CN113278550B - 改善肠道降解黄曲霉毒素玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改善肠道降解黄曲霉毒素玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌，所述凝结芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC NO.20893；所述制剂含有所述凝结芽孢杆菌的培养物的提取物；本发明的优点在于：能够抑制肠道致病菌，且可高效降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，作用条件简单，其发酵产物不破坏饲料中的营养成分，可在饲料中长期添加。

Description

改善肠道降解黄曲霉毒素玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌

技术领域

本发明涉及一种凝结芽孢杆菌，具体地说是改善动物肠道降解黄曲霉毒素与玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans B4.0120），属于农业生物领域。

背景技术

抗生素的使用，是人类历史上一次伟大的进步。抗生素的使用，大大提高了动物的抗病能力，且可促进动物生长，提高畜禽养殖水平。但是随着抗生素的大量使用，人们发现滥用抗生素带来的细菌耐药性、环境污染等问题逐渐凸显。因此，于2020年7月1日起，我国停止生产含有促生长类药物饲料添加剂的商品饲料。抗生素的禁用对畜禽养殖是一次巨大的冲击，急需一种可以高效替代抗生素的产品。此外，霉菌毒素是真菌在其生长繁殖过程中产生的一类有毒代谢产物。其对动物和人体危害巨大。常见的霉菌毒素有黄曲霉毒素（AF）、玉米赤霉烯酮（ZEA）、呕吐毒素（DON）、赭曲霉毒素（OT）、烟曲霉毒素（FB）等，各种霉菌毒素对动物的毒性效应不尽相同。实际生产中，常常出现几种霉菌毒素同时污染的显现，而大部分霉菌毒素之间是协同作用的关系，因此寻找可同时降解多种霉菌毒素的的微生物是解决当前霉菌毒素污染问题的有效手段。

发明内容

本发明的目的在于，提供了能够改善动物肠道、降解黄曲霉毒素与玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌，能够抑制肠道致病菌，且可高效降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，作用条件简单，其发酵产物不破坏饲料中的营养成分，可在饲料中长期添加。

本发明的技术方案为：

一种改善肠道降解黄曲霉毒素玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.20893。

所述凝结芽孢杆菌的液体培养基配方重量分数为：10‰玉米面、10‰蛋白胨、10‰酵母粉，培养条件为：40℃，pH维持在5.8-6.5，通气发酵，得到凝结芽孢杆菌液体培养物；固体培养基配方重量分数为：90%的细麸皮、5%蛋白胨、5%酵母浸粉，水分50%，培养条件为：40℃，微需氧发酵，得到凝结芽孢杆菌固体培养物。

一种生物制剂，所述制剂含有上述凝结芽孢杆菌培养物的提取物。

所述提取物的制备方法为：将凝结芽孢杆菌接种于液体发酵罐中，40℃好氧发酵24hr，或者将其固体培养物在40℃培养3天，对发酵后发酵液进行离心喷雾干燥，得到固体发酵物料后进行快速干燥；最后按照一定比例与载体混合。

所述载体包括麦麸、玉米芯粉、玉米淀粉、米糠、葡萄糖、沸石粉、膨润土中的一种或几种。

所述生物制剂中提取物的含量为重量分数20-60%。

所述凝结芽孢杆菌发酵提取物与载体的质量比例为：20-60：80-40。

本发明生物制剂的作用对象包括饲料及其制作原料等。

所述凝结芽孢杆菌菌株16SrDNA基因序列测定：

ACATCTGTCACTTCGGCGGCTGGCTCCGTAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGCAGGCGGGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGAATGGTTTTCTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTCTCGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGGTCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAAGGCCCTGTCTCCAGGGAGGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGCCTCCCAGTTTCCAATGACCGCTTGCGGTTGAGCCGCAAGATTTCACATCAGACTTAAGAAGCCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGCCGGGTACCGTCAAGGCGCCGCCCTGTTCGAACGGCACTTGTTCTTCCCCGGCAACAGAGTTTTACGACCCGAAGGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGCCCATCTGTAAGTGACAGCAGAAGCCGTCTTTCCTTTTTCCTCCATGCGGAGGAAAAAACTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGCGTTATCCCGATCTTACAGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACCTTTTAAAAGCAAGCTTTTAAAAGGTCCGCACGACTTGCATGTATTAGGCAGCCCCATGGCAC。

本发明凝结芽孢杆菌属于兼性厌氧菌，进入动物体内后前期消耗肠道内的氧气，创造一个厌氧的环境，抑制大肠杆菌等需氧菌的生长，后期则产生有机酸，有利于肠道有益菌乳酸杆菌的生长繁殖，改善了肠道微生态环境。同时本发明可以高效降解黄曲霉毒素与玉米赤霉烯酮，因此，其在畜禽养殖领域具有很广的应用前景。

