CN102086462A - 手性单体扁桃酸的获得方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了制备S-扁桃酸或R-扁桃酸的方法以及将S-扁桃酸转化为R-扁桃酸的方法。本发明提供的方法，使用对羟基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶催化苯丙酮酸获得S-扁桃酸，使用对羟基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脱氢酶和D-扁桃酸脱氢酶或D-扁桃酸还原酶催化S-扁桃酸获得R-扁桃酸。本发明提供的方法可用于体外制备单一构型的S-扁桃酸或R-扁桃酸，同时将这些酶组合过表达可以发酵葡萄糖获得S-扁桃酸或R-扁桃酸，还可以用于手性拆分混旋扁桃酸生成R-扁桃酸或将S-扁桃酸转化为R-扁桃酸。用于发酵培养合成S-扁桃酸或R-扁桃酸时，可实现方法的可持续性并能降低成本，并且方法温和，对环境和人友好。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体的说，是关于手性单体扁桃酸的获得方法。
背景技术
扁桃酸(Mandelic acid，MA)，又名苦杏仁酸、苯羟乙酸、α-羟基苯乙酸。在有机合成和药物生产中有着广泛的用途，是尿路杀菌剂扁桃酸乌洛托品、末稍血管扩张剂环扁桃酯、滴眼药羟苄唑及乌托品类解痉剂的重要中间体。扁桃酸为手性分子，有R-扁桃酸和S-扁桃酸两种构型，其中结构式如下：
R-扁桃酸 S-扁桃酸
单一构型的扁桃酸是不对称合成反应中非常重要的手性中间体，被广泛应用于光学纯的氨基酸、血管紧张肽转化酶抑制剂、以及辅酶A的不对称合成。单一构型的扁桃酸(或扁桃酸衍生物)所合成的药物与外消旋的扁桃酸(或扁桃酸衍生物)相比，不仅药效提高一倍，更关键的是副作用下降，而且在许多生物技术方面的应用必须要求是单一性化合物。因此，目前市场上对R-型或S-型扁桃酸单体的需求远远大于对其外消旋体的需求。
目前生产扁桃酸采用的方法主要是化学法和酶法(或生物细胞转化法)，合成中需要使用有毒的化学试剂，如：HCN等，不仅价格高，而且对环境和人的伤害比较大，并且酶法合成所用前体基本都来源于化石基产品，因而不利于该方法的长期有效发展；有的酶法合成的是混旋的R/S扁桃酸，需要拆分，而光学拆分剂又非常的昂贵，或者是利用菌株特异降解混旋扁桃酸中的一种单体，从而可以获得另外一种单体，这种方法的缺点就是消耗掉了一半的扁桃酸，转化率不超过50％。
因此，有必要提供一种新的合成R-扁桃酸或S-扁桃酸的方法，以及一种新的手性拆分方法将混旋扁桃酸中的S-扁桃酸转化为R-扁桃酸的方法，从而以较低的成本生产R-扁桃酸或S-扁桃酸。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种制备S-扁桃酸的方法，以克服现有扁桃酸生产方法所存在的上述缺点和不足。
本发明提供的制备S-扁桃酸的方法以苯丙酮酸为底物，并使用对羟基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶催化获得。
根据本发明的一个优选实施例，该方法可用于体内或体外制备S-扁桃酸。
根据本发明的一个优选实施例，在体内制备S-扁桃酸为向产生苯丙酮酸的菌株或重组菌株内导入表达对羟基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶的序列，产生苯丙酮酸的菌株或重组菌株体内具有L-苯丙氨酸代谢途径。
其中，所述对羟基扁桃酸合成酶来源于Amycolatopsis orientalis或Streptomyces coelicolor。
根据本发明的一个优选实施例，菌株体内的L-苯丙氨酸代谢途径经过人工改造，不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株存活的代谢支路被部分或全部切断，不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株存活的代谢支路包括L-色氨酸途径、L-酪氨酸途径和/或苯丙酮酸到L-苯丙氨酸的反应途径。
根据本发明的一个优选实施例，产生苯丙酮酸的菌株或重组菌株为tyrB aspC tyrA三突变体或tyrA，tyrB，aspC，trpE四突变体大肠杆菌菌株，该菌株中aroFfbr，pheAfbr过表达。
本发明还有一个目的在于，提供一种用于发酵生产S-扁桃酸的重组菌株。
本发明提供的用于发酵生产S-扁桃酸的重组菌株产生苯丙酮酸，且该重组菌株表达催化苯丙酮酸转变为S-扁桃酸的酶。且所述重组菌株表达对羟基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶。
其中，所述对羟基扁桃酸合成酶来源于Amycolatopsis orientalis或Streptomyces coelicolor。
根据本发明的一个优选实施例，苯丙酮酸通过重组菌株人工改造的L-苯丙氨酸途径代谢获得。
根据本发明的一个更优选的实施例，该人工改造的L-苯丙氨酸代谢途径是指不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株存活的代谢支路被部分或全部切断，其中的代谢支路包括L-色氨酸途径、L-酪氨酸途径和/或苯丙酮酸到L-苯丙氨酸的酶反应途径。
根据本发明的一个优选实施例，产生苯丙酮酸的菌株或重组菌株为tyrB aspC tyrA三突变体或tyrA，tyrB，aspC，trpE四突变体大肠杆菌菌株，该菌株中aroFfbr，pheAfbr过表达。
本发明还有一个目的在于，提供一种制备R-扁桃酸的方法。
