CN110959750A - 一种酵母细胞壁在渔用抗菌剂领域中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及渔用抗菌剂领域，具体涉及一种酵母细胞壁在渔用抗菌剂领域中的应用。本发明所述酵母细胞壁通过将酵母经碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β‑葡聚糖酶和纤维素酶酶解得到。本发明所述酵母细胞壁来源于酵母，其对水产病原菌具有较好的抑菌效果，应用在渔用抗菌剂领域中能有效防治水生动物疾病、促进水生动物生长。与抗生素类添加剂相比，酵母细胞壁具有无毒、无残留和不产生耐药性的优势；与中草药类添加剂相比，酵母细胞壁成分明确，可工业化生产，质量稳定。

Description

一种酵母细胞壁在渔用抗菌剂领域中的应用
技术领域
本发明涉及渔用抗菌剂领域，具体涉及一种酵母细胞壁在渔用抗菌剂领域中的应用。
背景技术
抗生素所发挥的积极作用主要体现在防治水生动物疾病、促进生长、节约营养成分等方面。尤其是抗生素的应用有效控制了许多水产疾病的发生，促进了水产养殖业的发展。但是，由于抗生素的不断使用容易产生耐药菌株、存在药物残留以及容易破坏水生动物微生态平衡，一方面使得水产养殖疾病越来越难治；另一方面水产品质量安全得不到保证。因此，为了人类的健康和水产养殖业的可持续发展，必须充分认识到抗生素在水产养殖中所带来的副作用。抗生素的副作用集中表现在以下几个方面。
(1)耐药菌株的产生。某种曾经有效的抗生素在生产上低剂量、长时间使用后，会出现药效减弱或完全消失的现象，这是因为病原菌对抗生素产生的抗性或耐药性，即产生了耐药菌株。耐药菌株的产生使得生产上用药量越来越大，药效越来越差，既增加了生产成本，又增加了防治难度。耐药菌株的产生同时也对人类的公共卫生构成威胁。
(2)在水产品中产生药物残留。抗生素使用后进入水生动物的血液循环，大多数会被排出体外，极少数则会残留在体内组织中，并且随着多次使用在体内蓄积起来。抗生素的残留在影响人类身体健康的同时，也会影响水产养殖业的发展。
(3)破坏微生态平衡。水是水生动物赖以生存的环境，其中有许多有益微生物，如光合细菌、硝化细菌等；水生动物肠道里也有大量的有益微生物，如乳酸杆菌、部分弧菌等。它们在维持水环境的稳定、水生动物代谢平衡中起着关键性的作用，成为水产动物体内外微生态平衡中的重要组织成部分。抗生素的使用在抑制或杀灭病原微生物的同时也会抑制这些有益微生物，使水生动物体内外微生态平衡被破坏，导致微生物恶化或消化吸收障碍而引起新的疾病。
(4)对免疫***有抑制作用。抗生素对免疫***的作用主要表现为对吞噬细胞的抑制。一是抗生素直接影响吞噬细胞的功能；二是通过影响微生物而影响吞噬细胞对微生物的趋化、摄取和杀灭等功能。
抗生素在水产养殖疾病防治中虽然有较好的应用效果，但是随着人们生活水平的提高，对水产品的质量安全意识不断增强，抗生素利弊之间的矛盾日益激化，已经引起人们的普遍关注。因此，为了生产无公害水产品，提升水产品质量，应该科学、合理地认识抗生素使用的利与弊，要谨慎使用抗生素，严禁使用国家违禁的氯霉素、红霉素、杆菌肽锌、泰乐菌素、环丙沙星等抗生素药物，以确保养殖水产品安全卫生。
目前，市场上除抗生素外其他抗菌剂主要来源于中草药，由于成分不明确，产品品质差异性很大。
发明内容
本发明所解决的现有技术问题是：抗生素在水产饲料早已禁用，无法使用，仅现场用药，且存在耐药性和残留等问题；中草药添加类增强免疫的成分功能和成分含量不明确，很难确保批次生产的饲料使用效果的一致性。
本发明的目的是提供一种酵母细胞壁在渔用抗菌剂领域中的应用，酵母细胞壁来源于酵母，其具有较好的抑菌效果，特别是对水产病原菌，能有效防治水生动物疾病、促进水生动物生长。与抗生素类添加剂相比，酵母细胞壁具有无毒、无残留和不产生耐药性的优势；与中草药类添加剂相比，酵母细胞壁成分明确，可工业化生产，质量稳定。
具体来说，针对现有技术的不足，本发明提供了如下技术方案：
一种酵母细胞壁在渔用抗菌剂领域中的应用，所述酵母细胞壁通过将酵母经碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶酶解得到。
优选的，上述应用中，所述酵母细胞壁通过将酵母经碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶逐一酶解而得到。
优选的，上述应用中，将所述酵母细胞壁添加到渔用饲料中饲喂水产动物。
优选的，上述应用中，以所述渔用饲料的重量计，添加0.01％-0.5％的酵母细胞壁。
优选的，上述应用中，将所述酵母细胞壁与载体混合制成预混料饲喂水产动物，优选所述载体为玉米粉、小麦粉、大豆粉、米糠或沸石粉中的一种或两种以上。
优选的，上述应用中，将所述酵母细胞壁与其他饲料添加剂混合制成预混料饲喂水产动物。
优选的，上述应用中，所述酵母为酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae FX-2)，其保藏编号为CCTCC NO:M2016418。
优选的，上述应用中，以所述酵母细胞壁干物质质量计，所述碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶的添加量分别为2.0-5.5‰、2.0-5.0‰、0.2-0.8‰和0.3-0.8‰。
优选的，上述应用中，所述酵母细胞壁通过将酵母先经自溶破壁，然后经碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶逐一酶解而得到。
