CN105875820A - 一种液态复合生物保鲜剂及其制备方法与应用 - Google Patents
一种液态复合生物保鲜剂及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105875820A CN105875820A CN201610222937.2A CN201610222937A CN105875820A CN 105875820 A CN105875820 A CN 105875820A CN 201610222937 A CN201610222937 A CN 201610222937A CN 105875820 A CN105875820 A CN 105875820A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- parts
- bacterium solution
- solution
- bacterium
- streptomyces
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
- A23B7/00—Preservation or chemical ripening of fruit or vegetables
- A23B7/14—Preserving or ripening with chemicals not covered by groups A23B7/08 or A23B7/10
- A23B7/153—Preserving or ripening with chemicals not covered by groups A23B7/08 or A23B7/10 in the form of liquids or solids
- A23B7/154—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
- A23B7/00—Preservation or chemical ripening of fruit or vegetables
- A23B7/14—Preserving or ripening with chemicals not covered by groups A23B7/08 or A23B7/10
- A23B7/153—Preserving or ripening with chemicals not covered by groups A23B7/08 or A23B7/10 in the form of liquids or solids
- A23B7/154—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
- A23B7/155—Microorganisms; Enzymes; Antibiotics
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明涉及一种液态复合生物保鲜剂，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料组成：壳聚糖5～25份、ε‑聚赖氨酸5～25份、溶菌酶5～25份、吸水链霉菌的菌液5～20份、细黄链霉菌的菌液5～20份、金产色链霉菌的菌液5～20份、乳酸链球菌的菌液5～20份、枯草芽孢杆菌的菌液5～20份、地衣芽孢杆菌的菌液5～20份、啤酒酵母菌的菌液5～20份、淡紫拟青霉菌的菌液5～20份、哈茨木霉菌的菌液5～20份。本发明的液态复合生物保鲜剂是一种高效、无毒、健康营养、对食品安全的果品保鲜剂,尤其对南果梨、软枣猕猴桃或草莓保鲜效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及食品生物技术领域，特别是用于南果梨、野生软枣猕猴桃、草莓的果品保鲜的液态复合生物保鲜剂及其制备方法。
背景技术
食物是人类生存和发展的物质基础，是维持人体生命活动不可或缺的原料，经过采收、处理、储存、包装、运输等一系列过程才被人们食用。由于呼吸生理代谢、病原微生物侵染、储藏方法不当等问题引起腐败变质，不仅使国民经济产生巨大损失，还对人类健康造成重大威胁。因此，对健康、高效、低污染、低能耗、低成本的食品保鲜技术的研究已刻不容缓。
当前，冷藏结合化学防腐剂处理是控制食物腐败的最有效技术措施，但由于使用化学防腐剂能够对人体健康造成危害，并且使植物致病微生物对其产生抗药性，所以迫切需要研究高效、无害、防腐的生物保鲜剂，以取代化学防腐剂的使用。
生物保鲜剂是指从生物机体中分离或利用细胞工程、基因工程、发酵工程和酶工程等技术获得的，对人体安全健康，并且拥有食品保鲜功能的物质。在食品保鲜应用中生物保鲜剂有很好的效果，其保鲜作用机理有以下几个方面：①含有抗菌活性物质，能够抑制或杀死食物中的腐败微生物，保持食物的新鲜度；②抗氧化作用，通过防止食品中不饱和脂肪酸等的氧化起到保质保鲜的作用；③抑制酶的活性，防止食物颜色发生变化，使其拥有良好的感官特性；④构成一层防护膜，能避免病原菌的污染，降低水分流失，保持食物品质。
生物保鲜剂的使用是一种新兴的食品保鲜方法，它是一种利用某些天然物质配制成适当浓度的溶液，通过涂膜、浸泡或喷淋等方法处理生鲜食品来抑制或杀死其中的微生物，进而达到防腐保鲜效果的保鲜技术。生物保鲜剂可以抑制或杀灭食物中的腐败菌，降低空气与食品的接触程度，减缓氧化作用，调节保存环境的气体组成和相对湿度，因其具有绿色、高效、健康等好处，扩大了生物保鲜剂的应用范围，引导着未来食品保鲜技术发展和应用。
生物保鲜剂大多是从生物体中提取得到的，与化学保鲜剂相比，拥有绿色、安全、健康营养的特点。使用生物保鲜剂不仅不会对食品的食用特性和营养价值产生影响，而且也不会引起二次污染。目前，按其来源不同，把生物保鲜剂分为天然保鲜剂与化学保鲜剂，凭借价格低廉这一特点，在食物保鲜中化学保鲜剂占据着主要地位。生物保鲜剂的特性是安全无毒，效率高，应用范围广，在未来的食品保鲜中必成为主流方向。
南果梨主产于辽宁省鞍山市，所以又称为“鞍果”，是辽宁省极具特色的特产梨，其在辽宁鞍山已经有近百年的种植历史，被称为“梨中之王”，是可以和众多地区的特色梨相媲美的珍贵梨种。南果梨中含有非常丰富的营养成分，经过农业部检测，南果梨含有的微量元素达到了38种，这其中有许多微量元素的含量都大于其它水果。其中含可溶性固形物14.4%～15.5%，含酸量0.41%，并且有延年益寿、美容之功效，因此鞍山的父老乡亲把它亲切比作梨中营养王后。
软枣猕猴桃别名软枣子、猕猴梨，为猕猴桃科落叶藤本植物。产于吉林省长白山区各县，是长白山区著名的经济野果之一，是珍贵的野生果中之王，被誉为“世界之珍果”。根据国内外学者对软枣猕猴桃的大量实验与深入研究表明，软枣猕猴桃富含各种营养成分，具有抗癌、降血压、抗衰老等各种医疗保健功效和极高的食用、营养、保健、药用价值。
草莓,蔷薇科、草莓属多年生草本植物，一种红色的花果，又名红莓、洋莓、地莓等，外观呈心形，鲜美红嫩，果肉多汁，含有特殊的浓郁水果芳香。草莓富含氨基酸、果糖、蔗糖、葡萄糖、柠檬酸、苹果酸、果胶、胡萝卜素、维生素B1、B2、烟酸及矿物质钙、镁、磷、钾、铁等，这些营养素对生长发育有很好的促进作用，对老人、儿童大有裨益。国外学者研究发现，草莓中的有效成分，可抑制癌肿的生长。每百克草莓含维生素C50-100毫克，比苹果、葡萄高10倍以上。科学研究业已证实，维生素C能消除细胞间的松弛与紧张状态，使脑细胞结构坚固，皮肤细腻有弹性，对脑和智力发育有重要影响。饭后吃一些草莓，可分解食物脂肪，有利消化。
不论南果梨、软枣猕猴桃或是草莓，极不易贮存，采摘后15天左右就将腐烂。所以，研制一种新型的生物保鲜剂对南果梨、软枣猕猴桃或是草莓的保鲜具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种液态复合生物保鲜剂。
本发明的另一个目的是提供一种液态复合生物保鲜剂的制备方法。
本发明的再一个目的是提供一种液态复合生物保鲜剂在南果梨、野生软枣猕猴桃或草莓上的应用。
本发明使用的微生物菌是中国普通微生物菌种保藏管理中心1997、2003和2012年版的菌种目录中公开的菌种，编号和菌株名是：
