CN104450580A - 放线菌素d的制备方法及其应用 - Google Patents

放线菌素d的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产生放线菌素D的放线菌新菌株，易变链霉菌Streptomyces mutabilis TRM45540，2014年4月14日保藏于U.S. Department of Agriculture Agricultural Research Service (ARS) Culture Collection，保藏号为NRRL B-59117；同时还公布了利用该菌株高效生产放线菌素D的种子培养基和发酵培养基及其从发酵液中提取分离放线菌素D的制备工艺；抗菌活性测试表明该菌及其发酵产生的放线菌素D对棉花枯黄萎病菌、核桃腐霉病菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌等病原菌具有广谱而高效的拮抗活性，对棉花、核桃等农作物的安全生产及奶牛***炎和妇***道炎等疾病的防控具有重要应用价值和很好的应用开发前景。

Description

放线菌素D的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及农业和医药领域，具体涉及放线菌素D的新用途和一种能够产生放线菌素D的新菌株及其利用该菌株生产放线菌素D的制备方法。
背景技术
Smelanochromogenes No.1779与Streptomyces parvullus这两株菌株能够产生放线菌D，其主要作用机制为阻碍RNA多聚酶的功能，抑制RNA特别是mRNA的合成，从而妨碍蛋白质合成而抑制肿瘤生长，同时还能与放射治疗合用，提高肿瘤对放射治疗的敏感性，然而，放线菌素D对棉花枯黄萎病、核桃腐霉病植物病原菌以及妇***道炎的致病菌白色念珠菌的作用还未见报道。
棉花枯萎病和棉花黄萎病是危害棉花生产的最主要病害，近年来棉花枯萎病和棉花黄萎病在我国棉区发生日趋严重。然而，目前还没有防治棉花枯萎病和棉花黄萎病的有效药剂。从微生物资源中寻找生物农药是有效途径之一，放线菌所产生的农用抗生素是其中的最重要来源。井冈霉素、阿维菌素和秦岭霉素等生物农药的研制并推广充分证明了从放线菌的代谢产物中筛选经济高效农用抗生素的合理性和优越性。目前登记注册的防治棉花枯黄萎菌的抗生素还未见报道。
因此，通过从放线菌中筛选防治棉花枯萎病和棉花黄萎病的高效抗生素是本发明的主要目的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种产生放线菌素D的放线菌，其为易变链霉菌(Streptomyces mutabilis)TRM45540，于2014年4月14日保藏于U.S.Department ofAgriculture Agricultural Research Service(ARS)Culture Collection(地址：U.S.Departmentof Agriculture，Peoria,IL 61604USA)，保藏号为NRRL B-59117，经检测存活。
所述的放线菌在抗菌中的应用，其用于防治棉花枯黄萎病、核桃腐霉病植物病原菌，或者用于防治作为奶牛***炎致病菌的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌，或者用于防治妇***道炎的致病菌白色念珠菌。
所述的放线菌在产生的放线菌素D中的应用。所述的应用，其特征在于包括下述步骤：在合适条件下培养所述放线菌，获得发酵液；从发酵液中分离纯化放线菌素D。
所述的应用，其培养所述放线菌的培养基配方和培养条件为：玉米粉15g/L(煮沸20min，四层纱布过滤取汁)，蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，CaCO31g/L，NaCl 40g/L，调节pH为7.2-7.4；按6％的接种量接种于发酵培养基中，28℃、180rpm条件下摇床培养7天。
从发酵液中分离纯化放线菌素D的方法具体为：发酵液滤过后，湿法上样到D101或AB-8大孔树脂色谱柱大孔树脂；然后分别用2倍柱体积的清水、10％乙醇溶液、30％乙醇溶液、50％乙醇溶液、70％乙醇溶液、95％乙醇溶液洗脱；合并70-95％乙醇洗脱液，减压浓缩去掉溶剂后得到富含放线菌素D的发酵液70-95％乙醇浸膏。
从发酵液中分离纯化放线菌素D的方法进一步包括如下步骤：将发酵液70-95％乙醇浸膏烘干后先用甲醇常温超声溶解，甲醇可溶部分再用丙酮溶解，丙酮可溶部分回收丙酮溶剂后得到桔红色粉末，放线菌素D的含量达到90％以上。
从发酵液中分离纯化放线菌素D的方法进一步包括如下步骤：将丙酮萃取获得的桔红色粉末甲醇溶解后过Sephadex LH-20色谱柱，收集并合并棕黄色～桔红色部位，回收甲醇溶剂后得纯度98％以上的桔红色放线菌素D纯品。
本发明具有以下有益效果：易变链霉菌TRM45540及其主要代谢产物放线菌素D对棉花枯黄萎病菌、核桃腐霉病菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌等病原菌具有广谱而高效的拮抗活性，对棉花、核桃等农作物的安全生产及奶牛***炎和妇***道炎等疾病的防控具有重要应用价值，可以用于开发高效生物农药和生物医药。