优选的，上述应用中，所述酵母细胞壁的制备包括下述步骤：
(1)将含酵母的原料进行自溶破壁，分离得到酵母细胞壁沉淀物；
(2)将所述酵母细胞壁沉淀物进行碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶逐一酶解，得到酵母细胞壁。
优选的，上述应用中，在步骤(1)中，所述的自溶破壁是在盐浓度2-4.5％、pH值5.0-6.5并且温度55-75℃条件下进行。
优选的，上述应用中，所述含酵母的原料是采用酿酒酵母菌种，糖蜜为碳源，尿素为氮源，进行发酵处理而得到。
优选的，上述应用中，所述发酵处理的pH为4.0-6.0，发酵时间为16-24h，发酵温度为28-30℃。
优选的，上述应用中，在步骤(2)中，将酵母细胞壁沉淀物进行碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶酶解之前，先将酵母细胞壁沉淀物进行稀释成以酵母细胞壁沉淀物干物质计浓度为10-20％的悬浮液。
优选的，上述应用中，所述碱性蛋白酶的酶解温度为40-60℃，pH为6.0-8.5，水解时间为7-10小时；
所述甘露聚糖酶的酶解温度为40-60℃，pH为6.0-8.0，水解时间为10-15小时；
所述β-葡聚糖酶的酶解温度为55-60℃，pH为5.0-6.0，水解时间为5-8小时；
所述纤维素酶的酶解温度为50-65℃，pH为4.0-5.5，水解时间为8-10小时。
本发明所取得的有益效果是：本发明所酵母细胞壁来源于酵母，其对水产病原菌具有较好的抑菌效果，应用在渔用抗菌剂领域中能有效防治水生动物疾病、促进水生动物生长。与抗生素类添加剂相比，酵母细胞壁具有无毒、无残留和不产生耐药性的优势；与中草药类添加剂相比，酵母细胞壁成分明确，可工业化生产，质量稳定。
菌株保藏信息及获取鉴定信息
本发明所用的菌种酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae FX-2)于2016年8月1日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC：M2016418，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。酿酒酵母FX-2记载在专利文献201611141122.8《酿酒酵母高密度培养方法及其pH调控方法》中。
本发明所使用的酿酒酵母FX-2来自于发酵面团，发酵面团中含有多种野生菌，以发酵面团为样品，制备面团浸出液，经过稀释涂布平板分离法分离得到纯种的菌株，经鉴定确认该菌株属于酿酒酵母。
菌株鉴定方法为:将菌株的26S rDNA的D1/D2区序列，与GenBank核酸数据库中的序列进行同源性分析，结果表明序列同源性大于99％，从而确定本发明分离得到的菌株属于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，生物学分类为酿酒酵母FX-2(Saccharomycescerevisiae)。
具体实施方式
鉴于目前水产饲料中缺乏较好的有抑菌效果的抗菌剂：抗生素在水产饲料早已禁用，无法使用，仅现场用药，且存在耐药性和残留等问题；中草药添加类增强免疫的成分功能和成分含量不明确，很难确保批次生产的饲料使用效果的一致性。本发明提供了一种酵母细胞壁在渔用抗菌剂领域中的应用，所述酵母细胞壁通过将酵母经碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶酶解得到。酵母细胞壁来源于酵母，其具有较好的抑菌效果，特别是对水产病原菌，能有效防治水生动物疾病、促进水生动物生长。
在本发明一种优选的实施方式中，本发明提供了一种酵母细胞壁在渔用抗菌剂领域中的应用，所述酵母细胞壁通过将酵母先经自溶破壁，然后经碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶逐一酶解而得到。通过自溶盐，优选为氯化钠，在偏酸性环境下处理，能够保持无菌环境，激发酵母的内源酶活性，促进酵母细胞裂解，达到除去酵母细胞中的内容物，使剩下的酵母细胞壁沉淀物含有较高的多糖成分的目的。“逐一进行酶解”是指按顺序进行酶解，即依次进行碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶酶解处理。
然后将经过自溶处理后的物质进行分离，除去酵母自溶物，得到酵母细胞壁沉淀物，将酵母细胞壁沉淀物采用多种酶进行复合酶解，包括碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶依次进行酶解处理。酵母细胞壁的结构从外层到内层依次为磷酸化的甘露聚糖、甘露聚糖、蛋白质和葡聚糖，因此，发明人经过实验探究发现，首先采用碱性蛋白酶处理，用来破坏酵母细胞壁，使蛋白质降解，暴露甘露聚糖和葡聚糖，接着采用甘露聚糖酶处理，能够破坏酵母细胞壁的结构，使得甘露聚糖成分分离；然后采用β-葡聚糖酶进行处理，降解细胞壁中的葡聚糖使其变成小分子片段；最后采用纤维素酶进行处理，进一步使酵母细胞壁中的葡聚糖变成小分子片段，从而暴露出功能位点。
在本发明的一种优选实施方式中，将所述酵母细胞壁添加到渔用饲料中饲喂水产动物，以所述渔用饲料的重量计，添加0.01％-0.5％的酵母细胞壁。
在本发明的一种优选实施方式中，将所述酵母细胞壁与载体混合制成预混料饲喂水产动物，优选所述载体为玉米粉、小麦粉、大豆粉、米糠或沸石粉中的一种或两种以上。
在本发明的一种优选实施方式中，将所述酵母细胞壁与其他饲料添加剂混合制成预混料饲喂水产动物。
