CN101909659A - 对淀粉样蛋白具有亲和性的新化合物的应用及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于检测沉积在生物组织中的淀粉样蛋白的试剂，所述试剂可以使用具有淀粉样蛋白亲和性且能抑制例如诱变性等毒性的化合物，以高灵敏度在体外和体内检测淀粉样蛋白。所述用于检测沉积在生物组织中的淀粉样蛋白的试剂包括下式(1)表示的化合物或其盐：其中A1、A2、A3和A4独立地表示碳或氮；R1是放射性卤素取代基；R2选自以下的基团：氢，羟基，甲氧基，羧基，氨基，N-甲基氨基，N，N-二甲基氨基和氰基；且m是0-2的整数，条件是，A1、A2、A3和A4中的至少1个表示碳，且R1与A1、A2、A3或A4所表示的碳键合。

Description

对淀粉样蛋白具有亲和性的新化合物的应用及制备方法
技术领域
本发明涉及对淀粉样蛋白具有亲和性的新化合物的应用及其制备方法，特别是涉及用于检测生物组织中的淀粉样蛋白的试剂，其可以在全身性淀粉样变性病和其他与淀粉样蛋白蓄积有关的疾病的诊断中用于检测病灶部位中的淀粉样蛋白。
背景技术
由被称作淀粉样蛋白的纤维状蛋白质在体内各种器官或组织中沉积而引发的疾病统称作淀粉样变性病。淀粉样变性病的共同特征是，富含β-折叠结构的被称作淀粉样蛋白的纤维状蛋白质在各种器官中***性地或在位点局部性地沉积，以至于在器官或组织中触发了功能异常。淀粉样蛋白一般是指生物体内各种淀粉样蛋白的前体蛋白例如淀粉样蛋白-β、突变型转甲状腺素蛋白和β2-微球蛋白聚集形成的蛋白凝聚物。淀粉样蛋白尽管是由任意的淀粉样蛋白的前体蛋白形成的，但是它们具有富含β-折叠的特征性结构。因此，能与β-折叠结构结合的化合物例如刚果红和硫磺素T的特征在于，它们与淀粉样蛋白具有亲和性。
根据淀粉样蛋白的沉积模式，淀粉样变性病分为全身性淀粉样变性病和局限性淀粉样变性病。
全身性淀粉样变性病是淀粉样蛋白沉积发生在全身各个部分的疾病。全身性淀粉样变性病的例子包括：家族性淀粉样变性病(其中肝脏内产生的淀粉样蛋白沉积在全身的各个器官而导致疾病)、老年性TTR淀粉样变性病(其中淀粉样蛋白沉积在心脏和大关节例如手关节中)、透析性淀粉样变性病(发生在长期透析患者的骨和关节等部位)、反应性AA淀粉样变性病(继发性淀粉样变性病，是由血清淀粉样蛋白A产生的淀粉样蛋白沉积导致的，所述血清淀粉样蛋白A是慢性炎性疾病例如慢性风湿病之后继发的急性期蛋白)、和免疫细胞性淀粉样变性病(其中由免疫球蛋白产生的淀粉样蛋白沉积在全身的各个器官中)。
局限性淀粉样变性病是淀粉样蛋白沉积仅发生在某些器官中的疾病。局限性淀粉样变性病的例子包括：脑淀粉样变性病例如阿尔茨海默病(其中淀粉样蛋白沉积在脑中)、脑血管淀粉样变性病和克雅病、内分泌淀粉样变性病(其中淀粉样蛋白沉积在伴随II型糖尿病的胰岛和胰岛素瘤中、或者沉积在心房中)、皮肤淀粉样变性病(其中淀粉样蛋白沉积在皮肤中)、和局限性结节性淀粉样变性病(其中结节状淀粉样蛋白沉积在皮肤和肺中)。
在全身性淀粉样变性病的情况下，如下进行淀粉样变性病的诊断：首先从皮肤、肾和胃肠道等可活组织检查的部位采集组织；并且用刚果红或硫磺素T将其染色。刚果红是一种对淀粉样蛋白的β-折叠结构具有高度亲和性的荧光性化合物，刚果红由于其定向性而在偏光显微镜下显示双折射，因此它可以选择性地染色组织中的淀粉样蛋白沉积物。同样地，硫磺素T也是对淀粉样蛋白具有亲和性的荧光性化合物，并可与刚果红同样地使用。在发现组织染色呈阳性后，组合利用抗体的免疫染色，进行确诊。然而，用刚果红或硫磺素T染色即使是在偏光显微镜下观察也往往难以判定为阳性。
另一方面，人们考虑用近年来广泛发展的图像诊断装置例如PET、SPECT和MRI来进行全身性淀粉样变性病的图像诊断。
然而，当刚果红和硫磺素T是被标记的、并且用作图像诊断的探针时，它们的存在问题是，与淀粉样蛋白的结合特异性较差，以至于不能获得良好的检测灵敏度。
此外，由于刚果红具有致癌性，它不适用于人体的诊断。
因此，已经提出，将作为刚果红衍生物的双-(3-羟基羰基-4-羟基)苯乙烯基苯(BSB)及其衍生物用作检测淀粉样蛋白的荧光试剂，它对全身性淀粉样蛋白具有高度的亲和性和检测灵敏度，可以用于体内检测(非专利文献14，专利文献7)。据报道，BSB与由脑淀粉样变性病和全身性淀粉样变性病产生的淀粉样蛋白具有高度亲和性，并且其结构中没有联苯胺结构，因此它几乎不存在致癌问题，并且可以是放射性标记的，用作图像诊断的探针。
另一方面，对于作为典型的脑淀粉样变性病的阿尔茨海默病(以下称作AD)，因为不能采集活检标本，因此已经尝试使用与淀粉样蛋白具有高度亲和性的化合物作为标记物来在体内检测AD。
用于脑内淀粉样蛋白的图像诊断的这样的探针大多是疏水性的低分子量化合物，其与淀粉样蛋白具有高度的亲和性，且脑转移性很高，并且用各种放射性核素例如11C、18F和123I标记。例如，有报告指出，11C或放射性卤素标记的化合物包括各硫磺素衍生物例如6-碘-2-[4′-(N，N-二甲基氨基)苯基]苯并噻唑(以下称作TZDM)和6-羟基-2-[4′-(N-甲基氨基)苯基]苯并噻唑(以下称作6-OH-BTA-1)(专利文献1，非专利文献3)；均二苯乙烯化合物例如(E)-4-甲基氨基-4′-羟基均二苯乙烯(以下称作SB-13)和(E)-4-二甲基氨基-4′-碘代均二苯乙烯(以下称作m-I-SB)(专利文献2，非专利文献4，非专利文献5)；苯并噁唑衍生物例如6-碘-2-[4′-(N，N-二甲基氨基)苯基]苯并噁唑(以下称作IBOX)和6-[2-(氟)乙氧基]-2-[2-(2-二甲基氨基噻唑-5-基)乙烯基]苯并噁唑(非专利文献6，非专利文献7)；DDNP衍生物例如2-(1-{6-[(2-氟乙基)(甲基)氨基]-2-萘基}亚乙基)丙二腈(以下称作FDDNP)(专利文献4，非专利文献8)；和咪唑并吡啶衍生物例如6-碘-2-[4′-(N，N-二甲基氨基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶(以下称作IMPY)(专利文献3，非专利文献9)。此外，对用于图像诊断的某些探针，已经进行了人体图像研究，并且报道了与正常人相比，在AD患者的脑中有显著的放射性蓄积(非专利文献10，非专利文献11，非专利文献12，非专利文献13)。
国际公开WO2007/002540号小册子公开了一系列具有与淀粉样蛋白有亲和性的基团的化合物，该基团通过乙二醇或聚乙二醇与放射性核素标记的位点连接(专利文献5)。
国际公开WO2007/063946号小册子公开了一系列化合物，其与五元芳香杂环基相连以防止它们在脑内代谢(专利文献6)。
[专利文献1]JP-T-2004-506723
[专利文献2]JP-T-2005-504055
[专利文献3]JP-T-2005-512945
[专利文献4]JP-T-2002-523383
[专利文献5]国际公开WO2007/002540小册子
[专利文献6]国际公开WO2007/063946小册子
[专利文献7]国际公开WO2005/016888小册子
[非专利文献1]J.A.Hardy & G.A.Higgins，“Alzheimer′s Disease：The Amyloid Cascade Hypothesis.”，Science，1992，256，p.184-185
[非专利文献2]G.McKhann等人，“Clinical diagnosis of Alzheimer′s disease：Report of the NINCDS-ADRDA Work Group underthe auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer′s Disease.”，Neurology，1984，34，p.939-944
[非专利文献3]Z.-P.Zhuang等人，“Radioiodinated Styrylbenzenes and Thioflavins as Probes for Amyloid Aggregates.”，J.Med.Chem.，2001，44，p.1905-1914
[非专利文献4]Masahiro Ono等人，“11C-labeled stilbenederivatives as Aβ-aggregate-specific PET imaging agents for Alzheimer′s disease.”，Nuclear Medicine and Biology，2003，30，p.565-571
[非专利文献5]H.F.Kung等人，“Novel Stilbenes as Probes for amyloid plaques.”，J.American Chemical Society，2001，123，p.12740-12741
[非专利文献6]Zhi-Ping Zhuang等人，“IBOX(2-(4′-dimethylaminophenyl)-6-iodobensoxazole)：a ligand for imaging amyloidplaques in the brain.”，Nuclear Medicine and Biology，2001，28，p.887-894
[非专利文献7]Furumoto Y等人，“[11C]BF-227：A New11C-Labeled2-Ethenylbenzoxazole Derivative for Amyloid-β Plaques Imaging.”，European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging，2005，32，Sup.1，P759
[非专利文献8]Eric D.Agdeppa等人，“2-Dialkylamino-6-Acylmalononitrile Substituted Naphthalenes(DDNP Analogs)：Novel Diagnostic and Therapeutic Tools in Alzheimer′s Disease.”，Molecular Imaging and Biology，2003，5，p.404-417
[非专利文献9]Zhi-Ping Zhuang等人，“Structure-Activity Relationship of Imidazo[1，2-a]Pyridines as Ligands for Detecting β-Amyloid Plaques in the Brain.”，J.Med.Chem，2003，46，p.237-243
[非专利文献10]W.E.Klunk等人，“Imaging brain amyloid in Alzheimer′s disease with Pittsburgh Compound-B.”，Ann.Neurol.，2004，55，p.306-319
[非专利文献11]Nicolaas P.L.G.Verhoeff等人，“In-Vivo Imaging of Alzheimer Disease β-Amyloid With[11C]SB-13 PET.”，American Journal of Geriatric Psychiatry，2004，12，p.584-595
[非专利文献12]Hiroyuki Arai等人，“[11C]-BF-227 AND PET to Visualize Amyloid in Alzheimer′s Disease Patients”，Alzheimer′s & Dementia：The Journal of the Alzheimor′s Association，2006，2，Sup.1，S312
[非专利文献13]Christopher M.Clark等人，“Imaging Amyloidwith I123 IMPY SPECT”，Alzheimer′s & Dementia：The Journal of the Alzheimer′s Association，2006，2，Sup.1，S342
[非专利文献14]D.M.Skovronsky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，2000，97，7609
发明内容
发明要解决的课题
如上所述，公开了各种化合物可以作为以淀粉样蛋白为对象的图像诊断的探针，并探索了其临床用途。
在正常小鼠中的实验结果表明，用[125I]标记的TZDM、IBOX和m-I-SB都会在施用2分钟后转移到脑内。但是，这些化合物从正常组织中的清除是不充分的，并且会随着施用后时间的推移而在脑中逐渐蓄积(JP-T-2005-512945；Zhi-Ping Zhuang等人，Nuclear Medicineand Biology，2001，28，p.887-894；H.F.Kung等人，J.Am.Chem.Soc.，2001，123，p.12740-12741)。当从正常组织中的清除不充分时，就出现了一个问题：在淀粉样蛋白蓄积位点不能获得足够的对比度。用[11C]标记的SB-13在大鼠的实验中显示了其具有从正常组织中的清除性能，但清除速率还谈不上足够快(Masahiro Ono等人，NuclearMedicine and Biology，2003，30，p.565-571)。
同时，据披露，如用[125I]标记的化合物的实验结果所示，具有咪唑并吡啶骨架的化合物例如IMPY具有在施用后转移到脑中并在淀粉样蛋白上蓄积的性质，其也具有与上述化合物不同的从正常组织中迅速消除的优良性质。但是，IMPY是一种在回复突变试验中呈阳性的化合物。为了将这种化合物用作图像诊断的探针，必须充分考虑剂量和给药方式(国际公开WO03/106439号小册子)。
据报道，FDDNP在回复突变试验中也是呈阳性的。(国际公开WO03/106439号小册子)。
靶向淀粉样蛋白的图像诊断探针优选是与淀粉样蛋白的亲和性优良并且像IMPY一样从正常组织中清除足够迅速，但是又能抑制毒性例如诱变性的化合物。但是，还没有公开过具有这种性质的化合物。
此外，根据我们的研究结果，已经证实了IMPY非特异性地蓄积在没有沉积淀粉样蛋白的白质或其它位置。作为AD诊断剂，必须使用能抑制淀粉样蛋白沉积部位以外的非特异性蓄积的化合物，但是还没有公开过这样的化合物。
本发明正是鉴于已经公开了作为靶向淀粉样蛋白的探针的各种化合物、但是还没有化合物被证实具有临床可接受的性质的情况下进行的，其目的在于通过提供对淀粉样蛋白具有亲和性的新化合物而能够在体内或体外以高灵敏度检测淀粉样蛋白。
解决颗题的方法
本发明人发现，具有咪唑并吡啶-苯基骨架或与之类似骨架(其苯基的碳连接有氧原子)的特定的新化合物与淀粉样蛋白具有亲和性，并且例如诱变性等毒性低，并且可以通过使用一系列这样的化合物作为探针，在体内或体外以高灵敏度检测淀粉样蛋白。由此完成了本发明。