本发明提供的制备R-扁桃酸的方法以苯丙酮酸为底物，并依次使用：A)对羟基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶催化苯丙酮酸生成S-扁桃酸；B)对羟基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脱氢酶催化S-扁桃酸生成苯乙酮酸；和C)D-扁桃酸脱氢酶或D-扁桃酸还原酶催化苯乙酮酸生成R-扁桃酸。
根据本发明的一个优选实施例，该方法可用于体内或体外制备R-扁桃酸。
根据本发明的一个优选实施例，体内制备R-扁桃酸为向产生苯丙酮酸的菌株或重组菌株内导入表达A)对羟基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶；B)对羟基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脱氢酶；和C)D-扁桃酸脱氢酶或D-扁桃酸还原酶的序列。
其中，所述对羟基扁桃酸合成酶来源于Amycolatopsis orientalis或Streptomyces coelicolor。
其中，其特征在于，所述对羟基扁桃酸氧化酶来源于Streptomyces coelicolor和Amycolatopsis orientalis。
其中，所述D-扁桃酸脱氢酶来源于Rhodotorula graminis。
根据本发明的一个优选实施例，菌株体内的L-苯丙氨酸代谢途径经过人工改造，不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株存活的代谢支路被部分或全部切断，不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株存活的代谢支路包括L-色氨酸途径、L-酪氨酸途径和/或苯丙酮酸到L-苯丙氨酸的反应途径。
根据本发明的一个优选实施例，产生苯丙酮酸的菌株或重组菌株为tyrB aspC tyrA三突变体或tyrA，tyrB，aspC，trpE四突变体大肠杆菌菌株，该菌株中aroFfbr，pheAfbr过表达。
本发明还有一个目的在于，提供一种用于发酵生产R-扁桃酸的重组菌株。
本发明提供的用于发酵生产R-扁桃酸的重组菌株产生苯丙酮酸，且所述重组菌株包含表达：A)催化苯丙酮酸转变为S-扁桃酸的酶；B)催化扁桃酸转变为苯乙酮酸的酶；和C)催化苯乙酮酸转变为R-扁桃酸的酶。
根据本发明的一个优选实施例，苯丙酮酸通过重组菌株人工改造的L-苯丙氨酸途径代谢获得。
根据本发明的一个更优选的实施例，该人工改造的L-苯丙氨酸代谢途径是指不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株存活的代谢支路被部分或全部切断，其中的代谢支路包括L-色氨酸途径、L-酪氨酸途径和/或苯丙酮酸到L-苯丙氨酸的酶反应途径。
根据本发明的一个优选实施例，产生苯丙酮酸的菌株或重组菌株为tyrB aspC tyrA三突变体或tyrA，tyrB，aspC，trpE四突变体大肠杆菌菌株，该菌株中aroFfbr，pheAfbr过表达。
本发明还有一个目的在于，提供一种将S-扁桃酸转化为R-扁桃酸的方法。
本发明提供的将S-扁桃酸转化为R-扁桃酸的方法为向S-扁桃酸中依次加入：A)对羟基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脱氢酶催化S-扁桃酸生成苯乙酮酸；和B)D-扁桃酸脱氢酶或D-扁桃酸还原酶催化苯乙酮酸生成R-扁桃酸。
其中，所述对羟基扁桃酸氧化酶来源于Streptomyces coelicolor和Amycolatopsis orientalis。
其中，所述D-扁桃酸脱氢酶来源于Rhodotorula graminis。
本发明还有一个目的在于，提供一种手性拆分对映消旋体扁桃酸的方法。
本发明提供的手性拆分对映消旋体扁桃酸的方法，为向对映消旋体扁桃酸中依次加入：A)对羟基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脱氢酶催化S-扁桃酸生成苯乙酮酸；和B)D-扁桃酸脱氢酶或D-扁桃酸还原酶催化苯乙酮酸生成R-扁桃酸。
其中，所述对羟基扁桃酸氧化酶来源于Streptomyces coelicolor和Amycolatopsis orientalis。
其中，所述D-扁桃酸脱氢酶来源于Rhodotorula graminis。
本发明提供的方法可用于体外和体内制备单一构型的S-扁桃酸或R-扁桃酸，还可以用于手性拆分混旋扁桃酸生成R-扁桃酸或将S-扁桃酸转化为R-扁桃酸。同时，与现有的制备单一构型的扁桃酸的方法相比，本发明提供的重组基因工程菌株用于发酵培养合成S-扁桃酸或R-扁桃酸时，可以利用可再生的原料如葡萄糖，实现方法的可持续性并能降低成本，为将来开发利用生物秸杆发酵生产扁桃酸奠定了基础，并且发酵法比较温和，对环境和人更加友好，属于绿色方法，符合未来生物技术的发展方向。
附图说明
图1是本发明提供的重组菌株发酵生产S-扁桃酸的代谢途径。
图2是本发明提供的重组菌株发酵生产R-扁桃酸的代谢途径。
图3是手性催化S-MA为R-MA用于手性拆分示意图。
图4是本发明构建的4种用于合成S-扁桃酸的重组质粒的结构示意图。
图5是本发明构建的用于手性拆分合成R-扁桃酸的重组质粒图5A和发酵法合成R-扁桃酸的重组质粒图5B的结构示意图。
图6是多突变体SUN32 PCR鉴定结果，其中，N为阴性对照，P为阳性对照，2为采用P1转导获得的一株四抗筛选出来的四突变阳性菌株。
图7是体外酶反应手性鉴定结果，其中(a)是扁桃酸混旋标准品；(b)是HmaS体外催化苯丙酮酸生成S-扁桃酸结果；(c)是组合使用Hmo和DMD体外催化S-扁桃酸生成R-扁桃酸结果。
图8是组合使用Hmo和DMD体外催化S-扁桃酸生成R-扁桃酸的反应过程。
图9是重组基因工程菌株SUN32/pSUFAAQ发酵合成S-扁桃酸的发酵曲线及发酵液HPLC检测结果。
图10是发酵法合成S-扁桃酸的手性鉴定结果。
