烷基C(=O)ORd、C1-4亚烷基OC1-4亚烷基C(=O)ORd、C(=O)NRdSO2Rd、C1-4亚烷基N(Rd)2、C2-6亚烷基N(Rd)2、C(=O)NRdC1-4亚烷基ORe、C(=O)NRdC1-4亚烷基杂芳基、SO2N(Rd)2、C1-3亚烷基芳基、C1-4亚烷基杂芳基、C1-6亚烷基ORe、C1-3亚烷基N(Rd)2、C(=O)N(Rd)2、芳基OC1-3亚烷基N(Rd)2、芳基OC(=O)Rd和C(=O)C1-4亚烷基杂芳基所组成的组中;
Rc独立地选自由H、取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C3-8环烷基、取代的或未取代的C3-8杂环烷基、取代的或未取代的C1-4亚烷基N(Rd)2、取代的或未取代的C1-3亚烷基杂C1-3烷基、取代的或未取代的芳基杂C1-3烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的芳基C1-3烷基、取代的或未取代的杂芳基C1-3烷基、C1-3亚烷基芳基、取代的或未取代的C1-3亚烷基杂芳基、C(=O)Rd和C(=O)ORd所组成的组中;
或者在相同原子上或邻近连接的原子上的两个Rc可以环化,以形成具有3-8个环上成员的环,该环可以是任选取代的,并且可以包括选自NRd、O和S中的最多两个杂原子作为环上成员;
Rd选自由H、取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10烯基、取代的或未取代的C2-10炔基、取代的或未取代的C3-8环烷基、取代的或未取代的C3-8杂环烷基、取代的或未取代的C1-3亚烷基N(Re)2、芳基、取代的或未取代的芳基C1-3烷基、取代的或未取代的C1-3亚烷基芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基C1-3烷基和取代的或未取代的C1-3亚烷基杂芳基所组成的组中;
或者两个Rd基团与跟它们连接的氮原子一起形成5元环或6元环,该5环或6元环任选地含有第二个杂原子,该第二个杂原子为N、O或S;
Re选自由H、取代的或未取代的C1-6烷基、取代的或未取代的C3-8环烷基、取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基所组成的组中,
或者两个Re基团与跟它们连接的氮原子一起形成5元环或6元环,该5环或6元环任选地含有第二个杂原子,该第二个杂原子为N、O或S;
所述A、R1、Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为任选地被1-3个取代基所取代,所述取代基选自由C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-8环烷基、C3-8杂环烷基、C1-6亚烷基ORe、C1-4亚烷基N(Re)2、芳基、C1-3亚烷基芳基、杂芳基、C(=O)ORe、C(=O)Re、OC(=O)Re、卤素、CN、CF3、NO2、N(Re)2、ORe、OC1-6全氟烃基、OC(=O)N(Re)2、C(=O)N(Re)2、SRe、SO2Re、SO3Re、氧代(=O)和CHO所组成的组中;以及
n为0或1。
本发明的化合物是PI3Kδ活性的选择性抑制剂。所述化合物在生化分析中呈现抑制PI3Kδ的作用,并且在基于细胞的分析中选择性地破坏表达PI3Kδ的细胞的功能。如上所述,已证明本发明的化合物具有抑制嗜中性粒细胞和其它白细胞的特定功能以及破骨细胞功能的能力。
此处所用的术语“烷基”定义为含有所示碳原子数的直链的或支链的烃基或环烃基,典型的有甲基、乙基、以及直链和支链的丙基和丁基、以及环丙基、环戊基和环己基,以及直链基团、支链基团和环基团的组合(例如环丙基甲基和降冰片基(norbornyl))。所述烃基可以含有多达16个碳原子,优选1-8个碳原子。术语“烷基”包括环、双环和“桥烷基”,即C6-C16双环或多环烃基,例如降冰片基、金刚烷基(adamantyl)、双环[2.2.2]辛基、双环[2.2.1]庚基、双环[3.2.1]辛基、或十氢萘基(decahydronaphthyl)。术语“环烷基”定义为环状C3-C8烃基,例如环丙基、环丁基、环己基和环戊基。
术语“烯基”与“烷基”的定义相同,除了烃基含有至少一个碳-碳双键。术语“炔基”与“烷基”的定义相同,除了烃基含有至少一个碳-碳三键。“环烯基”的定义类似于环烷基,除了在环中存在至少一个碳-碳双键。
术语“全氟烃基”定义为每个氢原子都被氟取代的烷基。
术语“亚烷基”定义为含有取代基的烷基,例如,术语“C1-3亚烷基芳基”指含有1-3个碳原子的烷基,且以一个芳基取代。同样,“亚烷基”不用于描述其它基团时,可以指二价的烷基,它可以将两个其它结构特征连接起来,例如CH2和(CH2)3是1-碳和3-碳亚烷基。
术语“卤”或“卤素”此处定义为包括氟、溴、氯和碘。通常,优选为氟或氯。
术语“卤烷基”此处定义为以一个或多个卤素取代基取代的烷基,卤素如氟、氯、溴、碘或它们的组合。类似地,“卤环烷基”定义为具有一个或多个卤素取代基的环烷基。
单独的或在组合中的术语“芳基”此处定义为单环或多环芳香基团,优选单环或双环芳香基团,例如苯基或萘基。除非另外说明,“芳基”基团可以是未取代的或取代的,例如以一个或多个(特别是1-3个)卤素、烷基、苯基、羟烷基、烷氧基、烷氧基烷基(alkoxyalkyl)、卤烷基、硝基、氨基、烷基氨基(alkylamino)、酰氨基(acylamino)、硫烷基(alkylthio)、烷基亚磺酰基(alkylsulfinyl)和烷基磺酰基(alkylsulfonyl)。示例性的芳基包括:苯基、萘基、二苯基、四氢萘基、氯苯基、氟苯基、氨基苯基、甲基苯基、甲氧基苯基、三氟甲基苯基、硝基苯基、羧基苯基等等。术语“芳基C1-6烷基”和“杂芳基C1-6烷基”定义为具有C1-6烷基取代基的芳基或杂芳基。
术语“杂芳基”此处定义为含有一个或两个芳香环的单环或双环***,并且在芳香环中含有至少一个氮、氧或硫原子,并且可以是未取代的或取代的,例如以一个或多个(特别是1-3个)取代基取代,所述取代基例如卤素、烷基、羟基、羟烷基、烷氧基、烷氧基烷基、卤烷基、硝基、氨基、烷基氨基、酰氨基、硫烷基、烷基亚磺酰基和烷基磺酰基。杂芳基的实例包括:噻吩基(thienyl)、呋喃基(furyl)、吡啶基(pyridyl)、噁唑基(oxazolyl)、喹啉基(quinolyl)、异喹啉基(isoquinolyl)、吲哚基(indolyl)、***基(triazolyl)、异***基(isothiazolyl)、异噁唑基(isoxazolyl)、咪唑基(imidazolyl)、苯并噻唑(benzothiazolyl)、吡嗪基(pyrazinyl)、嘧啶基(pyrimidinyl)、噻唑基(thiazolyl)和噻二唑基(thiadiazolyl)。
术语“C3-8杂环烷基”定义为含有选自由氧、氮和硫所组成的组中的一个或多个杂原子的单元环***。“C3-8杂环烷基”还可以含有连接在环上的氧基团(=O)。“C3-8杂环烷基”基团的非限制性实例包括:1,3-二氧戊环、2-吡唑啉(pyrazoline)、吡唑烷(pyrazolidine)、吡咯烷(pyrrolidine)、哌嗪(piperazine)、吡咯啉(pyrroline)、2H-吡喃、4H-吡喃、吗啉(morpholine)、硫代啡啉(thiopholine)、哌啶(piperidine)、1,4-二噻烷(dithiane)和1,4-二噁烷(dioxane)。
术语“羟基”定义为-OH。
术语“烷氧基”定义为-OR,其中R是C1-C8烷基、C2-C8烯基或C2-C8炔基;各烷基、烯基和炔基可以是被任选取代的。
术语“烷氧基烷基”定义为氢被烷氧基所取代的烷基。术语“(硫烷基)烷基”的定义与烷氧基烷基类似,除了存在的是硫原子而不是氧原子。
术语“羟烷基”定义为在烷基上附加有羟基。
术语“氨基”定义为-NH2,术语“烷基氨基定义为”-NR2,其中至少一个R为烷基,第二个R为烷基或氢。
术语“酰氨基”定义为RC(=O)N,其中R为烷基或芳基。
术语“硫烷基”定义为-SR,其中R为烷基。
术语“烷基亚磺酰基”定义为R-SO,其中R为烷基。
术语“烷基磺酰基”定义为R-SO2,其中R为烷基。
术语“氨基”定义为-NH2,术语“烷基氨基”定义为-NR2,其中至少一个R为烷基、烯基或炔基,第二个R为烷基、烯基、炔基或氢。
术语“酰氨基”定义为RC(=O)N,其中R为烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或杂环基。
术语“硝基”定义为-NO2。
术语“三氟甲基”定义为-CF3。
术语“三氟甲氧基”定义为-OCF3。
术语“氰基”定义为-CN。
烷基、烯基和炔基通常具有化学上有意义的取代。典型的取代包括(但不限于)卤素、=O、=N-CN、=N-OR、=NR、OR、NR2、SR、SO2R、SO2NR2、NRSO2R、NRCONR2、NRCOOR、NRCOR、CN、COOR、CONR2、OOCR、COR和NO2,其中各R独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂烯基、C6-C10芳基、或C5-C10杂芳基,且各R是以卤素、=O、=N-CN、=N-OR’、=NR’、OR’、NR’2、SR’、SO2R’、SO2NR’2、NR’SO2R’、NR’CONR’2、NR’COOR’、NR’COR’、CN、COOR’、CONR’2、OOCR’、COR’和NO2,其中各R’独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基任选取代。烷基、烯基和炔基也可以以C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基取代,它们中的每一个可以被适合于特定基团的取代基所取代。
芳基和杂芳基部分可以被多种取代基所取代,包括C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-C12芳基、C1-C8酰基和这些的杂合形式,它们中的每一个自身可以被进一步取代;芳基和杂芳基部分的其它取代基包括卤素、OR、NR2、SR、SO2R、SO2NR2、NRSO2R、NRCONR2、NRCOOR、NRCOR、CN、COOR、CONR2、OOCR、COR和NO2,其中各R独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C7-C12芳基烷基或C6-C12杂芳基烷基,且各R被上述烷基任选地取代。所述在芳基或杂芳基上的取代基可以被此处所述的适合于各类所述取代基或所述取代基的各组分的基团进一步取代。因此,例如,芳基烷基取代基可以在芳基部分以此处描述的典型芳基取代基所取代,并且进一步可以在烷基部分以此处描述的典型或适合于烷基的取代基所取代。
此处所用的“杂合形式”指修饰的烷基、烯基、芳基等等,其中,在所述烃基中,选自N、O和S中的至少一个杂原子取代至少一个碳原子。
在式(I)化合物的优选实施方式中,X选自由CH2、CH2CH2、CH=CH、CH(CH3)、CH(CH2CH3)、CH2CH(CH3)和C(CH3)2所组成的组中。在更优选的实施方式中,Y不存在(即,代表在X和A之间是一个键)、或者Y选自由S和NH所组成的组中。
当X含有手性碳时,例如当X为CH(CH3)或CH(CH2CH3)时,通常优选使用X的S-对映体。在其它实施方式中,也可以使用R-对映体。
在某些实施方式中,X为CHRc或CHRcCHRc,且Y为NRc,且两个Rc基团环化以形成环。当在此类实施方式中X为手性时,通常在特定实施方式中优选S对映体,在某些实施方式中优选R对映体。在某些此类实施方式中,-X-Y-连在一起代表一个环,如下:
A环可以是单环或双环。单环的A环体系是芳香性的。双环的A环体系含有至少一个芳香环,但两个环可以都是芳香性的。A环体系的实例包括(但不限于):咪唑基、吡唑基、1,2,3-***基、吡地嗪基(pyridizinyl)、嘧啶基、吡嗪基、1,3,5-三嗪基、噌嗪基(cinnolinyl)、酞嗪基(phthalazinyl)、喹唑啉基(quinazolinyl)、喹喔啉基(quinoxalinyl)、1,8-萘啶基(naphthyridinyl)、碟啶基(pteridinyl)、1H-吲哚基和苯并咪唑基。A的某些优选实施方式包括至少一种嘧啶环,例如,包括嘌呤和碟啶环体系,以及咪唑嘧啶(imidazolpyrimidines)、吡唑嘧啶(pyrazolopyrimidines)和吡咯嘧啶(pyrrolopyrimidines)。
在某些优选的结构式(I)的化合物种,A表示为选自以下组中的任选取代的环体系:
所述A环体系可以任选地被1-3个、优选1或2个取代基所取代,所述取代基选自由N(Re)2、卤素、C1-3卤烷基、C1-3烷基、S(C1-3烷基)和ORe所组成的组中。特定取代基包括(但不限于):NH2、NH(CH3)、N(CH3)2、NHCH2C6H5、NH(C2H5)、Cl、F、CH3、CF3、SCH3和OH。
尤其优选的A环包括:
对于环体系
在优选实施方式中,n为0。优选的环体系包括(但不限于):
所述环体系是未取代的(即,Ra和Rb为氢),或者它们可以是被适合于芳基或杂芳基的取代基所取代,优选以一个或多个C1-6烷基、卤素、C1-6烷氧基、CF3、C3-8环烷基、芳基或杂芳基。当含有V、W和Z的环是被取代的时,通常由一个或两个取代基所取代。在某些实施方式中,取代基位于以V表示的原子上,而在某些实施方式中,取代基位于以W表示的原子上。