在本发明的一种优选实施方式中，本发明提供了一种酵母细胞壁在渔用抗菌剂领域中的应用，所述酵母细胞壁的制备包括下述步骤：
(1)自溶破壁
将含酵母的原料在盐质量浓度为2-4.5％、pH值5.0-6.5、温度55-75℃的条件下自溶处理，分离得到酵母细胞壁沉淀物；
(2)酶解处理
将酵母细胞壁沉淀物加水稀释成干物质质量浓度为10-20％，加入质量浓度为2.0-5.5‰碱性蛋白酶(所述酶的含量均以酵母细胞壁干物质的质量计，以下均同)，控制温度40-60℃，pH至6.0-8.5，水解7-10小时；然后加入质量浓度为2.0-5.0‰的甘露聚糖酶，控制温度40-60℃，pH至6.0-8.0，水解时间10-15小时；然后调节pH为5.0-6.0，加入0.2-0.8‰的β-葡聚糖酶，控制温度为55-60℃水解5-8小时；最后调节温度为50-65℃，pH为4-5.5下，加入0.3-0.8‰的纤维素酶，水解时间为8-10小时。
(3)离心干燥
将步骤(2)得到的酶解产物升温到90℃保温30min-1h，干燥得到酵母细胞壁。
在本发明的又一种优选实施方式中，在自溶处理之前，采用酿酒酵母菌种，以糖蜜为碳源，尿素为氮源，发酵pH值4.0-6.0、温度28-30℃、发酵16-24小时，获得最佳酵母细胞壁多糖含量的酵母原料。优选，所述酿酒酵母菌种为酿酒酵母FX-2(Saccharomycescerevisiae FX-2)保藏编号为：CCTCC NO:M2016418。
下面对本实施例所用的原料及设备的生产厂家，以及产品分析使用的设备和分析方法进行说明如下，其中所述的化学物质没有标明的均为常规试剂的化学纯级别。其中，实施例和对比例中所用到的原料的信息如下表所示。
表1本发明所用到的原料的信息
原料 厂家
碱性蛋白酶(100万u/g) 南宁庞博生物工程有限公司
甘露聚糖酶(10000u/g) 山东西唐生物科技有限公司
β-葡聚糖酶(20万u/g) 德国英联酶制剂公司
纤维素酶(2000u/g) 南宁庞博生物工程有限公司
糖蜜 新疆伊力特糖业有限公司
尿素 山东华鲁恒升化工股份有限公司
荧光假单胞菌 中国国家科学院水生生物研究所
舒适气单胞菌 中国国家科学院水生生物研究所
嗜水气单胞菌 中国国家科学院水生生物研究所
维氏气单胞菌 中国国家科学院水生生物研究所
杀蛙气单胞菌 中国国家科学院水生生物研究所
无乳链球菌 中国国家科学院水生生物研究所
黄霉素 南京邦诺生物科技有限公司
实施例一
(一)酵母细胞壁的制备
采用如下方法制备得到酵母细胞壁：
(1)采用酿酒酵母菌种酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae)保藏编号为：CCTCC NO:M2016418，碳源为糖蜜，氮源为尿素，pH值4.5，培养温度30℃，发酵周期16小时，得到酵母原料。
具体的培养基的成分和含量：
Figure BDA0001820149880000071
Figure BDA0001820149880000081
(2)将上述酵母原料进行自溶处理，加入氯化钠，使得氯化钠的质量浓度为2％，pH值5.5，温度55℃，自溶20小时后，离心分离后得到酵母细胞壁沉淀物。
(3)酶解：
a.将此沉淀物加水稀释成为15％的浓度，加入2‰质量浓度的碱性蛋白酶(以酵母细胞壁干物质计，以下同)，控制温度55℃，pH值8.5，水解7小时；
b.继续加入2.5‰质量浓度的甘露聚糖酶，控制温度55℃，pH值8.0，水解时间控制在15小时；
c.继续加入0.2‰质量浓度的β-葡聚糖酶，控制温度55℃，调节pH为6.0，水解时间控制在5小时；
d.调节温度至65℃，加入0.3‰质量浓度的纤维素酶，调节pH至4.0，水解时间控制在8.5小时；
(4)反应结束后，升温到90℃保温1h，干燥，得到酵母细胞壁。
(二)酵母细胞壁的体外抑菌试验
将步骤(一)制备得到的酵母细胞壁样品配制成溶液，然后取出500mL到1000mL，于5000-6000g，离心10-20min，取上清，用旋转蒸发仪在75-80℃下蒸发浓缩至酵母细胞壁干物质浓度为40％左右(即1mL水中酵母细胞壁干物质为0.4g，即酵母细胞壁的浓度为0.4g/mL)，用于后续的抑菌性实验。具体的实验过程和实验结果如下：
1.抑菌试验样品制备
将步骤(一)制备得到的酵母细胞壁样品配制成干物质浓度10％的溶液，取500mL，于5000g，离心20min，取上清，用旋转蒸发仪在80℃温度下蒸发浓缩，至干物质浓度为40％，用于后续的抑菌性试验。
2.抑菌性试验方案
从抑菌圈大小检验本发明制备得到的酵母细胞壁的抑菌效果的差异。实验过程包括培养基的准备、菌种培养和抑菌圈试验。
2.1培养基的准备。
将MH肉汤、MH琼脂培养基121℃，高压灭菌20min中，并制作MH琼脂平板备用。
2.2菌种培养
将保存好的荧光假单胞菌、舒适气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、杀蛙气单胞菌和无乳链球菌接种于MH肉汤，37℃，恒温摇床孵育12-14h。将复苏后的荧光假单胞菌、舒适气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、杀蛙气单胞菌和无乳链球菌重新接种MH肉汤，培养16-20h左右。经分光光度计检测，OD值在0.4-0.7之间。活菌数约为1010CFU/mL(CFU/mL表示的是每mL样品中含有的细菌菌落总数)。
2.3抑菌圈试验