附图说明
图1易变链霉菌TRM45540的分类学地位与***发育树；
图2易变链霉菌TRM45540的电镜照片(示螺旋状孢子丝和椭圆形孢子)；
图3放线菌素D的化学结构；
图4放线菌素D的1HNMR谱图；
图5放线菌素D的13CNMR谱图；
图6放线菌素D的HSQC谱图；
图7放线菌素D的HMBC谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例一易变链霉菌TRM45540的来源与分离培养
从新疆楼兰古城(海拔1400m，东径89°22′22″，北纬40°29′55″)0-30cm土壤样品中，采用涂布平板法，用含5％、10％、15％、20％和25％氯化钠的8种培养基，28℃恒温培养，共分离出7个属的放线菌35株，通过平板对峙法初筛和管碟法复筛，最终分离和筛选出了抑菌效果最好的生防菌TRM45540。
实施例二易变链霉菌TRM45540的鉴定
为进一步确定生防菌TRM45540的分类学地位，本发明采用传统分类方法和分子分类方法对该菌株进行了分类鉴定。
1形态观察用培养基
无机盐淀粉琼脂(ISP4)培养基：淀粉10g·L-1,(NH4)2SO44g·L-1,MgSO42g·L-1,K2HPO42g·L-1,CaCO31g·L-1,NaCl 40g·L-1,琼脂18g·L-1,pH 7.2-7.4。
2引物
采用放线菌通用引物由奥科生物技术(北京)有限公司合成。其序列分别为：27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’)和1492R(5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)
3试验方法
3.1形态学观察
普通显微镜观察：采用插片法，28℃培养生防菌TRM45540。用光学显微镜观察记录菌丝形态、气生菌丝和基内菌丝生长情况，菌丝体是否产生孢子丝及孢子丝的排列方式、形状；孢子形状和大小；孢子的有无、形状、大小及形成方式等。
3.2生防菌TRM45540的分子生物学鉴定
(A)生防菌TRM45540基因组DNA的提取
收集培养平板上的TRM45540菌体放入1.5mL的无菌离心管中，加入480μL的
1×TE缓冲液。加入20μL溶菌酶(50mg·mL-1)，放入37℃摇床中，200rpm振荡过夜。每管加入50μL 20％的SDS，加入5μL 20mg·mL-1的蛋白酶K，放入60℃摇床中，200r/min振荡1h。加入550μL的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，12000rpm离心10min，取上清移入另一离心管中，反复抽提2-3次。取上清，加入等体积的无水乙醇，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol·L-1)，放入4℃冰箱中沉淀DNA约0.5h。12000rpm离心10min，弃上清。用200μL的70％乙醇清洗离心产物2次，12000rpm离心5min，弃上清，将乙醇挥发完全。用50μL无菌超纯水充分溶解底部的DNA，1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，将提取的DNA放入-20℃冰箱中保存备用。
(B)生防菌TRM4554016S rDNA基因的扩增
用放线菌16S rDNA基因通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’)和1492R(5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增放线菌基因组DNA中的16S rDNA基因片段。
25μL的PCR反应体系为：ddH2O 20.4μL，10×Buffer(缓冲液含Mg2+)2.5μL，dNTPs0.5μL，引物27F(10μmol·L-1)0.5μL，引物1492R(10μmol·L-1)0.5μL，Taq DNA聚合酶0.1μL，模板DNA 0.5μL。
PCR反应条件为：预变性94℃4min；变性94℃1min，退火56℃1min，延伸72℃2min，30次循环；总延伸72℃8min。反应完成后用1％琼脂糖凝胶电泳检测。符合条件的PCR产物进行序列测定。
(C)测序结果的比对分析
测序结果用DNAMAN5.2软件拼接，序列通过BLAST与GenBank数据库中的已有效发表的菌株序列进行比对，下载相似度较高的已有效发表菌株的16S rDNA基因序列，用MEGA5.0软件对序列进建***发育树的行构，确定放线菌的分类学地位。
4试验结果
4.1生防菌TRM45540的形态学观察结果
生防菌TRM45540在ISP4培养基上生长良好，菌落圆形扁平，表面干燥，菌落边缘整齐，气生菌丝丰富，孢子堆白色，基内菌丝黄色，有黄色的可溶性色素产生。
生防菌TRM45540革兰氏染色为阳性，最适生长温度37℃，最适生长pH为7.2，最适NaCl(W/V)为5％，在ISP4培养基上37℃插片培养7d，通过光学显微镜观察发现：生防菌TRM45540的基内菌丝分枝多、无横隔；气生菌丝丰富，气生菌丝体形成长短不一的孢子链，孢子成串生长，孢子丝较直。根据生防菌TRM45540菌落、菌体形态和生理特征测定，确定生防菌TRM45540属于链霉菌属(Streptomyces)。