本发明的有益效果为：能够抑制肠道致病菌，且可高效降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，作用条件简单，其发酵产物不破坏饲料中的营养成分，可在饲料中长期添加。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为本发明实施例凝结芽孢杆菌在1600 X显微镜下的菌体图；

图2为本发明实施例凝结芽孢杆菌在1600 X显微镜下的芽孢图；

图3为本发明实施例菌株对大肠杆菌的拮抗作用图；

图4为本发明实施例菌株对金黄色葡萄球菌的拮抗作用图；

图5为本发明实施例菌株对沙门氏菌的拮抗作用图；

图6所示为0hr所取样品中黄曲霉毒素B1含量色谱图；

图7所示为本发明菌株降解24hr后样品中黄曲霉毒素B1含量色谱图；

图8所示为0hr所取样品中玉米赤霉烯酮含量色谱图；

图9所示为本发明菌株降解24hr后样品中玉米赤霉烯酮含量色谱图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种改善肠道降解黄曲霉毒素玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌，所述凝结芽孢杆菌的液体培养基配方重量分数为：10‰玉米面、10‰蛋白胨、10‰酵母粉，培养条件为：40℃，pH维持在5.8-6.5，通气发酵，得到凝结芽孢杆菌液体培养物；固体培养基配方重量分数为：90%的细麸皮、5%蛋白胨、5%酵母浸粉，水分50%，培养条件为：40℃，微需氧发酵，得到凝结芽孢杆菌固体培养物。

一种生物制剂，所述制剂含有上述凝结芽孢杆菌培养物的提取物。

所述提取物的制备方法为：将凝结芽孢杆菌接种于液体发酵罐中，40℃好氧发酵24hr，或者将其固体培养物在40℃培养3天，对发酵后发酵液进行离心喷雾干燥，得到固体发酵物料后进行快速干燥；最后按照一定比例与载体混合。

所述载体包括麦麸、玉米芯粉、玉米淀粉、米糠、葡萄糖、沸石粉、膨润土中的一种或几种。

所述生物制剂中提取物的含量为重量分数20-60%。

所述凝结芽孢杆菌发酵提取物与载体的质量比例为：20：80或30：70或40：60或50：60或60：40。

所述凝结芽孢杆菌菌株是从酸败的牛奶中分离得到。

收集腐败变质的牛奶进行菌种筛选试验。将酸败牛奶均匀涂布于YPD平板上，40℃培养48hr，对平板上的每个单菌落转接到空白YPD平板上，得到纯化的菌株。对具有产酸能力的菌落在液体PCY培养基中培养24hr后，对其抑菌能力、黄曲霉毒素与玉米赤霉烯酮降解能力进行测定。

实施例2 本发明菌株对肠道有害菌的拮抗作用

本发明菌株培养液活化：将纯化的菌株进行液体PCY培养基培养，活化24h后得到本发明菌株的培养液。

毒株培养液活化：将纯化的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌进行LB液体培养基培养，培养24hr后得到毒株培养液。用血球计数板对其活菌数进行估测，用无菌生理盐水将其稀释至10-3个/mL浓度。

含有毒株培养液平皿的制备：配制LB固体培养基，将其分装于250mL的锥形瓶中，121℃灭菌20min，待其冷却到40℃左右，培养基凝固之前，加入1mL上述稀释的毒株培养液，充分混合均匀，倾倒平皿。

待平皿凝固后，用直径为6mm灭菌打孔器进行打孔，每个平板打4个孔，作为平行。然后将培养好的本发明凝结芽孢杆菌培养液加入打好的孔中，每个孔添加50μL的培养液。正置放入培养箱中40℃培养24hr，观察并计量抑菌圈直径。

从图3、图4、图5可以看出，本发明凝结芽孢杆菌对动物肠道常见有害菌具有显著的拮抗效果。其中对大肠杆菌的抑菌圈直径为14mm-15mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为14mm-16mm，对沙门氏菌的抑菌圈直径为14mm-15mm。

实施例3 本发明菌株对黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的降解率

一、样品处理：

将实施例1纯化的菌种进行PCY液体培养基活化，活化24hr后得到本发明菌株的培养液。在无菌操作的前提下，准确量取50mL上述培养液置于250mL的三角瓶中，如果为固体样品，则在50mL的灭菌培养基（培养基组成：1%玉米面、1%蛋白胨、1%酵母粉）中加入0.1g固体物料。然后加入1mL黄曲霉毒素B1或1mL玉米赤霉烯酮标准品，使得最终反应体系中黄曲霉毒素B1的浓度为50μg/L，玉米赤霉烯酮的浓度为500μg/L，混合均匀，将其置于40℃，150rpm条件下培养。同时做不添加任何培养液或固体物料的空白对照，其他处理相同。

