CN101849608B - 油菜饼抗菌肽 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的对饲料中的霉菌有很好抑制作用的抗菌肽。该抗菌肽来源于油菜饼，其抑菌活性较高、分子量小、稳定性强、安全无毒，在饲料防腐试验中显示出比单一化学防霉剂更好的抑菌效果。本发明还提供了油菜饼抗菌肽的分离纯化方法、稳定性测试方法、动物急性毒性试验方法以及提供一种防止饲料中霉菌的应用方法。

Description

油菜饼抗菌肽

一、技术领域

本发明涉及可用于生产饲料和食品防腐剂的油菜饼抗菌肽。

二、背景技术

在饲料中添加防腐剂、防霉剂等是延长饲料保质期的有效措施之一，但这些饲料保存剂都是化学药剂，存在残留问题，产生毒副作用，会间接影响到人体健康。抗生素作为抗菌助长剂添加到饲料中由来已久。它能够减少动物的发病率；抑制肠道中有害微生物，提高动物对养分的吸收率具有明显的经济效益。但是，抗生素在动物体内和动物产品中的残留，以及病原菌产生的抗药性问题，对人类的健康和环境产生了负面的影响。随着抗生素的大量、广泛地用于饲料中和人们对食品质量的要求越来越高，人们对其使用的副作用认识日益加深，抗生素在饲料业已面临着淘汰或禁用的局面。而化学防腐剂、防霉剂以及抗生素随着饲料到达胃肠道，会影响体内正常的微生物菌群，破坏其间的平衡，造成消化功能紊乱，进而引起慢性腹泻等消化道疾病，寻找新型、安全的抗菌剂代替抗生素，已成为当前国内外饲料学科的一项重要内容。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)因具有广谱的抗细菌活性，高效的抗真菌、病毒和原虫的活性；热稳定性好；抗菌机理独特，不易产生抗药性等特性，正引起人们的关注，有望成为替代抗生素的产品之一。研究发现抗菌肽广泛存在于原核生物、植物及动物体内，并在生物的天然防御***中起着重要的作用。抗菌肽包括抗细菌多肽(antibacterial peptides)和抗真菌多肽(antifungal peptides)。

目前，不少研究者对抗菌肽做了一些相关的研究。实验研究发现，鲎素对多种饲料中的有害微生物包括致病性和相对致病性饲料细菌、饲料霉菌等均有高效的杀菌作用，有望成为一种新型高效、环保的绿色饲料添加剂应用于饲料的保鲜防腐。马卫明等发现猪小肠抗菌肽对鸡、猪大肠杆菌株、鸡白痢沙门氏菌株、白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、鱼致病性嗜水气单胞菌等11株细菌均有不同程度的抑制作用。温刘发等人通过在畜禽鱼的饲料中添加抗菌蛋白或抗菌肽，发现无论是在日生长速度、相对增重率、饲料系数、成活率，还是抗病力方面均有显著提高。此外，国外有报道称，抗菌肽对饲料防霉也有一定的效果。

国内的抗菌肽研究主要集中在动物和微生物源抗菌肽的理化性质，作用机制以及基因工程应用方面，对植物源抗菌肽的研究相对较少。四川大学资源微生物学及微生物生物技术四川省重点实验室长期都在对植物源抗菌蛋白和肽进行筛选，通过筛选证实很多植物都含有抗菌蛋白和肽类物质。特别是我国大面积种植的甘蓝型油菜，是油菜生产大国，而榨油之后的副产品油菜饼也产量巨大，为抗菌肽的获取提供了丰富的资源。