在优选实施方式中,式(I)中的R1选自由任选取代的C1-6烷基、芳基、杂芳基、C3-8环烷基、C3-8杂环烷基、C1-4亚烷基C3-8杂环烷基、C1-4亚烷基环烷基、以及C1-4亚烷基芳基所组成的组中。特定R1基团包括(但不限于):任选取代形式的:
所述R1基团可以被1-3个取代基所取代,例如,卤素、ORe、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、芳基、杂芳基、C1-4亚烷基ORe、CF3、NO2、N(Re)2、C(=O)ORe、SO2N(Re)2、CN、C(=O)Re、C1-4亚烷基N(Re)2、OC1-4全氟烃基、氧和CHO。R1基团的特定取代基包括(但不限于):Cl、F、CH3、CH(CH3)2、OH、OCH3、(CH2)3N(CH3)2、CH2C≡CH、Q(=O)NH2、C6H5、NO2、NH2和CO2H。在某些实施方式中,R1优选为苯基、杂芳基、C3-8环烷基、或C3-8杂环烷基,它们中的每一个可以是未取代的或是被最多3个取代基所取代的。
此处所用的嘧啶-4-酮环结构为5,6-融合的双环或6,6-融合的双环体系,并且为了方便使用下述数字标记环结构:
所述嘌呤环结构有时以式(I)的基团A存在,并且为了方便,该环结构的数字标记为:
当A代表嘌呤时,A有时与Y在所述嘌呤的第9位连接,而有时在所述嘌呤的第6位连接。当A与Y在所述嘌呤环的第6位连接时,Y通常代表S、NH或NRC,并且所述嘌呤基团通常在第9位被进一步取代,例如被胺取代。
通常认为生物体系对于化合物的绝对立体化学特性可以展现出敏感的活性。见EJ.Ariens,Medicinal Research Reviews,6:451-466(1986);EJ.Ariens,Medicinal Research Reviews,7:367-387(1987);K.W.Fowler,Handbook ofStereoisomers:Therapeutic Drugs,CRC Press,edited by Donald P.Smith,pp.35-63(1989);和S.C.Stinson,Chemical and Engineering News,75:38-70(1997)。
因此,本发明包括具有不对称中心的结构式(I)化合物(不仅包括外消旋化合物,还包括旋光异构体)的所有可能的立体异构体和几何异构体。
当结构式(I)的化合物作为单个对映体时,可以通过最终产物的分离或通过从异构的纯起始材料或使用手性助剂而进行的立体有择合成来获得所述化合物。例如,见Z.Ma et al.,Tetrahedron:Asymmetry,8(6),pages 883-888(1997)。所述最终产物、中间产物或起始材料的分离可以通过本领域已知的任意方法来实现。特定的立体异构体展现出优异的抑制PI3Kδ激酶活性的能力。
此处所用的术语“药物前体”指在体内可以迅速转化成具有结构式(I)或(II)化合物的化合物,例如通过水解。药物前体设计通常在Hardma et al.(Eds.),Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics,9thed.,pp.11-16(1996)中论述。在Higuchi et al.,Prodrugs as Novel DeliverySystems,Vol.14,ASCD Symposium Series和Roche(ed.),″BioreversibleCarriers in Drug Design,″American Pharmaceutical Association and PergamonPress(1987)中提供了对药物前体的彻底论述。
简言之,施用药物,然后从体内消除或经某些生物转化,由此使所述药物的生物活性降低或消除。可选择地,生物转化过程可以导致代谢副产品,该副产品本身与初始所施用的药物相比就有更强活性或等同活性。对这些生物转化过程的理解的增加,使所谓的“药物前体”的设计成为可能,所述药物前体在生物转化之后变为更具生理活性的改变的状态。因此,药物前体包括药理学上的惰性化合物,它能够转变为生物学活性的代谢物。
例如,药物前体可以通过例如酯或酰胺连接的水解,而转变为药理学活性形式,由此在所得的产物上引入功能基团或使功能基团暴露。可以设计药物前体与内源化合物反应以形成水溶性偶联物,从而进一步增强所述化合物的药理学特性,例如,增加循环半衰期。可选择地,可以设计药物前体以在功能性基团上进行共价修饰,例如以葡萄糖醛酸、硫酸、谷胱甘肽、氨基酸或乙酸进行修饰。得到的偶联物可以被失活并从尿中排出,或者比亲代化合物更有效。高分子量偶联物还可以被排出到胆汁中,经酶切割,并释放回循环中,由此有效地增加最初使用的化合物的生物半衰期。
鉴定PI3Kδ活性的负调节剂的方法
在任意多种药物筛选技术中,PI3Kδ蛋白以及它的具有生物学活性的片段可以用来筛选假定的负调节剂化合物。PI3Kδ的负调节剂是减少或消除PI3Kδ行使任意生物学功能的能力的化合物。此类化合物的实例为降低PI3Kδ多肽使磷脂酰肌醇磷酸化或靶向细胞内合适结构的能力的试剂。可以通过将化合物对PI3Kδ的活性与对其它蛋白的活性相比较,来评估负调节PI3Kδ活性的化合物的选择性。选择性的负调节剂包括,例如,特异性与PI3Kδ多肽结合的抗体和其它蛋白或肽、特异性结合PI3Kδ多肽的寡核苷酸、和特异性与PI3Kδ多肽相互作用的其它非肽化合物(例如分离的或合成的有机分子)。负调节剂还包括与PI3Kδ多肽的特异性结合配偶体相互作用的上述化合物。
最近,开发选择性PI3Kδ负调节剂的优选靶包括,例如:
(1)与其它蛋白接触和/或将PI3Kδ定位于细胞内的PI3Kδ多肽的胞质区;
(2)能够结合特异性结合配偶体的PI3Kδ多肽的区域;
(3)能够结合底物的PI3Kδ多肽的区域;
(4)在调节信号下,能或不能直接与活性位点相互作用的PI3Kδ多肽的变构调节位点;
(5)介导多聚化的PI3Kδ的区域。
例如,用于开发调控剂的一个靶点是确定的p85与p110δ的确定的调节性相互作用,该相互作用涉及所述p110δ部分的激活和/或亚细胞定位。还有其它选择性调控剂,包括识别特异性调控或编码PI3Kδ的核苷酸序列的调控剂。PI3Kδ活性的调控剂可以治疗性地用于治疗广范围的涉及PI3Kδ活性异常的疾病和生理学情况。
相应地,本发明提供表征分析化合物作为PI3Kδ多肽抑制剂的能力的方法,所述方法包括以下步骤:(a)在存在分析化合物情况下,测量PI3Kδ多肽的活性;(b)将存在所述分析化合物时的PI3Kδ多肽活性与存在等量参比化合物时的PI3Kδ多肽活性相比较(例如,本发明的抑制剂化合物,其中,存在分析化合物时的PI3Kδ多肽活性比存在参比化合物时的PI3Kδ多肽活性低,说明所述分析化合物是比所述参比化合物更有效地抑制剂,且存在分析化合物时的PI3Kδ活性比存在参比化合物时的PI3Kδ多肽活性高,说明所述分析化合物比所述参比化合物是效力更低的抑制剂)。
本发明还提供表征分析化合物作为PI3Kδ多肽抑制剂的能力的方法,该方法包括以下步骤:(a)测定将PI3Kδ多肽的活性抑制到参比抑制百分比的对照化合物(例如本发明的PI3Kδ抑制剂化合物)的量,由此定义所述对照化合物的参比抑制量;(b)测定将PI3Kδ多肽的活性抑制到参比抑制百分比的分析化合物的量,由此定义所述分析化合物的参比抑制量;(c)将所述分析化合物的参比抑制量与所述对照化合物的参比抑制量相比较,其中,所述分析化合物的参比抑制量比所述对照化合物的参比抑制量低说明所述分析化合物是比所述对照化合物更有效地抑制剂,而所述分析化合物的参比抑制量比所述对照化合物的参比抑制量高说明所述分析化合物是比所述对照化合物效力更低的抑制剂。在一个方面,所述方法使用将PI3Kδ多肽活性抑制到50%、60%、70%或80%的化合物的量作为参比抑制量。在另一方面,所述方法使用将PI3Kδ多肽活性抑制到90%、95%或99%的化合物的量作为参比抑制量。这些方法包括在体外生化分析、体外基于细胞的分析或体内分析中测定化合物的参比抑制量。
本发明还提供鉴定PI3Kδ活性的负调节剂的方法,该方法包括以下步骤:(i)在存在或不存在分析化合物的条件下,测量PI3Kδ多肽的活性,以及(ii)鉴定作为负调节剂的分析化合物,该化合物降低PI3Kδ活性并与本发明的化合物竞争结合PI3Kδ。此外,本发明提供鉴定抑制PI3Kδ活性的化合物的方法,该方法包括以下步骤:(i)在存在和不存在分析化合物的条件下,将PI3Kδ多肽与本发明的化合物接触,以及(ii)鉴定作为PI3Kδ活性的负调节剂的分析化合物,其中所述化合物与本发明的化合物竞争结合PI3Kδ。因此,本发明提供筛选PI3Kδ活性的候选负调节剂的方法,和/或验证此类负调节剂候选物的作用方式。也可以对其它PI3K亚型使用此类方法,平行地建立所述分析化合物对所述亚型和/或相对于本发明的化合物的比较活性。
在这些方法中,所述PI3Kδ多肽可以是呈现激酶活性的p110δ片段,即含有p110δ的催化位点的片段。可选择地,所述PI3Kδ多肽可以是来自p85的p110δ结合结构域的片段,并且提供了鉴定PI3Kδ变构调控剂的方法。可以在内源或外源表达PI3Kδ或其亚基的细胞中使用所述方法。相应地,在此种方法中使用的多肽可以是溶于溶液中的、固定在固体载体上的、经修饰而在细胞表面展示的、或定位于细胞内的。然后可以测量活性的调控或在PI3Kδ多肽和要分析的试剂之间的结合复合体的形成。
人PI3K多肽可以适用于根据已知方法和本领域实践的生化或基于细胞的高通量筛选(HTS)分析,包括研究受体-配体相互作用的黑色素细胞分析***、基于酵母的分析***和哺乳动物细胞表达***。综述见Jayawickremeet al.,Curr Opin Biotechnol,<S:629-34(1997)。例如,在Houston et al.,CurrOpin Biotechnol,5:734-40(1997)中描述了自动的和小型的HTS分析。
此类HTS分析可以用于筛选化合物库以鉴定呈现所需要的性质的特定化合物。可以使用任意的化合物库,包括化学库、天然产物库、和组合库(包括随机或设计的寡肽、寡核苷酸或其它有机化合物)。化学库可以含有已知化合物、已知化合物的专有结构类似物、或从天然产物筛选中鉴定的化合物。
天然产物库是从天然来源分离的材料的集合,典型地天然来源包括微生物、动物、植物或海洋生物。天然产物是通过微生物发酵然后对发酵液进行分离和提取或通过从微生物或组织(植物或动物)自身直接提取而从它们的来源分离的。天然产物库包括聚酮、非核糖体肽、和它们的变体(包括非天然存在的变体)。综述见Cane et al.,Science,282:63-68(1998)。
组合库由大量的相关化合物组成,例如作为混合物的肽、寡核苷酸或其它有机化合物。可以通过传统的自动合成方法、PCR、克隆或适当的合成方法相对直接地设计和制备此类化合物。肽和寡核苷酸组合库特别有意义。
还有其它感兴趣的库,包括肽、蛋白质、模拟肽(peptidomimetic)、多重平行合成集合、重组和多肽库。组合化学和由此产生的库的综述见Myers,Curr Opin Biotechnol,5:701-07(1997)。
PI3Kδ活性抑制剂的治疗性应用
本发明提供了在治疗上或预防上选择性或特异性地抑制PI3Kδ活性的方法。所述方法包括以有效量使用选择性或特异性PI3Kδ活性抑制剂。所述方法可以用于治疗患有或可以患有任意由PI3Kδ的表达或PI3Kδ的活性所介导的症状或病理情况的人或动物。
此处所用的“治疗”指在易患失调(但仍未被诊断患有该失调)的动物中预防所述失调的出现;抑制所述失调,即阻止它的发展;减轻所述失调,即引起它的衰退;或改善所述失调,即减轻与所述失调相关的症状。“失调”预计包括医学失调、疾病、情况、综合症等等,并不限于这些。
本发明的方法包括治疗动物患者的多种方式,所述动物患者优选为哺乳动物,更优选为灵长类,且仍更优选为人类。可以治疗的哺乳动物有,例如陪伴动物(宠物),包括狗和猫;家畜,包括牛、马、绵羊、猪和山羊;实验室动物,包括大鼠、小鼠、兔、豚鼠和非人类的灵长类;以及动物园样本。非哺乳动物类动物包括,例如,鸟、鱼、爬行动物和两栖动物。
可以使用本发明的方法在治疗上或预防上治疗患有或可以患有炎症性失调的患者。本发明的一个方面来源于PI3Kδ涉及介导炎症过程的方面。不预计被任何理论所束缚,认为由于炎症涉及典型的由白细胞(例如嗜中性粒细胞或淋巴细胞)激活和趋化性迁移介导的过程,而且由于PI3Kδ可以介导此现象,因此可以使用PI3Kδ拮抗剂来抑制炎症相关的伤害。
此处所用的“炎症性失调”可以指任意疾病、失调或综合症,其中过度的或未调节的炎症性反应导致过度的炎症性症状、宿主组织损伤或丧失组织功能。“炎症性失调”还指由白细胞和/或嗜中性粒细胞趋化性流通所介导的病理状态。
此处所用的“炎症”指由组织受损或破坏引起的局部的、保护性的反应,它的作用是破坏、减弱或隔开(隔离)有害试剂和受损的组织。炎症与白细胞和/或嗜中性粒细胞的趋化性流通相关。炎症可以来自于致病生物和病毒的感染,和来自于非感染方式,例如外伤、或心肌梗塞后的再灌注、或中风、对外来抗原的免疫应答、和自身免疫应答。相应地,适应本发明的炎症性失调包括与特异性防御***反应以及与非特异性防御***反应相关的失调。
此处所用的术语“特异性防御***”指与特异性抗原呈递反应的免疫***的成分。来自特异性防御***应答的炎症的实例包括对外源抗原的经典应答、自身免疫性疾病、和由T细胞介导的迟发过敏性应答。所述特异性防御***的炎症性反应的另外实例慢性炎症性疾病、实体移植组织和器官的排斥(例如肾和骨髓移植)和移植物抗宿主病(GVHD)。