采用牛津杯法进行抑菌圈实验，其测定原理为将培养基灭菌，然后以无菌操作在培养基表面直接垂直放上牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管)，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入待检样品，牛津杯一般可以装240微升,勿使其外溢。加满后置一定温度下培养一定时间，观察可以发现以牛津杯为中心呈现透明的圆圈。这是因为在培养过程中，一方面试验菌开始生长，另一方面待测样品呈球面扩散，离杯越近，待测样品的浓度越大，离杯越远待测样品的浓度越小。随着待测样品的浓度减小，有一条最低抑菌浓度带，在该带范围内，菌不能生长，而呈透明的圆圈，称作“抑菌圈”。待测样品的浓度越高，抑菌圈越大。可以用尺子直接测定抑菌圈的大小。
2.3.1含菌平皿的制作
用生理盐水(经121℃，高压灭菌20min)，将步骤2.2中的纯培养菌液稀释1000倍，制作菌悬液；
将灭菌后的MH琼脂倾倒平皿，等MH平皿凝固后，每个平皿滴加200μL菌悬液；
用灭菌后的玻璃棒，快速将菌液均匀涂布整个平皿，制作含菌平皿。
2.3.2将制备好的酵母细胞壁样品调整到相同的浓度。
2.3.3将牛津杯放入制备好的含菌平皿。
2.3.4将酵母细胞壁样品加入牛津杯(每个加250μL左右)，使液面与牛津杯相平。
2.3.5将2.3.4中的平皿置于恒温培养箱，37℃培养14h左右，观察结果。
实验过程中，以步骤(一)制备得到的酵母细胞壁作为待测样品，以黄霉素作为阳性对照品，以生理盐水作为阴性对照品。其中，黄霉素是一种磷酸化多糖类抗生素，其抗菌作用机理是通过干扰细胞壁的结构物质肽聚糖的生物合成从而抑制细菌的繁殖。其中，结果如表1所示。
表1渔用抗菌剂对水产常见病原菌的体外抑菌效果
Figure BDA0001820149880000101
结果表明：步骤(一)制备得到的酵母细胞壁对荧光假单胞菌、舒适气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、杀蛙气单胞菌和无乳链球菌有明显的抑菌效果，酵母细胞壁的体外抑菌效果接近黄霉素。
(三)酵母细胞壁在异育银鲫上的应用效果
选用150g左右的健康异育银鲫(由江苏省射阳县黄沙港镇裕达水产养殖场提供，下同)450尾，随机分为分为三组，对照组投喂基础日粮，基础日粮配方为白鱼粉10份、豆粕30份、菜粕18份、棉粕12份、面粉4.67份、麦麸5份、玉米淀粉5份、鱼油3.3份、豆油3.2份、维生素预混料0.39份、矿物质预混料5份、氯化胆碱0.11份、羧甲基纤维素2.5份。黄霉素组优选在基础日粮中添加0.5％的黄霉素、酵母细胞壁组在基础日粮中添加0.2％酵母细胞壁，每组实验设三个平行组。饲养试验开始，每天喂3次，投喂量为各试验组鱼体体重的1.6％，依据鱼的摄食情况调整投饵量，试验周期为4周。渔用抗菌剂对异育银鲫的促生长试验结果见表2。
表2酵母细胞壁对异育银鲫生长的影响
Figure BDA0001820149880000111
注：表2的促生长实验结果为每组150尾异育银鲫的平均值
特定生长率＝100*(lnW末-lnW初)/t
其中，W末为异育银鲫结束时体重，W初为异育银鲫开始时体重，t为养殖天数。
从表2中可以看出，添加酵母细胞壁的试验组的特定生长率要优于对照组，具有明显的促生长效应。
酵母细胞壁对异育银鲫血清免疫指标的影响试验结果见表3。
表3酵母细胞壁对异育银鲫血清免疫指标的影响
Figure BDA0001820149880000112
注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
从表3中可以看出，数据处理和分析采用SPSS15.0软件，t检验分析，投喂酵母细胞壁的异育银鲫的溶菌酶活性显著高于对照组和黄霉素组(P<0.05)；但黄霉素组的溶菌酶活性与对照组无显著差异(P＞0.05)。从白细胞吞噬活性的测定结果来看，酵母细胞壁组的吞噬活性要显著高于对照组，而黄霉素组的白细胞吞噬活性则低于对照组，但无显著差异(P＞0.05)。
对照组及酵母细胞壁组的异育银鲫经嗜水气单胞杆菌攻毒后，各组的死亡情况如表4所示。
表4酵母细胞壁对嗜水气单胞杆菌攻毒后异育银鲫的保护作用
Figure BDA0001820149880000121
注：保护率＝100*(1－死亡率/对照组死亡率)
从表4可以看出，在饲料中添加酵母细胞壁和黄霉素的两个试验组鱼体死亡率明显的低于的对照组，其中黄霉素的保护率更高，酵母细胞壁对攻毒后的保护率接近黄霉素。
实施例二
(一)酵母细胞壁的制备
采用如下方法制备得到酵母细胞壁：
(1)采用酿酒酵母菌种酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae)保藏编号为：CCTCC NO:M2016418，碳源为糖蜜，氮源为尿素，pH值6.0，培养温度28℃，发酵周期24小时，得到酵母原料。
(2)将上述酵母原料进行自溶处理，加入氯化钠，使得氯化钠的质量浓度为4.5％，pH值6.5，温度75℃，自溶30小时后，离心分离后得到酵母细胞壁沉淀物。
(3)酶解：
a.将此沉淀物加水稀释成为20％的浓度，加入5.5‰质量浓度的碱性蛋白酶(以酵母细胞壁干物质计，以下同)，控制温度40℃，pH值6.0，水解10小时；
b.继续加入5.0‰质量浓度的甘露聚糖酶，控制温度60℃，pH值3.0，水解时间控制在10小时；
c.继续加入0.8‰质量浓度的β-葡聚糖酶，控制温度60℃，调节pH为5.0，水解时间控制在8小时；
d.调节温度至50℃，加入0.8‰质量浓度的纤维素酶，调节pH至5.5，水解时间控制在10小时；
(4)反应结束后，升温到90℃保温1h，干燥，得到酵母细胞壁。