图11是重组基因工程菌株SUN32/pSUFAAQSD发酵合成R-扁桃酸的发酵曲线及发酵液HPLC检测结果。
图12是发酵法合成R-扁桃酸的手性鉴定结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件或厂商提供的条件进行。
在本发明中，发明人在体外试验中发现，使用对羟基扁桃酸合成酶(Hmas)或扁桃酸合成酶催化苯丙酮酸，能获得S-扁桃酸，然后以获得的S-扁桃酸为底物，以对羟基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脱氢酶和D-扁桃酸脱氢酶或D-扁桃酸还原酶进行催化，可获得R-扁桃酸；并且经体内试验验证，利用大肠杆菌中已有的L-苯丙氨酸代谢途径中的苯丙酮酸，并引入外源性的前述酶或酶组合后，在体内也能实现上述反应，具体过程如实施例所示，其中，
在进行体内试验验证时，发明人利用大肠杆菌中已有的L-苯丙氨酸代谢途径，通过在E.coli中引入异源的扁桃酸合成酶，构建人工操纵子，人为的对其进行改造，切断该代谢途径中不需要的支路，如L-色氨酸途径和L-酪氨酸途径，以及不需要的下游途径，如苯丙酮酸(PP)到L-苯丙氨酸的酶反应步骤，同时引入异源酶S-扁桃酸合成酶，以将代谢流从PP引向S-扁桃酸，从而实现了在大肠杆菌中合成扁桃酸的目的，并获得了在E.coli中表达扁桃酸的重组质粒和重组菌株，然后，还在S-扁桃酸合成途径的基础上再引入异源酶S-扁桃酸氧化酶和D-扁桃酸脱氢酶，成功实现了在重组大肠杆菌中发酵葡萄糖合成手性单体R-扁桃酸。同时组合使用Hmo和DMD可以实现手性拆分混旋扁桃酸获得R-扁桃酸。其中，S-扁桃酸的合成途径如图1所示，R-扁桃酸的合成途径如图2所示，手性拆分获得R-扁桃酸如图3所示。
本发明大致可以概括如下：首先将基因aroFfbr和pheAfbr的片段克隆到质粒pSU2718中，获得重组质粒pSUFA，再将AohmaS和SchmaS基因分别克隆到重组质粒pSUFA中，获得重组质粒pSUFAAohmaS和pSUFASchmaS，然后将基因lacIq的片段分别克隆到质粒pSUFAAohmaS和pSUFASchmaS中，获得重组质粒pSUFAAQ和pSUFASQ；并将上述4种重组质粒pSUFAAohmaS、pSUFASchmaS、pSUFAAQ和pSUFASQ分别转化到tyrA，tyrB，aspC，trpE基因均缺失的突变体菌株W3110(ΔABCE)中，获得发酵生产S-扁桃酸的工程菌SUN.32/pSUFAAohmaS，SUN32/pSUFASchmaS，SUN32/pSUFAAQ和SUN32/pSUFASQ，然后在重组质粒pSUFAAQ的基础上再将异源基因hmo和dmd顺序克隆入pSUFAAQ，使其在启动子Ptrc启动下获得转录表达，获得重组质粒pSUFAAQSD，并将其转入W3110(ΔABCE)中，获得重组基因工程菌SUN32/pSUFAAQSD，同时将hmo和dmd组合克隆入pTrc99a中获得的pTrcSD可以拆分混旋扁桃酸获得R-扁桃酸。
在本发明的下述实施例中，使用的hmaS基因分别来源于Amycolatopsis orientalis和Streptomyces coelicolor的对羟基扁桃酸合成酶基因；使用的hmo基因来源于Streptomyces coelicolor和Amycolatopsis orientalis的对羟基扁桃酸氧化酶基因；dmd基因来源于Rhodotorula graminis的D-扁桃酸脱氢酶基因。
在本发明的下述实施例中，使用的E.coli W3110，DH5a菌购自CGSC，BL21(DE3)购自Novagen。
在本发明的下述实施例中，使用的含有邻氨基苯甲酸合成酶基因(trpE)的突变体JW1256-1(ΔtrpE772::Kan)和含有分支酸变位酶预苯酸脱氢酶基因(tyrA)的突变体N3087(tyrA16::Tn10)购自CGSC。
在本发明的下述实施例中，使用的胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。
在本发明的下述实施例中，使用的酶分别购自TaKaRa或MBI。
在本发明的下述实施例中，扁桃酸的手性鉴定采用HPLC进行，其鉴定条件如下：
HPLC CHIRALCEL OD-H column(250mm×0.46mm，5μm；Daicel Co.，Japan)，流动相：正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸＝94∶6∶0.2(v/v/v)，流速：1ml/min，检测波长：228nm，S-mandelic acid出峰时间为：16～17，R-mandelic acid出峰时间为：19～20，出峰时间会随着柱温的变化而发生迁移。
实施例1、重组质粒构建
在本实施例中，先将aroFfbr和pheAfbr基因克隆到质粒pSU2718(Martinez，E.，B.Bartolome，and F.de la Cruz，1988.pACYC 184-deribed cloning vectors containing the multiple cloning site and lacZa reporter gene of pUC8/9and pUC18/19plasmids.Gene68：159-162)中，获得重组质粒pSUFA，再将AohmaS和SchmaS基因分别克隆到重组质粒pSUFA中，获得pSUFAAohmaS和pSUFASchmaS中，再将lacIq基因分别克隆到pSUFAAohmaS和pSUFASchmaS中，获得pSUFAAQ和pSUFASQ，具体过程如下：
1.1、构建重组质粒pSUaroF
参考分子克隆III中提供的方法，抽提获得E.coli DH5α(购自Amersham公司)的基因组。