菌种编号为CGMCC4.1114的吸水链霉菌（stretomyces hygroscopicus），菌种编号为CGMCC4.891的细黄链霉菌（Streptomyces microflavus），菌种编号为CGMCC4.909的金产色链霉菌（Streptomyces aureochromogenes），菌种编号为CGMCC1.18的乳酸链球菌（Lactococcus lactis），菌种编号为CGMCC1.884的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），菌种编号为CGMCC1.1216的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），菌种编号为CGMCC2.1528的啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae），菌种编号为CGMCC3.4035的淡紫拟青霉菌(Paecilomyces lilacinus Samson)，菌种编号为CGMCC 3.6635的哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum Rifai)。
按照本发明所述的液态复合生物保鲜剂，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖5～25份、ε-聚赖氨酸5～25份、溶菌酶5～25份、吸水链霉菌的菌液5～20份、细黄链霉菌的菌液5～20份、金产色链霉菌的菌液5～20份、乳酸链球菌的菌液5～20份、枯草芽孢杆菌的菌液5～20份、地衣芽孢杆菌的菌液5～20份、啤酒酵母菌的菌液5～20份、淡紫拟青霉菌的菌液5～20份、哈茨木霉菌的菌液5～20份。
按照本发明所述的液态复合生物保鲜剂，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖7～20份、ε-聚赖氨酸7～20份、溶菌酶7～20份、吸水链霉菌的菌液5～15份、细黄链霉菌的菌液5～15份、金产色链霉菌的菌液5～15份、乳酸链球菌的菌液5～15份、枯草芽孢杆菌的菌液5～15份、地衣芽孢杆菌的菌液5～15份、啤酒酵母菌的菌液5～15份、淡紫拟青霉菌的菌液5～15份、哈茨木霉菌的菌液5～15份。
按照本发明所述的液态复合生物保鲜剂，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖10份、ε-聚赖氨酸10份、溶菌酶10份、吸水链霉菌的菌液7.5份、细黄链霉菌的菌液7.5份、金产色链霉菌的菌液15份、乳酸链球菌的菌液15份、枯草芽孢杆菌的菌液10份、地衣芽孢杆菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫拟青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
按照本发明所述的液态复合生物保鲜剂，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖20份、ε-聚赖氨酸7.5份、溶菌酶7.5份、吸水链霉菌的菌液10份、细黄链霉菌的菌液10份、金产色链霉菌的菌液10份、乳酸链球菌的菌液10份、枯草芽孢杆菌的菌液10份、地衣芽孢杆菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液6份、淡紫拟青霉菌的菌液6份、哈茨木霉菌的菌液6份。
按照本发明所述的液态复合生物保鲜剂，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖7.5份、ε-聚赖氨酸20份、溶菌酶7.5份、吸水链霉菌的菌液10份、细黄链霉菌的菌液10份、金产色链霉菌的菌液10份、乳酸链球菌的菌液10份、枯草芽孢杆菌的菌液10份、地衣芽孢杆菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液5份、淡紫拟青霉菌的菌液5份、哈茨木霉菌的菌液5份。
按照本发明所述的液态复合生物保鲜剂，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖7.5份、ε-聚赖氨酸7.5份、溶菌酶20份、吸水链霉菌的菌液10份、细黄链霉菌的菌液10份、金产色链霉菌的菌液10份、乳酸链球菌的菌液10份、枯草芽孢杆菌的菌液10份、地衣芽孢杆菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫拟青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
按照本发明所述的液态复合生物保鲜剂，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖7.5份、ε-聚赖氨酸7.5份、溶菌酶7.5份、吸水链霉菌的菌液15份、细黄链霉菌的菌液15份、金产色链霉菌的菌液15份、乳酸链球菌的菌液15份、枯草芽孢杆菌的菌液10份、地衣芽孢杆菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫拟青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
按照本发明所述的液态复合生物保鲜剂，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖7.5份、ε-聚赖氨酸7.5份、溶菌酶7.5份、吸水链霉菌的菌液10份、细黄链霉菌的菌液10份、金产色链霉菌的菌液10份、乳酸链球菌的菌液10份、枯草芽孢杆菌的菌液15份、地衣芽孢杆菌的菌液15份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫拟青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
一种制备如上所述的液态复合生物保鲜剂的方法，其特征在于如下步骤：
A、壳聚糖、ε-聚赖氨酸、溶菌酶的制备方法：
a、壳聚糖的制备方法：
称取虾壳25克，加1摩尔/升的盐酸溶液250毫升，搅拌，静置12小时，过滤，弃去滤液；加5%氢氧化钠溶液，至固液比1:8，搅拌,隔水煮1小时，过滤，得甲壳质，烘干，粉碎，备用；
取5克甲壳质粉于三口瓶中，加45%氢氧化钠溶液100毫升，于110～120℃搅拌反应1小时，冷却，离心，移去上清液，水洗沉淀，再离心，再移去上清液，水洗沉淀，再移去上清液，以95%乙醇洗涤沉淀，倒入抽滤瓶中，抽滤，留滤饼，制得壳聚糖，晾干，备用重；
b、ε-聚赖氨酸的制备方法：
将菌种编号为4.121的白色链霉菌（Streptomyces albulus）接种于含有5%甘油、1%硫酸铵、0.5%酵母浸膏、0.05%七水硫酸镁、0.003%七水硫酸亚铁、0.004%七水硫酸锌，pH为6.8的液体培养基中， 30℃温度下，连续培养48小时，得到含量为0.38克/升的ε-聚赖氨酸，备用；
c、溶菌酶的制备方法：
蛋清的制备：将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出，调鸡蛋清pH 值为8，轻轻搅拌5分钟，使其稠度均匀，用两层纱布过滤，备用；
鸡蛋清粗品分离：将上述过滤的蛋清量取100毫升边缓慢搅拌边加入等体积的去离子水，均匀后在不断搅拌下用1摩尔/升的盐酸溶液调pH值至7，用脱脂棉过滤，收取滤液，制得蛋清溶液，备用；
D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析：
1) D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用1摩尔/升氢氧化钠溶液浸泡，并搅拌4～8小时，抽滤, 用蒸馏水洗至pH7.5, 抽滤, 再用1摩尔/升的盐酸溶液按上述1摩尔/升氢氧化钠溶液处理树脂的方法，直到全部转变成氢型，抽滤, 用蒸馏水洗至pH5.5，保持过夜，抽滤,用2摩尔/升氢氧化钠溶液按上述处理树脂的方法，使之转变为钠型，pH值至6.5，吸干溶液，加pH6.5的0.02摩尔/升的磷酸盐缓冲液平衡树脂，制得树脂悬浮液；
2)装柱：取直径1.6厘米，长度为30厘米的层析柱，自顶部注入经处理的树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再加入树脂悬浮液，至树脂沉积至15～20厘米高度，于层析柱顶部继续加入 pH6.5的0.02摩尔/升磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液pH为6.5为止，关闭层析柱出口，保持液面高出树脂表面1厘米；
3)上柱吸附：将上述蛋清溶液加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内，流速为1毫升/分钟；