本发明提供了油菜饼抗菌肽的分离纯化方法和稳定性测试方法、动物急性毒性试验方法以及提供一种防止饲料中霉菌的应用方法。

三、发明内容

本发明涉及来源于油菜饼(Rape-seed meal)的抗菌肽，对饲料中引起霉变的某些真菌有较好的抑制效果。

饲料因微生物尤其是霉菌污染而造成饲料品质下降，甚至影响动物的健康，给饲料生产企业和畜牧生产者带来巨大的经济损失。饲料霉变是各种霉菌在适宜的温度、湿度和营养环境下迅速生长而造成的，其结果是使饲料发热、结块、有霉味，甚至改变饲料颜色并产生霉菌毒素。受霉菌感染的饲料，由于霉菌生长消耗饲料中的营养物质，以及在霉菌所含酶的作用下使饲料的组成成分发生改变或分解，致使饲料的营养价值严重降低。此外，动物食用被霉菌污染的饲料后，霉菌毒素会残留在动物体及其代谢产物中，因而可能会造成动物性食品污染，再通过食物链对人体健康产生极大的危害。因此，采用高效低毒的防霉剂对饲料中霉菌及其毒素进行预防处理，对于保证饲料质量，保护人与动物的生命安全具有十分重要的意义。

近年来研究发现，抗菌肽不仅具有广谱高效杀菌活性，还具有稳定性好、水溶性好、抗菌机理独特、对高等动物正常细胞无害等特点。抗菌蛋白(肽)在农业包括饲料生产中的研究也逐渐深入，但研究多集中于在饲料中添加抗菌肽以预防动物疾病，从而成为传统抗生素的代替物等方面，但是将其开发成为饲料防霉剂方面的研究却很少。

本发明的目的是提供一种新的抗菌肽，可用于饲料甚至食品的腐败真菌的防治。从油菜饼的水溶性物质中分离到具有抗真菌活性的小肽。该活性肽热稳定性强，在pH7～8的时候抑菌效果最为明显。动物急性毒性试验结果表明，提取的抗菌肽为无毒物质。通过与几种防腐剂对饲料中霉菌抑制作用的比较发现，油菜饼粕抗菌肽提取物的防霉性能优于恩拉鼎(Enradin)、富马酸，仅次于复合型防霉剂霉必克，可以开发成为一种高效的植物源性饲料防腐剂。

本发明的另一个目的是提供一套油菜饼抗菌肽的分离纯化方法。本发明的抗菌肽可用诸如盐析、分子筛以及多维色谱技术等进行分离。考虑到成本问题，可以以抗菌肽初提物的形式加以应用。

本发明的再一个目的是提供一种油菜饼抗菌肽在饲料防霉中的应用方法，包括用量和条件等。

步骤为：

1)培养基制备：PDA培养基(土豆马铃薯培养基)

马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH自然；

121℃灭菌30min。

2)抗真菌活性检测方法

①孢子悬液的制备

取长满真菌菌落(已形成分生孢子)的PDA平板，加入适量无菌水，玻璃棒轻轻搅动洗脱孢子。然后将该洗脱液过滤，除去菌丝，加适量无菌水配制制成3～5×10⁴个孢子/mL左有的孢子悬液，置4℃条件下保存。供试菌株为柑橘绿霉和黑曲霉。

②打孔法

制作PDA平板，吸取100μL供试菌种的孢子悬液，无菌操作，均匀涂布到平板上，晾干。用6mm直径的打孔器，在PDA孢子平板上垂直打孔。加样品或无菌水至平满，正面放置，28℃培养箱培养5d。测量抑菌圈直径。

3)油菜饼抗菌肽的分离纯化

①油菜蛋白粗提液的制备

称取一定量油菜饼磨碎，加200mL0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，4℃放置12h后，4℃，4000r/min离心30min取上清液。

②硫酸铵沉淀粗蛋白

上清液用饱和度为60±5％的硫酸铵沉淀，4℃放置过夜，4℃，14,000r/min离心20min，取沉淀，用1mL 0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液溶解。

③脱盐

将粗提液放入透析袋中，透析液选用0.05mol/L的pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，每隔2小时换一次透析液。

④分子筛柱层析

Sephadex G-100，取提取液上样，用0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，流速0.15mL/min，每3min收集1管，逐管收集，以洗脱液为对照测定每管的OD₂₈₀值。并测试每管洗脱液的抑菌活性。