以E.coli DH5α的基因组为模板，利用引物P148L(+)、P148L(-)、aroFSacI(+)和aroFSac I(-)进行重叠PCR，以扩增E.coli DH5α的aroF基因，其中，引物P148L(+)、P148L(-)、aroFSac I(+)和aroFSac I(-)的序列如下所示：
P148L(+)：5′-ttagatctgaatagcccgcaatacctgggc-3′；
P148L(-)：5′-gctattcagatctaacgcttccgtcgccagtgg-3′；
aroFSac I(+)：5′-aacgagctcaccggaaagtcctcgggcataag-3′；
aroFSac I(-)：5′-aacgagctccgacttcatcaatttgatcgcgtaa-3′。
扩增过程具体如下所示：
首先，用引物对aroFSac I(+)和P148L(+)以E.coli DH5α的基因组为模板进行PCR扩增，其中，扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，1min，30循环。
再以E.coli DH5α的基因组为模板，用引物对aroFSac I(-)和P148L(-)为引物对，进行PCR扩增，其中，扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，56℃，1min，72℃，1min，30循环。
胶回收上述两个PCR片段作为模板，再用引物对aroFSac I(+)和aroFSacI(-)扩增出aroF全长基因，其中，扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，56℃，1.5min，72℃，1min，30循环。
通过上述PCR步骤，E.coli DH5a中的aroF基因表达产物酶蛋白aroF 148位脯氨酸已突变成亮氨酸，得到突变的aroF基因，然后按照Martinez，E.，B.Bartolome，and F.de la Cruz.1988.pACYC184-derived cloning vectors containing the multiple cloning site and lacZα reporter gene of pUC8/9and pUC18/19plasmids.Gene68：159-162中的方法，将PCR片断突变的aroF基因，经测序验证后，用Sac I酶切后克隆至pSU2718质粒，得到重组质粒pSUaroF，重组质粒pSUaroF可用于表达反馈抑制脱敏的DAHP合成酶(DS)。
1.2、构建重组质粒pSUFA
在本实施例中，首先构建了重组质粒pKKpheA，然后将带有Ptac启动子的pheAfbrPCR片段经克隆入pSUaroF，获得重组质粒pSUFA，具体过程如下：
1.2.1、构建重组质粒pKKpheA
以E.coli DH5α(Amersham公司)的基因组为模板，利用引物pheA-M-F、pheA-M-R、pheA-MN-FM和pheA-M-RM进行重叠PCR，以扩增E.coli DH5α的pheA基因，引物pheA-M-F、pheA-M-R、pheA-MN-FM和pheA-M-RM的序列如下：
pheA-M-F：5′-GGGAATTCTATGACATCGGAAAACCCGTTAC-3′；
pheA-M-R：5′-ATCCGGAAGCTTTTCATCAGG-3′；
pheA-MN-FM：5′-AACAAGCCTGTGCGCTGG-3′；
pheA-M-RM：5′-TCAACCAGCGCACAGGCTTGTTGC-3′。
具体过程如下所示：
首先以引物pheA-M-F和pheA-M-RM作为引物对，进行PCR扩增，扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，1min，30循环。
再以引物pheA-MN-FM和pheA-M-R作为引物对，进行PCR扩增，扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，56℃，1min，72℃，1min，30循环。
参考厂商提供的方法，使用胶回收试剂盒回收上述两个PCR片段作为模板，再用引物pheA-M-F和pheA-M-R作为引物对，通过PCR扩增pheA全长基因，扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，56℃，1.5min，72℃，1min，30循环。
经测序验证，PCR结果中E.coli DH5α中的pheA基因表达产物酶蛋白pheA 309位的Gly已突变为Cys，得到突变的pheA基因，然后将PCR片断用EcoR I/Hind III双酶切后克隆至pKK223-3质粒(来自Pharmacia)上，获得重组质粒pKKpheA，重组质粒pKKpheA可用于表达反馈抑制脱敏的分支酸变位酶预苯酸脱水酶(CM-PD)。
1.2.2、构建重组质粒pSUFA
以重组质粒pKKpheA为模板，利用PCR引物PTacpheA*-F和PTacpheA*-R扩增带有Ptac启动子的pheAfbr基因，引物PTacpheA*-F和PTacpheA*-R的序列如下：
PTacpheA*-F：5′-GATCCGAAGCTTATCGACTGCACG-3′；
PTacpheA*-R：5′-AGTCGACGCTTTTCATCAGGTTGG-3′。
扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，56℃，1.5min，72℃，1min，30循环。
将带有Ptac启动子的pheAfbrPCR片段经HindIII/SalI双酶切，克隆入pSUaroF，获得重组质粒pSUFA，重组质粒pSUFA可用于表达DS和CM-PD。
1.3、构建重组质粒pSUFAAohmaS和pSUFASchmaS
1.3.1、构建重组质粒pSUFAAohmaS