4)洗脱：用pH6.5的0.02摩尔/升的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含有1.0摩尔/升氯化钠的pH值6.5的浓度为0.02 摩尔/升磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液；
5)聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液合并装入透析袋内，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加盖，酶液中的水被透析膜外的聚乙二醇所吸收，当浓缩到5毫升时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，取出浓缩液；
6)透析除盐：蒸馏水透析除盐24小时，制得鸡蛋清粗品；
Sephadex G50分子筛柱层析:
1)装柱：先将用20%乙醇保存的Sephadex G50层析柱抽滤除去乙醇，用 6克/升氯化钠溶液搅拌Sephadex G50数分钟，再抽滤，反复多次直至无醇味为止，加入胶体积1/4的6克/升氯化钠溶液，充分搅拌，超声除去气泡，装入1.6×50厘米的玻璃层析柱，柱床45厘米；
2)上样：将上述制备的鸡蛋清粗品加入层析柱；
3)洗脱:样品流完后，先分次加入6克/升的氯化钠溶液50毫升，洗脱柱壁上的样品，连接恒流泵，使流速为0.5毫升/分钟，用部分收集器收集，每10分钟一管；
4)聚乙二醇浓缩：合并活性峰溶液，用聚乙二醇浓缩至5毫升时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，取出浓缩液；
5)透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时，收集透析液，量取体积，制得溶菌酶，备用；
B、复合菌剂的制备：
制备所述吸水链霉菌的菌液、细黄链霉菌的菌液、金产色链霉菌的菌液的发酵方法：
a、斜面菌种活化培养：取高氏一号合成液体培养基，接入一种上述微生物的斜面培养物，27～28℃ 条件下在摇床上振荡培养96～120小时，搅拌转速为60～120转/分，然后转接到相同的培养基中培养，照此方法连续转接3～5 次，将获得的培养液稀释后涂布到平板固体培养基上，27～28℃ 条件下培养4～5天，待长出菌落后，挑取大菌落在同样的固体平板培养基上划线，挑选单菌落转接到固体斜面培养基，培养得到驯化菌株，保存备用；b、二级摇瓶菌种培养：取高氏一号合成液体培养基，接入一级斜面菌种，于27～28℃下培养96～120小时，搅拌转速为60～120转/分，得二级摇瓶种子液；根据生产规模，进一步采用种子罐进行种子的放大培养；
c、微生物菌液的发酵生产：取高氏一号合成液体培养基，接入上述制备的发酵种子液，于pH7.2～7.4 、温度27～28℃， 发酵4～5天，即得，可作为生产菌液备用；
制备所述啤酒酵母菌的菌液、淡紫拟青霉菌的菌液、哈茨木霉菌的菌液的发酵方法：
a、斜面菌种活化培养：取PDA液体培养基，接入一种上述微生物的斜面培养物，25～28℃条件下在摇床上振荡培养48～72小时，搅拌转速为60～120转/分，然后转接到相同的培养基中培养，照此方法连续转接3～5次，将获得的培养液稀释后涂布到平板固体培养基上，25～28℃条件下培养3～5天，转速为60～120转/分，待长出粗壮菌丝后，挑取粗壮菌丝在同样的固体平板培养基上划线，挑选粗壮菌丝转接到固体斜面培养基，培养得到驯化菌株，保存备用；
b、二级摇瓶菌种培养：取PDA液体培养基，接入一级斜面菌种，于25～28℃下培养48～72小时，搅拌转速为60～120转/分，得二级摇瓶种子液；根据生产规模，进一步采用种子罐进行种子的放大培养；
c、微生物菌液的发酵生产：取PDA液体培养基，接入上述制备的发酵种子液，于pH7.0～7.2、温度25～28℃ 发酵3～5天，即得，作为生产菌液备用；
制备所述乳酸链球菌的菌液、枯草芽孢杆菌的菌液、地衣芽孢杆菌的菌液的发酵方法：
a、斜面菌种活化培养：取牛肉膏蛋白胨液体培养基，接入一种上述微生物的斜面培养物，30～40℃ 条件下在摇床上振荡培养20～48小时，转速为60～120转/分，然后转接到相同的培养基中培养，照此方法连续转接3～5 次，将获得的培养液稀释后涂布到平板固体培养基上，30～40℃ 条件下培养1～2天，转速为60～120转/分，待长出菌落后，挑取大菌落在同样的固体平板培养基上划线，挑选单菌落转接到固体斜面培养基，培养得到驯化菌株，保存备用；
b、二级摇瓶菌种培养：取牛肉膏蛋白胨液体培养基，接入一级斜面菌种，于30～40℃下培养20～48小时，转速为60～120转/分，得二级摇瓶种子液；根据生产规模，进一步采用种子罐进行种子的放大培养；
c、微生物菌液的发酵生产：取牛肉膏蛋白胨液体培养基，接入上述制备的发酵种子液，于pH7.2～8.5 、温度30～40℃，发酵1～2天，即得，作为生产菌液备用；
C、液态复合生物保鲜剂的制备：
按照上述复合菌剂的原料重量份配比，将上述B步骤制备的各种菌液混合，制成复合菌剂，经检验，使含总有效活菌数达2亿个/毫升，每一种有效菌的数量不得少于2000万个/毫升以上，符合国家标准GB-20287-2006，再按照如上所述的原料组分的重量份配比，将上述步骤制备的壳聚糖、ε-聚赖氨酸、溶菌酶与复合菌剂混合均匀，即得。
一种如上所述的液态复合生物保鲜剂的用途，其特征在于，它作为果品保鲜剂应用于南果梨、野生软枣猕猴桃或草莓。
本发明使用的原料组分特点如下：
枯草芽孢杆菌可提高作物对病菌和逆境危害引发体内产生氧的清除能力，调节细胞微生物环境，维持细胞正常的生理代谢和生化反应，提高作物的抗逆性，增加作物的保健作用，能促进作物生长，提高产量。
地衣芽孢杆菌细胞形态和排列呈杆状、单生，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌。它能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。
乳酸链霉菌能产生乳链菌肽，一般不会被食物中的微生物水解，但是会被胃蛋白酶水解，所以人食用后会很快的被分解成小分子的氨基酸，对人体无害，与此同时不会改变人体内的正常菌落数，也不会和经常使用的其它的抗生素发生交叉的抗性，因此，它是一种对人体无毒的天然保鲜剂。它对李斯特菌、葡萄球菌、片球菌、肠球菌等革兰氏阳性菌，以及芽胞杆菌、梭状芽胞杆菌等产芽胞的细菌均有较好的抑制效果，是一种高效绿色的食品保鲜剂，延长水果贮存期4～6倍。
细黄链霉菌产生纺锤菌素、螺旋霉素，对革兰氏阳性及阴性细菌、酵母菌、丝状真菌都有抑制作用。常用于农业上防病保苗，同时可作菌肥，能转化土壤中氮磷元素提高土壤肥力，并有刺激作物生长的作用。
吸水链霉菌产生抑制***、分枝杆菌、原虫的潮霉素 (hygromycin)，抑制分枝杆菌、病毒、肿瘤、丝状真菌、酵母的吸水菌素(hygroscopin)，抑制***、丝状真菌、酵母的吸水制菌素(hygrostatin)等多种抗生素。
金产色链霉菌抑制***、产金青霉。产生抗真菌抗生素；对丝孢酵母也有作用，拮抗性好，抑制***、根瘤菌；弱抑制革兰氏阴性细菌，强抑制多种丝状真菌和一些酵母以及一些链霉菌。
哈茨木霉菌产生的次生代谢产物对多种农业致病菌有抑菌效果。
啤酒酵母菌对Pb2+的吸附量随pH值的增加而增大,当 pH=6时达到吸附最大值。
淡紫拟青霉菌属于内寄生性真菌，是一些植物寄生线虫的重要天敌，能够寄生于虫卵中，也能侵染幼虫和雌虫，可明显减轻多种作物根结线虫、胞囊线虫、茎线虫等植物线虫病的危害。
壳聚糖在细胞壁含有丰富的磷壁酸的情况下是不能被吸附到细菌表面的，因此，对于此类细菌，壳聚糖在细胞内可以与细胞质中的阴离子发生絮凝作用，扰乱其新陈代谢过程，使细胞内的蛋白质和葡萄糖等大分子组分发生泄漏，从而达到杀菌的目的。壳聚糖通过在生鲜食物表层形成一层薄膜，能够减缓食品水分和营养成分的损失，与空气中的氧气和致腐微生物隔离，从而食品不易腐败变质。
ε-聚赖氨酸在pH＜7时，能抑制大部分细菌和真菌的正常生长，对其抗性较强的如大肠杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌抑制能力也相当不错，而且能够杀死耐热性芽孢杆菌和一些病毒。
溶菌酶(Lysozyme)为碱性球蛋白，在酸性溶液中比较稳定。它能作用于细胞的细胞膜，能够水解膜上的糖蛋白，从而导致细胞不能正常生长。对革兰氏阳性菌，溶菌酶都能有非常好的抑制效果。