⑤高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)纯化对具有抑菌效果的收集液进一步纯化。检测各峰抑菌活性，收集抗菌活性部分。

⑥分离液浓缩

将具有抗菌活性的分离液冷冻干燥，粉末用适当体积的0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液溶解备用。

4)油菜饼抗菌肽的活性测定

①将真菌接种在PDA平板上，28℃培养三天，让其形成成熟的孢子。供试菌株玉米赤霉、柑橘绿霉、黑曲霉、黄曲霉。

②用接种针勾取少量孢子(无菌操作)混入2ml无菌水中，剧烈震荡后加入约200ml 50℃左右的PDA培养基(已加入了100μg/ml的氨卞青霉素)中，立即混匀倒板，冷却待用。

③活性测定时，用6mm直径打孔器，在PDA孢子平板上垂直打孔。加样品至平板，正面放置，28℃培养箱培养5d。测量抑菌圈直径。

5)聚丙烯酰胺凝胶电泳

分离小肽的Tricine-SDS-PAGE，分离胶浓度4％，浓缩胶浓度15％，样品分别添加还原性样品缓冲液(含巯基乙醇)和非还原性样品缓冲液(不含巯基乙醇)，在沸水中煮5-10分钟，冷却离心后取20μl上样。

6)抗菌肽的稳定性分析

①热稳定性检测

将抗菌肽分离液于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、120℃下分别处理15min，以柑橘绿霉为供试菌，以原抗菌肽分离液作为对照，重复3次，测定其抑菌圈直径，每个处理重复3次，根据抑菌圈直径大小来确定其热稳定性。

②酸碱稳定性检测

将抗菌肽分离液5mL用1mol/L HCl调整pH为3、4、5、6、7五个处理；另取5mL抗菌蛋白(肽)分离液用1mol/LNaOH调整pH为9、10两个处理，以原抗菌肽分离液(pH8)作为对照，以柑橘绿霉为受试菌，每个处理重复3次，根据抑菌圈直径大小来确定其稳定性。

7)对真菌抑制作用的扫描电镜观察

在柑橘绿霉的抑菌实验中，未加入油菜饼抗菌肽提取液的平板未发生抑菌效果，加入油菜饼抗菌肽提取液的平板产生了抑菌效果，分别切下前者菌丝正常生长的培养基(A)和后者(B)抑菌圈内的培养基，进行电镜观察。

8)油菜饼抗菌肽提取物的动物急性毒性试验

选昆明种小白鼠20只，其中雌性10只，雄性10只，体重为20±2g。将实验动物随机分为2组，每组10只，一个给药组和一个对照组。雌雄分开喂养。按小鼠每10克体重灌胃0.4ml(已达最大体积)受试药物(油菜饼抗菌肽提取液，0.8g/mL)，一日内给药一次。给药后立即观察至6小时，以后每天观察，连续7天，第8天解剖观察。

9)油菜饼蛋白提取物对饲料中霉菌抑制作用。

①抑菌活性试验

采用平皿抑菌圈法，将配好的不同浓度的防霉物质——油菜饼抗菌肽、恩拉鼎预混剂、富马酸、复合型防霉剂霉必克分别按0.8％、0.25％、0.08％、0.05％定量地加到定量的已溶化的霉菌培养基中混匀，倒入灭菌的培养皿中，待培养基冷却后在中心部位接种各种测试菌株。由于恩拉鼎主要用于防治家畜的消化道疾病，在防霉作用方面未见报道，故试验时它的添加量增加为正常使用量的250倍。同时设置空白组，置于恒温恒湿箱内(28℃)培养，观察霉菌的生长情况。

②饲料防霉实验

油菜饼抗菌肽提取物、恩拉鼎、富马酸、复合型防霉剂霉必克分别按0.8％、0.25％、0.08％、0.05％的添加量添加到粉料中，并设空白组(CK)。上述各成分分别进行强化试验和常规试验。