此处所用术语“非特异性防御***”指由没有免疫记忆的白细胞(例如粒细胞和巨噬细胞)介导的炎症性失调。至少一部分来自于所述非特异性防御***反应的炎症的实例包括与例如成人(急性)呼吸窘迫综合症(AEDS)或多器官损伤综合症的情况相关的炎症;再灌注损伤;急性肾小球肾炎;反应性关节炎;具有急性炎症性成分的皮肤病;急性化脓性脑膜炎或其它中枢神经***炎症性失调(例如中风);热损伤;炎症性肠病;粒细胞输血相关综合症;以及细胞因子诱导的毒性。
此处所用的“自身免疫性疾病”指组织损伤与体液或细胞介导的对机体自身成分的应答相关的失调。此处所用的“过敏性疾病”指任意由过敏引起的综合症、组织损伤或组织功能丧失。此处所用的“关节炎疾病”指特征为可归因于多种病因学的关节炎症性损伤的任意疾病。此处所用的“皮炎”指特征为可归因于多种病因学的皮肤炎症的皮肤疾病大家族中的任意疾病。此处所用的“移植排斥”指直接针对移植组织(例如器官或细胞(例如骨髓))的免疫反应,特征为移植组织或周围组织的功能丧失、疼痛、肿胀、白细胞增多和血小板减少。
本发明的治疗方法包括治疗与炎症性细胞激活相关的失调的方法。“炎症性细胞激活”指在炎症细胞(包括(但不限于):单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、粒细胞(即多形核白细胞,例如嗜中性粒细胞、嗜碱细胞和嗜酸性细胞)、肥大细胞、树突状细胞、朗氏细胞和内皮细胞)中,对增殖性细胞响应的刺激物(包括(但不限于):细胞因子、抗原或自身抗体)、可溶性中间物(包括(但不限于):细胞因子、氧自由基、酶、***素或血管活性胺)的产生、或细胞表面表达的新的或增加量的中间物(包括(但不限于)主要组织相容性抗原或细胞粘附分子)的感应。本领域技术人员应当理解,在这些细胞中激活这些表型的一种或组合可以有助于起始、延续或恶化炎症性失调。
已发现本发明的化合物能抑制嗜中性粒细胞释放过氧化物。嗜中性粒细胞响应多种刺激(包括感染信号)而释放过氧化物,作为杀细胞机制。例如已知肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导过氧化物的释放,巨噬细胞、肥大细胞和淋巴细胞与细菌细胞壁成分(例如脂多糖(LPS))接触会释放TNFα。TNFα是特别有效和混杂的炎症性过程激活剂,涉及嗜中性粒细胞和多种其它细胞类型的激活、白细胞/内皮细胞粘附的诱导、发热、增强的I类MHC的产生和血管生成的刺激。可选择地,过氧化物的释放可以由甲酰基-Met-Leu-Phe(fMLP)或其它N-末端被甲酰化甲硫氨酸所封闭的肽。此类肽通常不存在于真核细胞中,但是是细菌的基本特征,并且想免疫***提示细菌的存在。表达fMLP受体的白细胞(例如嗜中性粒细胞和巨噬细胞)被刺激沿这些肽的梯度向感染部位迁移(即趋化性)。此处证明,本发明的化合物抑制由嗜中性粒细胞响应TNFα或fMLP而刺激的过氧化物释放。还显示本发明的PI3Kδ抑制剂可以抑制嗜中性粒细胞的其它功能(包括刺激的胞外分泌和定向的趋化性迁移)。相应地,本发明的化合物可以预期用于治疗由任意或所有这些嗜中性粒细胞功能所介导的失调(例如炎症性失调)。
本发明提供了治疗下述疾病的方法:关节炎疾病,例如风湿性关节炎、单关节性关节炎、骨关节炎、通风性关节炎、脊椎炎;***(Behcetdisease);败血症(sepsis)、感染性休克(septic shock)、内毒素性休克(endotoxicshock)、革兰氏阴性败血症、革兰氏阳性败血症和中毒性休克综合症;败血症、外伤或出血继发的多器官损伤综合症;眼部失调,例如过敏性结膜炎、春季结膜炎、眼色素层炎(uveitis)和甲状腺相关的眼病;嗜酸性肉芽肿;肺部或呼吸失调,例如哮喘、慢性支气管炎、过敏性鼻炎、ARDS、慢性肺炎症性疾病(例如慢性阻塞性肺疾病)、硅肺病、肺结节病、胸膜炎、肺泡炎(alveolitis)、脉管炎、肺气肿、肺炎、支气管扩张和肺型氧中毒(pulmonaryoxygen toxicity);心肌、脑或肢端再灌注损伤;纤维化,例如囊肿性纤维化;瘢痕形成或疤痕组织形成;动脉硬化症;自身免疫性疾病,例如***性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性甲状腺炎、多发性硬化、某些形式的糖尿病、和雷诺氏综合症(Reynaud′s syndrome);移植排斥失调,例如GVHD和同种异体移植排斥;慢性肾小球肾炎;炎症性肠病,例如慢性炎症性肠病(CIBD)、克罗恩氏病(Crohn′s disease)、溃疡性结肠炎、以及坏死性结肠炎;炎症性皮肤病,例如接触性皮炎、遗传过敏性皮炎、牛皮癣或风疹;感染引起的发热和肌痛;中枢或外周神经***炎症性失调,例如脑膜炎、脑炎和较小外伤引起的脑或脊髓损伤;干燥综合症(Sjogren′s syndrome);涉及白细胞渗出的疾病;酒精性肝炎;细菌性肠炎;抗原-抗体复合物介导的疾病;低血容量性休克;I型糖尿病;急性和迟发性过敏;白细胞恶液质和转移引起疾病状态;热损伤;粒细胞输血相关综合症;以及细胞因子诱导的毒性。
所述方法可以用于治疗患有或可以患有再灌注损伤(即组织或器官经历一段时间的缺血然后再灌注的状态所导致的损失)的患者。术语“缺血”指由于动脉血流入受阻而引起的局部组织贫血。短暂缺血后再灌注特征性地导致嗜中性粒细胞激活并穿过受影响区域的血管内皮迁移。随后,激活的嗜中性粒细胞的累积导致反应性氧代谢物的产生,从而损害相关组织或器官的成分。该“再灌注损伤”现象通常与以下情况有关,例如血管中风(包括全部和局灶性缺血)、出血性休克、心肌缺血或梗塞、器官移植和脑血管痉挛。例如,心脏旁路手术结束时或在曾经拒绝接受血液的心脏开始再灌注时的心搏停止过程中会出现再灌注损伤。预期PI3Kδ活性抑制剂会导致此类情况中再灌注损伤的量减少。
对于神经***,当全脑的血流停止一段时间时出现全部缺血。心搏停止可以导致全部缺血。当一部分脑失去正常血液供给时出现局灶性缺血。脑血管血栓性闭塞、外伤头损伤、水肿或脑肿瘤可以引起局灶性缺血。即使是短暂的全部缺血或局灶性缺血都可以引起广泛的神经元损伤。尽管神经组织损伤可以出现在缺血发生后的几小时或甚至几天,但是在脑血流停止后的最初几分钟即可发生某些永久性神经组织损伤。
在心肌梗塞和其它心血管失调(其中由动脉硬化、血栓或痉挛引起冠状动脉的阻塞)的心脏中也可以出现缺血。相应地,认为本发明可以用于治疗心脏组织损伤,特别是哺乳动物中由心肌缺血导致的损伤或由再灌注损伤引起的损伤。
另一方面,本发明的选择性PI3Kδ抑制剂可以在治疗骨疾病的方法中使用,尤其是在破骨细胞功能异常或不合需要的疾病。如下所示,本发明的化合物在体外抑制破骨细胞功能。相应地,此类化合物和其它PI3Kδ选择性抑制剂的使用可以治疗骨质疏松症、佩吉特氏病(Paget′s disease)和相关的骨再吸收失调。
在又一方面,本发明包括使用PI3Kδ抑制剂化合物抑制造血来源的癌细胞的生长或增殖的方法,优选癌细胞为淋巴来源,更优选癌细胞与B淋巴细胞或B淋巴细胞祖细胞相关或衍生自B淋巴细胞或B淋巴细胞的祖细胞。可以使用本发明的方法治疗的癌症包括(但不限于)淋巴瘤,例如淋巴和网状内皮组织的恶性瘤,例如伯基特淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkins′lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞淋巴瘤等等;多发性骨髓瘤;白血病,例如淋巴细胞白血病、慢性骨髓(骨髓性)白血病等等。在优选实施方式中,本发明的PI3Kδ抑制剂化合物可以用于抑制或控制慢性骨髓(骨髓性)白血病细胞的生长和增殖。
在另一方面,本发明包括阻抑嗜碱细胞和/或肥大细胞的功能的方法,由此可以治疗特征为嗜碱细胞和/或肥大细胞活性过度或不需要的疾病或失调。根据所述方法,本发明的化合物可以用于选择性抑制嗜碱细胞和/或肥大细胞中的PI3Kδ的表达或活性。优选地,所述方法使用的PI3Kδ抑制剂的量足以抑制嗜碱细胞和/或肥大细胞的刺激性组胺的释放。相应地,本发明的选择性PI3Kδ抑制剂的应用可以治疗特征为组胺释放的疾病,即过敏性失调,包括例如慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、ARDS、肺气肿和相关失调。
PI3Kδ活性抑制剂的药物组合物
本发明的化合物可以作为纯化学药品施用,但是典型和优选以药物组合物或制剂的形式施用所述化合物。相应地,本发明还提供药物组合物,该药物组合物含有起PI3Kδ活性调控剂作用的化学或生物学化合物(“试剂”)、以及生物相容性药物载体、佐剂或赋形剂。所述组合物可以包括作为唯一活性部分的试剂或与其它试剂的组合,例如与一种或多种赋形剂或其它药物可接受载体混合的寡核苷酸或多核苷酸、寡肽或多肽、药物、或激素。载体和其它成分为药物可接受的,它们与所述制剂的其它成分相适应,并且不会对受体产生危害。
药物组合物的制剂制备和施用的技术可以在Remington′s PharmaceuticalSciences,18th Ed.,Mack Publishing Co,Easton,PA,1990中找到。可以使用任意常规方法制备本发明的药物组合物,例如混合、溶解、粒化、制成糖衣制剂、研碎、乳化、形成胶囊、包埋、熔融纺丝、喷雾干燥或冻干的方法。本领域技术人员可以根据施用途径和所需剂量来确定最佳的药物制剂。此类制剂可以影响所述施用的试剂的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。依赖于治疗的情况,这些药物组合物可以制备为全身性施用或局部施用的。
所述药物组合物可以制备为含有合适的药物可接受载体,且任选地可以含有赋形剂和助剂,以有助于药用制剂中的活性化合物的加工。施用形式通常决定载体的性质。例如肠胃外施用的制剂可以含有水溶形式的活性化合物的水溶液。适合于肠胃外施用的载体可以选自盐、缓冲盐、葡萄糖、水和其他生理上可接受的溶液。优选的肠胃外施用的载体为生理上相容的缓冲液,例如汉克溶液(Hank′s solution)、林格溶液(Ringer′s solution)或生理缓冲盐。对于组织或细胞施用,在制剂中使用适合于要渗透的特定载体的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域公知的。对于含有蛋白质的制剂,该制剂可以包括稳定化材料,例如多羟基化合物(例如蔗糖)和/或表面活性剂(例如非离子表面活性剂)等等。
可选择地,肠胃外应用的制剂可以含有活性化合物的分散液或悬浮液,所述活性化合物制备为合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(例如芝麻油)和合成的脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)、或脂质体。水性注射悬浮液可以含有增加所述悬浮液粘性的物质,例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地,所述悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加所述化合物溶解性的试剂,从而能够制成高浓度的溶液。也可以使用提供使活性试剂pH敏感性溶解和/或持续释放的水性聚合物来作为包被或基质结构,例如甲基丙烯酸聚合物,例如可获自Rohm America Inc.(Piscataway,NJ)的EUDRAGIT系列。也可以使用乳剂,例如水包油和油包水分散剂,所述乳剂任选地以乳化剂或分散剂(表面活性材料;表面活性剂)来稳定。悬浮液可以含有悬浮剂,例如乙氧基异十八醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨聚糖酯(sorbitan esters)、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminummetahydroxide)、膨润土、琼脂、黄芪胶(gum tragacanth)、和它们的混合物。
肠胃外施用还可以使用含有活性试剂的脂质体。脂质体通常来源于磷脂或其它脂类物质。以脂质体形式的组合物还可以含有其它成分,例如稳定剂、防腐剂、赋形剂等等。优选的脂类包括天然的和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。形成脂质体的方法是本领域所公知的。例如见Prescott(Ed.),Methodsin Cell Biology,Vol.XIV,p.33,Academic Press,New York(1976)。
含有适合于口服施用剂量的试剂的药物组合物可以使用本领域熟知的药物可接受载体制成制剂。口服施用的制剂可以以片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、糖衣剂、锭剂、液体、凝胶、糖浆、膏剂、酏剂、悬浮剂或粉末剂的形式。例如,可以通过将活性化合物与固体赋形剂结合而获得口服药物制剂,任选地,将得到的混合物研磨,并加工混合的颗粒,如果需要加入合适的助剂,然后获得片剂或糖衣剂的核。口服制剂可以使用与上述肠胃外用药类型相近的那些液体载体,例如缓冲液水溶液、悬浮液等等。
优选的口服制剂包括片剂、糖衣剂和明胶胶囊。这些制剂可以含有一种或多种赋形剂,包括(但不限于):
a)稀释剂,例如糖,包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖或山梨醇;
b)粘合剂,例如硅酸镁铝、玉米淀粉、小麦、稻、马铃薯等等;
c)纤维素材料,例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、树胶(例如***树胶和黄芪胶)、以及蛋白质(例如明胶和胶原);
d)崩解剂或增溶剂,例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、琼脂、藻酸或它的盐(例如藻酸钠),或泡腾组合物;