分别于培养的0h和24h取样1mL，加入4mL色谱级甲醇，混合均匀。置于摇床中震荡提取30min。提取结束后，4000rpm离心5min，玻璃纤维滤纸进行过滤，收集滤液进行免疫亲和柱净化，高效液相色谱检测。

二、净化：

取通过玻璃纤维滤纸的滤液5mL，加入20mL PBS缓冲溶液，混合均匀，待检。

将免疫亲和柱上方接上10mL玻璃注射器。去掉免疫亲和柱下方的堵头，弃去柱中的保护液，准确移取上述稀释好的待检液20mL于注射器中（可以移取2次，每次10mL）。将空气压力泵与注射器相连接，调节压力，使溶液以约1mL/min左右的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。加入10mL双蒸水洗涤2次，调节流速为3mL/min左右，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液。

最后分2次各准确加入0.5 mL（总体积为1 mL，）色谱纯甲醇，每次孵育2min，

流速为1mL/min左右，收集洗脱液于棕色小瓶中用于HPLC分析。

标准曲线绘制：

根据使用需要，准确吸取一定量的黄曲霉毒素标准贮备液（B1 100 μg/L）或者玉米赤霉烯酮标准贮备液（ZEA 1000 μg/L），用色谱级甲醇稀释，分别配成系列浓度的标准工作液：AFB1的浓度分别为0μg/L、1μg/L、5μg/L、25μg/L、50μg/L；ZEA的浓度分别为：0μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1000μg/L。以标准工作液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准曲线对样品进行定量。

三、检测：

黄曲霉毒素检测条件：

色谱柱：C18色谱柱，4.6 mm×150 mm，5μm；

流动相：甲醇：水=45:55；

流速：1 mL/min；

荧光检测器波长：激发波长λex 360 nm，发射波长λem 440 nm（开柱后衍生池）；

进样量：20 μL；

黄曲霉毒素B1 出峰时间：17-19 min。

玉米赤霉烯酮检测条件：

色谱柱：C18，150 mm×4.6 mm×5μm；

流动相：乙腈：水：甲醇=46:46:8；

流速：1 ml/min；

检测波长：激发波长λex 274nm，发射波长λem 440nm；

上样量：20 μL；

玉米赤霉烯酮的出峰时间：11~13 min。

四、结果：

结果显示：根据高效液相色谱检测数据，0h样品AFB1含量为48.90μg/L，24h样品AFB1含量为4.73μg/L，则本发明菌株对AFB1降解率为90.33%，0h样品ZEA含量为864.91 μg/L，24h样品ZEA含量为169.579 μg/L，则本发明菌株对ZEA的降解率为80.39%。

实施例4 本发明菌株对断奶仔猪生长性能及肠道健康的影响

选取体重相近，体型一致，健康无病的21日龄三元杂交断奶仔猪（杜×长×大三元杂交）120头，将其随机分为4个处理，每个处理5个重复，每个重复6头猪。其中C0组为对照组，饲喂玉米-豆粕型基础日粮；T1组饲喂在基础日粮基础上添加100g/T 本发明制剂日粮；T2组饲喂在基础日粮基础上添加300g/T 本发明制剂日粮；T3组饲喂在基础日粮基础上添加500g/T 本发明制剂日粮。

试验期间，试验动物自由采食与饮水，按照猪场常规管理程序进行免疫、驱虫。预饲期5天，试验期21天。试验结束的前一天晚上20:00停止喂料，正常饮水，于次日早上对猪只空腹逐个称重，以重复为单位记录剩料量、耗料量，计算试验期的平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比。猪只屠宰后，迅速打开腹腔，快速结扎盲肠的两端，于无菌操作取部分盲肠内容物，4℃进行保存，进行肠道微生物检测。

表1 试验设计

注：实测凝结芽孢杆菌生物制剂中凝结芽孢杆菌活菌数为1.03×10¹⁰CFU/g。

表2 凝结芽孢杆菌生物制剂对断奶仔猪生长性能的影响

同列数据肩标不同小写字母，表示差异显著。

由表2数据可以看出，添加本发明凝结芽孢杆菌生物菌剂可以显著增加断奶仔猪的体重、平均日增重，显著降低断奶仔猪的料重比，提高断奶仔猪的生产性能，说明本发明菌株可以改善动物的生长性能，提高饲料利用率。