强化试验：该方法是提高饲料水分含量，恶化环境(高温、高湿)，促使饲料尽快发霉，根据霉变严重程度及测定霉菌总数来判断防霉效果。在18％含水量的粉料中按设计的比例添加防霉物质，置培养箱(温度36℃，相对湿度95％以上)培养。

常规试验：在正常饲料(粉料的自然水分为12.58％)中按设计的比例添加防霉物质，同时设置空白组，在自然环境下储放(试验期间温度为25℃～30℃，空气相对湿度为80％左右)，各试验样品采用独立包装，便于取样。定期进行水分、霉菌总数的测定，每天定时观测室温、料温、空气相对湿度和饲料霉变情况等。

③测定方法

霉菌菌落总数的测定：按GB/T 13092-2006饲料中霉菌总数的测定方法测定。

水分的测定：按GB/T 6435-1986饲料水分的测定方法测定。

四、具体实施方式

1)培养基制备：PDA培养基(土豆马铃薯培养基)

马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH自然；

121℃灭菌30min。

2)抗真菌活性检测方法

①孢子悬液的制备

取长满真菌菌落(已形成分生孢子)的PDA平板，加入适量无菌水，玻璃棒轻轻搅动洗脱孢子。然后将该洗脱液用4层无菌纱布过滤，除去菌丝，加适量无菌水配制制成3～5×10⁴个孢子/mL左右的孢子悬液，置4℃条件下保存。供试菌株为柑橘绿霉和黑曲霉。

②打孔法

制作PDA平板，吸取100μL供试菌种的孢子悬液，无菌操作，均匀涂布到平板上，晾干。用6mm直径的打孔器，在PDA孢子平板上垂直打孔。加样品或无菌水至平满，正面放置，28℃培养箱培养5d。测量抑菌圈直径。

3)油菜饼抗菌肽的分离纯化

①油菜蛋白粗提液的制备

称取油菜饼40g磨碎，加200mL 0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，4℃放置12h后，4℃，4000r/min离心30min取上清液。

②硫酸铵分级沉淀粗蛋白

上清液200mL，分成5份，用硫酸铵沉淀，饱和度分别为30％，40％，50％，60％和70％4℃放置过夜，4℃，14,000r/min离心20min，取沉淀，用1mL 0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液溶解。检测其抑菌效果，筛选出具有最好抑菌效果的饱和度，按此饱和度进行盐析。

③脱盐

将粗提液放入透析袋中，透析液选用0.05mol/L的pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，每隔2小时换一次透析液。

④分子筛柱层析

Sephadex G-100，取提取液上样，用0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，流速0.15mL/min，每3min收集1管，逐管收集，以洗脱液为对照测定每管的OD₂₈₀值。并测试每管洗脱液的抑菌活性。

⑤高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)纯化

对具有抑菌效果的收集液进一步纯化。检测各峰抑菌活性，收集抗菌活性部分。

⑥分离液浓缩

将具有抗菌活性的分离液冷冻干燥，粉末用适当体积的0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液溶解备用。

4)油菜饼抗菌肽的活性测定

①将真菌接种在PDA平板上，28℃培养三天，让其形成成熟的孢子。供试菌株玉米赤霉、柑橘绿霉、黑曲霉、黄曲霉。

②用接种针勾取少量孢子(无菌操作)混入2ml无菌水中，剧烈震荡后加入约200ml 50℃左右的PDA培养基(已加入了100μg/ml的氨卞青霉素)中，立即混匀倒板，冷却待用。

③活性测定时，用6mm直径打孔器，在PDA孢子平板上垂直打孔。加样品至平板，正面放置，28℃培养箱培养5d。测量抑菌圈直径。

5)聚丙烯酰胺凝胶电泳

分离小肽的Tricine-SDS-PAGE，分离胶浓度4％，浓缩胶浓度15％，样品分别添加还原性样品缓冲液(含巯基乙醇)和非还原性样品缓冲液(不含巯基乙醇)，在沸水中煮5-10分钟，冷却离心后取20μl上样。