4.2生防菌TRM45540的分子生物学鉴定结果
4.2.1生防菌TRM45540的16S rDNA序列测定结果
测序结果用DNAMAN5.2软件拼接，确定该片段由1404个碱基组成，得到生防菌TRM45540的16S rDNA序列为：
AATCGCCAGTCCCACCTTCGACAGCTCCCTCCCACAAGGGGTTGGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCGTGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTTGAGATTCGCTCCACCTCGCGGTATCGCAGCTCATTGTACCGGCCATTGTAGCACGTGTGCAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCTCCCGTGAGTCCCCAGCACCACAAGGGCCTGCTGGCAACACGGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTACACCGACCACAAGGGGGACCCTGTCTCCAGGGTTTTCCGGTGTATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAGCCACATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGCACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACGGACAACGTGGAATGTTGCCCACACCTAGTGCCCACCGTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTATCGGCCCAGAGATCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCGATCTCCCCTACCGAACTCTAGCCTGCCCGTATCGACTGCAGACCCGGGGTTAAGCCCCGGGCTTTCACAACCGACGTGACAAGCCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTGATAGGCCGCGGGCTCATCCTGCACCGCCGGAGCTTTCGAACCTCGCAGATGCCTGCGAGGGTCAGTATCCGGTATTAGACCCCGTTTCCAGGGCTTGTCCCAGAGTGCAGGGCAGATTGCCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATCCCCACCCGAAGGTGGTTCATCG
4.2.2同源进化树构建
通过BLAST比对，在GenBank数据库中下载与待测放线菌16S rDNA基因序列相似度较近的序列，用MEGA5.0软件对放线菌16S rDNA基因序列进行多重序列比对，构建***发育树。生防菌TRM45540进化树见图1-1，生防菌TRM45540与易变链霉菌(Streptomyces mutabilis)的16S rDNA基因序列(一致性为99.87％)聚在同一个***进化分支上,故将该生防菌鉴定为易变链霉菌(Streptomyces mutabilis)TRM45540。
实施例三利用易变链霉菌TRM45540发酵并制备放线菌素D
接种少量菌丝体于ISP4培养基中，28℃培养4d，获得易变链霉菌TRM45540的种子液，取2mL(8％的接种量)种子液接种于玉米粉发酵培养基内发酵培养，发酵条件为：转速180rpm，初始pH 7.2-7.4，装液量250mL，发酵温度28℃，发酵7d。收集发酵液，用四层纱布过滤发酵液，湿法上样到大孔树脂色谱柱(发酵滤液每100L装填D101或AB-8大孔树脂2.0kg)；然后分别用2倍柱体积的清水、10％乙醇溶液、30％乙醇溶液、50％乙醇溶液、70％乙醇溶液、95％乙醇溶液洗脱；合并70-95％乙醇洗脱液，减压浓缩去掉溶剂后得到富含放线菌素D的发酵液70-95％乙醇浸膏，发酵液70-95％乙醇浸膏烘干后先用甲醇常温超声溶解，甲醇可溶部分再用丙酮溶解，丙酮可溶部分回收丙酮溶剂后得到桔红色粉末，放线菌素D的含量达到90％以上。丙酮萃取获得的桔红色粉末甲醇溶解后过Sephadex LH-20色谱柱，收集并合并棕黄色-桔红色部位，回收甲醇溶剂后得纯度98％以上的桔红色放线菌素D纯品。
实施例四放线菌素D的定量分析与结构表征
(1)放线菌素D的定量分析方法
采用高效液相色谱法对放线菌素D进行定量分析。色谱条件为：4.6mm×150mm C18色谱柱(0.5μm)，80％甲醇-水作为流动相，流速为1.0mL·min-1，检测波长为254nm,280nm,330nm和445nm。
(2)放线菌素D的结构表征
表1 放线菌素D的1H NMR和13C NMR谱图数据
实施例五易变链霉菌TRM45540发酵液及放线菌素D的抗菌活性测定