即，根据本发明的一个方面，提供了用于检测沉积在生物组织中的淀粉样蛋白的试剂，所述试剂包括下式(1)表示的化合物：
Figure BPA00001171927200071
或其盐。具体地，上述式(1)表示的化合物或其盐为检测淀粉样蛋白提供高度特异性试剂。在此，用于检测淀粉样蛋白的高度特异性试剂是指具有如下性质的试剂：其在淀粉样蛋白中蓄积而在其它部位几乎不蓄积或者即使蓄积也能快速清除，由此在给药后的某一时间段的显像中，表现出高度的淀粉样蛋白显像特异性。
生物组织可以是已知在淀粉样变性病中淀粉样蛋白沉积于其上的各种组织。这种生物组织的典型实例包括脑、心、肺、胰脏、骨和关节，最典型的生物组织可举出脑。在脑为对象的情况下，典型的淀粉样变性病包括阿尔茨海默病和Lewy体痴呆。
在式(1)中，A1、A2、A3和A4独立地表示碳或氮，必要的是，它们中的至少1个表示碳。优选地，A1、A2、A3和A4中的3个以上表示碳，更优选地，它们全部表示碳。在式(1)中，R1与A1、A2、A3或A4表示的碳键合。R1的键合位置优选是A3表示的碳，即6位的碳。
在式(1)中，R1是放射性卤素取代基。作为R1，可以使用各种放射性卤素，优选选自18F，75Br，76Br，123I，124I，125I和131I的放射性卤素，更优选为18F或123I。
R2是选自以下的基团：氢，羟基，甲氧基，羧基，氨基，N-甲基氨基，N，N-二甲基氨基和氰基。R2优选是氢，羟基，羧基或氨基，更优选为氢或羟基，特别优选为羟基。
另外，m是0-2的整数。
根据特别优选的实施方案，本发明的式(1)的化合物选自2-(4′-乙氧基苯基)-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶，2-(4′-乙氧基苯基)-6-[125I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶，2-(4′-乙氧基苯基)-6-[131I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶，2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶，2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-[125I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶，2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-[131I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶，2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶，2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-6-[125I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶，2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-6-[131I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶，2-(3′-乙氧基苯基)-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶，2-(3′-乙氧基苯基)-6-[125I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶，2-(3′-乙氧基苯基)-6-[131I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶，2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶，2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-[125I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶，2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-[131I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶，2-[3′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶，2-[3′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-6-[125I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶和2-[3′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-6-[131I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶，本发明的优选的淀粉样蛋白检测试剂是包括这些化合物或其盐的淀粉样蛋白检测试剂。
上述式(1)的化合物是新化合物，根据本发明的另一个方面，提供了放射性卤素标记的有机化合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
制备反应溶液的步骤，所述反应溶液包含下式(2)表示的化合物或其盐与放射性卤离子：
Figure BPA00001171927200091
其中A1、A2、A3和A4独立地表示碳或氮，
R3选自以下的基团：非放射性卤素取代基，硝基，烷基链具有1-4个碳原子的三烷基铵基，烷基链具有1-4个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基和三苯基甲锡烷基，
R4选自以下的基团：氢，羟基，甲氧基，羧基，氨基，N-甲基氨基，N，N-二甲基氨基和氰基，且
m是0-2的整数，
条件是，A1、A2、A3和A4中的至少1个表示碳，且R3与A1、A2、A3或A4表示的碳键合，
以及，
向反应溶液赋予反应条件，以合成下式(1)表示的化合物或其盐的步骤：
Figure BPA00001171927200092
其中A1、A2、A3和A4独立地表示碳或氮，
R1是放射性卤素取代基，
R3选自以下的基团：氢，羟基，甲氧基，羧基，氨基，N-甲基氨基，N，N-二甲基氨基和氰基，且
m是0-2的整数，
条件是，A1、A2、A3和A4中的至少1个表示碳，且R1与A1、A2、A3或A4表示的碳键合。
在式(2)中，A1、A2、A3和A4独立地表示碳或氮，必要的是，它们中的至少1个表示碳。优选地，A1、A2、A3和A4中的3个以上表示碳，更优选地，它们全部表示碳。在式(2)中，R3与A1、A2、A3或A4表示的碳键合。R3的键合位置优选是A3表示的碳，即6位的碳。
制备包含上述式(2)所示前体化合物或其盐和放射性卤离子的反应溶液的步骤可以如下进行，例如，将所述前体化合物或其盐溶解在惰性有机溶剂中，向其中添加由公知方法得到的包含放射性卤离子的溶液。
作为惰性有机溶剂，可以使用与所述前体化合物或其盐和放射性卤离子之间不具有反应性的各种溶剂，例如，当使用的放射性卤素是放射性碘时，可以优选使用甲醇；当使用的放射性卤素是放射性氟时，可以优选使用乙腈。
对于在合成上述式(1)表示的化合物或其盐的步骤中向反应溶液赋予的反应条件没有特别限制，只要它是允许进行用被添加到反应溶液中的放射性卤离子置换式(2)化合物的R3的反应的条件即可，并且可以使用适合放射性卤离子的种类的公知反应条件。
在本发明的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法中，作为放射性卤离子，例如，可以使用18F，75Br，76Br，123I，124I，125I或131I。
当制备其中R1表示的放射性卤素取代基是123I，124I，125I或131I的式(1)的化合物时，分别使用123I离子，124I离子，125I离子或131I离子作为放射性卤离子，并且，作为式(2)的化合物，优选使用其中R3是碘、溴，烷基链具有1-4个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基或三苯基甲锡烷基取代基，并更优选其中R3是碘，三甲基甲锡烷基取代基，三丁基甲锡烷基取代基和三苯基取代基的化合物。
在制备其中R1表示的放射性卤素取代基是18F的式(1)的化合物时，使用18F离子作为放射性卤离子，并且，作为式(2)的化合物，优选使用其中R3是硝基取代基或烷基链具有1-4个碳原子的三烷基铵基取代基的化合物。
在制备其中R1表示的卤素取代基是75Br或76Br的式(1)的化合物时，分别将75Br离子或76Br离子用作放射性卤离子，并且，作为式(2)的化合物，优选使用其中R3是溴的化合物。
根据本发明的另一个方面，提供了用于合成放射性卤素标记的有机化合物的前体化合物或其盐，该前体化合物由下式(2)表示：
Figure BPA00001171927200111
在式(2)中，A1、A2、A3和A4独立地表示碳或氮，必要的是，它们中的至少1个表示碳。优选地，A1、A2、A3和A4中的3个以上表示碳，更优选地，它们全部表示碳。在式(2)中，R3与A1、A2、A3或A4表示的碳键合。优选R3的键合位置是A3表示的碳，即6位的碳。
在式(2)中，R3选自以下的基团：非放射性卤素取代基，硝基，烷基链具有1-4个碳原子的三烷基铵基，烷基链具有1-4个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基和三苯基甲锡烷基。作为非放射性卤素取代基，可以使用能够作为使用放射性氟进行亲核取代反应的靶标的卤素，或者能够作为用放射性碘进行同位素交换反应的靶标的卤素，优选可以使用氯、碘或溴。作为三烷基甲锡烷基取代基，可以使用各种取代基，优选使用三甲基甲锡烷基取代基和三丁基甲锡烷基取代基。
R4选自以下的基团：氢，羟基，甲氧基，羧基，氨基，N-甲基氨基，N，N-二甲基氨基和氰基。R4优选是氢，羟基，羧基或氨基，更优选为氢或羟基，特别优选为羟基。
另外，m是0-2的整数。
发明效果
根据本发明，可以得到淀粉样蛋白检测试剂及其制备方法以及制备用中间体，该淀粉样蛋白检测试剂对淀粉样蛋白具有亲和性，因此可用于广泛的与淀粉样变性病有关的淀粉样蛋白的体外和体内检测。
附图说明
图1是2-[4′-(2-羟基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(非放射性碘化形式)的合成路线。
图2是6-三丁基甲锡烷基-2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶的合成路线。
图3是2-(4′-乙氧基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(非放射性碘化形式)的合成路线。
图4是6-三丁基甲锡烷基-2-(4′-乙氧基苯基)咪唑并[1，2-a]吡啶的合成路线。
图5(a)是注射123I-IMPY后的脑切片的放射自显影图，图5(b)是硫磺素T染色的样品的荧光显微镜图像(注射淀粉样蛋白混悬液的位点的放大图)。
图6(a)是注射2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶后的脑切片的放射自显影图，图6(b)是硫磺素T染色的样品的荧光显微镜图像(注射淀粉样蛋白混悬液的位点的放大图)。
图7(a)是注射2-(4′-乙氧基苯基)-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶后的脑切片的放射自显影图，图7(b)是硫磺素T染色的样品的荧光显微镜图像(注射淀粉样蛋白混悬液的位点的放大图)。
图8是2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(非放射性碘化形式)的合成路线。
图9是6-三丁基甲锡烷基-2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶的合成路线。
图10是2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(非放射性碘化形式)的合成路线。
图11是6-三丁基甲锡烷基-2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶的合成路线。
图12(a)是注射化合物4后的脑切片的放射自显影图，图12(b)是硫磺素T染色的样品的荧光显微镜图像(注射淀粉样蛋白混悬液的位点的放大图)。
图13(a)是注射化合物6后的脑切片的放射自显影图，图13(b)是硫磺素T染色的样品的荧光显微镜图像(注射淀粉样蛋白混悬液的位点的放大图)。
图14是显示化合物1对淀粉样蛋白的结合能力的图。
图15是显示化合物6对淀粉样蛋白的结合能力的图。
具体实施方式
(用于制备放射性卤素标记的有机化合物的前体化合物的合成方法)
以下，以6-三丁基甲锡烷基-2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶为例，描述本发明一个方面的用于制备放射性卤素标记的有机化合物的前体化合物的合成方法。
为了合成6-三丁基甲锡烷基-2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶，首先，使4′-羟基苯乙酮与溴化铜反应，以制备2-溴-4′-羟基苯乙酮(图1，步骤1)。此时，反应可根据常规方法进行，例如在文献King，L.Carroll & Ostrum，G.Kenneth，Journal ofOrganic Chemistry，1964，29(12)，p.3459-3461中所述的方法。
然后，使上述制备的2-溴-4′-羟基苯乙酮与2-氨基-5-碘吡啶反应，以制备2-(4′-羟基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(图1，步骤2)。该步骤可以根据以下方法进行。
首先，将2-溴-4′-羟基苯乙酮和2-氨基-5-碘吡啶溶解于惰性溶剂例如乙腈中，使它们在回流温度彼此反应2-6小时，以产生2-(4′-羟基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶的氢溴酸盐，为白色沉淀。此时使用的溶剂可以是乙腈或通常用于类似反应的其它溶剂，例如甲醇和丙酮。反应温度可以是允许回流的温度，例如在溶剂是乙腈时为110℃。使用的溶剂的量可以是足以实现反应的量，然而，需要注意的是，如果溶剂过多，则难以获得反应产物的沉淀。例如，当使用相当于10mmol量的2-溴-4′-羟基苯乙酮进行反应时，使用的溶剂的量可以为约40-80mL。