6)抗菌肽的稳定性分析

①热稳定性检测

将抗菌肽分离液于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、120℃下分别处理15min，以柑橘绿霉为供试菌，以原抗菌肽分离液作为对照，重复3次，测定其抑菌圈直径，每个处理重复3次，根据抑菌圈直径大小来确定其热稳定性。

②酸碱稳定性检测

将抗菌肽分离液5mL用1mol/L HCl调整pH为3、4、5、6、7五个处理；另取5mL抗菌蛋白(肽)分离液用1mol/LNaOH调整pH为9、10两个处理，以原抗菌肽分离液(pH8)作为对照，以柑橘绿霉为受试菌，每个处理重复3次，根据抑菌圈直径大小来确定其稳定性。

7)对真菌抑制作用的扫描电镜观察

在柑橘绿霉的抑菌实验中，未加入油菜饼抗菌肽提取液的平板未发生抑菌效果，加入油菜饼抗菌肽提取液的平板产生了抑菌效果，分别切下前者菌丝正常生长的培养基(A)和后者(B)抑菌圈内的培养基，进行电镜观察。

8)油菜饼抗菌肽提取物的动物急性毒性试验

选昆明种小白鼠20只，其中雌性10只，雄性10只，体重为20±2g。将实验动物随机分为2组，每组10只，一个给药组和一个对照组。雌雄分开喂养。按小鼠每10克体重灌胃0.4ml(已达最大体积)受试药物(油菜饼抗菌肽提取液，0.8g/mL)，一日内给药一次。给药后立即观察至6小时，以后每天观察，连续7天，第8天解剖观察。

9)油菜饼蛋白提取物对饲料中霉菌抑制作用。

①抑菌活性试验

采用平皿抑菌圈法，将配好的不同浓度的防霉物质——油菜饼抗菌肽、恩拉鼎预混剂、富马酸、复合型防霉剂霉必克分别按0.8％、0.25％、0.08％、0.05％定量地加到定量的已溶化的霉菌培养基中混匀，倒入灭菌的培养皿中，待培养基冷却后在中心部位接种各种测试菌株。由于恩拉鼎主要用于防治家畜的消化道疾病，在防霉作用方面未见报道，故试验时它的添加量增加为正常使用量的250倍。同时设置空白组，置于恒温恒湿箱内(28℃)培养，观察霉菌的生长情况。

抑菌活力(％)＝(对照菌盘扩展直径-含抗菌物质菌盘扩展直径)×100％/对照菌盘扩展直径。

②饲料防霉实验

油菜饼抗菌肽提取物、恩拉鼎、富马酸、复合型防霉剂霉必克分别按0.8％、0.25％、0.08％、0.05％的添加量添加到粉料中，并设空白组(CK)。上述各成分分别进行强化试验和常规试验。

强化试验：该方法是提高饲料水分含量，恶化环境(高温、高湿)，促使饲料尽快发霉，根据霉变严重程度及测定霉菌总数来判断防霉效果。在18％含水量的粉料中按设计的比例添加防霉物质，置培养箱(温度36℃，相对湿度95％以上)培养。

常规试验：在正常饲料(粉料的自然水分为12.58％)中按设计的比例添加防霉物质，同时设置空白组，在自然环境下储放(试验期间温度为25℃～30℃，空气相对湿度为80％左右)，各试验样品采用独立包装，便于取样。定期进行水分、霉菌总数的测定，每天定时观测室温、料温、空气相对湿度和饲料霉变情况等。