抽提Amycolatopsis orientalis HCCB10007的基因组DNA(对羟基扁桃酸合成酶基因序列参考专利：CN101063140A中基因vcm17)，作为模板，以引物Ao-hmaS-F(N)和Ao-hmaS-R(N)为引物对，进行PCR扩增，从而获得AohmaS基因，引物Ao-hmaS-F(N)和Ao-hmaS-R(N)的序列如下所示：
Ao-hmaS-F(N)：5′-CGCATATGCAGAATTTCGAGATCGACTAC-3′；
Ao-hmaS-R(N)：5′-ACATCCCAAGCTTCACGTTCGAGGTC-3′；
扩增程序为：94℃，2min，94℃，45sec，56℃，1.5min，72℃，1min，30循环。
参考厂商提供的方法，使用胶回收试剂盒回收上述PCR片段，然后使用Nde I/Hind III双酶切回收获得的PCR片段，并将其克隆到经Nde I/Hind III双酶切的质粒pET24a(Novagen)中，Nde I/Hind III酶切验证获得重组质粒pETAohmaS，重组质粒pETAohmaS可用于表达HmaS。
以质粒pETAohmaS为模板，以引物pETrbs-U-F和pET-U-D为引物对，进行PCR扩增，获得带有核糖体结合位点(rbs)的AohmaS片段，其中，引物pETrbs-U-F和pET-U-D的序列如下：
pETrbs-U-F：5′-CCGTCGACAAATAATTTTGTTTAACTTTAAG-3′；
pET-U-D：5′-CGGATCCTTTCGGGCTTTGTTAG-3′。
扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，56℃，1.5min，72℃，1min，30循环。
参考产商提供的方法，使用胶回收试剂盒回收PCR片段，然后通过SalI/BamHI双酶切，将回收获得的上述PCR片段克隆到经SalI/BamHI双酶切的质粒pSUFA中，SalI/BamHI酶切验证获得重组质粒pSUFAAohmaS，pSUFAAohmaS的结构如图4A所示，重组质粒pSUFAAohmaS，可用于表达DS，CM-PD和HmaS。
1.3.2、构建重组质粒pSUFASchmaS
抽提Streptomyces coelicolor A3(2)M145的基因组DNA(GenBank No：AL939115中的对羟基扁桃酸合成酶基因SCO3229)，作为模板，以引物hmaSSc-F1和hmaSSc-R2为引物对，进行PCR扩增，从而获得SchmaS基因片段，其中，引物hmaSSc-F1和hmaSSc-R2的序列如下所示：
hmaSSc-F1：5′-CCCATATGCCGCCCAGTGACATCGC-3′；
hmaSSc-R2：5′-GCAAGCTTCATCGGCCGGCCACTTC-3′。
扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，56℃，1.5min，72℃，1min，30循环。
参考产商提供的方法，使用胶回收试剂盒回收PCR片段，然后通过Nde I/HindIII双酶切，将上述回收获得的PCR片段克隆到经Nde I/Hind III双酶切的质粒pET24a中，Nde I/Hind III酶切验证获得重组质粒pETSchmaS，重组质粒pETSchmaS可用于表达HmaS。
以质粒pETSchmaS为模板，以引物pETrbs+ScHmaS-F和pETrbs+ScHmaS-R为引物对，进行PCR扩增，从而获得带有rbs片段的SchmaS，引物pETrbs+ScHmaS-F和pETrbs+ScHmaS-R的序列如下所示：
pETrbs+ScHmaS-F：5′-CCCTCGAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAG-3′；
pETrbs+ScHmaS-R：5′-CGGATCCTTCATCGGCCGGCCACTTC-3′。
扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，56℃，1.5min，72℃，1min，30循环。
参考产商提供的方法，使用胶回收试剂盒回收PCR片段，然后通过Xho I/BamHI双酶切，将上述回收获得的PCR片段克隆到经Xho I/BamH I双酶切的质粒pSUFA中，Xho I/BamH I酶切验证获得重组质粒pSUFASchmaS，结构如图4B所示，重组质粒pSUFASchmaS可用于表达DS，CM-PD和HmaS。
1.4、构建重组质粒pSUFAAQ和pSUFASQ
以质粒pTrc99a(Pharmacia)为模板，以引物lacIq-F和lacIq-R为引物对，进行PCR扩增，从而获得lacIq基因片段，其中引物lacIq-F和lacIq-R的序列如下所示：
lacIq-F：5′-CGCTAGCCCTGACGGGCTTGTCTG-3′；
lacIq-R：5′-CGCTAGCTTCCGATGGCTGCCTG-3′。
扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，56℃，1.5min，72℃，1min，30循环。
参考产商提供的方法，使用胶回收试剂盒回收PCR片段，然后通过Nhe I单酶切，将上述回收获得的PCR片段分别克隆到经Nhe I酶切的质粒pSUFAAohmaS和pSUFASchmaS中，Nhe I酶切验证获得pSUFAAQ和pSUFASQ，pSUFAAQ结构如图4C所示，pSUFASQ结构如图4D所示，其中，重组质粒pSUFAAQ和pSUFASQ都能用于表达DS，CM-PD，HmaS和LcaIq。
1.5、构建重组质粒pSUFAAQSD
1.5.1、构建重组质粒pTrchmo