然后，将反应溶液过滤以回收沉淀。将白色沉淀混悬在甲醇/水(1∶1)的混合液中。然后，向其中添加相对于混悬的沉淀物为非常大地过量的饱和碳酸氢钠水溶液，以释放作为沉淀的2-(4′-羟基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶。将新生成的沉淀过滤，以回收作为本步骤的目标化合物的2-(4′-羟基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(图1，步骤2)。甲醇/水的混合液的量没有特殊限制，只要它足以实现反应即可。然而，需要注意的是，如果混合液的量过多，则会妨碍产物的析出。例如，当使用相当于10mmol量的2-溴-4′-羟基苯乙酮时，甲醇/水的混合液的使用量可以是约40-100mL。对于碳酸氢钠的量没有特殊限制，只要其相对于作为反应底物的上述沉淀是非常大地过量即可。例如，当反应在上述条件下进行时，添加到反应溶液中的饱和碳酸氢钠水溶液的量可为约50mL。
在此，另外使2-溴乙醇和叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSC1)相互反应，以制备1-溴-2-(叔丁基二苯基甲硅烷氧基)乙烷(图1，步骤3)。此时，反应可根据常规方法进行，例如在文献(Organic Syntheses，Coll.Vol.10，p.170(2004)；Vol.79，p.59(2002))中所述的方法。
然后，将上述制备的2-(4′-羟基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶充分干燥，溶解于N，N-二甲基甲酰胺，并向其中添加碳酸钾和1-溴-2-(叔丁基二苯基甲硅烷氧基)乙烷。将该混合物在大约90℃搅拌约2小时后，添加饱和氯化钠水溶液，随后用乙酸乙酯萃取，并将乙酸乙酯层浓缩，进行色谱纯化，得到2-[4′-(2″-叔丁基二苯基甲硅烷氧基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(图1，步骤4)。碳酸钾的量可以是可中和反应过程中从1-溴-2-(叔丁基二苯基甲硅烷氧基)乙烷生成的氢溴酸的量，并典型地是另一种反应原料1-溴-2-(叔丁基二苯基甲硅烷氧基)乙烷的约2-3倍的摩尔比。另外，1-溴-2-(叔丁基二苯基甲硅烷氧基)乙烷可以以相对于反应底物过量的量使用，并典型地为反应底物2-(4′-羟基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶的约1.5倍的摩尔比。
然后，使用四丁基氟化铵将得到的2-[4′-(2″-叔丁基二苯基甲硅烷氧基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶的叔丁基二苯基甲硅烷基脱保护，得到2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(图1，步骤5)。此时，该反应可根据常规方法进行，例如在文献(Organic Syntheses，Coll.Vol.9，p.417(1998)；Vol.74，p.248(1997))中所述的方法。
将所得的2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶溶解于二噁烷，并向溶液中添加三乙胺，随后添加双(三丁基锡)和催化量的四(三苯膦)钯。将该反应溶液在大约90℃加热以进行反应约24小时，然后蒸馏出溶剂，进行色谱纯化，得到作为目标产物的6-三丁基甲锡烷基-2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶(图2步骤1)。此时所使用的双(三丁基锡)的量可以是满足其相对于反应底物过量条件的量，具体地，它相对于反应底物2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶为约1.5倍的摩尔比。
可以用适合目的的各种双(三烷基锡)代替图2的步骤1中使用的双(三丁基锡)，来得到咪唑并吡啶环的6位取代基是三丁基甲锡烷基取代基以外的三烷基甲锡烷基取代基的化合物。例如，当合成6位取代基是三甲基甲锡烷基取代基的化合物时，可以在图2的步骤1中使用双(三甲基锡)进行与上述同样的反应。
可以在图1的步骤2中使用在吡啶环上碘的键合位置各不相同的各化合物来代替2-氨基-5-碘吡啶，来得到咪唑并吡啶环上的官能团的键合位置是6-位碳以外的碳原子的化合物。例如，当官能团的键合位置是咪唑并吡啶环的8-位上的碳时，可以在图1的步骤2中使用2-氨基-3-碘吡啶来代替2-氨基-5-碘吡啶。
(放射性卤素标记的有机化合物的合成方法)
以下，以放射性碘标记的化合物为例，描述根据本发明另一个方面的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法。
可以通过将如上述操作制备的标记前体化合物溶解于惰性有机溶剂，向其中加入通过公知方法获得的[123I]碘化钠溶液作为放射性卤离子，再向其中加入酸和氧化剂进行反应，以合成放射性碘标记的化合物。作为溶解标记前体化合物的惰性有机溶剂，可以使用与标记前体及[123I]碘化钠等之间不具有反应性的各种溶剂，优选可以使用甲醇。
作为酸，可以使用各种酸，优选盐酸。
对氧化剂没有特别限定，只要它可以在反应液中氧化碘即可，优选过氧化氢或过乙酸。氧化剂的添加量可以为足以氧化反应液中的碘的量。
可以通过用适合目的的放射性卤素来标记符合合成目的的标记前体，来合成用碘以外的放射性卤素标记的化合物。例如，为了合成6-[18F]氟-2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶，可以使标记前体2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-硝基咪唑并[1，2-a]吡啶与[18F]氟离子在相转移催化剂和碳酸钾的存在下反应。
(本发明检测试剂的制备方法和使用方法)
根据前体蛋白的种类不同，淀粉样蛋白具有许多不同结构，但它们的共同点是具有β-折叠结构。已知以淀粉样蛋白为对象的许多染色试剂例如硫磺素T和刚果红靶向该β-折叠结构，并且对不同种类的淀粉样蛋白具有同等的染色能力。
本发明的式(1)的化合物对以淀粉样蛋白β-蛋白(下文称作Aβ)为前体化合物的淀粉样蛋白具有亲和性，并且还具有抑制已知能结合广泛的淀粉样蛋白的硫磺素T与淀粉样蛋白结合的活性。
因此，认为本发明的式(1)的化合物与硫磺素T同样，对淀粉样蛋白的β-折叠结构具有亲和性。这启示本发明式(1)和(2)的化合物对各种淀粉样蛋白具有相同的亲和性。
即，本发明的淀粉样蛋白检测试剂可以与硫磺素T和刚果红同样地用于诊断全身性淀粉样变性病和局限性淀粉样变性病。全身性淀粉样变性病包括免疫球蛋白性淀粉样变性病、反应性AA淀粉样变性病、家族性淀粉样变性病、透析淀粉样变性病、老年性淀粉样变性病等。局限性淀粉样变性病包括脑淀粉样变性病、内分泌淀粉样变性病、皮肤淀粉样变性病和局限性结节性淀粉样变性病等。
本发明的淀粉样蛋白检测试剂不仅可以用作体外活组织检查使用的试剂，而且由于使用了能抑制诱变性等毒性的化合物，因此可以作为放射性诊断剂在体内使用。
本发明的淀粉样蛋白检测试剂，可以与其他一般公知的放射性诊断剂同样地，配制成将上述式(1)的放射性卤素标记的化合物根据期望混入任选调节至适当pH的水、生理盐水或林格液等而成的溶液。此时，应将本发明化合物的浓度调节至不超过确保本发明化合物稳定性的浓度。对本发明化合物的剂量没有特别限制，只要它足以得到所给予试剂的分布图像即可。例如，就碘-123(123I)标记的化合物和氟-18(18F)标记的化合物而言，可以通过静脉内或局部给予约50-600MBq/60kg成人体重。可以通过公知方法使所给予的试剂分布显像。例如，可以通过SPECT装置使碘-123(123I)标记的化合物显像，另外可以通过PET装置使氟-18(18F)标记的化合物显像。
通过对生物体给予本发明的淀粉样蛋白检测试剂，可以使沉积在生物组织例如脑、心脏、肺、消化道、血管、肝、胰脏、肾、关节和骨中的淀粉样蛋白显像，并且用于使难以活检采集的生物组织例如脑、心脏、肺、胰脏、骨和关节中的淀粉样蛋白沉积显像。
实施例
以下通过实施例、比较例和参考例更详细地描述本发明。然而，以下的例子决不限制本发明的范围。
在以下实施例中，用于实验的各化合物的名称如表1中所定义。
表1
  化合物名   通用名
  化合物1   2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶
  化合物2   2-(4′-乙氧基苯基)-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶
  化合物3   2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶
  化合物4   2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶
  化合物5   2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶
  化合物6   2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶
  化合物7   2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶
  化合物8   2-(4′-乙氧基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶
化合物9   6-三丁基甲锡烷基-2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶
实施例1：2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡 啶(非放射性碘化形式)的合成
向28.17g(相当于126mmol)的溴化铜添加50mL乙酸乙酯以得到混悬液，向其中添加8.18g(相当于60.0mmol)的4′-羟基苯乙酮在50mL乙酸乙酯和50mL氯仿的混合液中的溶液。然后，将得到的混合物加热回流。5小时后，将反应混合物冷却到室温并过滤。减压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯，通过添加活性碳进行脱色操作。然后，过滤浓缩得到的溶液。得到的粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱溶剂：氯仿/甲醇＝20/1)，从乙酸乙酯/石油醚中重结晶，得到7.25g(相当于33.7mmol)的2-溴-4′-羟基苯乙酮(图1，步骤1)。
将441mg(相当于2.0mmol)的2-溴-4′-羟基苯乙酮和449mg(相当于2.0mmol)的2-氨基-5-碘吡啶溶解于15mL乙腈。将得到的溶液在油浴中在110℃加热回流5小时。在反应完成后，将反应溶液冷却到室温，过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀，减压干燥。将得到的粗结晶混悬于10mL水和10mL甲醇的混合液中。然后，向其中添加约10mL的饱和碳酸氢钠水溶液，使用超声洗涤机将混合物超声处理5分钟。从得到的混合物过滤回收沉淀，用水充分洗涤，减压干燥，得到526mg(相当于1.56mmol)的2-(4′-羟基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(图1，步骤2)。
另外，将2.50g(相当于20.0mmol)的2-溴乙醇和2.72g(相当于40.0mmol)的咪唑溶解于10mL的二甲基甲酰胺(DMF)中，冷却到0℃。然后向其中添加5.50g(相当于20.0mmol)的叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSC1)。将反应混合物室温搅拌18小时后，添加饱和氯化钠水溶液，用乙酸乙酯萃取3次。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。得到的粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱溶剂：己烷/乙酸乙酯＝10/1)，得到7.04g(相当于19.4mmol)的1-溴-2-(叔丁基二苯基甲硅烷氧基)乙烷(图1，步骤3)。
将200mg(相当于0.595mmol)的2-(4′-羟基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶溶解于3.0mL的二甲基甲酰胺中，向其中添加247mg(相当于1.79mmol)的碳酸钾。然后向其中添加259mg(相当于0.714mmol)的1-溴-2-(叔丁基二苯基甲硅烷氧基)乙烷。将反应混合物在90℃搅拌2小时后，添加饱和氯化钠水溶液，用乙酸乙酯萃取3次。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。得到的粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱溶剂：己烷/乙酸乙酯＝2/1)，得到368mg(相当于0.595mmol)的2-[4′-(2″-叔丁基二苯基甲硅烷氧基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(图1，步骤4)。
将368mg(相当于0.595mmol)的2-[4′-(2″-叔丁基二苯基甲硅烷氧基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶溶解于1.0mL的四氢呋喃(THF)，向其中添加0.70mL的1.0mol/L四丁基氟化铵(TBAF)的四氢呋喃溶液。将反应混合物室温搅拌2小时后，添加氯化铵水溶液，随后添加5.0mL水和2.0mL乙腈。然后将析出的沉淀过滤。过滤的沉淀依次用水和乙腈洗涤，得到226mg(相当于0.595mmol)的2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(图1，步骤5)。
得到的2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶的NMR测定结果(内标物：四甲基硅烷)如下所示。
使用的NMR装置：JNM-ECP-500(由日本电子株式会社(JEOL)制)