e)润滑剂,例如硅石、滑石粉、硬脂酸或它的镁或钙盐、以及聚乙二醇;
f)食用香料和甜味剂;
g)着色剂或色素,例如为了鉴定产物或为了表征活性化合物的量(剂量);以及
h)其它成分,例如防腐剂、稳定剂、溶胀剂、乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐、以及缓冲液。
明胶胶囊包括由明胶制成的推入配合式胶囊,以及由明胶和包被(例如甘油或山梨醇)制成的柔软密封的胶囊。推入配合式胶囊可以含有与填充剂、粘合剂、润滑剂和/或稳定剂等混合的活性成分。在柔软胶囊中,所述活性化合物可以溶解或悬浮于合适的流体中,例如脂肪油、液体石蜡或有或没有稳定剂的液体聚乙二醇。糖衣剂的核可以进行合适的包被,例如浓缩的糖溶液,该溶液还可以含有***胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶(carbopolgel)、聚乙二醇、和/或二氧化钛、漆溶液(lacquer solution)、以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。
所述药物组合物可以以所述活性试剂的盐的形式提供。盐比相应的游离酸或碱形式更能溶于水或其它质子溶剂。药物可接受盐是本领域所熟知的。含有酸性部分的化合物可以形成具有合适阳离子的药物可接受盐。合适的药物可接受阳离子包括例如碱金属(例如钠或钾)和碱土金属(例如钙或镁)阳离子。
含有碱性部分的结构式(I)化合物可以与合适的酸形成药物可接受酸加成盐。例如Berge等“药物科学”(Pharm Sci,66:1(1977))中详细描述了药物可接受盐。所述盐可以在本发明的化合物的最终分离和纯化过程中原位制备,或通过游离碱功能团与合适酸反应而独立制备。
有代表性的酸加成盐包括(但不限于):乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐(camphorate)、樟脑磺酸盐(camphorolsulfonate)、二葡萄糖酸盐(digluconate)、甘油磷酸盐、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐(heptanoate)、己酸盐、延胡索酸盐(fumarate)、盐酸盐(hydrochloride)、氢溴酸盐(hydrobromide)、氢碘酸盐(hydroiodide)、2-羟乙基磺酸盐(异硫代羟酸盐)、乳酸盐、马来酸盐(maleate)、甲磺酸盐(methanesulfonate)或硫酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐(pyrantel)、果胶盐(pectinate)、过硫酸盐(persulfate)、3-苯丙酸盐(phenylpropionate)、苦味酸盐(picrate)、三甲基乙酸盐(pivalate)、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐或磷酸氢盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐(bicarbonate)、对甲苯磺酸盐、和十一酸盐(undecanoate)。可以用于形成药物可接受酸加成盐的酸的实例包括(但不限于):如盐酸、氢溴酸、硫磺酸和磷酸的无机酸,以及如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸的有机酸。
碱加成盐可以在本发明的化合物的最终分离和纯化过程中原位制备,或通过含羧酸的部分与合适的碱(例如药物可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)反应,或与氨水或有机的伯胺、仲胺或叔胺反应而独立制备。药物可接受的碱加成盐包括(但不限于)基于碱金属或碱土金属的阳离子,例如锂、钠、钾、钙、镁、以及铝的盐等等,以及无毒的季胺和胺阳离子,包括铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、乙基铵、二乙基铵、三乙基胺等等。用于制备碱加成盐的其它代表性有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等等。
含氮的碱性基团可以被以下试剂季铵化:低级烷基卤化物,例如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物;二烷基硫酸盐,如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸盐;长链烷基卤化物,例如癸基、十二烷基、十四烷基和十八烷基的氯化物、溴化物和碘化物;芳基烷基卤化物,例如苯甲基和苯乙基溴化物;等等。由此获得具有修饰的溶解性或分散性的产物。
根据前面所述,此处出现的任意参考的本发明化合物包括:结构式(I)的化合物,以及它们的药学上可接受的盐、溶剂化物、季铵盐衍生物和药物前体。
含有本发明化合物的组合物可以制成在药物可接受载体中的制剂,该制剂可以置于适当的容器中,并标记用于治疗的指定情况。相应地,还考虑到一些制品,例如含有本发明化合物制剂的容器,以及含有所述化合物使用说明书的标签。也可以制成试剂盒。例如,该试剂盒可以包括药物组合物的制剂和含有所述化合物用于治疗病情的使用说明书的***包。在任一情况下,在所述标签上标出的病情包括治疗炎症性失调、癌症等等。
施用PI3Kδ活性抑制剂的方法
含有PI3Kδ活性抑制剂的药物组合物可以通过任意常规方法向患者施用,包括肠胃外的和肠内的技术。肠胃外给药形式包括:通过除胃肠道以外的途径施用所述组合物的形式,例如静脉内注射、动脉内注射、腹膜内注射、脊髓内注射、肌肉内注射、关节内注射、鞘内注射、以及脑室内注射(intraventricular injection)。肠内施用形式包括例如口服(包括口腔和舌下)和直肠给药。经皮给药形式包括例如穿粘膜给药和透皮给药。穿粘膜给药包括例如肠内给药,以及鼻内给药、吸入和深肺给药;***给药;以及直肠给药。透皮给药包括被动或主动的透皮或经皮形式(包括例如贴片和离子电渗设备),以及糊剂(pastes)、油膏(salves)或软膏(ointments)的局部给药。肠胃外给药还可以使用高压技术(例如POWDERJECT)来完成。
外科技术包括:贮存(储存)组合物、渗透泵等等的植入。治疗炎症的优选给药途径可以对局部失调(例如关节炎)进行局部递送,或对分布式的失调进行全身递送(例如对再灌注损伤或对全身性病情(如败血症)进行的静脉内递送)。对于其它疾病,包括涉及呼吸道的疾病,例如慢性阻塞性肺病、哮喘和肺气肿,可以通过喷雾剂、气溶胶、粉末等等的吸入或深肺给药来完成给药。
对于肿瘤疾病的治疗,尤其是白血病和其它分布式的癌症(distributedcancer),典型优选肠胃外给药。需要在肠胃外给药以后,优化化合物制剂的体内分布(biodistribution)。PI3Kδ抑制剂化合物可以在化学疗法、放射线疗法和/或外科手术之前、过程中或之后施用。
此外,可以通过将PI3Kδ抑制剂化合物修饰或衍生化,使其靶向递送到癌细胞(该细胞表达鉴定此种细胞的标记物),来增加所述PI3Kδ抑制剂化合物的治疗指数。例如,可以将所述化合物连接到识别癌细胞的选择性或特异性标记物的抗体上,从而将所述化合物带到所述细胞附近,以在局部发挥作用,如前所述(例如见Pietersz et al.,Immunol Rev,129:51(1992);Trail et al.,Science,261:212(1993);and Rowlinson-Busza et al.,Curr Opin Oncol,4:1142(1992))。这些化合物的肿瘤定向递送,能使由放射治疗或化学疗法导致的可能的非特异性毒性最小化,从而增强治疗效果。在另一方面,PI3Kδ抑制剂化合物和放射性同位素或化学疗法试剂结合相同的抗肿瘤抗体。
对于骨再吸收失调或由破骨细胞介导的失调的治疗,可以通过任意合适的方法递送所述PI3Kδ抑制剂。最好是局部施用,例如通过关节内注射。在某些情况下,需要将所述化合物与可以使该化合物靶向骨的部分连接。例如,可以将PI3Kδ抑制剂连接在与骨的主要成分羟磷灰石具有高度亲和力的化合物上。例如,这可以通过为使***靶向递送到骨的目的而开发的四环素偶联方法来完成(Orme et al.,Bioorg Med Chem Lett,4(11):1375-80(1994))。
为了在治疗上有效地调节中枢神经***的靶,本发明的方法中所用的试剂在外周施用时应当易于穿过血脑屏障(blood brain barrier)。然而不能穿过血脑屏障的化合物仍可以通过静脉途径而有效地施用。
如上所述,所述试剂本身和所述试剂的制剂的特征,可以影响所施用的试剂的物理状态、稳定性、体内释放速率、以及体内清除速率。可以通过临床前的体外和体内研究来收集此类药代动力学和药效学信息,稍后再临床试验的过程中在人类验证。因此,对于本发明的方法中使用的任意化合物,最初可以通过生化和/或基于细胞的分析来估计治疗上的有效剂量。然后,剂量可以以动物模式制成制剂,以实现所需要的调控PI3Kδ的表达或PI3Kδ的活性的循环浓度范围。随着对人类研究的进行,会呈现出关于对多种疾病和情况的合适剂量水平和治疗持续时间的进一步信息。
此类化合物的毒性和治疗功效可以通过标准药物程序在细胞培养物或实验性动物中进行测定,例如测定LD50(群体的50%致死的剂量)和ED50(群体的50%治疗有效地剂量)。毒性和治疗作用之间的剂量比为“治疗指数”,典型的治疗指数表示为LD50/ED50。优选呈现大的治疗指数的化合物(即毒性剂量基本上高于有效剂量)。从此类细胞培养分析和额外的动物研究中获得的数据可以用于制备人类使用的剂量范围。此类化合物的剂量优选在包括ED50而几乎没有或没有毒性的循环浓度范围内。
根据本发明,可以使用任意有效的调节剂量持续时间和顺序的施用方案。所述试剂的剂量包括含有有效量试剂的药物剂量单位。此处所用“有效量”指足以调控PI3Kδ表达或活性和/或通过施用一种或多种药物剂量单位使受体的生理参数产生可测量的改变的量。
对人类受体的实例性剂量水平为从每千克体重约0.001毫克的活性试剂(mg/kg)到约1000mg/kg。典型地,例如根据说明、施用途径和病情的严重性,所述活性试剂的剂量单位为约0.01-1000mg,优选为约0.1-100mg。根据施用途径,合适的剂量可以根据体重、体表面积或器官大小来计算。通过主治医师的良好医疗习惯,考虑到改变药物作用的多种因素,来确定最终的剂量方案,所述多种因素,例如化合物的特异活性、疾病状态的特性和严重性、患者的反应、年龄、病情、体重、性别、以及患者的饮食、以及各种感染的严重性。可以考虑的其它因素包括:施用的时间和频率、药物组合物、反应敏感性、以及治疗耐受性/反应。通过熟练的从业者排除不适当的实验,来对涉及此处所述的任意制剂的治疗合适剂量,进行进一步精细的确定,尤其根据公开的剂量信息和分析,以及在人类临床试验中观察到的药代动力学数据。可以通过使用已建立的用于测定体液或其它样品中试剂浓度的分析,并与剂量反应数据一起,来确定合适的剂量。
定量给药的频率依赖于试剂的药代动力学参数和施用途径。调整剂量和使用,以提供足够的活性部分的水平或维持所需的效果。相应地,为了满足维持所需的试剂最小水平的需要,所述药物组合物可以以单剂量、多倍不连续的剂量、连续灌输、持续释放储存剂、或它们的组合给药。短期作用的药物组合物(即半衰期短),可以每天给药一次或每天多次(例如每天两次、三次或四次)。长期作用的药物组合物可以每3-4天、每周、或每两周给药。可以使用例如皮下的、腹膜内的或硬膜下的(subdural)泵进行连续灌输。
提供下面的实施例以进一步辅助理解本发明,并假定实施例中的常规方法是本领域普通技术人员所熟知的,例如载体和质粒的构建、将编码多肽的基因***到此类载体和质粒中、或将载体和质粒引入宿主细胞中。在许多出版物中详细描述了此类方法,例如Sambrook et al.,分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989),Ausubel et al.(Eds.),现代分子生物学方法(Current Protocols inMolecular Biology),John Wiley & Sons,Inc.(1994);和Ausubel et al.(Eds.),简单分子生物学方法(Short Protocols in Molecular Biology),4th ed,JohnWiley & Sons,Inc.(1999)。下面描述的特定材料和条件预期例证本发明的特定方面,而不应当解释为限制本发明的合理范围。
实施例1
重组PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ的制备和纯化
使用BAC-TO-BACHT杆状病毒表达***(GIBCO/BRL)过表达由p110催化亚基和p85调节亚基组成的重组PI3K异源二聚体复合物,然后纯化,以用于生化分析。将四种I类PI3-激酶,克隆到以下杆状病毒载体中:
p110δ:使用标准的重组DNA技术,将FLAG-标签的人p110δ(SEQ IDNO:1)(见Chantry et al.,J Biol Chem,272:19236-41(1997))亚克隆到昆虫细胞表达载体pFastbac HTb(Life Technologies,Gaithersburg,MD)的BamH1-Xba1位点,以使该克隆与所述载体的His标签的读码框一致。在美国专利Nos.4,703,004、4,782,137、4,851,341和5,011,912中描述了该FLAG体系,并且试剂获自Eastman Kodak Co公司。