表3 凝结芽孢杆菌生物制剂对断奶仔猪肠道微生物的影响

同列数据肩标不同小写字母，表示差异显著。

从表3可以看出，添加本发明菌株可以显著降低断奶仔猪肠道有害菌大肠杆菌数量，显著增加肠道有益菌双歧杆菌与乳酸杆菌的数量。说明本发明菌株可以调节动物肠道微生态平衡，维持机体健康。

综上所述，通过实验室实验与动物实验，充分说明本发明菌株可以调节动物肠道健康，同时高效降解黄曲霉毒素与玉米赤霉烯酮，在实际生产中具有较大的应用价值。

序列表

<110> 科润生科技发展有限公司

<120> 改善肠道降解黄曲霉毒素玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌

<141> 2021-05-19

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1459

<212> DNA

<213> 凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)

<400> 1

acatctgtca cttcggcggc tggctccgta aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa 60

actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc 120

tgatccgcga ttactagcga ttccggcttc atgcaggcgg gttgcagcct gcaatccgaa 180

ctgggaatgg ttttctggga ttggcttaac ctcgcggtct cgcagccctt tgtaccatcc 240

attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc 300

ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag 360

gtcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca 420

accatgcacc acctgtcact ctgtcccccg aaggggaagg ccctgtctcc agggaggtca 480

gaggatgtca agacctggta aggttcttcg cgttgcttcg aattaaacca catgctccac 540

cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg agtttcagcc ttgcggccgt actccccagg 600

cggagtgctt aatgcgttag ctgcagcact aaagggcgga aaccctctaa cacttagcac 660

tcatcgttta cggcgtggac taccagggta tctaatcctg tttgctcccc acgctttcgc 720

gcctcagcgt cagttacaga ccagagagcc gccttcgcca ctggtgttcc tccacatctc 780

tacgcatttc accgctacac gtggaattcc actctcctct tctgcactca agcctcccag 840

tttccaatga ccgcttgcgg ttgagccgca agatttcaca tcagacttaa gaagccgcct 900

gcgcgcgctt tacgcccaat aattccggac aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct 960

gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg ccgggtaccg tcaaggcgcc gccctgttcg 1020

aacggcactt gttcttcccc ggcaacagag ttttacgacc cgaaggcctt cttcactcac 1080

gcggcgttgc tccgtcagac tttcgtccat tgcggaagat tccctactgc tgcctcccgt 1140

aggagtttgg gccgtgtctc agtcccaatg tggccgatca ccctctcagg tcggctacgc 1200

atcgttgcct tggtgagccg ttaccccacc aactagctaa tgcgccgcgg gcccatctgt 1260

aagtgacagc agaagccgtc tttccttttt cctccatgcg gaggaaaaaa ctatccggta 1320

ttagccccgg tttcccggcg ttatcccgat cttacaggca ggttgcccac gtgttactca 1380

cccgtccgcc gctaaccttt taaaagcaag cttttaaaag gtccgcacga cttgcatgta 1440

ttaggcagcc ccatggcac 1459

Claims (6)

1.改善肠道降解黄曲霉毒素玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌，其特征在于：所述凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）的保藏编号为CGMCC NO.20893。

2.一种如权利要求1所述的改善肠道降解黄曲霉毒素玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌的制备方法为，其特征在于：

液体培养基配方重量分数为：10‰玉米面、10‰蛋白胨、10‰酵母粉，培养条件为：40℃，pH维持在5.8-6.5，通气发酵，得到凝结芽孢杆菌液体培养物；

固体培养基配方重量分数为：90%的细麸皮、5%蛋白胨、5%酵母浸粉，水分50%，培养条件为：40℃，微需氧发酵，得到凝结芽孢杆菌固体培养物。

3.一种生物制剂，其特征在于：所述制剂含有如权利要求1或2所述的凝结芽孢杆菌的培养物的提取物，所述提取物的制备方法为：将凝结芽孢杆菌接种于液体发酵罐中，40℃好氧发酵24hr，或者将其固体培养物在40℃培养3天，对发酵后发酵液进行离心喷雾干燥，得到固体发酵物料后进行快速干燥；最后与载体混合。

4.根据权利要求3所述的生物制剂，其特征在于：所述载体包括麦麸、玉米芯粉、玉米淀粉、米糠、葡萄糖、沸石粉、膨润土中的一种或几种。

5.根据权利要求3所述的生物制剂，其特征在于：所述生物制剂中提取物的含量为重量分数20-60%。

6.根据权利要求3所述的生物制剂，其特征在于：所述凝结芽孢杆菌发酵提取物与载体的质量比例为20：80或30：70或40：60或50：60或60：40。

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