1H-NMR(溶剂：二甲亚砜-d6；共振频率：500MHz)：δ8.95(s，1H)，8.27(s，1H)，7.87(d，J ＝8.7Hz，2H)，7.54-7.46(m，2H)，7.04(d，J＝8.7Hz，2H)，4.04(t，J＝4.6Hz，2H)，3.73(t，J＝4.6Hz，2H)。
13C-NMR(溶剂：二甲亚砜-d6，共振频率：125MHz)：δ158.9，143.0，142.4，133.5，131.5，127.1，124.4，116.7，114.8，108.1，76.7，69.5，59.4
实施例2：6-三丁基甲锡烷基-2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-咪 唑并[1，2-a]吡啶的合成
将100mg(相当于0.263mmol)实施例1中得到的2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶溶解于4.0mL的二噁烷，向其中添加2.0mL的三乙胺。然后向其中添加0.20mL(相当于0.39mmol)的双(三丁基锡)和20.1mg(催化量)的四(三苯膦)钯。将反应混合物在90℃搅拌21小时后，减压蒸馏出溶剂。残余物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱溶剂：己烷/乙酸乙酯＝1/2)，得到75.3mg(相当于0.139mmol)的6-三丁基甲锡烷基-2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶(图2，步骤1)。
得到的6-三丁基甲锡烷基-2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶的NMR测定结果(内标物：四甲基硅烷)如下所示。
使用的NMR装置：JNM-ECP-500(由日本电子株式会社(JEOL)制)
1H-NMR(溶剂：氯仿-d1；共振频率：500MHz)：δ7.98(s，1H)，7.89(d，J＝8.7Hz，1H)，7.75(s，1H)，7.56(d，J＝8.7Hz，1H)，7.15(d，J＝8.7Hz，1H)，6.98(d，J＝8.7Hz，1H)，4.13(t，J＝4.6Hz，2H)，3.99(t，J＝4.6Hz，2H)，2.63(s，3H)，1.64-1.51(m，6H)，1.36(六重峰，J＝7.3Hz，6H)，1.19-1.06(m，6H)，0.92(t，J＝7.3Hz，9H)。
13C-NMR(溶剂：氯仿-d1，共振频率：125MHz)：δ158.6，145.7，145.0，131.2，130.0，127.4，127.2，121.9，116.9，114.8，106.4，69.3，61.4，29.0，27.3，13.7，9.8
实施例3：2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-[ 123 I]碘咪唑并 [1，2-a]吡啶的合成
向60μL的6-三丁基甲锡烷基-2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶(浓度：1mg/mL)在甲醇/二甲亚砜(混合比：9/1)混合液中的溶液中，添加150μL的1mol/L盐酸，15μL的1mmol/L碘化钠，250μL的274MBq的[123I]碘化钠和15μL的10％(W/V)过氧化氢。将混合液在50℃静置10分钟后，将其在下述条件下进行HPLC，得到2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶级分。
HPLC条件：
柱：Phenomenex Luna C18(商品名；由Phenomenex公司制；规格：4.6×150mm)
流动相：含0.1％三氟乙酸的水/含0.1％三氟乙酸的乙腈＝80/20→0/100(17分钟)
流速：1.0mL/min
检测器：紫外可见吸光光度计(检测波长：282nm)和放射性计数器(由Raytest公司制；STEFFI型)
向该级分中添加10ml水。使所得溶液通过反相柱(商品名：Sep-Pak(注册商标)Light C8 Cartridges，Waters公司制；填充剂的填装量：145mg)，以使得该柱吸附收集2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶。用1mL水漂洗该柱，然后让1mL***通过，以洗脱2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶。在合成刚刚结束时，所得化合物的放射性活度是22MBq。另外，在下述条件下进行TLC分析，结果，该化合物的放射化学纯度是97％。
TLC分析条件：
TLC板：硅胶60F254(商品名；由默克公司制)
流动相：氯仿/甲醇/三乙胺＝100/1/2
检测器：Rita Star(商品名；由Raytest公司制)
实施例4：2-(4′-乙氧基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(非放射 性碘化形式)的合成
向2.72g(相当于12.2mmol)的溴化铜添加30mL乙酸乙酯，得到混悬液，向其中添加1.00g(相当于6.09mmol)的4′-乙氧基苯乙酮。然后，将混合物加热回流。3小时后，将反应混合物冷却到室温并过滤。然后，减压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯并浓缩。得到的粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱溶剂：己烷/乙酸乙酯＝10/1)，得到1.20g(相当于4.94mmol)的2-溴-4′-乙氧基苯乙酮(图3，步骤1)。
将1.20g(相当于4.94mmol)2-溴-4′-乙氧基苯乙酮和1.09g(相当于4.95mmol)2-氨基-5-碘吡啶溶解于20mL乙腈。将得到的溶液在油浴中在110℃加热回流1.5小时。在反应完成后，将反应溶液冷却到室温，过滤沉淀。然后，用乙腈洗涤沉淀，减压干燥。将得到的粗结晶混悬于10mL水和5mL甲醇的混合液中。然后向其中添加约20mL饱和碳酸氢钠水溶液，使用超声洗涤机将混合物超声处理10分钟。从得到的混合物过滤回收沉淀，用水充分洗涤，减压干燥，得到1.64g(相当于4.50mmol)的2-(4′-乙氧基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(图3，步骤2)。
得到的2-(4′-乙氧基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶的NMR测定结果(内标物：四甲基硅烷)如下所示。
使用的NMR装置：JNM-ECP-500(由日本电子株式会社(JEOL)制)
1H-NMR(溶剂：二甲亚砜-d6；共振频率：500MHz)：δ9.06(s，1H)，8.38(s，1H)，7.86(d，J＝8.7Hz，2H)，7.77-7.57(m，2H)，7.06(d，J＝8.7Hz，2H)，4.10(q，J＝6.9Hz，2H)，1.36(t，J＝6.9Hz，3H)。
13C-NMR(溶剂：二甲亚砜-d6，共振频率：125MHz)：δ159.3，141.1，140.3，135.9，132.0，127.3，122.1，115.3，114.9，108.5，78.6，63.2，14.5
实施例5：6-三丁基甲锡烷基-2-(4′-乙氧基苯基)咪唑并[1，2-a] 吡啶的合成
将364mg(相当于1.00mmol)实施例4中得到的2-(4′-乙氧基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶溶解于4.0mL的二噁烷，向其中添加2mL的三乙胺。然后向其中添加0.76mL(相当于1.5mmol)的双(三丁基锡)和76.3mg(催化量)的四(三苯膦)钯。将反应混合物在90℃搅拌23小时后，减压蒸馏出溶剂。残余物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱溶剂：己烷/乙酸乙酯＝5/1)，得到331mg(相当于0.628mmol)的6-三丁基甲锡烷基-2-(4′-乙氧基苯基)咪唑并[1，2-a]吡啶(图4的步骤1)。
得到的6-三丁基甲锡烷基-2-(4′-乙氧基苯基)咪唑并[1，2-a]吡啶的NMR测定结果(内标物：四甲基硅烷)如下所示。
使用的NMR装置：JNM-ECP-500(由日本电子株式会社(JEOL)制)
1H-NMR(溶剂：氯仿-d1；共振频率：500MHz)：δ7.96(s，1H)，7.88(d，J ＝8.7Hz，2H)，7.74(s，1H)，7.58(d，J＝8.7Hz，1H)，7.14(d，J＝8.7Hz，1H)，6.96(d，J＝8.7Hz，2H)，4.07(q，J＝6.9Hz，2H)，1.63-1.49(m，6H)，1.43(t，J＝6.9Hz，3H)，1.39-1.31(m，6H)，1.18-1.04(m，6H)，0.90(t，J＝7.3Hz，9H)。
13C-NMR(溶剂：氯仿-d1，共振频率：125MHz)：δ159.0，145.7，145.2，131.2，130.1，127.4，126.7，121.9，117.0，114.8，106.4，63.6，29.1，27.4，15.0，13.8，9.9
实施例6：2-(4′-乙氧基苯基)-6-[ 123  I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶的 合成
向60μL的6-三丁基甲锡烷基-2-(4′-乙氧基苯基)咪唑并[1，2-a]吡啶(浓度：1mg/mL)在甲醇/二甲亚砜(混合比：9/1)混合液的溶液中添加90μL的2mol/L盐酸，15μL的1mmol/L碘化钠，100μL的436MBq的[123I]碘化钠和15μL的10％(W/V)过氧化氢。将混合液在50℃静置10分钟后，将其在下述条件下进行HPLC，得到2-(4′-乙氧基苯基)-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶级分。
HPLC条件：
柱：Phenomenex Luna C18(商品名；由Phenomenex公司制；规格：4.6×150mm)
流动相：含0.1％三氟乙酸的水/含0.1％三氟乙酸的乙腈＝80/20→0/100(17分钟)
流速：1.0mL/min
检测器：紫外可见吸光光度计(检测波长：282nm)和放射性计数器(由Raytest公司制；STEFFI型)
向该级分中添加10ml水。使所得溶液通过反相柱(商品名：Sep-Pak(注册商标)Light C8 Cartridges，Waters公司制；填充剂的填装量：145mg)，以使得该柱吸附收集2-(4′-乙氧基苯基)-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶。用1mL水漂洗该柱，然后让1mL***通过，以洗脱2-(4′-乙氧基苯基)-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶。在合成刚刚结束时，所得化合物的放射性活度是88MBq。另外，在下述条件下进行TLC分析，结果，该化合物的放射化学纯度是98％。
TLC分析条件：
TLC板：硅胶60F254(商品名；由默克公司制)
流动相：氯仿/甲醇/三乙胺＝100/1/2
检测器：Rita Star(商品名；由Raytest公司制)
参考例1：[ 123 I]-IMPY的合成
根据下述步骤制备用于测定logP辛醇和评价脑中蓄积性的比较例中的[123I]-IMPY。
根据文献(Zhi-Ping Zhuang等人，J.Med.Chem，2003，46，p.237-243)中所述的方法，合成6-三丁基甲锡烷基-2-[4′-(N，N-二甲氨基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶，将其溶解于甲醇中(浓度：1mg/mL)。向53μL所得溶液中，加入75μL的1mol/L盐酸，60-70μL的224-253MBq[123I]碘化钠，10μL的1mmol/L碘化钠溶液和15μL的10％(W/V)过氧化氢。在将混合液在50℃下静置10分钟后，将该溶液在与实施例3相同的条件下进行HPLC，以得到[123I]-IMPY级分。
向该级分中添加10ml水。使所得溶液通过反相柱(商品名：Sep-Pak(注册商标)Light C8 Cartridges，Waters公司制；填充剂的填装量：145mg)，使得所述柱吸附收集[123]-IMPY。用1mL水漂洗该柱，然后让1mL***通过，以洗脱[123I]-IMPY。在合成结束时，所得化合物的放射性活度是41-57MBq。另外，在与实施例3相同的条件下进行TLC分析，结果，该化合物的放射化学纯度是93％。
实施例7，比较例1-3：与淀粉样蛋白亲和性的测定
通过以下体外结合试验来检验本发明化合物对淀粉样蛋白的亲和性。
(1)将Aβ1-42(由Wako公司制)溶解于磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，在37℃振荡72小时，得到1mg/mL的凝集Aβ(以下，在本实施例中，称作淀粉样蛋白)的混悬液(以下，在本实施例中，称作淀粉样蛋白混悬液)。
(2)根据文献(Naiki，H.，等人，Laboratory Investigation 74，p.374-383(1996))中所述的方法，通过使用硫磺素T(由Fluka制)的荧光分光光度法，对淀粉样蛋白混悬液进行定性实验，，以证实在(1)中得到的凝集的Aβ是淀粉样蛋白(测定条件：激发波长为446nm，荧光波长为490nm)。
(3)根据文献(Wang，Y.，等人，J.Labeled CompoundRadiopharmaceut.44，S239(2001))中所述的方法，从标记前体2-(4′-氨基苯基)苯并噻唑制备[125I]2-(3′-碘-4′-氨基苯基)苯并噻唑(以下称作[125I]3′-I-BTA-0)，将其溶解于乙醇中。将刚果红、硫磺素T和6-甲基-2-[4′-(N，N-二甲基氨基)苯基]苯并噻唑(以下称作6-Me-BTA-2)，直接以市售试剂的形式称重并使用。
(4)根据文献(Zhuang，Z.P.等人，J.Med.Chem.46，237(2003))中所述的方法来合成IMPY。
(5)将各评价化合物或其乙醇溶液、上述(3)中制备的[125I]3′-I-BTA-0的乙醇溶液和上述(1)中制备的淀粉样蛋白混悬液溶解于含有0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，分别制备各评价化合物、[125I]3′-I-BTA-0和淀粉样蛋白的最终浓度分别为如表2所示浓度的样品。