p110α:与上述p110δ使用的方法相似,将FLAG-标签的人p110α(见Volinia et al.,Genomics,24(3):427-477(1994))亚克隆到pFastbac HTb(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)的BamH1-HindIII位点,以使该克隆与所述载体的His标签的读码框一致。
p110β:根据制造商的方法,从人MARATHONReady脾cDNA文库(Clontech,Palo Alto CA)中,使用以下引物扩增p110β(见Hu et al.,MoI CellBiol,73:7677-88(1993)):
5’引物
5′-GATCGAATTCGGCGCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGTGCTTCAGTTTCAT AATGCCTCC-3′(SEQ ID NO:3)
3′引物
5′-GATCGCGGCCGCTTAAGATCTGTAGTCTTTCCGAACTGTGTG-3′(SEQ ID NO:4)
所述5’引物构建为含有与p110β序列读码框一致的FLAG-标签。扩增以后,使用标准重组技术将FLAG-p110β序列,亚克隆到pFastbac Hta(LifeTechnologies)的EcoR1-Not1位点,以使该克隆与所述载体的His标签的读码框一致。
p110γ:根据制造商的方法,从人Marathon Ready脾cDNA文库(Clontech)中,使用以下引物扩增p110γcDNA(见Stoyanov et al.,Science,269:690-93(1995)):
5′引物
5′-AGAATGCGGCCGCATGGAGCTGGAGAACTATAAACAGCCC-3′(SEQ ID NO:5)
3′引物
5′-CGCGGATCCTTAGGCTGAATGTTTCTCTCCTTGTTTG-3′(SEQ IDNO:6)
随后将FLAG-标签连接在所述p110γ序列的5’端,并使用标准重组DNA技术,将其克隆到pFastbac HTb(Life Technologies)的BamH1-Spe1位点,使FLAG-110γ序列与所述载体的His标签的读码框一致。
p85α:将FLAG-标签的p85 cDNA的BamH1-EcoR1片段(见Skolnik etal.,Cell,65:83-89(1991))亚克隆到载体pFastbac dual(Life Technologies)的BamH1-EcoR1位点。
使用制造商推荐的方法(Life Technologies)产生含有上述克隆的重组杆状病毒。用表达His-标签的p110α、p110β或p110δ催化亚基和p85亚基共感染进入Sf21昆虫细胞。为了富集异源二聚体酶复合物,感染过量的表达p85亚基的杆状病毒,并且在镍色谱柱上纯化与p85形成复合物的His-标签p110催化亚基。由于p110γ不与p85结合,因此仅用表达His-标签p110γ的重组杆状病毒感染Sf21细胞。在可选方法中,可以将p101克隆到杆状病毒中,以使它与它的优选结合配偶体p110γ共表达。
感染后72小时,收集感染的Sf21细胞(3L),并使用杜恩斯(Dounce)匀浆器在低渗缓冲液(20mM HEPES-KOH,pH 7.8、5mM KCl、完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche Biochemicals,Indianapolis,IN))中混合均匀。将均匀混合物在1,000×g离心15分钟。将上清在10,000×g再离心20分钟,然后再100,000×g超速离心60分钟。立即将可溶部分上样到10mL HITRAP镍亲和柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)中,该柱先以50mL缓冲液A(50mMHEPES-KOH,pH 7.8、0.5M NaCl、10mM咪唑)平衡。该柱用缓冲液A广泛地清洗,并用10-500mM线性梯度的咪唑洗脱。在清洗步骤中从柱中除去游离的p85亚基,在250mM咪唑处仅洗脱出异二聚体酶复合物。镍级分的部分通过10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,以SYPRO红(Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR)染色,并以STORMPhospholmager(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)定量。合并活性级分,直接上样至以缓冲液B(含50mM HEPES-KOH,pH 7.5、50mM NaCl、2mM二硫苏糖醇(DTT))预先平衡的5mL Hi-trap肝素柱中。该柱以50mL缓冲液B清洗,并以0.05-2M线性梯度的NaCl洗脱。含PI3K酶复合物的单峰在0.8M NaCl处洗脱出来。SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析显示纯化的PI3K酶级分含有化学当量1∶1的p110和p85亚基的复合物。在肝素色谱过程中,所述酶复合物的蛋白谱相应于脂类激酶活性的谱。合并活性级分,并在液氮中冷冻。
实施例2
PI3Kδ的高通量筛选(HTS)和选择性分析
进行专有化学药品库的高通量筛选以鉴定候选PI3Kδ活性抑制剂。PI3Kδ催化磷酸从γ-[32P]ATP转移到在PIP2肌醇脂环的D3’位点上的PIP2/PS脂质体。该反应时依赖MgCl2的,并且在含有30mM EDTA的pH 8.0的高摩尔浓度磷酸钾缓冲液中结束。在所述筛选中,在存在或不存在文库化合物的条件下进行该反应。将反应产物(和所有未标记产物)转移到96孔预湿PVDF(聚偏(二)氟乙烯)滤板中,过滤,并在高摩尔浓度磷酸钾中清洗。在干燥的孔中加入闪烁体(scintillant),并定量整体的放射活性。
制造底物和酶的3倍分析储液,并储存于槽中(用于机器人分析)或96孔V底聚丙烯板中(用于手动分析)。试剂在室温下至少稳定3小时。
用于HTS的3倍底物含有在20mM HEPES(pH 7.4)中的0.6mMNa2ATP、0.10mCi/mL γ-[32P]ATP(NEN,Pittsburgh,PA)、6μM PIP2/PS脂质体(Avanti Polar Lipids,Inc.,Atlanta,GA)。
用于HTS的3倍底物含有在20mM HEPES(pH 7.4)中的1.8nM的PI3Kδ、150μg/ml的马IgG(仅用作稳定剂)、15mM的MgCl2、3mM的DTT。
将二甲基亚砜(DMSO)中的化学高通量筛选(HTS)文库样品(每个含有22个化合物的混合),以双蒸水稀释到18.75μM或37.8μM,将20μL稀释液置于96孔聚丙烯板的孔中用于分析。阴性抑制剂对照(或阳性酶对照)为溶于水中的DMSO,阳性抑制剂对照使用足够提供50%和100%抑制作用的浓度的LY294002。
向20μL混合的化学药品库稀释液中加入20μL的3倍底物(3×substrate)。以20μL 3倍的酶起始反应,在室温培育10分钟。该稀释在该反应体积中建立了200μM ATP的终浓度。以150μL终止缓冲液(pH 8.0的1.0M磷酸钾、30mM EDTA)来停止反应。然后将终止后的溶液的一部分(180μL)转移到PVDF滤板(Millipore #MAIP NOB,以连续的200μL 100%甲醇、水和最后的pH 8.0的1.0M磷酸钾洗涤缓冲液清洗而使滤板预湿)中。
该PVDF滤板在适度真空(2-5mm Hg)下吹干,以5×200μL洗涤缓冲液清洗,然后吹干。随后取下滤膜,彻底进行空气干燥,并***Wallac计数盒,每孔加入50μL Ecoscint闪烁体混合物。定量合并的放射活性,分析数据,以酶阳性对照(设定为100%)均一化以后,鉴定50%抑制值与曲线交叉处的值,以估计抑制剂的IC50值。进行所述抑制剂对PI3Kα和PI3Kβ的选择性分析(见实施例9中的分析方法)。
从选择性分析发现,本发明的化合物是有效地和选择性的3PIKδ抑制剂。例如,如上所述,PI3-激酶抑制剂LY294002(Calbiochem,La Jolla,CA)在分析的不同PI3-激酶亚型中不具有显著的选择性。在我们的分析条件下,LY294002抑制所有三种PI3-激酶亚型,IC50为0.3-1μM。本发明的化合物对α、β和γ亚型的抑制,比对δ亚型的抑制效果至少低10倍。这些结果显示本发明的化合物具有选择性抑制PI3Kδ活性的能力。
实施例3-7
因为PI3Kδ在白细胞中有显著的表达水平,因此研究PI3Kδ选择性抑制剂对白细胞功能的作用非常重要。相应地,检测了在几种类型的白细胞中PI3Kδ抑制剂的作用。检测了嗜中性粒细胞,以确定选择性抑制PI3Kδ可能起的作用(下述实施例3)。令人惊奇地发现,选择性抑制PI3Kδ活性与激活的嗜中性粒细胞的某些(但不是全部)功能的抑制显著地相关。另外,还分析了PI3Kδ抑制剂对B细胞和T细胞功能的作用(下述实施例4-5)。而且,由于PI3Kδ也在破骨细胞中表达,因此还研究了PI3Kδ抑制对这些特定细胞功能的作用(下述实施例6)。还研究了PI3Kδ对嗜碱细胞功能的作用(下述实施例7)。
实施例3
PI3Kδ在嗜中性粒细胞功能中的作用的表征
可以检测本发明的PI3Kδ抑制剂对嗜中性粒细胞功能(例如过氧化物产生、弹性蛋白酶的胞外分泌、趋化作用和杀细菌作用)的作用。
A、来自人血的嗜中性粒细胞制品
将来自健康志愿者的肝素化血液的一部分(8mL)涂层到3mL 7.3%FICOLL(Sigma,St.Louis,MO)和15.4% HYPAQUE(Sigma)的垫上,并在台式离心机(Beckman)中以900rpm于室温下离心30分钟。收集在FICOLL-HYPAQUE上方的富含嗜中性粒细胞的条带,以含有0.1%明胶的汉克斯平衡盐溶液(HBSS)洗涤。通过以0.2% NaCl低渗裂解来除去残余的红细胞。该嗜中性粒细胞制品以含0.1%明胶的HBSS洗涤两次,并立即使用。
B、由嗜中性粒细胞产生过氧化物的测量
嗜中性粒细胞激活的特点之一是产生过氧化物。许多激活剂可增强嗜中性粒细胞产生过氧化物。测量了本发明的PI3Kδ抑制剂对过氧化物产生的作用,该作用是通过三种不同激动剂行使的:TNF1α、IgG和fMLP,每个代表单独类型的激活剂。通过监测细胞色素C的减少而导致的吸光度的改变,来测量由嗜中性粒细胞产生的过氧化物,该方法为Green等人所述的方法的改良(pp.14.5.1-14.5.11 in Supp.12,Curr Protocols Immunol(Eds.,Colligan etal.)(1994)),如下。96孔板的每个孔以50μL的2mg/mL人纤维蛋白酶原溶液或IgG于4℃包被过夜。以PBS清洗所述孔,并向各孔加入如下试剂:50μL HBSS或过氧化物歧化酶(1mg/mL)、50μL HBSS或TNF1α(50ng/mL)、50μL细胞色素C(2.7mg/mL)和100μL纯化的人嗜中性粒细胞悬浮液(2×106个细胞/mL)。将平板以200rpm离心2分钟,监测550nm的吸光度2小时。为了测量产生的过氧化物的相对量,从所有数据中减去从含过氧化物歧化酶的孔获得的值,并以未加任何抑制剂的孔获得的值进行均一化(normalized)。
本发明的化合物以浓度依赖的方式抑制嗜中性粒细胞中由TNF诱导的过氧化物的产生。另外,本发明的化合物并未显著地抑制由IgG诱导的过氧化物的产生。
还研究了通过另外一个有效诱导剂(细菌肽甲酰化-Met-Leu-Phe(fMLP))诱导的本发明的化合物对过氧化物产生的作用。与TNF诱导的过氧化物产生相似,fMLP诱导的过氧化物产生也被本发明的化合物所抑制。这些结果显示本发明的PI3Kδ抑制剂化合物可以防止刺激物特异性诱导嗜中性粒细胞产生过氧化物,表明在此过程中涉及PI3Kδ。
C、嗜中性粒细胞胞外分泌弹性蛋白酶的检测
除了过氧化物的产生,激活的嗜中性粒细胞还响应释放几种蛋白酶,所述蛋白酶的作用是在炎症过程中破坏组织和软骨。作为蛋白酶释放的指示,检测了本发明的化合物对弹性蛋白酶的胞外分泌的影响。通过改良的Ossanna等人所述的方法(J Clin Invest,77:1939-1951(1986)),来定量弹性蛋白酶的胞外分泌,如下。在96孔板中,用溶于PBS(含0.01mg/mL细胞松弛素B、1.0μM叠氮化钠(NaN3)、5μg/mL L-甲硫氨酸和1μM fMLP)的fMLP刺激纯化的人嗜中性粒细胞(0.2×106)(以DMSO或溶于DMSO的系列稀释的本发明化合物处理)90分钟。在培育期结束时,将平板以1000rpm离心5分钟,转移90μL上清到10μL的10mM的弹性蛋白酶底物肽(MeO-suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA)溶液中,其中MeO-suc=甲氧基琥珀酰基;pNA=对硝基苯胺(Calbiochem,San Diego,CA)。在96孔平板读数仪中检测410nm的吸光度2小时。为了测量胞外分泌的弹性蛋白的相对量,所有的吸光度值以未加任何抑制剂的值均一化。本发明的PI3Kδ抑制剂化合物显著地抑制fMLP诱导的弹性蛋白酶的胞外分泌,并且是以剂量依赖的方式。
D、fMLP诱导的人嗜中性粒细胞迁移的检测