③测定方法

霉菌菌落总数的测定：按GB/T 13092-2006饲料中霉菌总数的测定方法测定。

水分的测定：按GB/T 6435-1986饲料水分的测定方法测定。

10)结果：油菜饼粗蛋白纯化方法中盐析用硫酸铵的最适饱和度为60％，从油菜饼的水溶性成分中分离得到小肽的提取物，其分子量在6.2～8.2KD之间。并且在温度升高到90℃依然保持活性，在pH7～8的时候抑菌效果最为明显。该小肽物质对受试真菌有明显的抑制作用。这种活性肽能够很明显地影响真菌菌丝和孢子的正常生理形态，但对小鼠无不良影响。通过与几种防腐剂对饲料中霉菌抑制作用的比较发现，油菜饼抗菌肽提取物的防霉性能优于恩拉鼎、富马酸，仅次于复合型防霉剂霉必克。

Claims (1)

1.一种油菜饼抗菌肽的分离纯化方法及稳定性、安全性和活性的测定方法，其特征是将油菜饼粉碎后溶于缓冲液中制备蛋白粗提液，再通过硫酸铵沉淀粗蛋白、粗蛋白脱盐、分子筛柱层析和高效液相色谱纯化、冷冻干燥一系列分离纯化操作，得到纯化后的油菜饼抗菌肽；同时检测抗菌肽的抗菌活性、热稳定性、酸碱稳定性和安全性，并检验抗菌肽对饲料中霉菌的抑制效果；步骤为：

1)培养基制备：

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH自然，121℃灭菌30min；

2)抗真菌活性检验：

①孢子悬液的制备：取长满已形成分生孢子的真菌菌落PDA平板，加入适量无菌水，玻璃棒轻轻搅动洗脱孢子；然后将该洗脱液用4层无菌纱布过滤，除去菌丝，加入适量无菌水制成3～5×10⁴个孢子/mL的孢子悬液，置4℃条件下保存；供试菌株为柑橘绿霉和黑曲霉；

②打孔法：制作PDA平板，吸取100μL供试菌株的孢子悬液，无菌操作，均匀涂布到平板上，晾干；用6mm直径的打孔器，在PDA孢子平板上垂直打孔，然后加入样品或无菌水至平满，正面放置，28℃培养箱培养5d，测量抑菌圈直径；

3)油菜饼抗菌肽的分离纯化：

①油菜饼蛋白粗提液的制备：将40g油菜饼磨碎，加200mL 0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，4℃放置12h后，在4℃，4000r/min下离心30min，取上清液；

②硫酸铵沉淀粗蛋白：上清液用饱和度为60±5％的硫酸铵沉淀，4℃下放置过夜，然后在4℃，14000r/min下离心20min，取沉淀，用1mL 0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液溶解；

③脱盐：将粗提液放入透析袋中，透析液选用0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液，每隔2小时换一次透析液；

④分子筛柱层析：选取Sephadex G-100为填料，取提取液上样，用0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，流速0.15mL/min，每3min收集1管，逐管收集，以洗脱液为对照测定每管的OD₂₈₀值，并测试每管洗脱液的抑菌活性；

⑤高效液相色谱法纯化：对分子筛柱层析中具有抑菌效果的收集液进一步纯化，检测各峰洗脱液的抑菌活性，收集抗菌活性部分；

⑥分离液浓缩：将具有抗菌活性的分离液冷冻干燥，粉末用适当体积的0.05mol/L的pH8.0的Tris-HCl缓冲液溶解备用；

4)油菜饼抗菌肽的活性测定：

①将真菌接种在PDA平板上，在28℃下培养三天，让其形成成熟的孢子，供试菌株为玉米赤霉、柑橘绿霉、黑曲霉、黄曲霉；

②在无菌操作下用接种针勾取少量孢子混入2ml无菌水中，剧烈震荡后加入200mL 50℃的已加入了100μg/mL氨苄青霉素的PDA培养基中，立即混匀倒板，冷却待用；

③活性测定时，用6mm直径打孔器，在PDA孢子平板上垂直打孔，加样品至平板，正面放置，在28℃培养箱中培养5d，然后测量抑菌圈直径； 

5)油菜饼抗菌肽的分子大小测定：采用分离小肽的Tricine-SDS-PAGE测定，分离胶浓度4％，浓缩胶浓度15％，样品分别添加含巯基乙醇的还原性样品缓冲液和不含巯基乙醇的非还原性样品缓冲液，在沸水中煮5-10分钟，冷却离心后取20μL上样；