表2：样品溶液中的各化合物的最终浓度
Figure BPA00001171927200261
(6)将上述(5)中制备的各样品溶液填充到96孔微量培养板的各孔(体积约0.3mL)。将填充有样品溶液的微量培养板以指定速度(400rpm)在22℃下振荡3小时。然后让各样品溶液通过玻璃纤维过滤器(商品名；MulutiscreenTM-FC，Millipore公司制)过滤，以从游离的[125I]3′-I-BTA-0中分离出与淀粉样蛋白结合的[125I]3′-I-BTA-0。
(7)将用于过滤各样品溶液的玻璃纤维过滤器用含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液洗涤(0.5mL×5次)，然后用Autowell Gamma***(由Aloka公司制，型号：ARC-301B)测定该玻璃纤维过滤器的放射性(以下，A表示各评价化合物的浓度为零(0)的样品的放射性水平，B表示各评价化合物的浓度为0.001nmol/L以上的样品的放射性水平)。
(8)另外，制备包含15μmol/L的6-Me-BTA-2、400pmol/L的[125I]3′-I-BTA-0和1μmol/L淀粉样蛋白的溶液，进行与上述(6)和(7)中的同样操作，来测定放射性水平。将所测定的放射性水平定义为背景放射性水平(以下称作BG)，用于计算抑制率。
(9)使用在上述(7)和(8)中测定的放射性水平，通过下式(1)求出抑制率。
B - BG A - BG × 100 ( % ) - - - ( 1 )
绘制由所得抑制率进行概率单位变换得到的数值相对于评价化合物浓度的对数的图，以通过最小二乘法获得近似的直线。使用这条线，确定各评价化合物的50％抑制浓度(以下称作IC50％值)。使用该值作为指示，评价各各评价化合物与淀粉样蛋白的亲和性。
各评价化合物的IC50％值如表3所示。化合物3显示了低于100的IC50％值，与一般已知与淀粉样蛋白具有亲和性的刚果红和硫磺素T相比，显示出显著更高的与淀粉样蛋白的高度亲和性。这些结果表明，化合物3与IMPY同样，具有良好的淀粉样蛋白亲和性。
表3：本发明化合物的IC50％值
  实验   评价化合物   IC50％值(nmol/L)
  比较例1   刚果红   ＞1000
  比较例2   硫磺素T   ＞1000
  比较例3   IMPY   25.8
  实施例7   化合物3   66.9
实施例8-9，比较例4：基于辛醇萃取法的分配系数的测定
测定了基于辛醇萃取法的分配系数(以下称作logP辛醇)，其一般已知是化合物通过血脑屏障(以下称作BBB)的渗透性的指标。
将实施例3中制备的化合物1的***溶液(实施例8)、实施例6中制备的化合物2的***溶液(实施例9)、和参考例1中制备的[123I]-IMPY的***溶液(比较例4)分别用含有10mg/mL抗坏血酸的生理盐水稀释，调节放射性浓度至20-30MBq/ml。分别向2mL辛醇中各添加10μL所制备的样品溶液，再添加2mL的10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，随后搅拌30秒。在用低速离心机离心分离(2000rpm×60分钟)各混合液后，对辛醇层和水层各自取样1mL，用Autowell Gamma***(型号：ARC-301B，由Aloka制)测定放射性计数。使用所测得的放射性计数，根据式(2)计算logP辛醇。
Figure BPA00001171927200271
结果如表4所示。所有化合物显示的logP辛醇值都在1～3之间。已知能渗透通过BBB的化合物的logP辛醇值在1～3之间(Douglas D.Dischino等人，J.Nucl.Med.，(1983)，24，p.1030-1038)。因此表明，这两种化合物都具有与IMPY同样的BBB渗透性。
表4：本发明化合物的logP辛醇值
  实验   化合物   logP辛醇值
  比较例4   [123I]-IMPY   1.9
  实施例8   化合物1   1.8
  实施例9   化合物2   2.1
实施例10-11，比较例5：脑内转移性和清除性的测定
使用化合物1(实施例10)和化合物2(实施例11)，测定雄性Wistar大鼠(7周龄)的脑中放射性蓄积的经时变化。
将实施例3中制备的化合物1的***溶液(实施例10)、实施例6中制备的化合物2的***溶液(实施例11)、和参考例1中制备的[123I]-IMPY的***溶液(比较例5)分别用含有10mg/mL抗坏血酸的生理盐水稀释，以调节放射性浓度至8-12MBq/ml。在硫喷妥钠麻醉下，将0.05mL所制备的各样品溶液注射到大鼠的尾静脉中。在注射后2、5、30和60分钟，通过从腹部大动脉放血将这些大鼠处死，摘取脑，测定脑质量，再用单通道分析仪(检测器型号：SP-20，应用光研工业株式会社制)测定脑的放射性(以下，在本实施例中称作A)。此外，按照与上述同样的方式测定全身其余部分的放射性(以下，在本实施例中称作B)。使用这些测定结果，根据下述式(3)计算在各个时间点的每单位脑重量的放射性分布率(％ID/g)。
在各时间点使用3只动物进行实验。
Figure BPA00001171927200281
结果如5所示。如表5所示，化合物1和2与[123I]-IMPY同样，在注射后2分钟的时间点显示出显著的放射性蓄积，随后在60分钟内显示出迅速消除的趋势。这些结果启示，化合物1和2与[123I]-IMPY同样，具有优良的脑转移性以及从脑中的迅速清除性。
表5：本发明化合物在静脉注射后的脑内放射性分布率(大鼠)
Figure BPA00001171927200291
比较例6：使用注射淀粉样蛋白的大鼠模型进行的[ 123 I]-IMPY的 离体放射自显影图
(1)将Aβ1-40(株式会社肽研究所制)溶解于磷酸盐缓冲液(pH7.4)，在37℃下振荡72小时，得到1mg/mL的凝集Aβ混悬液(以下，在本实施例中，称作淀粉样蛋白混悬液)。
(2)将2.5μL(相当于25μg)的淀粉样蛋白混悬液注射到雄性Wistar大鼠(7周龄)一侧的杏仁核中。作为对照，将2.5μL的磷酸盐缓冲生理盐水溶液(pH 7.4)注射到该大鼠另一侧的杏仁核中。在注射淀粉样蛋白混悬液和磷酸盐缓冲生理盐水溶液(pH 7.4)1天后检查该大鼠。
(3)将[123I]-IMPY溶解于包含10mg/mL的抗坏血酸的生理盐水中，得到样品溶液(在样品溶液中，放射性浓度为29MBq/mL)。在硫喷妥钠麻醉于，将该溶液通过尾静脉注射到大鼠中(剂量：0.5mL，给予的放射性活度：相当于14.5MBq)。
(4)在注射60分钟后移取脑，用切片机(型号：CM3050S，由LEICA公司制)制成厚度10μm的脑切片。将该脑切片在成像板上曝光20小时，然后通过使用生物图像分析仪(型号：BAS-2500；由富士胶片株式会社制)进行图像分析。
5)在使用生物图像分析仪进行图像分析后，用硫磺素T进行病理学染色，通过使用荧光显微镜(由尼康公司制；型号：TE2000-U型；激发波长：400-440nm；检测波长：470nm)进行显像。从而证明了淀粉样蛋白沉积于切片上(图5b)。
图5显示了脑内注射淀粉样蛋白的大鼠的脑切片的放射自显影图和硫磺素T染色得到的图像。如该图所示，在注射了淀粉样蛋白混悬液一侧的杏仁核中观测到明显的放射性蓄积，但是在没有注射淀粉样蛋白的白质中也观察到了非特异性蓄积。
实施例12：脑中淀粉样蛋白的显像确认
进行下述实验以检验通过本发明的化合物是否可以使脑中的淀粉样蛋白显像。
(1)将Aβ1-42(和光纯药工业公司制)溶解于磷酸盐缓冲液(pH7.4)，并在37℃下振荡72小时，得到1mg/mL的凝集Aβ混悬液(以下，在本实施例中，称作淀粉样蛋白混悬液)。
(2)将2.5μL(相当于25μg)的淀粉样蛋白混悬液注射到雄性Wistar大鼠(7周龄)一侧的杏仁核中。作为对照，将2.5μL的磷酸盐缓冲生理盐水溶液(pH 7.4)注射到该大鼠另一侧的杏仁核中。在注射淀粉样蛋白混悬液和磷酸盐缓冲生理盐水溶液(pH 7.4)1天后检查该大鼠。
(3)将化合物1溶解于含有10mg/mL抗坏血酸的生理盐水中，得到样品溶液(在样品溶液中，放射性浓度为22MBq/mL)。在硫喷妥钠麻醉下，将该溶液通过尾静脉注射到大鼠中(剂量：0.5mL，给予的放射性活度：相当于11-13MBq)。
(4)在注射后60分钟移取脑，用切片机(型号：CM3050S，由LEICA公司制)制成厚度10μm的脑切片。将该脑切片在成像板上曝光20小时，然后通过使用生物图像分析仪(型号：BAS-2500；由富士胶片株式会社制)进行图像分析。
(5)在使用生物图像分析仪进行图像分析后，用硫磺素T进行病理学染色，通过使用荧光显微镜(由尼康公司制；型号：TE2000-U型；激发波长：400-440nm；检测波长：470nm)进行显像。由此确认了淀粉样蛋白沉积于切片上(图6b)。
图6显示了脑内注射淀粉样蛋白的大鼠的脑切片的放射自显影图和硫磺素T染色的图像。如该图所示，在注射了淀粉样蛋白混悬液一侧的杏仁核中观测到明显的放射性蓄积。另一方面，与其他位点相比，在注射生理盐水一侧的杏仁核中没有观察到显著的放射性蓄积。另外，在放射自显影图中，在注射淀粉样蛋白的位点以外的部位几乎观察不到放射性蓄积。由硫磺素T染色的结果，证明了淀粉样蛋白存在于放射性蓄积位点上(图6b)。
因此，化合物1在注射淀粉样蛋白的位点以外的部位显示几乎没有放射性蓄积，并且几乎没有显示出在[123I]-IMPY中观察到的与白质的非特异性结合。这些结果启示，化合物1在总的放射自显影图中具有优良的使淀粉样蛋白显像的能力。这些结果也启示，化合物1是对于使脑内淀粉样蛋白显像具有高度特异性的化合物。
实施例13：脑中淀粉样蛋白的显像确认
除了使用将化合物2溶解在10mg/mL抗坏血酸溶液中而形成的溶液作为样品溶液(样品溶液的放射性浓度是25MBq/mL)，进行与实施例12同样的操作。
图7显示了脑内注射淀粉样蛋白的大鼠的脑切片的放射自显影图和硫磺素T染色的图像。如该图所示，在注射了淀粉样蛋白混悬液一侧的杏仁核中观测到明显的放射性蓄积。由放射性蓄积位点的硫磺素T染色的结果，证明了在该位点存在着淀粉样蛋白。另一方面，与其他位点相比，在注射生理盐水一侧的杏仁核中没有观察到显著的放射性蓄积。
化合物2在注射淀粉样蛋白位点以外的部位显示出一定程度的放射性蓄积，但是与[123I]-IMPY相比，这种蓄积受到很大的抑制。结果，整个图像显示出其具有很高的使淀粉样蛋白显像的能力。
这些结果也启示，化合物2是对于使脑内淀粉样蛋白显像具有高度特异性的化合物。
实施例14：2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a] 吡啶(非放射性碘化形式)的合成
向8.60g(相当于46.0mmol)的溴化铜添加50mL乙酸乙酯，得到混悬液，向其中添加2.50g(相当于22.0mmol)的3′-羟基苯乙酮。然后，将得到的混合物加热回流。2小时后，将反应混合物冷却到室温并过滤。减压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯，通过添加活性碳进行脱色操作。然后，过滤浓缩得到的溶液。得到的粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱溶剂：己烷/乙酸乙酯＝2/1)，得到4.42g(相当于20.6mmol)的2-溴-3′-羟基苯乙酮(图8，步骤1)。
将987mg(相当于4.55mmol)的2-溴-3′-羟基苯乙酮和1.00g(相当于4.55mmol)的2-氨基-5-碘吡啶溶解于50mL乙腈。将得到的溶液在油浴中在110℃加热回流2小时。在反应完成后，将反应溶液冷却到室温，过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀，减压干燥。将得到的粗结晶混悬于10mL水和1mL甲醇的混合液中。然后，向其中添加大约10mL的饱和碳酸氢钠水溶液，使用超声洗涤机将混合物超声处理5分钟。从得到的混合物过滤回收沉淀，用水充分洗涤，减压干燥，得到927mg(相当于2.76mmol)的2-(3′-羟基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(图8，步骤2)。
另外，将2.50g(相当于20.0mmol)的2-溴乙醇和2.72g(相当于40.0mmol)的咪唑溶解于10mL的二甲基甲酰胺，冷却到0℃。然后，向其中添加5.50g(相当于20.0mmol)的叔丁基二苯基氯硅烷。将反应混合物室温搅拌18小时后，添加饱和氯化钠水溶液，用乙酸乙酯萃取3次。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。得到的粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱溶剂：己烷/乙酸乙酯＝10/1)，得到7.04g(相当于19.4mmol)的1-溴-2-(叔丁基二苯基甲硅烷氧基)乙烷(图8，步骤3)。
将300mg(相当于0.893mmol)的2-(3′-羟基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶溶解于5.0mL的二甲基甲酰胺，向其中添加370mg(相当于2.68mmol)的碳酸钾，然后向其中添加357mg(相当于0.982mmol)的1-溴-2-(叔丁基二苯基甲硅烷氧基)乙烷。将反应混合物在90℃搅拌2小时后，添加饱和氯化钠水溶液，用乙酸乙酯萃取3次。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。得到的粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱溶剂：己烷/乙酸乙酯＝3/1)，得到477mg(相当于0.771mmol)的2-[3′-(2″-叔丁基二苯基甲硅烷氧基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(图8，步骤4)。
将477mg(相当于0.771mmol)的2-[3′-(2″-叔丁基二苯基甲硅烷氧基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶溶解于0.98mL的四氢呋喃，向其中添加0.93mL的1.0mol/L四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液。将反应混合物室温搅拌15分钟后，添加氯化铵水溶液，随后添加5.0mL水和2.0mL乙腈，以过滤析出的沉淀。将过滤的沉淀依次用水和乙腈洗涤，得到120mg(相当于0.316mmol)的2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(图8，步骤5)。