嗜中性粒细胞具有通过组织而迁移的内在能力,是最先到达炎症或组织损伤部位的细胞类型之一。测量了本发明的化合物对嗜中性粒细胞向fMLP浓度梯度迁移的作用。在进行迁移分析的前一天,以重组ICAM-1/Fc融合蛋白(Van der Vieren et al.,Immunity,3:683-690(1995))(25μg/mL溶于碳酸氢盐缓冲液中,pH 9.3)包被6孔板,在4℃放置过夜。洗涤后,向有或没有抑制剂的孔中加入1%琼脂糖溶液(溶于含0.5%牛血清白蛋白(BSA)的RPMI-1640中),将平板置于冰箱中,然后在凝固的琼脂糖上打洞,以产生空斑(每个孔中,在1个中心洞周围围绕6个外周洞)。
如上所述的获得人嗜中性粒细胞,并以5×106个细胞/mL重悬于补充0.5%BSA的RPMI培养基中。向嗜中性粒细胞悬浮液中加入等体积的培养基(含有DMSO或溶于DMSO的系列稀释的分析化合物)以后,将嗜中性粒细胞分装到所述外周洞中,而在中心洞放入fMLP(5μM)。将平板在37℃存在5% CO2条件下培育4小时,然后通过添加溶于D-PBS的1%戊二醛溶液来终止迁移。除去琼脂糖层以后,以蒸馏水洗涤孔并干燥。
在Nikon DIAPHOT倒置显微镜(1×物镜)录像工作站上使用NIH 1.61程序进行嗜中性粒细胞迁移的分析。使用Microsoft Excel和Table Curve 4(SSPS Inc.,Chicago IL)程序获得各研究条件的迁移指数。迁移指数定义为在代表迁移的嗜中性粒细胞数对每个细胞迁移的净距离作图的曲线下的面积。
本发明的PI3Kδ抑制剂化合物对嗜中性粒细胞的迁移有作用,以剂量依赖的方式抑制此种活性。
E、嗜中性粒细胞杀菌能力的检测
考虑到本发明的PI3Kδ抑制剂化合物能影响特定的嗜中性粒细胞功能,因此所述化合物是否影响嗜中性粒细胞介导的杀菌作用很令人感兴趣。根据Clark和Nauseef描述的方法(pp.7.23.4-7.23.6 in Vol.2,Supp.6,Curr ProtocolsImmunol(Eds.,Colligan et al.)(1994)),研究了所述化合物对嗜中性粒细胞介导的杀金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作用的影响。将纯化的人嗜中性粒细胞(5×106个细胞/mL)(以DMSO或溶于DMSO的系列稀释的本发明化合物处理)与自体同源的血清混合。洗涤过夜生长的金黄色葡萄球菌细胞,重悬于HBSS中,并以10∶1的比例加入血清调理的嗜中性粒细胞。通过在37℃培育20分钟,使嗜中性粒细胞通过噬菌作用而内在化细菌。以10单位/mL溶葡萄球菌酶在37℃培育5分钟,而杀死未内在化的细菌(noninternalized cell),总混合物在37℃旋转培育。在最高达90分钟的多个时间点,收回样品,稀释到水中以裂解嗜中性粒细胞。将适当的稀释液涂布于胰蛋白酶-大豆-琼脂平板上,计数过夜生长后的金黄色葡萄球菌集落,来计数活的细菌。
在以DMSO处理的样品(对照)和本发明化合物处理的样品中,嗜中性粒细胞介导的杀金黄色葡萄球菌作用相似。因此,PI3Kδ抑制剂不能显著地影响嗜中性粒细胞杀死金黄色葡萄球菌的能力,提示在此种嗜中性粒细胞功能途径中不涉及PI3Kδ。
实施例4
PI3Kδ在B淋巴细胞功能中的作用的表征
还研究了PI3-激酶抑制剂对B细胞功能的作用,所述B细胞功能包括经典的例如抗体的产生和特异刺激物诱导的增殖。
A、来自外周人血液的B细胞的制备和刺激
来自健康志愿者的肝素化的血液(200mL)与等体积的D-PBS混合,涂层到10×10mL的FICOLL-PAQUE(Pharmacia)上,并以1600rpm于室温下离心30分钟。从FICOLL/血清界面收集外周血单核细胞(PBMC),覆盖10mL牛血清(FBS),并以800rpm离心10分钟以除去血小板。洗涤后,将细胞与DYNAL抗体混合物(B细胞试剂盒)(Dynal Corp.,Lake Success,NY)在4-8℃培育20分钟。在除去未结合的抗体以后,将PBL与包被抗小鼠IgG的磁性小珠(Dynal)混合,在4-8℃温和摇动20分钟,然后在磁性小珠分离器上除去标记的非B细胞。重复此步骤一次。将B细胞重悬于含10%FBS的RPMI-1640中,并置于冰上直到使用。
B、人B细胞的抗体产生的检测
为了研究抗体产生,以50-75×103个细胞/孔,将B细胞分装到有或没有抑制剂的96孔板中,再加入IL-2(100U/mL)和PANSORB IN(Calbiochem)金黄色葡萄球菌细胞(1∶90,000)。24-36小时以后,除去部分培养基,并加入新鲜培养基(有或没有抑制剂)和IL-2。培养物在37℃、存在CO2的培养箱中再额外培育7天。移出各条件的样品(三个重复),通过ELISA测量来分析IgG和IgM。简言之,用在碳酸氢盐缓冲液中的150ng/mL驴抗人IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch,West Grove PA)或2μg/mL驴抗人IgG+IgM(H+L)(Jackson ImmunoResearch)包被IMMULON4 96孔板(50μl/孔),置于4℃下过夜。以含0.1% TWEEN-80的磷酸盐缓冲液(PBST)(350μL/孔)洗涤三次后,用溶于PBST中的3%山羊血清(100μL/孔)在室温下封闭1小时,加入在PBST中稀释的B细胞用过培养基的样品(100μL/孔)。对于IgG平板,稀释范围为1∶500-1∶10000,对于IgM,稀释范围为1∶50-1∶1000。1小时后,将平板暴露于生物素偶联的抗人IgG(100ng/mL)或抗人IgM(200ng/mL)(Jackson ImmunoResearch)下30分钟,然后加入链霉素-HRP(1∶20000)暴露30分钟,最后,加入含H2O2(1∶10000)的TMB溶液(1∶100)暴露5分钟,各步骤之间以3×PBST洗涤。以H2SO4溶液终止显色反应,平板在ELISA平板读数仪上读数。
本发明的化合物抑制抗体的产生。
C、响应细胞表面IgM刺激的B细胞增殖的测量
在上述实验中,用PANSORB IN刺激B细胞。使用抗IgM抗体测量了当通过B细胞表面IgM刺激B细胞时,本发明的化合物对B细胞增殖应答的作用。将在10% FBS/RPMI中的小鼠脾细胞(Balb/c)以每孔2×105个细胞铺种于96孔微量滴定板中。向细胞中加入以完全培养基适当稀释的分析抑制剂,并在加入刺激物之前将平板培育30-60分钟。在以分析抑制剂预培育后,向孔中加入终浓度为25μg/mL的对小鼠IgM μ-链特异性的山羊抗体的F(ab′)2制剂。将平板在37℃培育3天,在培育的最后4个小时向各孔加入1μCi的[3H]-胸腺嘧啶。将平板收集到纤维滤膜上,洗涤,并使用计数器(Matrix 96,Packard Instrument Co.,Downers Grove,IL)测定放射标记的掺入,表示为个数/分钟(CPM)。
本发明的化合物以剂量依赖的方式抑制抗IgM刺激的B细胞增殖。因为本发明的化合物抑制B细胞增殖,可以预想这些化合物和其它PI3Kδ抑制剂可以用来在临床上阻抑不需要的B细胞增殖。例如,在B细胞恶化中,多种分化阶段的B细胞显示不可调节的增殖。基于上述显示的结果,可以推断PI3Kδ选择性抑制剂可以用于控制、限制或抑制此类细胞的生长。
实施例5
PI3Kδ在T淋巴细胞功能中的作用的表征
检测了响应CD3+CD28共刺激的T细胞增殖。根据制造商的方法(Dynal),通过使用抗体包被的磁性小珠的阴性筛选,从健康人血液中纯化T细胞,并重悬于RPMI中。以DMSO或溶于DMSO中的系列稀释的本发明化合物处理所述细胞,并以1×105个细胞/孔铺种于预包被山羊抗小鼠IgG的96孔板中。然后向各孔加入分别为0.2ng/mL和0.2μg/mL的小鼠单克隆抗-CD3和抗-CD28抗体。将平板于37℃培育24小时,并加入[3H]-胸腺嘧啶(1μCi/孔)。再额外培育18小时,用自动细胞收集器收集细胞,洗涤,并定量掺入的放射活性。
尽管本发明的PI3Kδ抑制剂化合物已知抗CD3和抗CD28诱导的T细胞增殖,但是它的作用不像对B细胞的作用或多嗜中性粒细胞的某些功能的作用那么强烈。
实施例6
PI3Kδ在破骨细胞功能中的作用的表征
为了分析本发明的PI3Kδ抑制剂化合物对破骨细胞的作用,分离小鼠骨髓细胞,通过以巨噬细胞集落刺激因子-1(mCSF-1)和骨原壳蛋白(Osteoprotegerin)配体(OPGL)在含血清培养基(含有10%热灭活的FBS的αMEM;Sigma)中处理该细胞3天,使该细胞分化为破骨细胞。在第4天,当形成破骨细胞时,除去培养基并收集细胞。将所述破骨细胞在生长培养基(即含有1%血清和2%BSA的αMEM,以及含有55μg/mL OPGL和10ng/mL mCSF-1)中以105个细胞/孔铺种于牙本质切片上。3小时以后,将培养基更换为含1%血清和1%BSA、有或没有骨桥蛋白(osteopontin)(25μg/mL)和PI3K抑制剂(100nM)。每24小时更换培养基加入新鲜的骨桥蛋白和抑制剂。72小时后,除去培养基,以水洗涤牙本质表面以除去细胞碎片,并以酸性苏木精染色。洗掉过多的染料,用共聚焦显微镜定量坑的深度。
本发明的PI3-激酶抑制剂对破骨细胞功能有抑制作用。非特异性抑制剂LY294002和渥曼青霉素都能抑制破骨细胞活性。然而,本发明的PI3Kδ抑制剂化合物的作用更大,并且某些情况下几乎可以完全抑制破骨细胞活性。
实施例7
PI3Kδ在嗜碱细胞功能中的作用的表征
使用常规的组胺释放分析来评估本发明的化合物对嗜碱细胞功能的作用,通常根据Miura et al.,J Immunol,762:4198-206(1999)所述的方法。简言之,富集嗜碱细胞,并于37℃以0.1-1000nM的几个浓度的分析化合物进行预培养。然后,加入多克隆山羊抗人IgE(0.1μg/mL)或fMLP,并额外培养30分钟。使用自动荧光测量技术测量释放到上清中的组胺。
当以抗IgE刺激所述嗜碱细胞时,观察到本发明的化合物以剂量依赖性的形式减少组胺的释放。在1000nM时,此种组胺释放的阻抑基本达100%。当以fMLP刺激所述嗜碱细胞时,本发明的化合物没有任何作用。为了比较,在0.1nM和10,000nM时,分析非选择性PI3K抑制剂LY294002,显示在最高浓度对组胺释放的抑制接近100%。
这说明本发明的PI3Kδ活性抑制剂可以用于阻抑组胺的释放,组胺是过敏的介导物之一。由于在许多细胞类型中,多种PI3-激酶的活性是蛋白质运输、分泌和胞外分泌所必需的,因此上述结果也提示了其它细胞(例如肥大细胞)的组胺释放也可以被PI3-激酶δ选择性抑制剂所破坏。
化学合成实施例
下面提供本发明的化合物的特定非限制性实施例,以及该化合物合成的典型和通常的途径。本领域内应当理解可以根据合成化学的通用原理的需要来使用保护基团。通常在合成的最终步骤中,通过对本领域技术人员显而易见的碱性、酸性或氢化条件而除去这些保护基团。通过使用合适的操作和对化学药品功能的保护,此处没有详细描述的结构式(I)化合物的合成可以通过类似于下述方案的方法来完成。
除非另外说明,所有起始材料获自商业供应,并不经进一步纯化而使用。通过在250mm硅胶板上的薄层色谱(TLC)来分析所有反应和色谱组分,以紫外(UV)光或碘(I2)染料显色。通过快速色谱或反相高效液相色谱来纯化产物和中间物。
在合成实施例中使用如下缩写:aq(水性)、RT(室温)、H2O(水)、HCl(盐酸)、MeOH(甲醇)、TFA(三氟乙酸)、K2CO3(碳酸钾)、SOCl2(亚硫酰氯)、CH2Cl2(二氯甲烷)、DMF(二甲基甲酰胺)、AcOH(乙酸)、KOAc(乙酸钾)、TLC(薄层色谱)、HPLC(高效液相色谱)、HATU(O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯)、POCI3(三氯氧化磷)、NBS(N-溴代琥珀酰亚胺)、CH3CN(乙腈)、DIEA(二异丙基乙胺)、和NH3(氨)。
基本过程
可以通过下述方案和实施例来制备本发明的化合物。在WO2005/113554和White等人于2006年11月13日提出的题目为“用于治疗炎症性失调和癌症的噻吩并吡啶酮”的美国临时申请No.61608-3000100;以及美国专利Nos.6,518,277、6,667,300、6,949,535、6,800,620和公开的美国专利申请US 2006/0106038中,描述了适合于本领域技术人员制造本发明的化合物的另外方法和实例。
方案1
方案2
方案3
方案4
方案5
方案6
A3:1-甲基-5-硝基-1H-吡唑-4-羧酸苯酰胺。以DMF(3滴)处理溶于甲苯(10mL)的可商购的1-甲基-5-硝基-1H-吡唑-4-羧酸(2.5g,14.6mmol)溶液,然后添加亚硫酰氯(5.3mL,73.0mmol)。将得到的混合物回流加热16小时,然后冷却到室温。然后通过旋转蒸发,将冷却的溶液浓缩成为残渣。将该残渣溶解于二噁烷(10mL)中,然后以二异丙基乙胺(DIEA)(7.6mL,43.8mmol)处理,随后添加苯胺(1.67mL,18.3mmol)。将得到的混合物在室温下搅拌16小时,然后以H2O(75mL)处理。形成黄色沉淀,通过多孔玻璃漏斗(fritted glass funnel)的过滤,来收集沉淀。沉淀在真空电炉里于50℃干燥2.5小时。回收黄色固体的纯的产物。LC/MS(AP-ESI,AcOH 0.05%)m/z 247(MH+)。
A4:5-氨基-1-甲基-1H-吡唑-4-羧酸苯酰胺。以锌粉(2.39g,36.5mmol)在室温下处理溶于乙酸(25mL)的1-甲基-5-硝基-1H-吡唑-4-羧酸苯酰胺(1.5g,6.09mmol)溶液。将得到的混合物在室温搅拌20分钟,然后通过滤纸过滤。通过旋转蒸发,浓缩滤出液以得到残渣,将残渣溶解于二氯甲烷(20mL)中。然后将该溶液用饱和的碳酸氢钠水溶液(1×35mL)洗涤。加入乙酸乙酯(75mL),在加入饱和的氯化钠水溶液(20mL)。萃取有机层,并以乙酸乙酯(3×75mL)萃取水层。合并的有机相萃取液以硫酸镁干燥,过滤,并通过旋转蒸发浓缩,从而得到灰白色固体产物。LC/MS(AP-ESI,AcOH0.05%)m/z 217(MH+)。