本发明的液态复合生物保鲜剂是将各种菌液按所述原料比例混配制备，能很好地保持复合菌剂中的各菌群数量比例相对稳定。复合菌剂与依靠自然环境进行分解的微生物菌群及与未经单独培养而混配的菌群相比，采用单独培养后，再混配在一起的菌群，由于可以根据实际需要选择合理的配比，能充分地发挥菌剂中各菌群自身的生物特性与相互协同作用，所以，用其进行生物处理的适用范围非常广泛。
本发明的液态复合生物保鲜剂是一种高效、无毒、健康营养、对食品安全的果品保鲜剂,尤其对南果梨、软枣猕猴桃或草莓保鲜效果显著。
具体实施方式
以下各实施例仅用于对本发明进行解释说明，并不构成对权利要求范围的限定，本领域技术人员根据说明书内容可以想到的其它替代手段，均应在本发明权利要求的保护范围之内。
本发明实施例采用的微生物菌种，选择中国普通微生物菌种保藏管理中心1997、2003、2012年版的菌种目录中公开的菌种，编号和菌株名是：
菌种编号为CGMCC4.1114的吸水链霉菌（stretomyces hygroscopicus），菌种编号为CGMCC4.891的细黄链霉菌（Streptomyces microflavus），菌种编号为CGMCC4.909的金产色链霉菌（Streptomyces aureochromogenes），菌种编号为CGMCC1.18的乳酸链球菌（Lactococcus lactis），菌种编号为CGMCC1.884的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），菌种编号为CGMCC1.1216的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），菌种编号为CGMCC2.1528的啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae），菌种编号为CGMCC3.4035的淡紫拟青霉菌(Paecilomyces lilacinus Samson)，菌种编号为CGMCC 3.6635的哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum Rifai)。
实施例的液态复合生物保鲜剂制备方法为如下步骤：
A、壳聚糖、ε-聚赖氨酸、溶菌酶的制备方法：
a、壳聚糖的制备方法：
称取虾壳25克，加1摩尔/升的盐酸溶液250毫升，搅拌，静置12小时，过滤，弃去滤液；加入5% 氢氧化钠溶液，至固液比1:8，搅拌,隔水煮1小时，过滤，得甲壳质，烘干，粉碎，待用；
取5克甲壳质粉于三口瓶中，加45%氢氧化钠溶液100毫升，于115℃搅拌反应1小时，冷却，离心，移去上清液，水洗沉淀，再离心，再移去上清液，水洗沉淀，再移去上清液，以95%乙醇洗涤沉淀，倒入抽滤瓶中，抽滤，留滤饼，制得壳聚糖，晾干，备用；
b、ε-聚赖氨酸的制备方法：
将菌种编号为4.121的白色链霉菌（Streptomyces albulus）接种于含有5%甘油、1%硫酸铵、0.5%酵母浸膏、0.05%七水硫酸镁、0.003%七水硫酸亚铁、0.004%七水硫酸锌，pH为6.8的液体培养基中， 30℃温度下，连续培养48小时，制得含量为0.38克/升的ε-聚赖氨酸，备用；
c、溶菌酶的制备方法：
蛋清的制备：将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出，调鸡蛋清pH 值为8，轻轻搅拌5分钟，使其稠度均匀，用两层纱布过滤，备用；
鸡蛋清粗品分离：将上述过滤的蛋清量取100毫升边缓慢搅拌边加入等体积的去离子水，均匀后在不断搅拌下用1摩尔/升的盐酸溶液调pH值至7，用脱脂棉过滤，收取滤液，制得蛋清溶液，备用；
D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析：
1) D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用1摩尔/升氢氧化钠溶液浸泡，并搅拌6小时，抽滤, 用蒸馏水洗至pH7.5, 抽滤, 再用1摩尔/升的盐酸溶液，按上述1摩尔/升氢氧化钠溶液处理树脂的方法，直到全部转变成氢型，抽滤, 用蒸馏水洗至pH5.5，保持过夜，抽滤,再用2摩尔/升氢氧化钠溶液按上述处理树脂的方法，使之转变为钠型，pH值至6.5，吸干溶液，加pH6.5的0.02摩尔/升的磷酸盐缓冲液平衡树脂，制得树脂悬浮液；
2)装柱：取直径1.6厘米，长度为30厘米的层析柱，自顶部注入经处理的树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再加入树脂悬浮液，至树脂沉积至20厘米高度，于层析柱顶部继续加入 pH6.5的0.02摩尔/升磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液pH为6.5为止，关闭层析柱出口，保持液面高出树脂表面1厘米；
3)上柱吸附：将上述蛋清溶液加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内，流速为1毫升/分钟；
4)洗脱：用pH6.5的0.02摩尔/升的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含有1.0摩尔/升氯化钠的pH值6.5的浓度为0.02 摩尔/升磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液；
5)聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液合并装入透析袋内，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加盖，酶液中的水被透析膜外的聚乙二醇所吸收，当浓缩到5毫升时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，取出浓缩液；
6)透析除盐：蒸馏水透析除盐24小时，制得鸡蛋清粗品；
Sephadex G50分子筛柱层析:
1)装柱：先将用20%乙醇保存的Sephadex G50层析柱抽滤除去乙醇，用 6克/升氯化钠溶液搅拌Sephadex G50数分钟，再抽滤，反复多次直至无醇味为止，加入胶体积1/4的6克/升氯化钠溶液，充分搅拌，超声除去气泡，装入1.6×50厘米的玻璃层析柱，柱床45厘米；
2)上样：将上述制备的鸡蛋清粗品加入层析柱；
3)洗脱:样品流完后，先分次加入6克/升的氯化钠溶液50毫升，洗脱柱壁上的样品，连接恒流泵，使流速为0.5毫升/分钟，用部分收集器收集，每10分钟一管；
4)聚乙二醇浓缩：合并活性峰溶液，用聚乙二醇浓缩至5毫升时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，取出浓缩液；
5)透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时，收集透析液，量取体积，制得溶菌酶，备用；
B、复合菌剂的制备：
制备所述吸水链霉菌的菌液、细黄链霉菌的菌液、金产色链霉菌的菌液的发酵方法：
a、斜面菌种活化培养：取高氏一号合成液体培养基，接入一种上述微生物的斜面培养物，27～28℃ 条件下在摇床上振荡培养100小时，搅拌转速为100转/分，然后转接到相同的培养基中培养，照此方法连续转接3～5 次，将获得的培养液稀释后涂布到平板固体培养基上，27～28℃ 条件下培养4～5天，待长出菌落后，挑取大菌落在同样的固体平板培养基上划线，挑选单菌落转接到固体斜面培养基，培养得到驯化菌株，保存备用；b、二级摇瓶菌种培养：取高氏一号合成液体培养基，接入一级斜面菌种，于27～28℃下培养100小时，搅拌转速为100转/分，得二级摇瓶种子液；根据生产规模，进一步采用种子罐进行种子的放大培养；
c、微生物菌液的发酵生产：取高氏一号合成液体培养基，接入上述制备的发酵种子液，于pH7.2～7.4 、温度27～28℃， 发酵4～5天，即得，可作为生产菌液备用；
制备所述啤酒酵母菌的菌液、淡紫拟青霉菌的菌液、哈茨木霉菌的菌液的发酵方法：
a、斜面菌种活化培养：取PDA液体培养基，接入一种上述微生物的斜面培养物，26～27℃条件下在摇床上振荡培养60小时，搅拌转速为100转/分，然后转接到相同的培养基中培养，照此方法连续转接3～5次，将获得的培养液稀释后涂布到平板固体培养基上，26～27℃条件下培养3～5天，转速为100转/分，待长出粗壮菌丝后，挑取粗壮菌丝在同样的固体平板培养基上划线，挑选粗壮菌丝转接到固体斜面培养基，培养得到驯化菌株，保存备用；