(二)酵母细胞壁的体外抑菌试验
按照与实施例一相同的方法对酵母细胞壁进行抑菌效果的测定。
测定结果如表5所示。从表5不难看出，制备得到的酵母细胞壁对荧光假单胞菌、舒适气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、杀蛙气单胞菌和无乳链球菌有明显的抑菌效果，酵母细胞壁的体外抑菌效果接近黄霉素。
表5渔用抗菌剂对水产常见病原菌的体外抑菌效果
Figure BDA0001820149880000131
(三)酵母细胞壁在异育银鲫上的应用效果
按照与实施例一相同的方法对酵母细胞壁进行在异育银鲫上的应用效果试验。与实施例一不同的是酵母细胞壁组在基础日粮中添加0.01％酵母细胞壁。
表6酵母细胞壁对异育银鲫生长的影响
Figure BDA0001820149880000141
从表6中可以看出，添加酵母细胞壁的试验组的特定生长率要优于对照组，具有明显的促生长效应。
表7酵母细胞壁对异育银鲫血清免疫指标的影响
Figure BDA0001820149880000142
注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
从表7中可以看出，投喂酵母细胞壁的异育银鲫的溶菌酶活性显著高于对照组和黄霉素组(P<0.05)；但黄霉素组的溶菌酶活性与对照组无显著差异(P＞0.05)。从白细胞吞噬活性的测定结果来看，酵母细胞壁组的吞噬活性要显著高于对照组，而黄霉素组的白细胞吞噬活性则低于对照组，但无显著差异(P＞0.05)。
表8酵母细胞壁对嗜水气单胞杆菌攻毒后异育银鲫的保护作用
Figure BDA0001820149880000143
Figure BDA0001820149880000151
从表8可以看出，在饲料中添加酵母细胞壁和黄霉素的两个试验组鱼体死亡率明显的低于的对照组，其中黄霉素的保护率更高，酵母细胞壁对攻毒后的保护率接近黄霉素。
实施例三
(一)酵母细胞壁的制备
采用如下方法制备得到酵母细胞壁：
(1)采用酿酒酵母菌种酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae)保藏编号为：CCTCC NO:M2016418，碳源为糖蜜，氮源为尿素，pH值4.0，培养温度30℃，发酵周期20小时，得到酵母原料。
(2)将上述酵母原料进行自溶处理，加入氯化钠，使得氯化钠的质量浓度为4％，pH值6.0，温度60℃，自溶30小时后，离心分离后得到酵母细胞壁沉淀物。
(3)酶解：
a.将此沉淀物加水稀释成为10％的浓度，加入4‰质量浓度的碱性蛋白酶(以酵母细胞壁干物质计，以下同)，控制温度60℃，pH值7.0，水解10小时；
b.继续加入2.0‰质量浓度的甘露聚糖酶，控制温度60℃，pH值8.0，水解时间控制在10小时；
c.继续加入0.2‰质量浓度的β-葡聚糖酶，控制温度55℃，调节pH为5.0，水解时间控制在5小时；
d.调节温度至65℃，加入0.3‰质量浓度的纤维素酶，调节pH至5.5，水解时间控制在8小时；
(4)反应结束后，升温到90℃保温1h，干燥，得到酵母细胞壁。
(二)酵母细胞壁的体外抑菌试验
按照与实施例一相同的方法对酵母细胞壁进行抑菌效果的测定。
测定结果如表9所示。从表9不难看出，制备得到的酵母细胞壁对荧光假单胞菌、舒适气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、杀蛙气单胞菌和无乳链球菌有明显的抑菌效果，酵母细胞壁的体外抑菌效果接近黄霉素。
表9渔用抗菌剂对水产常见病原菌的体外抑菌效果
Figure BDA0001820149880000161
(三)酵母细胞壁在异育银鲫上的应用效果
按照与实施例一相同的方法对酵母细胞壁进行在异育银鲫上的应用效果试验。与实施例一不同的是酵母细胞壁组在基础日粮中添加0.5％酵母细胞壁。
表10酵母细胞壁对异育银鲫生长的影响
Figure BDA0001820149880000162
从表10中可以看出，添加酵母细胞壁的试验组的特定生长率要优于对照组，具有明显的促生长效应。
表11酵母细胞壁对异育银鲫血清免疫指标的影响
Figure BDA0001820149880000171
注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
从表11中可以看出，投喂酵母细胞壁的异育银鲫的溶菌酶活性显著高于对照组和黄霉素组(P<0.05)；但黄霉素组的溶菌酶活性与对照组无显著差异(P＞0.05)。从白细胞吞噬活性的测定结果来看，酵母细胞壁组的吞噬活性要显著高于对照组，而黄霉素组的白细胞吞噬活性则低于对照组，但无显著差异(P＞0.05)。
表12酵母细胞壁对嗜水气单胞杆菌攻毒后异育银鲫的保护作用
Figure BDA0001820149880000172
从表12可以看出，在饲料中添加酵母细胞壁和黄霉素的两个试验组鱼体死亡率明显的低于的对照组，其中黄霉素的保护率更高，酵母细胞壁对攻毒后的保护率接近黄霉素。
实施例四
(一)酵母细胞壁的制备
采用如下方法制备得到酵母细胞壁：
(1)采用酿酒酵母菌种酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae)保藏编号为：CCTCC NO:M2016418，碳源为糖蜜，氮源为尿素，pH值5.0，培养温度30℃，发酵周期20小时，得到酵母原料。
(2)将上述酵母原料进行自溶处理，加入氯化钠，使得氯化钠的质量浓度为3％，pH值6.5，温度60℃，自溶25小时后，离心分离后得到酵母细胞壁沉淀物。
(3)酶解：