A5:N-(2-甲基-4-苯氨基甲酰-2H-吡唑-3-基)-丙脒酸甲酯。以乙酸(10滴)处理溶于原丙酸三甲酯(trimethyl orthopropionate)的5-氨基-1-甲基-1H-吡唑-4-羧酸苯酰胺(1.1g,5.09mmol)溶液,然后将得到的溶液于100℃加热18小时。然后通过旋转蒸发将反应混合物浓缩,然后溶解于乙酸乙酯(25mL)中。该溶液以饱和碳酸氢钠水溶液(1×25mL)和H2O(1×25mL)洗涤。将有机相萃取液用硫酸镁干燥,过滤,并通过旋转蒸发浓缩形成残渣,以己烷(5mL)处理该残渣。形成沉淀,以滤纸过滤收集该沉淀。回收白色固体的产物,不需进一步纯化。LC/MS(AP-ESI,AcOH 0.05%)m/z 287(MH+)。
A6:6-乙基-1-甲基-5-苯基-1,5-二氢-吡唑[3,4-d]嘧啶-4-酮。以乙酸(0.30mL)于室温下处理溶于原丙酸三甲酯(5mL)的N-(2-甲基-4-苯氨基甲酰-2H-吡唑-3-基)-丙脒酸甲酯(760mgs,2.65mmol)溶液。将得到的溶液回流加热4天。将反应冷却到室温,形成白色沉淀。通过滤纸过滤所述反应混合物,回收褐色固体的产物。LC/MS(AP-ESI,AcOH 0.05%)m/z 255(MH+)。
A7:3-溴-6-(1-溴-乙基)-1-甲基-5-苯基-1,5-二氢-吡唑[3,4-d]嘧啶-4-酮。基本过程。以乙酸钾(1.35g,13.7mmol)处理溶于乙酸(11mL)的6-乙基-1-甲基-5-苯基-1,5-二氢-吡唑[3,4-d]嘧啶-4-酮溶液,随后缓慢滴加溴(0.704mL,13.7mL)看,将得到的混合物于100℃加热7小时。通过LC/MS观察到起始材料完全消失以后,将反应混合物倒入1∶1的饱和硫代硫酸钠/乙酸乙酯的搅拌混合物(20mL)中。分离水相层,以H2O(1×50mL)洗涤有机相层。然后将有机相萃取液用硫酸镁干燥,过滤,并通过旋转蒸发浓缩,形成淡白色固体的粗产物(864mg)。通过HPLC(5.0×25cm C-18 Vydac柱,含0.05%CHCO2H的10-20% CH3CN/H2O)纯化,然后冻干,得到白色固体的纯化产物。LC/MS(AP-ESI,AcOH 0.05%)m/z 413(MH+)。
C2:5-氨基-3-甲基-异噁唑-4-羧酸苯酰胺。将溶于吡啶(2.5mL)的可商购的5-氨基-3-甲基-异噁唑-4-羧酸(200mg,1.41mmol)和苯胺(321μL,3.52mmol)溶液冷却到-20℃,然后以三氯氧化磷(164μL,1.76mmol)处理。于-20℃处理25分钟以后,将反应混合物加热到室温16小时。以H2O(30mL)处理该反应混合物,并以乙酸乙酯(2×25mL)萃取水相。将合并的有机相萃取液用硫酸镁干燥,过滤,并通过旋转蒸发浓缩,得到粗产物。通过HPLC(5.0×25cm C-18 Vydac柱,含0.05% AcOH的10-20% CH3CN/H2O)纯化,然后冻干,得到白色固体的纯化产物。LC/MS(AP-ESI,AcOH 0.05%)m/z 218(MH+)。
C3:5-(2-氯-乙酰氨基)-3-甲基-异噁唑-4-羧酸苯酰胺。以氯乙酰氯(37μL,0.474mmol)处理溶于二氯甲烷(2mL)的5-氨基-3-甲基-异噁唑-4-羧酸苯酰胺(103mg,0.474mmol)溶液,在室温下搅拌16小时。然后以DIEA(83mL,0.474mmol)处理该溶液。20分钟以后,添加等量的氯乙酰氯(37μL,0.474mmol)和DIEA(83mL,0.474mmol)处理上述反应混合物。将溶液在室温搅拌45分钟,然后以1N HCl(5mL)处理。以乙酸乙酯(1×10mL)萃取水相。分离有机相层,然后用硫酸镁干燥,过滤,并通过旋转蒸发浓缩,得到粗产物。通过HPLC(5.0×25cm C-18 Vydac柱,含0.05% CHCO2H的10-20% CH3CN/H2O)纯化,然后冻干,得到白色固体的纯化产物。LC/MS(AP-ESI,AcOH 0.05%)m/z 294(MH+)。
C4:6-氯甲基-3-甲基-5-苯基-5H-异噁唑[5,4-d]嘧啶-4-酮。将溶于三氯氧化磷(7mL)的5-(2-氯-乙酰氨基)-3-甲基-异噁唑-4-羧酸苯酰胺(45mg,0.153mmol)溶液在密封管中于130℃加热1小时40分钟。然后通过旋转蒸发浓缩反应混合物,得到褐色残渣。将该残渣溶解于乙酸乙酯(10mL)中,以饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)处理。分离有机相层,以硫酸镁干燥,过滤,并通过旋转蒸发浓缩,得到不需纯化的纯产物。LC/MS(AP-ESI,AcOH0.05%)m/z 276(MH+)。
F2:3-氨基-吡啶-2-羧酸苯酰胺。向溶于吡啶(55mL)的3-氨基吡啶酸(2.0g,14.5mmol)的搅拌混合物中加入DIEA(10滴)。注意:起始材料可溶性不是很好。通过加热和超声来改进边缘溶解度,以试图增加溶解度。加入苯胺(3.3mL.36.2mmol),然后将反应混合物冷却到-20℃。10分钟以后,加入POCl3,搅拌反应4小时。加入水(50mL),将反应混合物搅拌18小时。然后通过中心玻璃漏斗过滤反应混合物,以二氯甲烷(2×150mL)萃取滤出液。以饱和碳酸氢钠水溶液(2×200mL)和H2O(1×200mL)洗涤合并的有机相萃取液。然后将该有机相萃取液用硫酸镁干燥,过滤,并浓缩得到粗产物。在ISCO自动***上进行纯化,以溶于二氯甲烷中的1-2%乙酸乙酯洗脱(30mL/分钟)超过1小时,得到纯产物。LC/MS(AP-ESI,AcOH 0.05%)m/z 214(MH+)。
F3:3-(2-氯-丙酰氨基)-吡啶-2-羧酸苯酰胺。于0℃向溶于二氯甲烷的3-氨基-吡啶-2-羧酸苯酰胺(457mg,2.14mmol)溶液中加入2-氯丙酰氯(0.212mL,2.14mmol)。40分钟以后,以H2O(10mL)处理反应混合物。分离水相层,并以二氯甲烷(1×15mL)萃取。合并有机相层,以硫酸镁干燥,过滤,浓缩得到浅灰色产物,不需进一步纯化。LC/MS(AP-ESI,AcOH 0.05%)m/z 304(MH+)。
F4:2-(1-氯-乙基)-3-苯基-3H-吡啶[3,2-d]嘧啶-4-酮。将溶于三氯氧化磷(5mL)的3-(2-氯-丙酰氨基)-吡啶-2-羧酸苯酰胺(625mg,2.06mmol)溶液在密闭管中于125℃加热48小时,然后冷却到室温,浓缩得到残渣。将该残渣溶解于乙酸乙酯/二氯甲烷(2∶1,30mL)中,然后以饱和碳酸氢钠溶液(1×50mL)洗涤,再以H2O(1×50mL)洗涤。然后将有机相层以硫酸镁干燥,过滤,并浓缩得到粗产物。在ISCO自动化***上纯化粗材料,以溶于二氯甲烷中的5-10%甲醇洗脱(30mL/分钟)超过1小时,得到纯产物。LC/MS(AP-ESI,AcOH 0.05%)m/z 286(MH+)。
F5:2-(1-氨基-乙基)-3-苯基-3H-吡啶[3,2-d]嘧啶-4-酮。将溶于7NNH3/MeOH的2-(1-氯-乙基)-3-苯基-3H-吡啶[3,2-d]嘧啶-4-酮(304mg,1.06mmol)溶液在密闭管中于85℃加热26.5小时,然后冷却到室温,浓缩得到产物。LC/MS(AP-ESI,AcOH 0.05%)m/z 267(MH+)。
化合物1:6-[1-(6-氨基-嘌呤-9-基)-乙基]-3-溴-1-甲基-5-苯基-1,5-二氢-吡唑[3,4-d]嘧啶-4-酮。通用步骤。以腺嘌呤(15mg,0.111mmol)处理溶于DMF(2mL)的3-溴-6-(1-溴-乙基)-1-甲基-5-苯基-1,5-二氢-吡唑[3,4-d]嘧啶-4-酮(45mg,0.109mmol)的搅拌溶液,随后添加碳酸钾(15mg,0.109mmol)。将得到的混合物在室温搅拌16小时,然后通过添加饱和氯化钠水溶液(5mL)来终止,得到白色沉淀。过滤以后,得到白色固体的产物:1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.26(apparent fine d,J=1.8Hz,1H),7.97(apparent fine d,J=2.2Hz,1H),7.59(m,2H),7.44(t,J=6.6Hz,1H),7.33(t,J=7.9Hz,1H),7.20(br s,2H),7.07(d,J=7.3,1H),5.43(q,J=6.6Hz,1H),3.84(apparent fine d,J=1.8,3H),1.70(d,J=7.0,3H);LC/MS(AP-ESI,AcOH 0.05%)m/z 468(MH+)。
化合物2:3-溴-1-甲基-5-苯基-6-[1-(9H-嘌呤-6-基硫烷基)-乙基]-1,5-二氢-吡唑[3,4-d]嘧啶-4-酮。根据化合物1中描述的通用步骤,以6-巯基嘌呤一水合物(11mg,0.06mmol)处理溶于DMF(2mL)的3-溴-6-(1-溴-乙基)-1-甲基-5-苯基-1,5-二氢-吡唑[3,4-d]嘧啶-4-酮(25mg,0.06mmol)溶液,随后添加碳酸钾(9mg,0.06mmol)。得到黄色固体产物:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.42(s,1H),8.38(fine d,J=2.6Hz,1H),7.54(brs,2H),7.32(m,1H),7.25(d,J=8.1,1H),7.08(t,J=7.7,1H),5.08(q,J=7.2,1H),3.92(apparentfine d,J=2.8Hz,1H),1.68(d,J=6.8,3H);LC/MS(AP-ESI,AcOH 0.05%)m/z485(MH+)。
化合物4:3-甲基-5-苯基-6-(9H-嘌呤-6-基硫甲基)-5H-异噁唑[5,4-d]嘧啶-4-酮。根据化合物1中描述的通用步骤,以6-巯基嘌呤一水合物(12.5mg,0.073mmol)处理溶于DMF(500μL)的6-氯甲基-3-甲基-5-苯基-5H-异噁唑[5,4-d]嘧啶-4-酮(20mg,0.073mmol)溶液,随后添加碳酸钾(10mg,0.073mmol)。通过HPLC(1×18mm C-18 Luna柱,含0.05% CHCO2H的10-20%CH3CN/H2O)纯化粗反应产物。冻干以后得到丝绒状白色固体的产物:1HNMR(400MHz,DMSOd6)δ 8.55(s,1H),8.45(brs,1H),7.55(m,5H),4.40(s,2H),2.44(s,3H);LC/MS(AP-ESI,AcOH 0.05%)m/z(MH+)392。
化合物5:6-(6-氨基-嘌呤-9-基甲基)-3-甲基-5-苯基-5H-异噁唑[5,4-d]嘧啶-4-酮。根据化合物1中描述的通用步骤,以腺嘌呤(10mg,0.111mmol)处理溶于DMF(500μL)的6-氯甲基-3-甲基-5-苯基-5H-异噁唑[5,4-d]嘧啶-4-酮(20mg,0.073mmol)的搅拌溶液,随后添加碳酸钾(15mg,0.109mmol)。通过HPLC(1×18mm C-18 Luna柱,含0.05% CHCO2H的10-20%CH3CN/H2O)纯化粗反应产物。冻干以后得到丝绒状白色固体的产物:1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.25(s,IH),8.20(s,IH),7.63(m,5H),5.14(s,2H),2.47(s,3H);LC/MS(AP-ESI,AcOH 0.05%)m/z(MH+)375。
化合物11:2-[1-(4-氨基-苯并咪唑-1-基)-乙基]-3-苯基-3H-吡啶[3,2-d]嘧啶-4-酮。向溶于DMF(500μL)的2-(1-氯-乙基)-3-苯基-3H-吡啶[3,2-d]嘧啶-4-酮(94mg,0.329mmol)的搅拌溶液中加入腺嘌呤(66mg,0.494mmol),随后添加碳酸钾(45mg,0.329mmol)。然后将得到的混合物于80℃加热1小时,冷却到室温,并以H2O(10mL)处理。将得到的混合物浓缩,得到粗产物,然后通过HPLC(250×21.20mm C-18 Luna柱,含0.05% CF3CO2H的10-20% CH3CN/H2O)纯化。冻干后得到白色固体的产物:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.83(m,1H),8.45(fine d,J=I.2Hz,1H),8.20(fine d,J=1.6Hz,1H),8.10(m,1H),7.85(m,1H),7.70(d,J=8.2Hz,1H),7.59(t,J=7.8Hz,1H),7.44(t,J=7.4Hz,1H),7.34(t,J=7.4Hz,1H),7.12(d,J=8.2Hz,1H),5.51(q,J=7.0Hz,1H),1.77(d,J=6.8Hz,3H).LC/MS(AP-ESI,AcOH 0.05%)m/z385(MH+)。
化合物12:3-苯基-2-[1-(9H-嘌呤-6-基氨基)-乙基]-3H-吡啶[3,2-d]嘧啶-4-酮。向溶于乙醇(1mL)的2-(1-氨基-乙基)-3-苯基-3H-吡啶[3,2-d]嘧啶-4-酮(328mg,1.23mmol)溶液中添加6-溴嘌呤(245mg,1.23mmol)和DIEA(429μL,2.46mmol)。将得到的溶液于85℃加热24小时,然后冷却到室温,并浓缩得到粗产物。然后通过HPLC(250×21.20mm C-18 Luna柱,含0.05%CF3CO2H的10-20% CH3CN/H2O)纯化。冻干后得到产物。LC/MS(AP-ESI,AcOH 0.05%)m/z 385(MH+)。