b、二级摇瓶菌种培养：取PDA液体培养基，接入一级斜面菌种，于26～27℃下培养60小时，搅拌转速为100转/分，得二级摇瓶种子液；根据生产规模，进一步采用种子罐进行种子的放大培养；
c、微生物菌液的发酵生产：取PDA液体培养基，接入上述制备的发酵种子液，于pH7.0～7.2、温度26～27℃ 发酵3～5天，即得，作为生产菌液备用；
制备所述乳酸链球菌的菌液、枯草芽孢杆菌的菌液、地衣芽孢杆菌的菌液的发酵方法：
a、斜面菌种活化培养：取牛肉膏蛋白胨液体培养基，接入一种上述微生物的斜面培养物，35℃ 条件下在摇床上振荡培养35小时，转速为100转/分，然后转接到相同的培养基中培养，照此方法连续转接3～5 次，将获得的培养液稀释后涂布到平板固体培养基上，35℃条件下培养2天，转速为100转/分，待长出菌落后，挑取大菌落在同样的固体平板培养基上划线，挑选单菌落转接到固体斜面培养基，培养得到驯化菌株，保存备用；
b、二级摇瓶菌种培养：取牛肉膏蛋白胨液体培养基，接入一级斜面菌种，于35℃下培养35小时，转速为100转/分，得二级摇瓶种子液；根据生产规模，进一步采用种子罐进行种子的放大培养；
c、微生物菌液的发酵生产：取牛肉膏蛋白胨液体培养基，接入上述制备的发酵种子液，于pH7.2～8.5 、温度35℃，发酵2天，即得，作为生产菌液备用；
C、液态复合生物保鲜剂的制备：
按照如下的实施例所述复合菌剂的原料重量份配比，将上述B步骤制备的各种菌液混合，制成复合菌剂，经检验，使含总有效活菌数达2亿个/毫升，每一种有效菌的数量不得少于2000万个/毫升以上，符合国家标准GB-20287-2006，再按照如下的实施例所述的原料组分的重量份配比，将上述步骤制备的壳聚糖、ε-聚赖氨酸、溶菌酶与复合菌剂混合均匀，即得。
实施例1：由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖10份、ε-聚赖氨酸10份、溶菌酶10份、吸水链霉菌的菌液7.5份、细黄链霉菌的菌液7.5份、金产色链霉菌的菌液15份、乳酸链球菌的菌液15份、枯草芽孢杆菌的菌液10份、地衣芽孢杆菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫拟青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
实施例2：由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖20份、ε-聚赖氨酸7.5份、溶菌酶7.5份、吸水链霉菌的菌液10份、细黄链霉菌的菌液10份、金产色链霉菌的菌液10份、乳酸链球菌的菌液10份、枯草芽孢杆菌的菌液10份、地衣芽孢杆菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液6份、淡紫拟青霉菌的菌液6份、哈茨木霉菌的菌液6份。
实施例3：由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖7.5份、ε-聚赖氨酸20份、溶菌酶7.5份、吸水链霉菌的菌液10份、细黄链霉菌的菌液10份、金产色链霉菌的菌液10份、乳酸链球菌的菌液10份、枯草芽孢杆菌的菌液10份、地衣芽孢杆菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液5份、淡紫拟青霉菌的菌液5份、哈茨木霉菌的菌液5份。
实施例4：由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖7.5份、ε-聚赖氨酸7.5份、溶菌酶20份、吸水链霉菌的菌液10份、细黄链霉菌的菌液10份、金产色链霉菌的菌液10份、乳酸链球菌的菌液10份、枯草芽孢杆菌的菌液10份、地衣芽孢杆菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫拟青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
实施例5：由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖7.5份、ε-聚赖氨酸7.5份、溶菌酶7.5份、吸水链霉菌的菌液15份、细黄链霉菌的菌液15份、金产色链霉菌的菌液15份、乳酸链球菌的菌液15份、枯草芽孢杆菌的菌液10份、地衣芽孢杆菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫拟青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
实施例6：由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖7.5份、ε-聚赖氨酸7.5份、溶菌酶7.5份、吸水链霉菌的菌液10份、细黄链霉菌的菌液10份、金产色链霉菌的菌液10份、乳酸链球菌的菌液10份、枯草芽孢杆菌的菌液15份、地衣芽孢杆菌的菌液15份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫拟青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
本发明实施例的液态复合生物保鲜剂的使用方法及对比试验结果：
采用本发明实施例液态复合生物保鲜剂用于南果梨、软枣猕猴桃或是草莓的水果保鲜，其使用方法是：将生物保鲜剂12～15倍稀释后，浸涂水果5分钟，在20～25℃温度下自然沥干,常温贮存，经对比试验结果如下：
南果梨、软枣猕猴桃或草莓的失重率未使用组是生物保鲜剂使用组的3～4倍，使用组可以提高南果梨、软枣猕猴桃或草莓近15～18天的货架期，说明处理组保鲜效果非常明显。
采用本发明实施例液态复合生物保鲜剂12～15倍稀释在不同浓度下，将样品整个浸入，10秒后取出，在20～25℃温度下自然沥干，对比试验结果如下：
本发明实施例的液态复合生物保鲜剂对黑曲霉抑菌效果明显，抑菌圈直径在22mm以上；对腐败细菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均有明显的抑制作用，抑菌圈均达到了25mm以上。经过实施例的保鲜剂处理的多酚氧化酶活性高峰值比没经处理的分别低20.6%～23.8%，从而阻止果实贮藏后期果实褐变的程度。
贮存到25天时，经实施例的液态复合生物保鲜剂处理的果实丙二醛含量为1.05μmol/g，而未经处理的丙二醛含量为1.44μmol/g，对比具有显著的差别，说明保鲜剂处理有利于保持膜的完整性，进而维持果实的新鲜程度。
经实施例的液态复合生物保鲜剂处理的果实过氧化物酶为0.6U/mg，而未经处理的过氧化物酶为0.5U/mg，保鲜剂提高了酶的催化能力，阻止果实后熟和衰老。
经实施例的液态复合生物保鲜剂处理的果实过氧化氢酶为16.5U/mg, 而未经处理的过氧化物酶为10.5U/mg，保鲜剂提高了过氧化物酶的催化能力，阻止果实的衰老。
Claims (10)
1.一种液态复合生物保鲜剂，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖5～25份、ε-聚赖氨酸5～25份、溶菌酶5～25份、吸水链霉菌的菌液5～20份、细黄链霉菌的菌液5～20份、金产色链霉菌的菌液5～20份、乳酸链球菌的菌液5～20份、枯草芽孢杆菌的菌液5～20份、地衣芽孢杆菌的菌液5～20份、啤酒酵母菌的菌液5～20份、淡紫拟青霉菌的菌液5～20份、哈茨木霉菌的菌液5～20份。
2.根据权利要求1所述的液态复合生物保鲜剂，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖7～20份、ε-聚赖氨酸7～20份、溶菌酶7～20份、吸水链霉菌的菌液5～15份、细黄链霉菌的菌液5～15份、金产色链霉菌的菌液5～15份、乳酸链球菌的菌液5～15份、枯草芽孢杆菌的菌液5～15份、地衣芽孢杆菌的菌液5～15份、啤酒酵母菌的菌液5～15份、淡紫拟青霉菌的菌液5～15份、哈茨木霉菌的菌液5～15份。
3.根据权利要求1或2所述的液态复合生物保鲜剂，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖10份、ε-聚赖氨酸10份、溶菌酶10份、吸水链霉菌的菌液7.5份、细黄链霉菌的菌液7.5份、金产色链霉菌的菌液15份、乳酸链球菌的菌液15份、枯草芽孢杆菌的菌液10份、地衣芽孢杆菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫拟青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