a.将此沉淀物加水稀释成为15％的浓度，加入3‰质量浓度的碱性蛋白酶(以酵母细胞壁干物质计，以下同)，控制温度55℃，pH值8.0，水解7.5小时；
b.继续加入3.0‰质量浓度的甘露聚糖酶，控制温度50℃，pH值7.0，水解时间控制在12小时；
c.继续加入0.5‰质量浓度的β-葡聚糖酶，控制温度60℃，调节pH为5.5，水解时间控制在7小时；
d.调节温度至55℃，加入0.5‰质量浓度的纤维素酶，调节pH至5.0，水解时间控制在9小时；
(4)反应结束后，升温到90℃保温1h，干燥，得到酵母细胞壁。
(二)酵母细胞壁的体外抑菌试验
按照与实施例一相同的方法对酵母细胞壁进行抑菌效果的测定。
测定结果如表13所示。从表13不难看出，制备得到的酵母细胞壁对荧光假单胞菌、舒适气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、杀蛙气单胞菌和无乳链球菌有明显的抑菌效果，酵母细胞壁的体外抑菌效果接近黄霉素。
表13渔用抗菌剂对水产常见病原菌的体外抑菌效果
Figure BDA0001820149880000181
Figure BDA0001820149880000191
(三)酵母细胞壁在异育银鲫上的应用效果
按照与实施例一相同的方法对酵母细胞壁进行在异育银鲫上的应用效果试验。与实施例一不同的是酵母细胞壁组在基础日粮中添加0.01％酵母细胞壁。
表14酵母细胞壁对异育银鲫生长的影响
Figure BDA0001820149880000192
从表14中可以看出，添加酵母细胞壁的试验组的特定生长率要优于对照组，具有明显的促生长效应。
表15酵母细胞壁对异育银鲫血清免疫指标的影响
Figure BDA0001820149880000193
注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
从表15中可以看出，投喂酵母细胞壁的异育银鲫的溶菌酶活性显著高于对照组和黄霉素组(P<0.05)；但黄霉素组的溶菌酶活性与对照组无显著差异(P＞0.05)。从白细胞吞噬活性的测定结果来看，酵母细胞壁组的吞噬活性要显著高于对照组，而黄霉素组的白细胞吞噬活性则低于对照组，但无显著差异(P＞0.05)。
表16酵母细胞壁对嗜水气单胞杆菌攻毒后异育银鲫的保护作用
Figure BDA0001820149880000201
从表16可以看出，在饲料中添加酵母细胞壁和黄霉素的两个试验组鱼体死亡率明显的低于的对照组，其中黄霉素的保护率更高，酵母细胞壁具有一定的保护率。
实施例五
(一)酵母细胞壁的制备
按照与实施例四相同的方法制备得到酵母细胞壁。
(二)酵母细胞壁的体外抑菌试验
按照与实施例四相同的方法对酵母细胞壁进行抑菌效果的测定。
(三)酵母细胞壁在异育银鲫上的应用效果
按照与实施例四相同的方法对酵母细胞壁进行在异育银鲫上的应用效果试验。与实施例四不同的是酵母细胞壁组在基础日粮中添加0.2％酵母细胞壁。
表18酵母细胞壁对异育银鲫生长的影响
Figure BDA0001820149880000202
从表18中可以看出，添加酵母细胞壁的试验组的特定生长率要优于对照组，具有明显的促生长效应。
表19酵母细胞壁对异育银鲫血清免疫指标的影响
Figure BDA0001820149880000211
注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
从表19中可以看出，投喂酵母细胞壁的异育银鲫的溶菌酶活性显著高于对照组和黄霉素组(P<0.05)；但黄霉素组的溶菌酶活性与对照组无显著差异(P＞0.05)。从白细胞吞噬活性的测定结果来看，酵母细胞壁组的吞噬活性要显著高于对照组，而黄霉素组的白细胞吞噬活性则低于对照组，但无显著差异(P＞0.05)。
表20酵母细胞壁对嗜水气单胞杆菌攻毒后异育银鲫的保护作用
Figure BDA0001820149880000212
从表20可以看出，在饲料中添加酵母细胞壁和黄霉素的两个试验组鱼体死亡率明显的低于的对照组，其中黄霉素的保护率更高，酵母细胞壁对攻毒后的保护率接近黄霉素。
对比例一
(一)酵母细胞壁的制备
按照与实施例五相同的方法制备得到酵母细胞壁。与实施例五不同的是对比例一酶解过程中不包含碱性蛋白酶。
(二)酵母细胞壁的体外抑菌试验
按照与实施例五相同的方法对酵母细胞壁进行抑菌效果的测定。
测定结果如表21所示。从表21不难看出，制备得到的酵母细胞壁对荧光假单胞菌、舒适气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、杀蛙气单胞菌和无乳链球菌没有明显的抑菌效果。
表21渔用抗菌剂对水产常见病原菌的体外抑菌效果
Figure BDA0001820149880000221
(三)酵母细胞壁在异育银鲫上的应用效果
按照与实施例五相同的方法对酵母细胞壁进行在异育银鲫上的应用效果试验。
表22酵母细胞壁对异育银鲫生长的影响
Figure BDA0001820149880000222
从表22中可以看出，添加酵母细胞壁的试验组的特定生长率要低于于对照组，没有促生长效应。
表23酵母细胞壁对异育银鲫血清免疫指标的影响
Figure BDA0001820149880000231
注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
从表23中可以看出，投喂酵母细胞壁的异育银鲫的溶菌酶活性与对照组和黄霉素组无显著差异(P＞0.05)。从白细胞吞噬活性的测定结果来看，酵母细胞壁组的吞噬活性要与对照组无显著差异，而黄霉素组的白细胞吞噬活性则低于对照组，但无显著差异(P＞0.05)。