得到的2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶的NMR测定结果(内标物：四甲基硅烷)如下所示。
使用的NMR装置：JNM-ECP-500(由日本电子株式会社(JEOL)制)
1H-NMR(溶剂：二甲亚砜-d6；共振频率：500MHz)：δ8.91(s，1H)，8.35(s，1H)，7.52-7.51(m，2H)，7.45(s，2H)，7.35(t，J＝8.2Hz，1H)，6.93-6.90(m，1H)，4.06(t，J＝4.6Hz，2H)，3.75(t，J＝4.6Hz，2H)。
实施例15：6-三丁基甲锡烷基-2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]- 咪唑并[1，2-a]吡啶的合成
将70mg(相当于0.184mmol)实施例14中得到的2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶溶解于4.0mL的二噁烷中，向其中添加2.0mL的三乙胺。然后向其中添加0.20mL(相当于0.39mmol)的双(三丁基锡)和14.0mg(催化量)的四(三苯膦)钯。将反应混合物在90℃搅拌20小时后，减压蒸馏出溶剂。残余物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱溶剂：己烷/乙酸乙酯＝2/1)，得到73.0mg(相当于0.134mmol)的6-三丁基甲锡烷基-2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶(图9步骤1)。
得到的6-三丁基甲锡烷基-2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶的NMR测定结果(内标物：四甲基硅烷)如下所示。
使用的NMR装置：JNM-ECP-500(由日本电子株式会社(JEOL)制)
1H-NMR(溶剂：氯仿-d1；共振频率：500MHz)：δ7.99(d，J ＝0.9Hz，1H)，7.82(s，1H)，7.64-7.50(m，3H)，7.34-7.31(m，1H)，7.18-7.17(m，1H)，6.90-6.87(m，1H)，4.20(t，J＝4.3Hz，2H)，3.98(t，J＝4.3Hz，2H)，1.69-1.48(m，6H)，1.39-1.32(m，6H)，1.19-1.05(m，6H)，0.91(t，J＝7.4Hz，9H)。
实施例16：2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-[ 123 I]碘咪唑并 [1，2-a]吡啶的合成
向60μL的6-三丁基甲锡烷基-2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶(浓度：1mg/mL)在甲醇/二甲亚砜＝9/1的混合液中的溶液中，添加150μL的1mol/L盐酸、15μL的1mmol/L碘化钠、250μL的274MBq的[123I]碘化钠和15μL的10％(W/V)过氧化氢。将混合液在50℃静置10分钟后，将其在下述条件下进行HPLC，得到2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶级分。
HPLC条件：
柱：Phenomenex Luna C18(商品名；由Phenomenex公司制；规格：4.6×150mm)
流动相：含0.1％三氟乙酸的水/含0.1％三氟乙酸的乙腈＝80/20→0/100(17分钟)
流速：1.0mL/min
检测器：紫外可见吸光光度计(检测波长：282nm)和放射性计数器(由Raytest公司制；STEFFI型)
向该级分中添加10ml水。使所得溶液通过反相柱(商品名：Sep-Pak(注册商标)Light C8 Cartridges，Waters公司制；填充剂的填装量：145mg)，以使得该柱吸附收集2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶，用1mL水漂洗该柱，然后让1mL***通过，以洗脱2-[3′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶。在合成刚刚结束时，所得化合物的放射性活度是112.9MBq。另外，在下述条件下进行TLC分析，结果，该化合物的放射化学纯度是97％。
TLC分析条件：
TLC板：硅胶60F254(商品名；由默克公司制)
流动相：氯仿/甲醇/三乙胺＝100/1/2
检测器：Rita Star(商品名；由Raytest公司制)
实施例17：2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a] 吡啶(非放射性碘化形式)的合成
向28.17g(相当于126mmol)的溴化铜添加50mL乙酸乙酯，得到混悬液，向其中添加8.18g(相当于60.0mmol)的4′-羟基苯乙酮在50mL乙酸乙酯和50mL氯仿的混合液中的溶液。然后，将得到的混合物加热回流。5小时后，将反应混合物冷却到室温并过滤。减压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯，通过添加活性碳进行脱色操作。然后过滤浓缩得到的溶液。得到的粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱溶剂：氯仿/甲醇＝20/1)，从乙酸乙酯/石油醚中重结晶，得到7.25g(相当于33.7mmol)的2-溴-4′-羟基苯乙酮(图10，步骤1)。
将987mg(相当于4.55mmol)的2-溴-4′-羟基苯乙酮和1.00g(相当于4.55mmol)的2-氨基-5-碘吡啶溶解于50mL乙腈。将得到的溶液在油浴中在110℃加热回流2小时。在反应完成后，将反应溶液冷却到室温，过滤回收沉淀。周乙腈洗涤沉淀，减压干燥。将得到的粗结晶混悬于10mL水和1mL甲醇的混合液中。然后，向其中添加大约10mL的饱和碳酸氢钠水溶液，使用超声洗涤机将混合物超声处理5分钟。从得到的混合物过滤回收沉淀，用水充分洗涤，减压干燥，得到927mg(相当于2.76mmol)的2-(4′-羟基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(图10，步骤2)。
另外，将7.0g(相当于50.4mmol)的3-溴-1-丙醇和6.86g(相当于101mmol)的咪唑溶解于50mL的二甲基甲酰胺中，冷却到0℃。然后，向其中添加7.59g(相当于50.4mmol)的叔丁基二甲基氯硅烷。将反应混合物室温搅拌24小时后，向其中添加添加饱和氯化钠水溶液，用***萃取3次。合并的***层用无水硫酸镁干燥，减压浓缩。得到的粗产物通过减压蒸馏(100℃，70mmHg)进行纯化，得到7.23g(相当于30.2mmol)的1-溴-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙烷(图10，步骤3)。
将2.00g(相当于5.95mmol)的2-(4′-羟基苯基)-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶溶解于30.0mL的二甲基甲酰胺，并添加2.47g(相当于17.9mmol)的碳酸钾。然后，向其中添加1.51g(相当于5.95mmol)的1-溴-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)丙烷。将反应混合物室温搅拌8天后，向其中添加饱和氯化钠水溶液，用乙酸乙酯萃取3次。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。得到的粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱溶剂：己烷/乙酸乙酯＝1/1)，得到1.52g(相当于2.99mmol)的2-[4′-(3″-叔丁基二甲基甲硅烷氧基丙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(图10，步骤4)。
将1.52g(相当于2.99mmol)的2-[4′-(3″-叔丁基二甲基甲硅烷氧基丙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶溶解于5.0mL的四氢呋喃，向其中添加2.99mL的1.0mol/L四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液。将反应混合物室温搅拌30分钟后，添加氯化铵水溶液，随后添加10mL水和5.0mL乙腈以过滤析出的沉淀。将过滤的沉淀依次用水和乙腈洗涤，得到1.03g(相当于2.61mmol)的2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶(图10，步骤5)。
得到的2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶的NMR测定结果(内标物：四甲基硅烷)如下所示。
使用的NMR装置：JNM-ECP-500(由日本电子株式会社(JEOL)制)
1H-NMR(溶剂：二甲基甲酰胺-d6；共振频率：500MHz)：δ8.96(s，1H)，8.33(s，1H)，7.98(d，J＝8.7Hz，2H)，7.46(s，2H)，7.06(d，J＝8.7Hz，2H)，4.63(t，J＝5.0Hz，1H)，4.17(t，J＝6.0Hz，2H)，3.72(dt，J＝5.0，6.0Hz，2H)，1.98(tt，J＝6.0，6.0Hz，2H)。
实施例18：6-三丁基甲锡烷基-2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]- 咪唑并[1，2-a]吡啶的合成
向28.17g(相当于126mmol)的溴化铜添加50mL乙酸乙酯，得到混悬液，向其中添加8.18g(相当于60.0mmol)的4′-羟基苯乙酮在50mL乙酸乙酯和50mL氯仿的混合液中的溶液。然后，将得到的混合物加热回流。5小时后，将反应混合物冷却到室温并过滤。减压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯，通过添加活性碳进行脱色操作。然后，过滤浓缩得到的溶液。得到的粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱溶剂：氯仿/甲醇＝20/1)，从乙酸乙酯/石油醚中重结晶，得到7.25g(相当于33.7mmol)的2-溴-4′-羟基苯乙酮(图11，步骤1)。
将2.15g(相当于10.0mmol)的2-溴-4′-羟基苯乙酮和1.74g(相当于10.0mmol)的2-氨基-5-溴吡啶溶解于50mL乙腈。将得到的溶液在油浴中在105℃加热回流6小时。在反应完成后，将反应溶液冷却到室温，过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀，减压干燥。将得到的粗结晶混悬于20mL水和20mL甲醇的混合液中。然后，向其中添加大约25mL的饱和碳酸氢钠水溶液，使用超声洗涤机将混合物超声处理5分钟。从得到的混合物过滤回收沉淀，用水充分洗涤，减压干燥，得到2.41g(相当于8.32mmol)的6-溴-2-(4′-羟基苯基)咪唑并[1，2-a]吡啶(图11，步骤2)。
将充分干燥而除去水分的1.45g(相当于5.0mmol)的6-溴-2-(4′-羟基苯基)咪唑并[1，2-a]吡啶溶解于50mL的N，N-二甲基甲酰胺，向其中添加2.07g(相当于15.0mmol)的碳酸钾。向该混合液中补充680μL(相当于7.5mmol)的3-溴-1-丙醇，然后将该溶液室温搅拌17小时。在反应完成后，将反应液倾倒在水中，用氯仿萃取3次。合并的氯仿层用饱和氯化钠溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩。将得到的粗产物从甲醇中重结晶，得到1.28g(相当于3.67mmol)的6-溴-2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶(图11，步骤3)。
将100mg(相当于0.288mmol)的6-溴-2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶溶解于4.0mL的二噁烷，向其中添加2.0mL的三乙胺。然后向其中添加0.22mL(相当于0.43mmol)的双(三丁基锡)和22.0mg(催化量)的四(三苯膦)钯。将反应混合物在90℃搅拌24小时后，减压蒸馏出溶剂，将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱溶剂：己烷/乙酸乙酯＝3/1)，得到68.0mg(相当于0.122mmol)的6-三丁基甲锡烷基-2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶(图11，步骤4)。
得到的6-三丁基甲锡烷基-2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶的NMR测定结果(内标物：四甲基硅烷)如下所示。
使用的NMR装置：JNM-ECP-500(由日本电子株式会社(JEOL)制)
1H-NMR(溶剂：氯仿-d1；共振频率：500MHz)：δ7.97(s，1H)，7.88(d，J＝8.3Hz，2H)，7.74(s，1H)，7.58(d，J＝8.3Hz，1H)，7.14(d，J＝8.7Hz，1H)，6.98(d，J＝8.7Hz，2H)，4.18(t，J＝6.0Hz，2H)，3.89(t，J＝6.0Hz，2H)，2.08(tt，J＝6.0，6.0Hz，2H)，1.59-1.49(m，6H)，1.39-1.31(m，6H)，1.18-1.05(m，6H)，0.90(t，J＝7.3Hz，9H)。
实施例19：2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-6-[ 123 I]碘咪唑并 [1，2-a]吡啶的合成
向100μL的6-三丁基甲锡烷基-2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-咪唑并[1，2-a]吡啶(浓度：1mg/mL)在甲醇/二甲亚砜(比例为9/1)的混合液中的溶液中，添加80μL的2mol/L盐酸，15μL的1mmol/L碘化钠，120μL的414MBq的[123I]碘化钠和20μL的10％(W/V)过氧化氢。将混合液在50℃静置10分钟后，使该溶液在下述条件下进行HPLC，得到2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶级分。