4.根据权利要求1或2所述的液态复合生物保鲜剂，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖20份、ε-聚赖氨酸7.5份、溶菌酶7.5份、吸水链霉菌的菌液10份、细黄链霉菌的菌液10份、金产色链霉菌的菌液10份、乳酸链球菌的菌液10份、枯草芽孢杆菌的菌液10份、地衣芽孢杆菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液6份、淡紫拟青霉菌的菌液6份、哈茨木霉菌的菌液6份。
5.根据权利要求1或2所述的液态复合生物保鲜剂，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖7.5份、ε-聚赖氨酸20份、溶菌酶7.5份、吸水链霉菌的菌液10份、细黄链霉菌的菌液10份、金产色链霉菌的菌液10份、乳酸链球菌的菌液10份、枯草芽孢杆菌的菌液10份、地衣芽孢杆菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液5份、淡紫拟青霉菌的菌液5份、哈茨木霉菌的菌液5份。
6.根据权利要求1或2所述的液态复合生物保鲜剂，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖7.5份、ε-聚赖氨酸7.5份、溶菌酶20份、吸水链霉菌的菌液10份、细黄链霉菌的菌液10份、金产色链霉菌的菌液10份、乳酸链球菌的菌液10份、枯草芽孢杆菌的菌液10份、地衣芽孢杆菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫拟青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
7.根据权利要求1或2所述的液态复合生物保鲜剂，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖7.5份、ε-聚赖氨酸7.5份、溶菌酶7.5份、吸水链霉菌的菌液15份、细黄链霉菌的菌液15份、金产色链霉菌的菌液15份、乳酸链球菌的菌液15份、枯草芽孢杆菌的菌液10份、地衣芽孢杆菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫拟青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
8.根据权利要求1或2所述的液态复合生物保鲜剂，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料组成：
壳聚糖7.5份、ε-聚赖氨酸7.5份、溶菌酶7.5份、吸水链霉菌的菌液10份、细黄链霉菌的菌液10份、金产色链霉菌的菌液10份、乳酸链球菌的菌液10份、枯草芽孢杆菌的菌液15份、地衣芽孢杆菌的菌液15份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫拟青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
9.一种权利要求1～8所述的液态复合生物保鲜剂的制备方法，其特征在于如下步骤：
A、壳聚糖、ε-聚赖氨酸、溶菌酶的制备方法：
a、壳聚糖的制备方法：
称取虾壳25克，加1摩尔/升的盐酸溶液250毫升，搅拌，静置12小时，过滤，弃去滤液；加5%氢氧化钠溶液，至固液比1:8，搅拌,隔水煮1小时，过滤，得甲壳质，烘干，粉碎，备用；
取5克甲壳质粉于三口瓶中，加45%氢氧化钠溶液100毫升，于110～120℃搅拌反应1小时，冷却，离心，移去上清液，水洗沉淀，再离心，再移去上清液，水洗沉淀，再移去上清液，以95%乙醇洗涤沉淀，倒入抽滤瓶中，抽滤，留滤饼，制得壳聚糖，晾干，备用重；
b、ε-聚赖氨酸的制备方法：
将菌种编号为4.121的白色链霉菌（Streptomyces albulus）接种于含有5%甘油、1%硫酸铵、0.5%酵母浸膏、0.05%七水硫酸镁、0.003%七水硫酸亚铁、0.004%七水硫酸锌，pH为6.8的液体培养基中， 30℃温度下，连续培养48小时，得到含量为0.38克/升的ε-聚赖氨酸，备用；
c、溶菌酶的制备方法：
蛋清的制备：将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出，调鸡蛋清pH 值为8，轻轻搅拌5分钟，使其稠度均匀，用两层纱布过滤，备用；
鸡蛋清粗品分离：将上述过滤的蛋清量取100毫升边缓慢搅拌边加入等体积的去离子水，均匀后在不断搅拌下用1摩尔/升的盐酸溶液调pH值至7，用脱脂棉过滤，收取滤液，制得蛋清溶液，备用；
D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析：
1) D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用1摩尔/升氢氧化钠溶液浸泡，并搅拌4～8小时，抽滤, 用蒸馏水洗至pH7.5, 抽滤, 再用1摩尔/升的盐酸溶液按上述1摩尔/升氢氧化钠溶液处理树脂的方法，直到全部转变成氢型，抽滤, 用蒸馏水洗至pH5.5，保持过夜，抽滤,用2摩尔/升氢氧化钠溶液按上述处理树脂的方法，使之转变为钠型，pH值至6.5，吸干溶液，加pH6.5的0.02摩尔/升的磷酸盐缓冲液平衡树脂，制得树脂悬浮液；
2)装柱：取直径1.6厘米，长度为30厘米的层析柱，自顶部注入经处理的树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再加入树脂悬浮液，至树脂沉积至15～20厘米高度，于层析柱顶部继续加入 pH6.5的0.02摩尔/升磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液pH为6.5为止，关闭层析柱出口，保持液面高出树脂表面1厘米；
3)上柱吸附：将上述蛋清溶液加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内，流速为1毫升/分钟；
4)洗脱：用pH6.5的0.02摩尔/升的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含有1.0摩尔/升氯化钠的pH值6.5的浓度为0.02 摩尔/升磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液；
5)聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液合并装入透析袋内，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加盖，酶液中的水被透析膜外的聚乙二醇所吸收，当浓缩到5毫升时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，取出浓缩液；
6)透析除盐：蒸馏水透析除盐24小时，制得鸡蛋清粗品；
Sephadex G50分子筛柱层析:
1)装柱：先将用20%乙醇保存的Sephadex G50层析柱抽滤除去乙醇，用 6克/升氯化钠溶液搅拌Sephadex G50数分钟，再抽滤，反复多次直至无醇味为止，加入胶体积1/4的6克/升氯化钠溶液，充分搅拌，超声除去气泡，装入1.6×50厘米的玻璃层析柱，柱床45厘米；
2)上样：将上述制备的鸡蛋清粗品加入层析柱；
3)洗脱:样品流完后，先分次加入6克/升的氯化钠溶液50毫升，洗脱柱壁上的样品，连接恒流泵，使流速为0.5毫升/分钟，用部分收集器收集，每10分钟一管；
4)聚乙二醇浓缩：合并活性峰溶液，用聚乙二醇浓缩至5毫升时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，取出浓缩液；
5)透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时，收集透析液，量取体积，制得溶菌酶，备用；
B、复合菌剂的制备：
制备所述吸水链霉菌的菌液、细黄链霉菌的菌液、金产色链霉菌的菌液的发酵方法：