(1)将培养好的病原真菌孢子用无菌水从培养平板上洗脱，制成106-107个孢子/mL的孢子悬浮液，吸取100μL的孢子悬浮液到PDA平板上，用已灭菌的涂布棒将菌悬液涂布均匀，在超净工作台上稍微吹干。在带菌平板上等距离放置牛津杯，每个牛津杯中加入200μL纯化的放线菌素D，同一平板内牛津杯按照纯化的放线菌素D的浓度梯度进行添加，以放线菌素D的溶剂丙酮(对病原菌没有抑制作用)为对照，28℃培养4-5d，十字交叉法测量抑菌圈直径，每处理重复3次。植物病原真菌(棉花枯黄萎病菌、葡萄青霉病菌、黄瓜枯萎病菌、核桃腐霉病菌)在PDA培养基上进行抑菌实验，奶牛***炎的致病菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)在LB培养基培养上进行抑菌实验，妇***道炎的致病菌(白色念珠菌)在SDA培养基上进行抑菌实验。
(2)放线菌素D对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的拮抗作用
挑取病原菌单菌落于LB培养基中，过夜活化，将菌液以1/100的浓度转接于新鲜的LB培养基中，放37℃培养至OD值为0.4-0.6即制成病原菌的菌悬液，吸取100μL的菌悬液到LB平板上，用已灭菌的涂布棒将菌悬液涂布均匀，在超净工作台上稍微吹干。在带菌平板上等距离放置牛津杯，每个牛津杯中依次加入200μL纯化的放线菌素D，浓度分别为：10mg·mL-1,1mg·mL-1,0.1mg·mL-1,0.01mg·mL-1，以发酵培养基为对照，37℃培养过夜，十字交叉法测量抑菌圈直径，每处理重复3次。
(3)放线菌素D对白色念珠菌的拮抗作用
将培养好的病原真菌孢子用无菌水从培养平板上洗脱，制成106-107个孢子/mL的孢子悬浮液，吸取100μL的孢子悬浮液到SDA平板上，用已灭菌的涂布棒将菌悬液涂布均匀，在超净工作台上稍微吹干。在带菌平板上等距离放置牛津杯，每个牛津杯中依次加入不同浓度梯度的200μL纯化的放线菌素D，浓度分别为：10mg·mL-1,1mg·mL-1,0.1mg·mL-1,0.01mg·mL-1，以发酵培养基为对照，28℃培养过夜，十字交叉法测量抑菌圈直径，每处理重复3次。
上述实验结果，可见表2。
表2 放线菌素D的抗菌作用

Claims (8)

1.一种产生放线菌素D的放线菌，为易变链霉菌（Streptomyces mutabilis）TRM45540，于2014年4月14日保藏于U.S. Department of Agriculture Agricultural Research Service (ARS) Culture Collection，保藏号为NRRL B-59117。
2.按照权利要求1所述的放线菌在抗菌作用中的用途，其特征在于其用于防治棉花枯黄萎病、核桃腐霉病植物病原菌，或者用于防治作为奶牛***炎致病菌的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌，或者用于防治妇***道炎的致病菌白色念珠菌。
3.按照权利要求1所述的放线菌在生产放线菌素D中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于包括下述步骤：在合适条件下培养所述放线菌，获得发酵液；从发酵液中分离纯化放线菌素D。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：培养所述放线菌的培养基配方和培养条件为：玉米粉15g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 1g/L，NaCl 40 g/L，调节pH为7.2-7.4，其中玉米粉煮沸20min，四层纱布过滤取汁使用；按6%的接种量接种于发酵培养基中，28℃、180rpm条件下摇床培养7天。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于：从发酵液中分离纯化放线菌素D的方法具体为：
发酵液滤过后，湿法上样到D101或AB-8大孔树脂色谱柱大孔树脂；然后分别用2倍柱体积的清水、10%乙醇溶液、30%乙醇溶液、50%乙醇溶液、70%乙醇溶液、95%乙醇溶液洗脱；合并70-95%乙醇洗脱液，减压浓缩去掉溶剂后得到富含放线菌素D的发酵液70-95%乙醇浸膏。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：从发酵液中分离纯化放线菌素D的方法进一步包括如下步骤：将发酵液70-95%乙醇浸膏烘干后先用甲醇常温超声溶解，甲醇可溶部分再用丙酮溶解，丙酮可溶部分回收丙酮溶剂后得到桔红色粉末，放线菌素D的含量达到90%以上。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：从发酵液中分离纯化放线菌素D的方法进一步包括如下步骤：将丙酮萃取获得的桔红色粉末甲醇溶解后过Sephadex LH-20 色谱柱，收集并合并棕黄色～桔红色部位，回收甲醇溶剂后得纯度98%以上的桔红色放线菌素D纯品。
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