表24酵母细胞壁对嗜水气单胞杆菌攻毒后异育银鲫的保护作用
Figure BDA0001820149880000232
从表24可以看出，在饲料中添加黄霉素的试验组鱼体死亡率明显的低于的对照组，而酵母细胞壁对攻毒后的保护率为零。表明按照此类方法制备的酵母细胞壁对水产动物生产和免疫没有太大帮助。
对比例二
(一)酵母细胞壁的制备
按照与实施例五相同的方法制备得到酵母细胞壁。与实施例五不同的是对比例一酶解过程中不包含纤维素酶。
(二)酵母细胞壁的体外抑菌试验
按照与实施例五相同的方法对酵母细胞壁进行抑菌效果的测定。
测定结果如表25所示。从表25不难看出，制备得到的酵母细胞壁对荧光假单胞菌、舒适气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、杀蛙气单胞菌和无乳链球菌没有明显的抑菌效果。
表25渔用抗菌剂对水产常见病原菌的体外抑菌效果
Figure BDA0001820149880000241
(三)酵母细胞壁在异育银鲫上的应用效果
按照与实施例五相同的方法对酵母细胞壁进行在异育银鲫上的应用效果试验。
表26酵母细胞壁对异育银鲫生长的影响
Figure BDA0001820149880000242
从表26中可以看出，添加酵母细胞壁的试验组的特定生长率要低于对照组，没有的促生长效应。
表27酵母细胞壁对异育银鲫血清免疫指标的影响
Figure BDA0001820149880000251
注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
从表27中可以看出，投喂酵母细胞壁的异育银鲫的溶菌酶活性与对照组和黄霉素组无显著差异(P＞0.05)。从白细胞吞噬活性的测定结果来看，酵母细胞壁组的吞噬活性要与对照组无显著差异，而黄霉素组的白细胞吞噬活性则低于对照组，但无显著差异(P＞0.05)。。
表28酵母细胞壁对嗜水气单胞杆菌攻毒后异育银鲫的保护作用
Figure BDA0001820149880000252
从表28可以看出，在饲料中添加黄霉素的试验组鱼体死亡率明显的低于的对照组，而酵母细胞壁对攻毒后的保护率为零。表明按照此类方法制备的酵母细胞壁对水产动物生产和免疫没有太大帮助。
对比例三
(一)酵母细胞壁的制备
按照与实施例五相同的方法制备得到酵母细胞壁。与实施例五不同的是对比例一的碱性蛋白酶和纤维素酶的添加量不同，其中，碱性蛋白酶的添加量为7％，纤维素酶的添加量为0.1％。
(二)酵母细胞壁的体外抑菌试验
按照与实施例五相同的方法对酵母细胞壁进行抑菌效果的测定。
测定结果如表29所示。从表29不难看出，制备得到的酵母细胞壁对荧光假单胞菌、舒适气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、杀蛙气单胞菌和无乳链球菌没有明显的抑菌效果。
表29渔用抗菌剂对水产常见病原菌的体外抑菌效果
Figure BDA0001820149880000261
(三)酵母细胞壁在异育银鲫上的应用效果
按照与实施例五相同的方法对酵母细胞壁进行在异育银鲫上的应用效果试验。
表30酵母细胞壁对异育银鲫生长的影响
Figure BDA0001820149880000262
从表30中可以看出，添加酵母细胞壁的试验组的特定生长率要低于对照组，没有促生长效应。
表31酵母细胞壁对异育银鲫血清免疫指标的影响
Figure BDA0001820149880000263
Figure BDA0001820149880000271
注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
从表31中可以看出，投喂酵母细胞壁的异育银鲫的溶菌酶活性与对照组和黄霉素组无显著差异(P＞0.05)。从白细胞吞噬活性的测定结果来看，酵母细胞壁组的吞噬活性要与对照组无显著差异，而黄霉素组的白细胞吞噬活性则低于对照组，但无显著差异(P＞0.05)。。
表32酵母细胞壁对嗜水气单胞杆菌攻毒后异育银鲫的保护作用
Figure BDA0001820149880000272
从表32可以看出，在饲料中添加黄霉素的试验组鱼体死亡率明显的低于的对照组，而酵母细胞壁对攻毒后的保护率非常低。表明按照此类方法制备的酵母细胞壁对水产动物生产和免疫没有太大帮助。
对比例四
(一)酵母细胞壁的制备
按照与实施例五相同的方法制备得到酵母细胞壁。与实施例五不同的是对比例一的碱性蛋白酶和纤维素酶的添加量不同，其中，碱性蛋白酶的添加量为1％，纤维素酶的添加量为3％。
(二)酵母细胞壁的体外抑菌试验
按照与实施例五相同的方法对酵母细胞壁进行抑菌效果的测定。
测定结果如表33所示。从表33不难看出，制备得到的酵母细胞壁对荧光假单胞菌、舒适气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、杀蛙气单胞菌和无乳链球菌没有明显的抑菌效果。
表33渔用抗菌剂对水产常见病原菌的体外抑菌效果
Figure BDA0001820149880000281
(三)酵母细胞壁在异育银鲫上的应用效果
按照与实施例五相同的方法对酵母细胞壁进行在异育银鲫上的应用效果试验。
表34酵母细胞壁对异育银鲫生长的影响
Figure BDA0001820149880000282
从表34中可以看出，添加酵母细胞壁的试验组的特定生长率与对照组相同，没有促生长效应。
表35酵母细胞壁对异育银鲫血清免疫指标的影响
Figure BDA0001820149880000283
Figure BDA0001820149880000291