HPLC条件：
柱：Phenomenex Luna C18(商品名；由Phenomenex公司制；规格：4.6×150mm)
流动相：含0.1％三氟乙酸的水/含0.1％三氟乙酸的乙腈＝80/20→0/100(17分钟)
流速：1.0mL/min
检测器：紫外可见吸光光度计(检测波长：282nm)和放射性计数器(由Raytest公司制；STEFFI型)
向该级分中添加10ml水。使所得溶液通过反相柱(商品名：Sep-Pak(注册商标)Light C8 Cartridges，Waters公司制；填充剂的填装量：145mg)，以使得该柱吸附收集2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶。用1mL水漂洗该柱，然后让1mL***通过，以洗脱2-[4′-(3″-羟基丙氧基)苯基]-6-[123I]碘咪唑并[1，2-a]吡啶。在合成刚刚结束时，所得化合物的放射性活度是219MBq。另外，在下述条件下进行TLC分析，结果，该化合物的放射化学纯度是97％。
TLC分析条件：
TLC板：硅胶60F254(商品名；由默克公司制)
流动相：氯仿/甲醇/三乙胺＝100/1/2
检测器：Rita Star(商品名；由Raytest公司制)
实施例20-21，比较例7：基于辛醇萃取法的分配系数的测定
将实施例16制备的化合物4的***溶液(实施例20)、实施例19制备的化合物6的***溶液(实施例21)、和[123I]-IMPY的***溶液(比较例7)分别用含有10mg/mL抗坏血酸的生理盐水稀释，调节放射性浓度至20-30MBq/ml。分别向2mL辛醇中各添加10μL所制备的样品溶液，再添加2mL的10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，随后搅拌30秒。在用低速离心机离心分离(2000rpm×60分钟)各混合液后，对辛醇层和水层各自取样1mL，用Autowell Gamma***(型号：ARC-301B，由Aloka制)测定放射性计数。使用所测得的放射性计数，根据式(4)计算logP辛醇。
Figure BPA00001171927200401
结果如表6所示。所有化合物显示的logP辛醇值都在1～3之间。已知能渗透通过BBB的化合物的logP辛醇值在1～3之间(Douglas D.Dischino等人，J.Nucl.Med.，(1983)，24，p.1030-1038)。因此表明，这两种化合物都具有与IMPY同样的BBB渗透性。
表6：本发明化合物的logP辛醇值
  实验   化合物   logP辛醇值
  比较例7   [123I]-IMPY   2.1
  实施例20   化合物4   2.5
  实施例21   化合物6   2.1
实施例22-23，比较例8：脑内转移性和清除性的测定
使用化合物4和化合物6，测定雄性Wistar大鼠(7周龄)的脑中放射性蓄积的经时变化。
将化合物4(实施例22)、化合物6(实施例23)和上述参考例1中制备的[123I]-IMPY(比较例8)分别用含有10mg/mL抗坏血酸的生理盐水稀释，制备溶液(放射性浓度为20-31MBq/mL)。在硫喷妥钠麻醉下，将0.05mL所制备的各样品溶液注射到各个Wistar大鼠(7周龄)的尾静脉中。在注射后2、5、30和60分钟，通过从腹部大动脉放血将这些大鼠处死，摘取脑，测定脑质量，再用单通道分析仪(检测器型号：SP-20，应用光研工业株式会社制)测定脑的放射性(以下，在本实施例中称作A)。此外，按照与上述同样的方式测定全身其余部分的放射性(以下，在本实施例中称作B)。使用这些测定结果，根据下述式(5)计算在各个时间点的每单位脑重量的放射性分布率(％ID/g)。
在各时间点使用3只动物进行实验。
结果如7所示。如表7所示，化合物4和6与[123I]-IMPY同样，在注射后2分钟的时间点显示出显著的放射性蓄积，随后在60分钟内显示出迅速消除的趋势。这些结果启示，化合物4和6与[123I]-IMPY同样，具有优良的脑转移性以及从脑中的迅速清除性。
表7：本发明化合物在静脉注射后的脑内放射性分布率(大鼠)
Figure BPA00001171927200412
实施例24-25：脑中淀粉样蛋白的显像确认
进行下述实验以检验通过本发明的化合物是否可以使脑中的淀粉样蛋白显像。
(1)将Aβ1-42(和光纯药工业公司制)溶解于磷酸盐缓冲液(pH7.4)，并在37℃下振荡72小时，得到1mg/mL的凝集Aβ混悬液(以下，在本实施例中，称作淀粉样蛋白混悬液)。
(2)将2.5μL(相当于25μg)的淀粉样蛋白混悬液注射到雄性Wistar大鼠(7周龄)一侧的杏仁核中。作为对照，将2.5μL的磷酸盐缓冲生理盐水溶液(pH 7.4)注射到该大鼠另一侧的杏仁核中。在注射淀粉样蛋白混悬液和磷酸盐缓冲生理盐水溶液(pH 7.4)1天后检查该大鼠。
(3)分别制备将化合物4溶解于含有10mg/mL抗坏血酸的生理盐水中而形成的样品溶液(放射性浓度为30MBq/mL，实施例24)、和将化合物6溶解于含有10mg/mL抗坏血酸的生理盐水中而形成的样品溶液(放射性浓度为30MBq/mL，实施例25)。在硫喷妥钠麻醉下，将各溶液通过尾静脉注射到大鼠中(剂量：0.5mL，给予的放射性活度：相当于11-15MBq)。
(4)在注射后60分钟移取脑，用切片机(型号：CM3050S，由LEICA公司制)制成厚度10μm的脑切片。将该脑切片在成像板上曝光20小时，然后使用生物图像分析仪(型号：BAS-2500；由富士胶片株式会社制)进行图像分析。
(5)在使用生物图像分析仪进行图像分析后，用硫磺素T进行病理学染色，通过使用荧光显微镜(由尼康公司制；型号：TE2000-U型；激发波长：400-440nm；检测波长：470nm)进行显像。由此确认了淀粉样蛋白沉积于切片上(图12和图13)。
图12和图13示出了脑内注射淀粉样蛋白的大鼠的脑切片的放射自显影图和硫磺素T染色的图像。如这些图所示，在注射了化合物4和6的检体中，在注射了淀粉样蛋白混悬液一侧的杏仁核中观测到明显的放射性蓄积。另一方面，与其他位置相比，在注射生理盐水溶液一侧的杏仁核中没有观察到明显的放射性蓄积。在放射自显影图上，在淀粉样蛋白注射位点以外的位置几乎观察不到放射性蓄积。由硫磺素T染色的结果，证实了在该放射性蓄积位点存在着淀粉样蛋白(图12和图13)。这些结果启示，化合物4和6具有在脑内淀粉样蛋白上蓄积的性质和使脑内淀粉样蛋白显像的能力。
实施例26-28：回复突变试验
为了检验化合物3、化合物5和化合物8的基因诱变性，使用鼠伤寒沙门氏菌TA98和TA100进行回复突变试验(以下称作Ames试验)。
本试验在没有添加S9mix和添加S9mix的情况下进行。将二甲亚砜(DMSO)用作阴性对照。阳性对照在不添加S9mix的情况下使用2-(2-呋喃基)-3-(5-硝基-2-呋喃基)丙烯酰胺(以下称作AF-2)，在添加S9mix的情况下使用2-氨基蒽(以下称作2-AA)。
作为被加入到试验平板中的样品溶液，将各化合物溶解于DMSO中以制备浓度为50mg/mL的溶液，进而，将各溶液用DMSO稀释以制备7个浓度的溶液(几何比：3)。作为用于制备阳性对照样品的样品溶液，当将TA98用作试验菌株而没有添加S9mix的情况中，制备AF-2的DMSO溶液(化合物浓度：1μg/mL)；当将TA100用作试验菌株而没有添加S9mix的情况中，制备AF-2的DMSO溶液(化合物浓度：0.1μg/mL)；当将TA98用作试验菌株而添加S9mix的情况中，制备2-AA的DMSO溶液(化合物浓度：5μg/mL)；当将TA100用作试验菌株而添加S9mix的情况中，制备2-AA的DMSO溶液(化合物浓度：10μg/mL)。
将各受试样品溶液和试验菌株(TA98或TA100)混合在一起，使得各样品的添加量是0.1mL/平板，然后用软琼脂将混合物在试验平板的培养基上重叠成多层，然后在37℃培养48小时。另外，将各受试样品溶液、S9mix和试验菌株混合在一起，使得各样品的添加量是0.1mL/平板，然后用软琼脂将混合物在试验平板的培养基上重叠成多层，然后在37℃培养48小时。另一方面，对于阴性对照，仅将DMSO用作样品溶液，进行与上述同样的操作。通过计数培养后的平板上的回复突变菌落数来进行判定，在回复突变菌落数是阴性对照的该菌落数的两倍以上、且表现出浓度依赖性增加时，判定诱变性为阳性。
表8：Ames试验的结果
Figure BPA00001171927200441
(实施例29-实施例30)与淀粉样蛋白结合性的确认
为了研究本发明化合物的结合机制，使用以糊精作为前体化合物产生的淀粉样蛋白进行抑制与硫磺素T的结合的实验。糊精是在II型糖尿病中蓄积在胰脏中的淀粉样蛋白。
方法
(1)将糊精(人)(由Wako公司制)溶解于磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，在37℃振荡72小时，以获得1mg/mL的凝集糊精的混悬液(以下，在各实施例中，称作淀粉样蛋白混悬液)。
(2)根据文献(Naiki，H.等人，Laboratory Investigation，74，p.374-383(1996))所述的方法，基于使用硫磺素T(由Fluka公司制)的荧光分光光度法，进行该淀粉样蛋白混悬液的定性实验，以证实在(1)中获得的凝集糊精是淀粉样蛋白(测定条件：激发波长446nm，荧光波长490nm)。
(3)将该淀粉样蛋白混悬液以糊精浓度为15μM溶解于50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中。同时，将硫磺素T以15μM的浓度溶解于50mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 8.5)中。
(4)配制将各评价化合物和淀粉样蛋白溶解于50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中、且最终浓度分别如表9所示的样品。将(3)中制备的各50μL的淀粉样蛋白溶液和硫磺素T溶液、以及50μL的样品溶液填充在96孔微量培养板的各孔中(体积约0.3mL)。
表9：样品溶液中各化合物的最终浓度
Figure BPA00001171927200451
(5)制备混合了100μL的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)和50μL的50mM甘氨酸-NaOH缓冲液的样品作为空白，进行与(4)同样的操作，计算抑制率。
(6)将填充有样品溶液的微量培养板在室温下静置30小时。然后，用微量培养板读板器(型号：SPECTRA MAX GEMINI XS，由MolecularDevices公司制)测定各样品溶液的荧光强度(测定条件：激发波长446nm，荧光波长490nm)(以下，A表示各评价化合物的浓度为零(0)的样品的荧光强度，B表示各评价化合物的浓度为1.5μmol/L以上的样品的荧光强度)。
(7)使用在上述(6)中测定的荧光强度，通过下式(6)测定抑制率：
Figure BPA00001171927200452
各评价化合物的抑制率如表10所示。任意浓度的化合物1和化合物2都能抑制硫磺素T结合。该结果表明，化合物1和化合物2竞争性地抑制硫磺素T的结合。一般已知，硫磺素T通过识别淀粉样蛋白的β-折叠结构而与之结合。因此启示，化合物1和化合物2具有与硫磺素T同样的结合淀粉样蛋白的机制，即，通过识别β-折叠结构而与之结合。
表10：本发明化合物对淀粉样蛋白(糊精)与硫磺素T的结合的抑制率(％)
Figure BPA00001171927200461
(实施例31)各器官中放射性分布率的测定
为了证明本发明化合物能分布于靶器官中并具有良好的清除到体外的性质，使用化合物1在SD大鼠(8周龄)中测定各器官的放射性蓄积的经时变化。
将实施例3中制备的化合物1的***溶液(实施例10)用含有10mg/mL抗坏血酸的生理盐水稀释，调节放射性浓度至8-12MBq/mL的。在硫喷妥钠麻醉下，将0.05mL所制备的各样品溶液给药到上述大鼠的尾静脉中。在给药后的5、30、60和180分钟通过从腹部大动脉放血将这些大鼠处死，摘取表11中所示的各器官。通过与实施例10相同的方法测定各取出器官的质量和放射性。另外，测定取出器官后的大鼠的全身(以下称作全身其余部分)的放射性。使用这些测定结果，根据下式(7)计算在各时间点的各器官每单位重量的放射性分布率(％ID/g)。
在各时间点使用3只动物进行实验。
% ID / g = R T ( R S + R R ) × M T × 100 . . . ( 7 )
RT：靶器官的放射性(cpm)
RS：全部器官的放射性总和(cpm)
RR：全身其余部分的放射性(cpm)
MT：靶器官的质量(g)
结果如表11所示。如表11所示，化合物1在给予后5分钟的时间点分布于各器官中，随后大部分放射性分布于小肠和大肠。此外，其放射性分布从小肠转移至大肠。因此，发现化合物1在给予后迅速随胆汁***并且具有良好的体外清除性。
此外，对认为淀粉样蛋白会蓄积的脑、心脏、肺、胰脏和骨等进行观察，发现在给药后5分钟的时间点，在所有这些器官中出现了显著的放射性蓄积，此证实了化合物1的分布。此外，给药后5分钟的时间点与给药后180分钟的时间点之比((给药后5分钟的时间点的％ID/g)/(给药后180分钟的时间点的％ID/g))显示出了高值，例如脑为145，心脏为20，肺为13，胰脏为24，和骨为9。由此显示，在被认为淀粉样蛋白会蓄积的器官中发生了迅速的放射性分布和迅速的清除。
由上述可见，实现了对生物组织中的淀粉样蛋白检测试剂来说所需要的给药后早期的放射性分布以及迅速的体外清除性。
表11
Figure BPA00001171927200471
实施例32-33：回复突变试验
为了检验化合物7和化合物9的基因诱变性，使用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)TA98和TA100进行回复突变试验(以下称作Ames试验)。
本试验在没有添加S9mix和添加S9mix的情况下进行。将二甲亚砜(DMSO)用作阴性对照。阳性对照在不添加S9mix的情况下使用2-(2-呋喃基)-3-(5-硝基-2-呋喃基)丙烯酰胺(以下称作AF-2)，在添加S9mix的情况下使用2-氨基蒽(以下称作2-AA)。