以Streptomyces coelicolorA3(2)M145的基因组DNA(GenBank No：AL939115中的对羟基扁桃酸氧化酶基因SCO3228)，作为模板，以引物hmo-F和hmo-R为引物对，进行PCR扩增，从而获得hmo基因片段，其中，引物hmo-F和hmo-R的序列如下所示：
hmo-F：5′-GATATACCATGGGCAGCAGCCATC-3′；
hmo-R：5′-CGGTACCTGGTCATCCGTGGCTCCTG-3′。
扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，1.5min，30循环。
参考产商提供的方法，使用胶回收试剂盒回收PCR片段，然后通过Nco I/Kpn I双酶切，将上述回收获得的PCR片段克隆到经Nco I/Kpn I双酶切的质粒pTrc99a中，Nco I/Kpn I酶切验证获得重组质粒pTrchmo，重组质粒pTrchmo可用于表达Hmo。
1.5.2、构建重组质粒pET24admd
以Rhodotorula graminis ATCC20804的总cDNA为模板(D-扁桃酸脱氢酶基因GenBank No：AJ001428)，以引物dmd-F和dmd-R为引物对，进行PCR扩增，从而获得dmd基因片段，其中，引物dmd-F和dmd-R的序列如下所示：
dmd-F：5′-CCATATGCCTCGCCCTCGCGTC-3′；
dmd-R：5′-GGAATTCAGTAGGCGCGAAAAGCG-3′。
扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，1.5min，30循环。
参考产商提供的方法，使用胶回收试剂盒回收PCR片段，然后通过Nde I/EcoRI双酶切，将上述回收获得的PCR片段克隆到经Nde I/EcoR I双酶切的质粒pET24a中，Nde I/EcoR I酶切验证获得重组质粒pET24admd，重组质粒pET24admd可用于表达DMD。
1.5.3、构建重组质粒pTrcSD
以pET24admd为模板，以引物pET24a-F和pET24a-R为引物对，进行PCR扩增，从而获得dmd基因片段同时获得了表达必须原件RBS(核糖体结合位点)，其中，引物pET24a-F和pET24a-R的序列如下所示：
pET24a-F：5′-CGGTACCTTTGTTTAACTTTAAGAAGG-3′；
pET24a-R：5′-ACTGCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCT-3′。
扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，1.5min，30循环。
参考产商提供的方法，使用胶回收试剂盒回收PCR片段，然后通过Kpn I/Pst I双酶切，将上述回收获得的PCR片段克隆到经Kpn I/Pst I双酶切的质粒pTrchmo中，Kpn I/Pst I酶切验证获得重组质粒pTrcSD，如图5A所示，重组质粒pTrcSD可用于表达对羟基扁桃酸氧化酶(Hmo)和D-型扁桃酸还原酶(DMD)。
1.5.4、构建重组质粒pSUFAAQSD
以pTrcSD为模板，以引物pTrcSD-F和pTrcSD-R为引物对，进行PCR扩增，从而获得包括Ptrc启动子以及必要表达原件在内的hmo和dmd基因片段，其中引物pTrcSD-F和pTrcSD-R序列如下：
pTrcSD-F：5′-AGGATCCAAATCACTGCATAATTCG-3′；
pTrcSD-R：5′-TGGATCCGTTATTGTCTCATGAGCG-3′。
扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，2.5min，30循环。
参考产商提供的方法，使用胶回收试剂盒回收PCR片段，然后通过BamH I单酶切，将上述回收获得的PCR片段克隆到经BamH I酶切的质粒pSUFAAQ中，BamH I酶切验证获得pSUFAAQSD结构如图5B所示，重组质粒pSUFAAQSD可用于表达DS，CM-PD，HmaS，LacIq，Hmo和DMD。
1.6、构建重组质粒pSUFAAQAD
1.6.1、构建重组质粒pTrcAD
以Amycolatopsis orientalis HCCB10007的基因组DNA(对羟基扁桃酸氧化酶基因序列参考专利：CN101063140A中基因vcm18)，作为模板，以引物Aohmo-F和Aohmo-R为引物对，进行PCR扩增，从而获得Aohmo基因片段，其中，引物Aohmo-F和Aohmo-R的序列如下所示：
Aohmo-F：5′-GGTCTCCCATGACCCACGTCTGTCTCGAC-3′；
Aohmo-R：5′-CGGTACCAAGCTTCAGCCGCGGCG-3′。
扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，1.5min，30循环。
参考产商提供的方法，使用胶回收试剂盒回收PCR片段，然后通过Bsa I/Kpn I双酶切，将上述回收获得的PCR片段克隆到经Nco I/Kpn I双酶切的质粒pTrcSD中，置换掉原有的Streptomyces coelicolorA3(2)来源的hmo基因，酶切验证获得重组质粒pTrcAD，重组质粒pTrcAD可用于表达对羟基扁桃酸氧化酶(Hmo)和D-型扁桃酸还原酶(DMD)。
1.6.2、构建重组质粒pSUFAAQAD
以pTrcAD为模板，以引物pTrcAD-F和pTrcAD-R为引物对，进行PCR扩增，从而获得包括Ptrc启动子以及必要表达原件在内的Aohmo和dmd基因片段，其中引物pTrcAD-F和pTrcAD-R序列如下：
pTrcAD-F：5′-AAGATCTAAATCACTGCATAATTCG-3′；
pTrcAD-R：5′-TAGATCTGTTATTGTCTCATGAGCG-3′。
扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，2.5min，30循环。
参考产商提供的方法，使用胶回收试剂盒回收PCR片段，然后通过Bgl II单酶切，将上述回收获得的PCR片段克隆到经Bgl II酶切的质粒pSUFAAQ中，Bgl II酶切验证获得pSUFAAQAD，重组质粒pSUFAAQAD可用于表达DS，CM-PD，HmaS，LacIq，Hmo和DMD。
实施例2、缺失突变体的构建
在本实施例中，首先构建了2种单突变体，然后利用所构建和购买的4种单突变体为出发菌株，利用P1噬菌体转导，获得多突变体，以用于扁桃酸基因工程菌构建的宿主菌，具体过程如下：
2.1、W3110中tyrB和aspC基因的敲除
在本实施例中，参考Gust.B.等的文献(PCR-targeting system in Streptomyces coelicolor，Gust.B.，Kieser T.et al，2002)，应用PCR-targeting技术对分别敲除原始菌株E.coli W3110的芳香族氨基酸转氨酶基因(tyrB)和天冬氨酸转氨酶基因(aspC)，获得了单缺失突变体W3110(ΔtyrB)和W3110(ΔaspC)，具体过程如下：
2.1.1、制备单敲除菌株W3110(ΔtyrB)
以质粒pIJ778(购自E.coli Genetic Stock Center)为模板，以引物tyrB-U和tyrB-D为引物对，进行PCR扩增，以获得壮观霉素aadA(Spec)基因，其中引物tyrB-U和tyrB-D的序列如下所示：
tyrB-U：5′-TTTAACCACCTGCCCGTAAACCTGGAGAACCATCGCGTGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3′；
tyrB-D：5′-ACTGCAGGCTGGGTAGCTCCAGCCTGCTTTCCTGCATTATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′。
扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，50℃，45sec，72℃，90sec，10循环；94℃，2min；94℃，45sec，55℃，45sec，72℃，90sec，24循环。
胶回收PCR产物，借助电击转化(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)将PCR产物转入大肠杆菌W3110感受态细胞中，于37℃培养2～3小时，将菌液涂布在含有壮观霉素(50μg/ml)的抗性平板上，能够长出的转化子就是敲除了tyrB基因的菌株。
将获得的阳性转化子以引物tyrB_F_V和tyrB_R_V进行PCR鉴定，引物序列如下：
tyrB_F_V：5′-CTGTTGCTAATTGCCGTTCG-3′；
tyrB_R_V：5′-CACGTAGAACGATGGCATCA-3′。
扩增程序为：94℃，2min，94℃，45sec，55℃，45sec，72℃，90sec，30循环。
根据上述结果，获得的阳性转化子中tyrB基因已敲除，可用于进一步敲除使用。
2.1.2、制备单敲除菌株W3110(ΔaspC)
以质粒pIJ773(E.coli Genetic Stock Center)为模板，利用引物aspC-U和aspC-D，PCR扩增质粒pIJ773中的安普霉素aac(Apra)基因，引物序列如下：
aspC-U：
5′-CGGACTTCCCTTCTGTAACCATAATGGAACCTCGTCATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3′；
aspC-D：
5′-AGCCCGCTTTTCAGCGGGCTTCATTGTTTTTAATGCTTATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’。
扩增程序为：94℃，2min；94℃，45sec，50℃，45sec，72℃，90sec，10循环；94℃，2min；94℃，45sec，55℃，45sec，72℃，90sec，24循环。
胶回收PCR产物，借助电击转化(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)将PCR产物转入大肠杆菌BW25113感受态细胞中，于37℃培养2～3小时，将菌液涂布在含有安普霉素(50μg/ml)的抗性平板上，能够长出的转化子就是敲除aspC基因的菌株。
获得的阳性转化子以引物aspC_V_F和aspC_V_R进行PCR鉴定，引物序列如下：
aspC_V_F：5′-TCTCCCGTTACCCTGATAGCG-3′；
aspC_V_R：5′-CAAAATATTGCAGGGGACGC-3′。
扩增程序为：94℃，2min，94℃，45sec，55℃，45sec，72℃，90sec，30循环。
根据上述结果，获得的阳性转化子中aspC基因已敲除，可用于进一步敲除使用。
2.2、制备双敲除菌株W3110(ΔtyrB ΔaspC)
分别以步骤2.1.1和2.1.2获得的单敲除菌株W3110(ΔtyrB)和W3110(ΔaspC)作为供体和受体，利用P1噬菌体转导方法获得双敲除菌株W3110(ΔtyrB ΔaspC)，具体过程如下：
将过夜培养的W3110(ΔtyrB)菌液接种至LB液体培养基中，37℃培养至OD值约为0.4，作为供体菌液；
然后取20μl供体菌液，100μl P1噬菌体原液，30μl 0.5M的CaCl2加入到3ml半固体LB培养基(含0.7％琼脂糖)上，于37℃培养4～6小时。
待噬菌体充分增殖后，再加入4.5ml LB液体培养基，4℃过夜培养。
将液体移至5mlEP管中，并加入几滴氯仿，剧烈来回摇动数次；然后于10000rpm离心5min，将上清液移至另一试管中，并加入几滴氯仿，水相即为lysate。将lysate用生理盐水稀释一倍后，置于平皿中，于紫外条件下照射5min。