注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
从表35中可以看出，投喂酵母细胞壁的异育银鲫的溶菌酶活性与对照组和黄霉素组无显著差异(P＞0.05)。从白细胞吞噬活性的测定结果来看，酵母细胞壁组和黄霉素组的白细胞吞噬活性则低于对照组，但无显著差异(P＞0.05)。
表36酵母细胞壁对嗜水气单胞杆菌攻毒后异育银鲫的保护作用
Figure BDA0001820149880000292
从表36可以看出，在饲料中添加黄霉素的试验组鱼体死亡率明显的低于的对照组，而酵母细胞壁对攻毒后的保护率基本为零。表明按照此类方法制备的酵母细胞壁对水产动物生产和免疫没有太大帮助。
综上所述，本发明的酵母细胞壁对荧光假单胞菌、舒适气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、杀蛙气单胞菌和无乳链球菌有明显的抑菌效果；与添加黄霉素的试验组相比，特定生长率无显著差异，均要高于对照组；溶菌酶活性和吞噬活性高于黄霉素组和对照组；经嗜水气单胞菌功毒后的死亡率相对于对照组大大降低，对攻毒后的保护率接近黄霉素。因此本发明的酵母细胞壁应用于渔用抗菌剂领域中，可以抑制鱼类病原菌，促进鱼类生长，降低疾病发生率，具有替代抗生素的作用。
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种酵母细胞壁在渔用抗菌剂领域中的应用，其特征在于，所述酵母细胞壁通过将酵母经碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶酶解得到。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述酵母细胞壁通过将酵母经碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶逐一酶解而得到。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，将所述酵母细胞壁添加到渔用饲料中饲喂水产动物。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，以所述渔用饲料的重量计，添加0.01％-0.5％的酵母细胞壁。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其中，将所述酵母细胞壁与载体混合制成预混料饲喂水产动物，优选所述载体为玉米粉、小麦粉、大豆粉、米糠或沸石粉中的一种或两种以上。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其中，将所述酵母细胞壁与其他饲料添加剂混合制成预混料饲喂水产动物。
7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其中，所述酵母为酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae FX-2)，其保藏编号为CCTCCNO:M2016418。
8.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其中，以所述酵母细胞壁干物质质量计，所述碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶的添加量分别为2.0-5.5‰、2.0-5.0‰、0.2-0.8‰和0.3-0.8‰。
9.根据权利要求1-8任一项所述的应用，其中，所述酵母细胞壁通过将酵母先经自溶破壁，然后经碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶逐一酶解而得到。
10.根据权利要求1-9任一项所述的应用，其中，所述酵母细胞壁的制备包括下述步骤：
(1)将含酵母的原料进行自溶破壁，分离得到酵母细胞壁沉淀物；
(2)将所述酵母细胞壁沉淀物进行碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶逐一酶解，得到酵母细胞壁。
11.根据权利要求10所述的应用，其中，在步骤(1)中，所述的自溶破壁是在盐浓度2-4.5％、pH值5.0-6.5并且温度55-75℃条件下进行。
12.根据权利要求10或11所述的应用，其中，所述含酵母的原料是采用酿酒酵母菌种，糖蜜为碳源，尿素为氮源，进行发酵处理而得到。
13.根据权利要求12所述的应用，其中，所述发酵处理的pH为4.0-6.0，发酵时间为16-24h，发酵温度为28-30℃。
14.根据权利要求10-13任一项所述应用，其中，在步骤(2)中，将酵母细胞壁沉淀物进行碱性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶酶解之前，先将酵母细胞壁沉淀物进行稀释成以酵母细胞壁沉淀物干物质计浓度为10-20％的悬浮液。
15.根据权利要求1-14任一项所述的应用，其中，
所述碱性蛋白酶的酶解温度为40-60℃，pH为6.0-8.5，水解时间为7-10小时；
所述甘露聚糖酶的酶解温度为40-60℃，pH为6.0-8.0，水解时间为10-15小时；
所述β-葡聚糖酶的酶解温度为55-60℃，pH为5.0-6.0，水解时间为5-8小时；
所述纤维素酶的酶解温度为50-65℃，pH为4.0-5.5，水解时间为8-10小时。
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