作为被加入到试验平板中的样品溶液，将各化合物溶解于DMSO中以制备浓度为50mg/mL的溶液，进而，将各溶液用DMSO稀释以制备7个浓度的溶液(几何比：3)。作为用于制备阳性对照样品的样品溶液，当将TA98用作试验菌株而没有添加S9mix的情况中，制备AF-2的DMSO溶液(化合物浓度：1μg/mL)；当将TA100用作试验菌株而没有添加S9mix的情况中，制备AF-2的DMSO溶液(化合物浓度：0.1μg/mL)；当将TA98用作试验菌株而添加S9mix的情况中，制备2-AA的DMSO溶液(化合物浓度：5μg/mL)；当将TA100用作试验菌株而添加S9mix的情况中，制备2-AA的DMSO溶液(化合物浓度：10μg/mL)。
将各受试样品溶液和试验菌株(TA98或TA100)混合在一起，使得各样品的添加量是0.1mL/平板，然后用软琼脂将混合物在试验平板的培养基上重叠成多层，然后在37℃培养48小时。另外，将各受试样品溶液、S9mix和试验菌株混合在一起，使得各样品的添加量是0.1mL/平板，然后用软琼脂将混合物在试验平板的培养基上重叠成多层，然后在37℃培养48小时。另一方面，对于阴性对照，仅将DMSO用作样品溶液，进行与上述同样的操作。通过在培养后对平板上的回复突变菌落数计数来进行判断，当回复突变的菌落数是阴性对照的2倍以上、且表现出浓度依赖性增加时，判定诱变性是阳性。
表12：Ames试验的结果
Figure BPA00001171927200491
实施例34-35：微核试验
为了研究化合物3和化合物7的诱变性(体内)，使用Crlj：CD1(ICR)雄性小鼠的骨髓细胞检验对具有微核的多染性红细胞(以下称作MNPCE)的诱发性。
设定试验剂量为0mg/kg(阴性对照组)，250，500，1000和2000mg/kg(试验样品组)。在单次经口给药24和48小时后，将小鼠处死，制作骨髓涂片并进行观察。另外，在阳性对照组中腹腔给予2mg/kg的单剂量MMC，在给药后24小时处死小鼠，然后制作骨髓涂片并进行观察。
当确认在每个给药组中MNPCE的出现频率显示出剂量依赖性增加或与阴性对照组相比显示出统计学显著增加时，判定为阳性，除此之外判定为阴性。作为统计学分析，通过Wilcoxon秩和检验，对于各给药组中MNPCE的出现频率、以及多染性红细胞(以下称作PCE)与总红细胞(以下称作RBC)的比例，在受试样品组和阳性对照组相对于阴性对照组之间或者各个组之间，进行显著性检验，予以说明，将显著性水平分别设置为小于5％和小于1％。
从试验结果没有观察到试验样品组的MNPCE出现频率、以及PCE与RBC的比例，与阴性对照组相比，有统计学显著性差异。另一方面，观察到阳性对照组的MNPCE出现频率与阴性对照组相比显著性增加。基于这些结果判定，试验样品的诱变性(体内)是阴性的，因为在上述试验条件下，使用化合物3或化合物7没有观测到在小鼠骨髓细胞中有微核的诱发。
(实施例36)与淀粉样蛋白的亲和性的测定
通过以下体外结合试验评价本发明化合物的淀粉样蛋白亲和性。
方法
(1)使用在实施例29和30中所述的方法，制备1mg/mL的凝集糊精的混悬液(以下，在本实施例中，称作糊精淀粉样蛋白混悬液)。
通过以下操作(2)和(3)制备具有交联β-折叠结构的胰岛素，操作(2)和(3)是对已知的文献(Burke，M.J.等人，Biochemistry.11，p.2435-2439(1972))中所述的方法进行了少许变更的方法。
(2)将5mg胰岛素(由Sigma Aldrich Japan制)溶解于用盐酸调节到pH 2的1mL去离子水中，并将该溶液在90℃加热10分钟，然后在干冰/乙醇中急速冷却。
(3)将(2)的样品溶液在90℃加热5分钟，然后在干冰/乙醇中急速冷却。在重复同样的操作10次后，目测确认样品溶液变成凝胶形式。
(4)将(3)的样品离心分离(16000g×15分钟)，然后除去上清液，用1mL的去离子水溶解沉淀，得到凝集胰岛素的混悬液(以下，在本实施例中，称作胰岛素淀粉样蛋白混悬液)。
通过以下操作(5)和(6)制备具有交联β-折叠结构的β2-微球蛋白，操作(5)和(6)是在已知文献(Ohhashi，Y.等人，Biochemistry.等人，Journal of Biological Chemistry.280，p.32843-32848(2005))中所述的方法，但对其进行了少许变更。
(5)向β2-微球蛋白(由Oriental Yeast Co.，ltd.制)的1mg/mL溶液添加包含100mM NaCl的50mM甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.5)，然后在超声波热水槽(由Branson Ultrasonic公司制，型号：B1200)和超声波均质器(由SMT Co.，Ltd制，型号：UH-50)中，在37℃超声处理1分钟，随后在没有超声波处理的情况下在37℃加热9分钟。
(6)在重复(5)的操作17次后，对该样品溶液进行与上述(2)同样的处理。将样品溶液离心分离(16000g×15分钟)，然后，除去上清液，并将沉淀物溶解于0.5mL的包含100mM NaCl的50mM甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.5)中，得到凝集β2微球蛋白的混悬液(以下，在本实施例中，称作β-2-m淀粉样蛋白混悬液)。
(7)根据实施例29和实施例30所述的基于使用硫磺素T(由Fluka公司制)的荧光分光光度法进行的定性实验，确认了在(4)和(6)中得到的凝集胰岛素和凝集β2微球蛋白是淀粉样蛋白。
(8)制备通过上述实施例3的方法合成的化合物1的溶液(放射性浓度为500MBq/mL)，用含0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释，以制备2-[4′-(2″-羟基乙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶的总量为1.2-112.9pM的溶液。
(9)向96孔微量培养板的各孔中添加50μL的在上述(8)中制备的溶液(最终浓度为0.2-22.6pM)和将糊精淀粉样蛋白混悬液、胰岛素淀粉样蛋白混悬液或β2-m-淀粉样蛋白混悬液用含有0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释而成的50μL溶液(最终浓度为0.8μg/mL)，然后添加150μL相同的缓冲液。
(10)将该微量培养板在22℃以指定速率(400rpm)振荡3小时。然后，让各孔的混合液通过玻璃纤维过滤器(商品名：MulutiscreenTM-FC，由Millipore公司制)过滤，以从游离的化合物1中分离出与淀粉样蛋白结合的化合物1。
(11)将过滤混合液后的玻璃纤维过滤器用含有0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液洗涤(0.2mL×5次)，并用Autowell Gamma***(Aloka公司制，型号：ARC-7001)测定该玻璃纤维过滤器的放射性。
(12)由(11)的测定结果评价与淀粉样蛋白结合的化合物1的量与淀粉样蛋白的添加量之间的关系。由在上述(9)中没有添加淀粉样蛋白混悬液的样品(实施例36)确定非特异性结合。
样品溶液中的化合物1的浓度与在上述(11)中测定的玻璃纤维过滤器上的放射性计数(CPM)之间的关系如图14所示。在添加淀粉样蛋白混悬液的组(图14，添加糊精淀粉样蛋白的组、添加胰岛素淀粉样蛋白的组和添加β-2-m淀粉样蛋白的组)中，放射性活度全部高于不添加淀粉样蛋白混悬液的组(图14，没有添加淀粉样蛋白的组)，且玻璃纤维过滤器上的放射性活度随化合物1的添加浓度呈比例地增加。在本实验的条件中，所有的淀粉样蛋白(和与化合物1结合的淀粉样蛋白)都大于玻璃纤维的孔径。因此，淀粉样蛋白被保持在玻璃纤维上，且玻璃纤维的放射性计数是反映与淀粉样蛋白结合的化合物1的量的值。因为玻璃纤维的放射性计数的数值随化合物1的浓度的增加而增加、并且其放射性活度比没有添加淀粉样蛋白的组高，因此表明化合物1是具有与淀粉样蛋白特异性结合的性质的化合物。
(实施例37)与淀粉样蛋白结合性的测定
除了制备化合物6的溶液(放射性浓度为500MBq/mL)，并用含有0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释，以制备2-[4′-(2″-羟基丙氧基)苯基]-6-碘咪唑并[1，2-a]吡啶的总量为0.5-59.7pM的溶液来作为样品溶液以外，进行与实施例36同样的操作。
样品溶液中的化合物6的浓度与玻璃纤维过滤器上的放射性计数(CPM)之间的关系如图15所示。在添加淀粉样蛋白混悬液的组(图15，添加糊精淀粉样蛋白的组、添加胰岛素淀粉样蛋白的组和添加β-2-m淀粉样蛋白的组)中，放射性活度全部高于不添加淀粉样蛋白混悬液的组(图15，没有添加淀粉样蛋白的组)，且玻璃纤维过滤器上的放射性活度随化合物6的添加浓度呈比例地增加。在本实验的条件中，所有的淀粉样蛋白(和与化合物6结合的淀粉样蛋白)都大于玻璃纤维的孔径。因此，淀粉样蛋白被保持在玻璃纤维上，且玻璃纤维的放射性计数是反映与淀粉样蛋白结合的化合物6的量的值。因为玻璃纤维的放射性计数的数值随化合物6的浓度的增加而增加、并且其放射性活度比没有添加淀粉样蛋白的组高，因此表明化合物6是具有与淀粉样蛋白特异性结合的性质的化合物。
产业实用性
本发明的用于检测生物组织中的淀粉样蛋白的试剂可用作淀粉样变性病例如全身性淀粉样变性病中的淀粉样蛋白的体外和体内诊断剂。

Claims (18)

1.用于检测沉积在生物组织中的淀粉样蛋白的试剂，包括下式(1)表示的化合物或其盐：
Figure FPA00001171927100011
其中A1、A2、A3和A4独立地表示碳或氮，
R1是放射性卤素取代基，
R2选自以下的基团：氢，羟基，甲氧基，羧基，氨基，N-甲基氨基，N，N-二甲基氨基和氰基，且
m是0-2的整数，
条件是，A1、A2、A3和A4中的至少1个表示碳，且R1与A1、A2、A3或A4表示的碳键合。
2.权利要求1的试剂，其中A1、A2、A3和A4中的至少3个表示碳。
3.权利要求2的试剂，其中A1、A2、A3和A4全部表示碳。
4.权利要求1-3中任一项的试剂，其中R2是羟基。
5.权利要求1-4中任一项的试剂，其中R1选自18F，75Br，76Br，123I，124I，125I和131I。
6.权利要求1-5中任一项的试剂，其中所述生物组织是脑、心脏、肺、胰脏、骨、或关节。
7.放射性卤素标记的有机化合物的制备方法，所述方法包括：
制备反应溶液的步骤，所述反应溶液包含下式(2)表示的化合物或其盐与放射性卤离子：
Figure FPA00001171927100021
其中A1、A2、A3和A4独立地表示碳或氮，
R3选自以下的基团：非放射性卤素取代基，硝基取代基，烷基链具有1-4个碳原子的三烷基铵基取代基，烷基链具有1-4个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基和三苯基甲锡烷基，
R4选自以下的基团：氢，羟基，甲氧基，羧基，氨基，N-甲基氨基，N，N-二甲基氨基和氰基，且
m是0-2的整数，
条件是，A1、A2、A3和A4中的至少1个表示碳，且R3与A1、A2、A3或A4表示的碳键合，和
向反应溶液赋予反应条件，以合成下式(1)表示的化合物或其盐的步骤：
Figure FPA00001171927100022
其中A1、A2、A3和A4独立地表示碳或氮，
R1是放射性卤素取代基，
R2选自以下的基团：氢，羟基，甲氧基，羧基，氨基，N-甲基氨基，N，N-二甲基氨基和氰基，且
m是0-2的整数，
条件是，A1、A2、A3和A4中的至少1个表示碳，且R1与A1、A2、A3或A4表示的碳键合。
8.权利要求7的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法，其中A1、A2、A3和A4中的至少3个表示碳。
9.权利要求8的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法，其中A1、A2、A3和A4全部表示碳。
10.权利要求7-9中任一项的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法，其中R2和R4都是羟基。
11.权利要求7-10中任一项的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法，其中
R3选自碘、溴、烷基链具有1-4个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基和三苯基甲锡烷基取代基；
所述放射性卤离子选自123I离子，124I离子，125I离子和131I离子；
R1选自123I，124I，125I和131I。
12.权利要求11的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法，其中R3选自碘，三甲基甲锡烷基取代基，三丁基甲锡烷基取代基和三苯基甲锡烷基取代基。
13.权利要求7-10中任一项的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法，其中R3是硝基取代基或烷基链具有1-4个碳原子的三烷基铵基取代基，所述放射性卤离子是18F离子，R1是18F。
14.权利要求7-10中任一项的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法，其中R3是溴，所述放射性卤离子是75Br离子或76Br离子，R1为75Br或76Br。
15.下式(2)表示的用于合成放射性卤素标记的有机化合物的前体化合物或其盐：
Figure FPA00001171927100041
其中A1、A2、A3和A4独立地表示碳或氮，
R3选自以下的基团：非放射性卤素取代基，硝基取代基，烷基链具有1-4个碳原子的三烷基铵基取代基，烷基链具有1-4个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基和三苯基甲锡烷基，
R4选自以下的基团：氢，羟基，甲氧基，羧基，氨基，N-甲基氨基，N，N-二甲基氨基和氰基，且
m是0-2的整数，
条件是，A1、A2、A3和A4中的至少1个表示碳，且R3与A1、A2、A3或A4表示的碳键合。
16.权利要求15的用于合成放射性卤素标记的有机化合物的前体化合物或其盐，其中A1、A2、A3和A4中的至少3个表示碳。
17.权利要求16的用于合成放射性卤素标记的有机化合物的前体化合物或其盐，其中A1、A2、A3和A4全部表示碳。
18.权利要求15-17中任一项的用于合成放射性卤素标记的有机化合物的前体化合物或其盐，其中R4是羟基。
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