6)油菜饼抗菌肽的热稳定性、酸碱稳定性检测：

①热稳定性检测：将抗菌肽分离液于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、120℃下分别处理15min，以柑橘绿霉为供试菌，以原抗菌肽分离液作为对照，测定其抑菌圈直径，每个处理重复3次，根据抑菌圈直径大小来确定其热稳定性；

②酸碱稳定性检测：将抗菌肽分离液5mL用1mol/L HCl调整pH为3、4、5、6、7五个处理；另取5mL抗菌肽分离液用1mol/L NaOH调整pH为9、10两个处理，以原抗菌肽分离液pH 8作为对照，以柑橘绿霉为受试菌，每个处理重复3次，根据抑菌圈直径大小来确定其酸碱稳定性；

7)扫描电镜观察油菜饼抗菌肽对真菌的抑制作用：

在柑橘绿霉的抑菌实验中，未加入油菜饼抗菌肽提取液的平板未发生抑菌效果，加入经高效液相色谱法纯化和分离液浓缩后的油菜饼抗菌肽提取液的平板产生了抑菌效果，分别切下前者菌丝正常生长的培养基和后者抑菌圈内的培养基，进行电镜观察；

8)油菜饼抗菌肽提取物的动物急性毒性试验：

选昆明种小白鼠20只，其中雌性10只，雄性10只，体重为20±2g；将实验动物随机分为2组，每组10只，一个给药组和一个对照组，雌雄分开喂养；按小鼠每10克体重灌胃0.4mL 0.8g/mL经高效液相色谱法纯化和分离液浓缩后的油菜饼抗菌肽提取液，一日内给药一次，给药后立即观察至6小时，以后每天观察，连续7天，第8天解剖观察；

9)油菜饼抗菌肽对饲料中霉菌抑制作用的检验：

①抑菌活性试验：采用平皿抑菌圈法，将配好的不同浓度的防霉物质--油菜饼抗菌肽、恩拉鼎预混剂、富马酸、复合型防霉剂霉必克分别按0.8％、0.25％、0.08％、0.05％定量地加到定量的已溶化的霉菌培养基中混匀，倒入灭菌的培养皿中，待培养基冷却后在中心部位接种柑橘绿霉，黑曲霉，玉米赤霉、黄曲霉测试菌株；由于恩拉鼎主要用于防治家畜的消化道疾病，在防霉作用方面未见报道，故试验时它的添加量增加为正常使用量的250倍；同时设置空白组，置于28℃恒温恒湿箱内培养，观察霉菌的生长情况；

抑菌活力(％)＝(对照菌盘扩展直径-含抗菌物质菌盘扩展直径)×100％/对照菌盘扩展直径；

②饲料防霉实验：油菜饼抗菌肽提取物、恩拉鼎、富马酸、复合型防霉剂霉必克分别按0.8％、0.25％、0.08％、0.05％的添加量添加到粉料中，并设空白组，上述各成分分别进行强化试验和常规试验；

强化试验：该方法是提高饲料水分含量，在高温、高湿的恶化环境中促使饲料尽快发霉，根据霉变严重程度及测定霉菌总数来判断防霉效果；在18％含水量的粉料中按设计的比例添加防霉物质，置于36℃，相对湿度95％以上的培养箱中培养；

常规试验：在自然水分为12.58％的正常粉料饲料中按设计的比例添加防霉物质，同时设置空白组，在25℃～30℃，空气相对湿度为80％的自然环境下储放，各试验样品采用独立包 装，便于取样；定期进行水分、霉菌总数的测定，每天定时观测室温、料温、空气相对湿度和饲料霉变情况；

③测定方法：

霉菌菌落总数的测定：按GB/T 13092-2006饲料中霉菌总数的测定方法测定；

水分的测定：按GB/T 6435-1986饲料水分的测定方法测定。