实施例9
PI3K的效力选择性和生物利用率的生化分析
使用20μM ATP的生化分析
使用上述实施例2中描述的方法,分析本发明的化合物对PI3Kδ的抑制活性和效力,以及相对于其它I类PI3K同功酶,对PI3Kδ的选择性。对PI3Kα(″α″)、PI3Kβ(″β″)、PI3γ(″γ″)和PI3Kδ(″δ″)给出了IC50值(μM)。为了说明化合物的选择性,分别给出了PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kγ的化合物的IC50值相对于PI3Kδ的IC50值的比值,“α/δ比值”、“β/δ比值”和“γ/δ比值”。
初始的选择性分析与实施例2中的选择性分析方法一致,除了在放射性标记检测中使用100μL Ecoscint。后来的选择性分析类似地使用相同的3倍的底物储液,除了该底物储液,还含有0.05mCi/mL γ[32P]ATP和3mM PIP2。后来的选择性分析还使用相同的3倍的酶储液,除了该酶储液还含有3nM的任意指定的PI3K亚型。
对于所有的选择性分析,对分析化合物称重,并溶解于100%DMSO中的10-50mM储液中(依赖于它们各自的溶解度),储存在-20℃。将化合物解冻(至室温或37℃),以水稀释到300μM,在从300μM以水制成3倍稀释的系列。从这些稀释液中,取20μL加入到分析孔中,旁边孔为酶(阳性)对照和无酶(背景)对照所用的水空白。剩余的分析基本根据实施例2中的选择性分析方法进行。
实施例10
PI3Kδ活性抑制剂的基于细胞的分析数据
使用上述实施例3中描述的方法,在嗜中性粒细胞(PMN)弹性蛋白酶释放的分析中,检测本发明的化合物的抑制活性和效力。
检测了本发明的化合物,显示本发明的化合物为PI3Kδ的选择性抑制剂;表1中显示了在本发明的范围内的某些特定化合物,以及选择的化合物的体外活性数据。
表1 选择的化合物和活性数据
本发明为清楚和理解的目的描述了特定实施方式作为参考,很明显本领域的技术人员可以在权利要求所定义的本发明的范围内进行进一步的改变和修饰。相应地,除了在权利要求中特别描述的那些限制,不对本发明做任何限制。
Claims (27)
1.一种式(I)所示的化合物或它们的药学上可接受的盐:
其中,U、V、W和Z各自独立地选自由CRa、N、NRb和O所组成的组中,
或者,U、V、W和Z中的至少一个为N,且U、V、W和Z中的其他几个选自由CRa、NRb、S和O所组成的组中,
并且,U、V、W和Z中的至少一个不是CRa,而且不是全部的U、V、W和Z均不是CRa;
A为任选取代的单环或者双环的环***,该环***含有至少两个氮原子作为环上成员,并且该***中的至少一个环是芳香族的;
X选自由C(Rc)2、C(Rc)2C(Rc)2、CH2CHRc、CHRcCHRc、CHRcCH2、CH=C(Rc)、C(Rc)=C(Rc)和C(Rc)=CH所组成的组中;
Y不存在(即,键),或者Y选自由S、SO、SO2、NH、N(Rc)、O、C(=O)、OC(=O)、C(=O)O和NHC(=O)CH2S所组成的组中;
R1选自由H、取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10烯基、取代的或未取代的C2-10炔基、取代的或未取代的C1-6全氟烃基、取代的或未取代的C3-8环烷基、取代的或未取代的C3-8杂环烷基、取代的或未取代的C1-4亚烷基C3-8环烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的芳基C1-4亚烷基ORe、取代的或未取代的杂芳基C1-4亚烃基N(Rd)2、取代的或未取代的杂芳基C1-4亚烷基ORe、取代的或未取代的C1-3亚烷基杂芳基、取代的或未取代的C1-3亚烷基芳基、取代的或未取代的芳基C1-6烷基、芳基C1-4亚烷基N(Rd)2、C1-4亚烷基C(=O)C1-4亚烷基芳基、C1-4亚烷基C(=O)C1-4亚烷基杂芳基、C1-4亚烷基C(=O)杂芳基、C1-4亚烷基C(=O)N(Rd)2、C1-6亚烷基ORd、C1-4亚烷基NRaC(=O)Rd、C1-4亚烷基OC1-4亚烷基ORd、C1-4亚烷基N(Rd)2、C1-4亚烷基C(=O)ORd和C1-4亚烷基OC1-4亚烷基C(=O)ORd所组成的组中;
Ra独立地选自由H、取代的或未取代的C1-6烷基、取代的或未取代的C3-8环烷基、取代的或未取代的C3-8杂环烷基、取代的或未取代的芳基、C1-3亚烷基芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基C1-3烷基、取代的或未取代的C1-3亚烷基杂芳基、卤素、NHC(=O)C1-3亚烷基N(Rd)2、NO2、ORe、CF3、OCF3、N(Rd)2、CN、OC(=O)Rd、C(=O)Rd、C(=O)ORd、芳基ORe、NRdC(=O)C1-3亚烷基C(=O)ORd、芳基OC1-3亚烷基N(Rd)2、芳基OC(=O)Rd、C1-4亚烷基C(=O)ORd、OC1-4亚烷基C(=O)ORd、C1-4亚烷基OC1-4亚烷基C(=O)ORd、C(=O)NRdSO2Rd、C1-4亚烷基N(Rd)2、C2-6亚烷基N(Rd)2、C(=O)NRdC1-4亚烷基ORe、C(=O)NRdC1-4亚烷基杂芳基、OC1-4亚烷基N(Rd)2、OC1-4亚烷基CH(ORe)CH2N(Rd)2、OC1-4亚烷基杂芳基、OC2-4亚烷基ORe、OC2-4亚烷基NRdC(=O)ORd、NRaC1-4亚烷基N(Rd)2、NRaC(=O)Rd、NRaC(=O)N(Rd)2、N(SO2C1-4烷基)2、NRa(SO2C1-4烷基)、SO2N(Rd)2、OSO2CF3、C1-3亚烷基芳基、C1-4亚烷基杂芳基、C1-6亚烷基ORe、C(=O)N(Rd)2、NHC(=O)C1-3亚烷基芳基、芳基OC1-3亚烷基N(Rd)2、芳基OC(=O)Rd、NHC(=O)C1-3亚烷基C3-8杂环烷基、NHC(=O)C1-3亚烷基杂芳基、OC1-4亚烷基OC1-4亚烷基C(=O)ORd、C(=O)C1-4亚烷基杂芳基和NHC(=O)卤素C1-6烷基所组成的组中;
Rb不存在,或者Rb选自由H、取代的或未取代的C1-6烷基、取代的或未取代的C3-8环烷基、取代的或未取代的C3-8杂环烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基C1-3烷基、C1-3亚烷基芳基、取代的或未取代的杂芳基、杂芳基C1-3烷基、取代的或未取代的C1-3亚烷基杂芳基、C(=O)Rd、C(=O)ORd、芳基ORe、芳基OC1-3亚烷基N(Rd)2、芳基OC(=O)Rd、C1-4亚烷基C(=O)ORd、C1-4亚烷基OC1-4亚烷基C(=O)ORd、C(=O)NRdSO2Rd、C1-4亚烷基N(Rd)2、C2-6亚烷基N(Rd)2、C(=O)NRdC1-4亚烷基ORe、C(=O)NRdC1-4亚烷基杂芳基、SO2N(Rd)2、C1-3亚烷基芳基、C1-4亚烷基杂芳基、C1-6亚烷基ORe、C1-3亚烷基N(Rd)2、C(=O)N(Rd)2、芳基OC1-3亚烷基N(Rd)2、芳基OC(=O)Rd和C(=O)C1-4亚烷基杂芳基所组成的组中;
Rc独立地选自由H、取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C3-8环烷基、取代的或未取代的C3-8杂环烷基、取代的或未取代的C1-4亚烷基N(Rd)2、取代的或未取代的C1-3亚烷基杂C1-3烷基、取代的或未取代的芳基杂C1-3烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的芳基C1-3烷基、取代的或未取代的杂芳基C1-3烷基、C1-3亚烷基芳基、取代的或未取代的C1-3亚烷基杂芳基、C(=O)Rd和C(=O)ORd所组成的组中;
或者在相同原子上或邻近连接的原子上的两个Rc能够环化,以形成具有3-8个环上成员的环,该环可以是任选取代的,并且可以包括选自NRd、O和S中的最多两个杂原子作为环上成员;
Rd选自由H、取代的或未取代的C1-10烷基、取代的或未取代的C2-10烯基、取代的或未取代的C2-10炔基、取代的或未取代的C3-8环烷基、取代的或未取代的C3-8杂环烷基、取代的或未取代的C1-3亚烷基N(Re)2、芳基、取代的或未取代的芳基C1-3烷基、取代的或未取代的C1-3亚烷基芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基C1-3烷基、以及取代的或未取代C1-3亚烷基杂芳基所组成的组中;
或者两个Rd基团与跟它们连接的氮原子一起形成5元环或6元环,该5环或6元环任选地含有第二个杂原子,该第二个杂原子为N、O或S;
Re选自由H、取代的或未取代的C1-6烷基、取代的或未取代的C3-8环烷基、取代的或未取代的芳基、以及取代的或未取代的杂芳基所组成的组中,
或者两个Re基团与跟它们连接的氮原子一起形成5元环或6元环,该5元环或6元环任选地含有第二个杂原子,该第二个杂原子为N、O或S;
所述A、R1、Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地任选地被1-3个取代基所取代,所述取代基选自由C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-8环烷基、C3-8杂环烷基、C1-6亚烷基ORe、C1-4亚烷基N(Re)2、芳基、C1-3亚烷基芳基、杂芳基、C(=O)ORe、C(=O)Re、OC(=O)Re、卤素、CN、CF3、NO2、N(Re)2、ORe、OC1-6全氟烃基、OC(=O)N(Re)2、C(=O)N(Re)2、SRe、SO2Re、SO3Re、氧代(=O)和CHO所组成的组中;以及
n为0或1。
2.根据权利要求1所述的化合物,其中,n为0,且V、W和Z中的一个为NRb。
3.根据权利要求1所述的化合物,其中,n为0,且V、W和Z中的一个为O。
4.根据权利要求1所述的化合物,其中,n为0,且V、W和Z中的一个为S。
5.根据权利要求1所述的化合物,其中,n为1,且V、W、U和Z中的一个为N,其它为CRa。
6.式(I)的化合物,其中,n为1,且V、W、U和Z中的两个为N,其它为CRa。
7.根据权利要求1-6中的任意一项所述的化合物,其中,A为任选取代的双环芳香基团。
8.根据权利要求7所述的化合物,其中,A含有嘧啶环或嘧啶酮环,且A任选地被最多3个取代基所取代。
9.根据权利要求7或8所述的化合物,其中,R1为任选取代的选自由苯基、杂芳基和C3-8环烷基所组成的组中的环。
10.根据权利要求9所述的化合物,其中,X为C(Rc)2。
11.根据权利要求9所述的化合物,其中,Y为键、NH或S。
12.根据权利要求10或11所述的化合物,其中,X为CH2或C(Rc)H,其中Rc为C1-C4烷基。
13.根据权利要求12所述的化合物,其中,X为C(Rc)H,且处于S构象。
14.根据权利要求9所述的化合物,其中,X和Y环化在一起形成下式的环:
15.根据权利要求1-14中的任意一项所述的化合物,其中,A为嘌呤基团,该嘌呤基团任选地被选自卤素、NH2、NHMe、NMe2、OH、SMe和Me中的最多3个取代基所取代。
16.根据权利要求1-13中的任意一项所述的化合物,其中,X为CHMe或CHEt。
17.根据权利要求15或16所述的化合物,其中,R1为苯基,该苯基任选地被选自由以下基团所组成的组中的1-3个取代基所取代:卤素、ORe、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、芳基、C3-8杂环烷基、杂芳基、CF3、NO2、N(Re)2、C(=O)ORe、SO2N(Re)2、CN、C(=O)Re、C(=O)N(Re)2、C1-4亚烷基N(Re)2、OC1-4全氟烃基、氧代和CHO。
18.一种药物组合物,其中,该药物组合物含有权利要求1-17中的任意一项所述的化合物,该化合物与至少一种药学上可接受的赋形剂混合在一起。
19.一种破坏白细胞功能的方法,其中,该方法包括使白细胞与有效量的权利要求1所述的化合物相接触。
20.一种治疗诊断为白血病的患者的方法,其中,该方法包括向所述患者施用有效量的权利要求1-17中的任意一项所述的化合物。
21.一种治疗诊断为淋巴瘤的患者的方法,其中,该方法包括向所述患者施用有效量的权利要求1-17中的任意一项所述的化合物。
22.一种治疗诊断为免疫失调的患者的方法,其中,该方法包括向所述患者施用有效量的权利要求1-17中的任意一项所述的化合物。
23.根据权利要求22所述的方法,其中,所述免疫失调选自哮喘、风湿性关节炎、多发性硬化和狼疮。
24.一种治疗诊断为高血压的患者的方法,其中,该方法包括向所述患者施用有效量的权利要求1-17中的任意一项所述的化合物。
25.一种治疗诊断为癌瘤或肉瘤的患者的方法,其中,该方法包括向所述患者施用有效量的权利要求1-17中的任意一项所述的化合物。
26.一种治疗诊断为骨再吸收失调的患者的方法,其中,该方法包括向所述患者施用有效量的权利要求1-17中的任意一项所述的化合物。
27.一种抑制磷脂酰肌醇3-激酶δ多肽的激酶活性的方法,其中,该方法包括使所述多肽与权利要求1所述的化合物相接触。
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