a、斜面菌种活化培养：取高氏一号合成液体培养基，接入一种上述微生物的斜面培养物，27～28℃ 条件下在摇床上振荡培养96～120小时，搅拌转速为60～120转/分，然后转接到相同的培养基中培养，照此方法连续转接3～5 次，将获得的培养液稀释后涂布到平板固体培养基上，27～28℃ 条件下培养4～5天，待长出菌落后，挑取大菌落在同样的固体平板培养基上划线，挑选单菌落转接到固体斜面培养基，培养得到驯化菌株，保存备用；b、二级摇瓶菌种培养：取高氏一号合成液体培养基，接入一级斜面菌种，于27～28℃下培养96～120小时，搅拌转速为60～120转/分，得二级摇瓶种子液；根据生产规模，进一步采用种子罐进行种子的放大培养；
c、微生物菌液的发酵生产：取高氏一号合成液体培养基，接入上述制备的发酵种子液，于pH7.2～7.4 、温度27～28℃， 发酵4～5天，即得，可作为生产菌液备用；
制备所述啤酒酵母菌的菌液、淡紫拟青霉菌的菌液、哈茨木霉菌的菌液的发酵方法：
a、斜面菌种活化培养：取PDA液体培养基，接入一种上述微生物的斜面培养物，25～28℃条件下在摇床上振荡培养48～72小时，搅拌转速为60～120转/分，然后转接到相同的培养基中培养，照此方法连续转接3～5次，将获得的培养液稀释后涂布到平板固体培养基上，25～28℃条件下培养3～5天，转速为60～120转/分，待长出粗壮菌丝后，挑取粗壮菌丝在同样的固体平板培养基上划线，挑选粗壮菌丝转接到固体斜面培养基，培养得到驯化菌株，保存备用；
b、二级摇瓶菌种培养：取PDA液体培养基，接入一级斜面菌种，于25～28℃下培养48～72小时，搅拌转速为60～120转/分，得二级摇瓶种子液；根据生产规模，进一步采用种子罐进行种子的放大培养；
c、微生物菌液的发酵生产：取PDA液体培养基，接入上述制备的发酵种子液，于pH7.0～7.2、温度25～28℃ 发酵3～5天，即得，作为生产菌液备用；
制备所述乳酸链球菌的菌液、枯草芽孢杆菌的菌液、地衣芽孢杆菌的菌液的发酵方法：
a、斜面菌种活化培养：取牛肉膏蛋白胨液体培养基，接入一种上述微生物的斜面培养物，30～40℃ 条件下在摇床上振荡培养20～48小时，转速为60～120转/分，然后转接到相同的培养基中培养，照此方法连续转接3～5 次，将获得的培养液稀释后涂布到平板固体培养基上，30～40℃ 条件下培养1～2天，转速为60～120转/分，待长出菌落后，挑取大菌落在同样的固体平板培养基上划线，挑选单菌落转接到固体斜面培养基，培养得到驯化菌株，保存备用；
b、二级摇瓶菌种培养：取牛肉膏蛋白胨液体培养基，接入一级斜面菌种，于30～40℃下培养20～48小时，转速为60～120转/分，得二级摇瓶种子液；根据生产规模，进一步采用种子罐进行种子的放大培养；
c、微生物菌液的发酵生产：取牛肉膏蛋白胨液体培养基，接入上述制备的发酵种子液，于pH7.2～8.5 、温度30～40℃，发酵1～2天，即得，作为生产菌液备用；
C、液态复合生物保鲜剂的制备：
按照权利要求1～8所述复合菌剂的原料重量份配比，将上述B步骤制备的各种菌液混合，制成复合菌剂，经检验，使含总有效活菌数达2亿个/毫升，每一种有效菌的数量不得少于2000万个/毫升以上，符合国家标准GB-20287-2006，再按照权利要求1～8所述的原料组分的重量份配比，将上述步骤制备的壳聚糖、ε-聚赖氨酸、溶菌酶与复合菌剂混合均匀，即得。
10.一种权利要求1～8所述的液态复合生物保鲜剂的用途，其特征在于，它作为果品保鲜剂应用于南果梨、野生软枣猕猴桃或草莓。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610222937.2A CN105875820A (zh) | 2016-04-12 | 2016-04-12 | 一种液态复合生物保鲜剂及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610222937.2A CN105875820A (zh) | 2016-04-12 | 2016-04-12 | 一种液态复合生物保鲜剂及其制备方法与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105875820A true CN105875820A (zh) | 2016-08-24 |
Family
ID=57012578
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610222937.2A Pending CN105875820A (zh) | 2016-04-12 | 2016-04-12 | 一种液态复合生物保鲜剂及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105875820A (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108157493A (zh) * | 2017-12-12 | 2018-06-15 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 一种基于含ε-聚赖氨酸发酵液的复合生物防腐保鲜剂 |
| CN109090224A (zh) * | 2018-07-09 | 2018-12-28 | 湖州吴兴道场城乡建设发展有限公司 | 一种微生物水果保鲜剂 |
| CN109090430A (zh) * | 2018-09-20 | 2018-12-28 | 贵州省贵福菌业发展有限公司 | 一种鲜油茶菇保鲜用乳酸菌保鲜液 |
| CN110055203A (zh) * | 2019-04-23 | 2019-07-26 | 沈阳农业大学 | 一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸高产菌株及制备工艺 |
| CN111838298A (zh) * | 2020-07-29 | 2020-10-30 | 四川大学 | 一种缩短猕猴桃后熟时间的催熟方法及其产品 |
| CN112120077A (zh) * | 2019-06-09 | 2020-12-25 | 王虎 | 一种绿色环保的杨梅保鲜剂配方及其制备方法的制备方法 |
| CN113796414A (zh) * | 2021-09-23 | 2021-12-17 | 临沂大学 | 一种蓝莓鲜果的保鲜方法 |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101619308A (zh) * | 2009-08-14 | 2010-01-06 | 湖北神地农业科贸有限公司 | 从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法 |
| CN101870959A (zh) * | 2010-06-11 | 2010-10-27 | 河北省科学院生物研究所 | 一种枯草芽孢杆菌、其菌剂、以及其制剂在水果保鲜领域的应用 |
| CN102188034A (zh) * | 2010-03-03 | 2011-09-21 | 天津科技大学 | 一种用于食品的复合生物防腐保鲜剂 |
| CN102617755A (zh) * | 2012-04-20 | 2012-08-01 | 江南大学 | 一种用虾壳或虾壳加工残渣制备壳聚糖的简易工艺 |
| CN103125590A (zh) * | 2011-11-21 | 2013-06-05 | 南通中科睿智科技服务有限公司 | 一种葡萄的生物保鲜剂及其制备方法 |
| CN103651774A (zh) * | 2013-12-03 | 2014-03-26 | 河北省科学院生物研究所 | 一种用于食用菌的生物储存剂、其制备方法和食用菌保鲜纸 |
| CN104082830A (zh) * | 2014-06-11 | 2014-10-08 | 南通昊友食品添加剂有限公司 | 一种复合生物防腐保鲜剂 |
| CN104496707A (zh) * | 2015-01-11 | 2015-04-08 | 鞍山禾瑞生物科技有限公司 | 一种液态复合生物多控肥料及其制备方法与应用 |
| CN104542727A (zh) * | 2015-01-27 | 2015-04-29 | 辽宁玉泉生态农业科技有限公司 | 一种液态复合生物多控杀虫剂及其制备方法 |
| CN104611144A (zh) * | 2014-12-17 | 2015-05-13 | 山东省药学科学院 | 一种天然果蔬清洁保鲜剂及其使用方法 |
-
2016
- 2016-04-12 CN CN201610222937.2A patent/CN105875820A/zh active Pending
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101619308A (zh) * | 2009-08-14 | 2010-01-06 | 湖北神地农业科贸有限公司 | 从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法 |
| CN102188034A (zh) * | 2010-03-03 | 2011-09-21 | 天津科技大学 | 一种用于食品的复合生物防腐保鲜剂 |
| CN101870959A (zh) * | 2010-06-11 | 2010-10-27 | 河北省科学院生物研究所 | 一种枯草芽孢杆菌、其菌剂、以及其制剂在水果保鲜领域的应用 |
| CN103125590A (zh) * | 2011-11-21 | 2013-06-05 | 南通中科睿智科技服务有限公司 | 一种葡萄的生物保鲜剂及其制备方法 |
| CN102617755A (zh) * | 2012-04-20 | 2012-08-01 | 江南大学 | 一种用虾壳或虾壳加工残渣制备壳聚糖的简易工艺 |
| CN103651774A (zh) * | 2013-12-03 | 2014-03-26 | 河北省科学院生物研究所 | 一种用于食用菌的生物储存剂、其制备方法和食用菌保鲜纸 |
| CN104082830A (zh) * | 2014-06-11 | 2014-10-08 | 南通昊友食品添加剂有限公司 | 一种复合生物防腐保鲜剂 |
| CN104611144A (zh) * | 2014-12-17 | 2015-05-13 | 山东省药学科学院 | 一种天然果蔬清洁保鲜剂及其使用方法 |
| CN104496707A (zh) * | 2015-01-11 | 2015-04-08 | 鞍山禾瑞生物科技有限公司 | 一种液态复合生物多控肥料及其制备方法与应用 |
| CN104542727A (zh) * | 2015-01-27 | 2015-04-29 | 辽宁玉泉生态农业科技有限公司 | 一种液态复合生物多控杀虫剂及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 个人分享: "《教学研究：壳聚糖制备工艺》", 23 February 2016, 豆丁网 * |
| 贾士儒: "《生物防腐剂》", 30 September 2009, 北京：中国轻工业出版社 * |
| 陈庆森 等: "《实用生物化学实验技术指导》", 30 September 2013, 杭州：浙江大学出版社 * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108157493A (zh) * | 2017-12-12 | 2018-06-15 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 一种基于含ε-聚赖氨酸发酵液的复合生物防腐保鲜剂 |
| CN109090224A (zh) * | 2018-07-09 | 2018-12-28 | 湖州吴兴道场城乡建设发展有限公司 | 一种微生物水果保鲜剂 |
| CN109090430A (zh) * | 2018-09-20 | 2018-12-28 | 贵州省贵福菌业发展有限公司 | 一种鲜油茶菇保鲜用乳酸菌保鲜液 |
| CN110055203A (zh) * | 2019-04-23 | 2019-07-26 | 沈阳农业大学 | 一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸高产菌株及制备工艺 |
| CN110055203B (zh) * | 2019-04-23 | 2021-04-20 | 沈阳农业大学 | 一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸高产菌株及制备工艺 |
| CN112120077A (zh) * | 2019-06-09 | 2020-12-25 | 王虎 | 一种绿色环保的杨梅保鲜剂配方及其制备方法的制备方法 |
| CN111838298A (zh) * | 2020-07-29 | 2020-10-30 | 四川大学 | 一种缩短猕猴桃后熟时间的催熟方法及其产品 |
| CN111838298B (zh) * | 2020-07-29 | 2022-12-06 | 四川大学 | 一种缩短猕猴桃后熟时间的催熟方法及其产品 |
| CN113796414A (zh) * | 2021-09-23 | 2021-12-17 | 临沂大学 | 一种蓝莓鲜果的保鲜方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105875820A (zh) | 一种液态复合生物保鲜剂及其制备方法与应用 | |
| CN103478439B (zh) | 虾饲料添加剂组合物及其制造方法 | |
| CN107446852B (zh) | 一株植物乳杆菌及其在发酵饲料方面的应用 | |
| CN106399159B (zh) | 一种坚强芽孢杆菌菌剂及其制备方法与应用 | |
| CN105919110B (zh) | 黑茶复合酵素及其制备方法 | |
| CN107593955A (zh) | 发酵食用菌茶制作工艺及发酵食用菌茶 | |
| CN108611287A (zh) | 一株控制桃果采后病害的膜醭毕赤酵母 | |
| CN105613707A (zh) | 枯草芽孢杆菌生物保鲜剂及在大黄鱼保鲜中的应用 | |
| CN106234895A (zh) | 一种白刺果乳酸菌发酵饮料及其制备方法 | |
| KR20160136718A (ko) | 황기 발효산물 및 그것의 제조 방법 | |
| CN105981581A (zh) | 一种蝉花的人工培养方法 | |
| KR101701827B1 (ko) | 불릴 필요없는 발효 곡물의 제조방법 | |
| KR20200136964A (ko) | 탈모 치료용 조성물의 제조 방법 | |
| CN106072518B (zh) | 南酸枣酵素及其制备方法 | |
| CN108157065A (zh) | 一种牛樟芝菌丝体的培养方法及其应用 | |
| CN110547384B (zh) | 一种小黄鱼骨胶原抗菌肽及其应用 | |
| CN107027516A (zh) | 一种富硒蝉花虫草、其培养方法及应用 | |
| CN105794963A (zh) | 一株降解玉米赤霉烯酮毒素酵母菌及应用 | |
| CN110527639A (zh) | 一种美极梅奇酵母及其应用 | |
| CN109628334A (zh) | 利用l-脯氨酸诱导培养提高酵母抑制果实病害效力的方法、制剂及所用培养基 | |
| CN104988183A (zh) | 糙皮侧耳发酵液的制备方法及该发酵液在降解黄曲霉毒素b1中的应用 | |
| CN102630480B (zh) | 一种富铁黑木耳及其制备方法 | |
| KR102233304B1 (ko) | 안정적인 배양이 가능하고 인체면역증강 및 생리활성물질을 다량 함유하는 밀리타리스 동충하초의 재배 배지조성물 및 이를 이용한 밀리타리스 동충하초 재배방법과 이에 따라 재배된 밀리타리스 동충하초 | |
| CN103931665A (zh) | 一种防治褐飞虱的混合配方制剂 | |
| CN102643730A (zh) | 一种以蛹虫草培养基残基为原料的保健酒及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 114041 Liaoning, Anshan, Qianshan District, Tun Town, Tun Tun Village Applicant after: Liaoning Hei Bio Technology Co., Ltd. Address before: 114041 Liaoning, Anshan, Qianshan District, Tun Town, Tun Tun Village Applicant before: ANSHAN HERUI BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160824 |