将过夜培养的W3110(ΔaspC)菌液，接种于LB液体培养基上，37℃培养2～3小时，作为受体菌株；
取100μl受体菌液，加入450μl 50mM的CaCl2和10μl lysate，放置37℃温育30min后，4000rpm离心5min，弃去上清，并向沉淀中加入100μl LB和100μl 1M的柠檬酸钠，然后将菌液涂布在含有阿普拉霉素(50μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的双抗平板上培养12-16h，因为敲除菌株获得了抗性基因，因此能够长出的转化子就是tyrB和aspC已经被双敲除的菌株。
将敲除tyrB和aspC双基因的大肠杆菌W3110(ΔtyrB ΔaspC)分别以引物tyrB_F_V和tyrB_R_V(PCR条件同2.1.1)以及aspC_V_F和aspC_V_R(PCR条件同2.1.2)进行PCR鉴定，结果显示W3110(ΔtyrB ΔaspC)构建成功。
2.3、制备多缺失突变体W3110(ΔABC)，W3110(ΔBCE)和W3110(ΔABCE)
参考实施例2.2的方法，以实施例2.2中制备的双缺失突变体W3110(ΔtyrBΔaspC)为受体菌，以JW1256-1(ΔtrpE772::Kan)为供体菌株，制备获得tyrB，aspC，trpE三突变体菌株W3110(ΔBCE)，其中，制备和检测所使用的引物均为trpE-Ko-V-F和trpE-Ko-V-R。同样以W3110(ΔtyrB ΔaspC)为受体菌，以N3087(tyrA16::Tn10)为供体菌制备获得tyrA，tyrB，aspC三突变体菌株W3110(ΔABC)，并将其命名为SUN21，检测所使用的引物均为tyrA_F_V和tyrA_R_V。
然后参考实施例2.2的方法，以三突变体菌株W3110(ΔBCE)为受体菌，以N3087(tyrA16::Tn10)为供体菌制备获得tyrA，tyrB，aspC，trpE四突变体菌株W3110(ΔABCE)，并将其命名为SUN32，其中，制备和检测所使用的引物均为tyrA_F_V和tyrA_R_V，PCR鉴定结果见图6，所用引物trpE-Ko-V-F，trpE-Ko-V-R，tyrA_F_V和tyrA_R_V的序列如下所示：
trpE-Ko-V-F：5′-CGTACTGAAAGGTTGGTGGCG-3′；
trpE-Ko-V-R：5′-AGGAGAAAGCATCAGCACCG-3′；
tyrA_F_V：5′-TATCCGTAACCGATGCCTGC-3′；
tyrA_R_V：5′-GGGAAATCACCCGTTCAATG-3′。
因为SUN32分别获得了来自W3110(ΔtyrB)，W3110(ΔaspC)，N3087和JW1256-1的一个单突变基因，其中，tyrB::Spc(spectinomycin)来源于W3110(ΔtyrB)；aspC::AM(apramycin)来源于W3110(ΔaspC)；tyrA::Tn10(tetracycline)来源于N3087；trpE::Kan(kanamycin)来源于JW1256-1，因此该菌获得了同时带有四个突变基因的突变菌株，该突变株的获得增强了L-苯丙氨酸代谢流，流向S-扁桃酸合成的前体PP，该突变菌株可以作为宿主菌用于发酵法合成扁桃酸的研究。
实施例3、体外酶活反应及手性鉴定
3.1、S-扁桃酸制备
将重组质粒pET24a、pETAohmaS和pETSchmaS转化入BL21(DE3)，分别获得BL21(DE3)/pET24a、BL21(DE3)/pETAohmaS和BL21(DE3)/pETSchmaS，其中BL21(DE3)/pET24a作为空白对照，将上述菌株分别加入LB培养基中，培养至OD为0.4-0.6后，用1mM IPTG诱导4h，于4℃，4000rpm离心10min，将收集获得的菌体重悬于pH＝7.5，200mM的磷酸钾缓冲液中，超声破碎，离心取上清，获得对羟基扁桃酸合成酶粗酶液。
然后，使用获得的上述对羟基扁桃酸合成酶粗酶液于28℃催化苯丙酮酸进行反应，其反应体系：3ml的测定混合物包含200mM pH7.5的磷酸钾缓冲液，5mM苯丙酮酸，44mM抗坏血酸和0.3mM FeSO4以及终浓度为0.6mg/ml的对羟基扁桃酸合成酶粗酶液。反应12h后，分别向反应液中加入1M HCl，以终止测定，并对反应液进行手性测定，以购自Sigma的扁桃酸混旋标准品为对照，标准品检测结果如图7(a)所示，反应液检测结果如图7(b)所示，根据该结果，反应液中存在S-扁桃酸。
实验证明Amycolatopsis orientalis和Streptomyces coelicolor来源的对羟基扁桃酸合成酶都可以催化底物苯丙酮酸合成S-扁桃酸。
根据上述结果，对羟基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶能用于催化苯丙酮酸制备S-扁桃酸。
3.2、R-扁桃酸制备
参考实施例3.1.1的方法，将重组质粒pTrc99a、pTrcSD和pTrcAD转化入BL21(DE)获得的重组菌株BL21(DE)/pTrc99a、BL21(DE)/pTrcSD和BL21(DE)/pTrcAD转入LB培养基中培养，以获得对羟基扁桃酸氧化酶和D-扁桃酸脱氢酶的粗酶液，其中BL21(DE)/pTrc99a作为空白对照。
以S-扁桃酸为底物，使用对羟基扁桃酸氧化酶和D-扁桃酸脱氢酶的粗酶液作为催化剂进行反应，其中，
反应体系(5ml测定混合物)包含：200mM磷酸钾缓冲液pH 7.5，5mM S-扁桃酸，200uM NADH，40mM NAD+，终浓度为0.6mg/ml粗酶液。
将上述反应体系于30℃水浴反应，在反应过程中，每隔12h取一次样，向样品中加入1M HCl溶液，以终止反应，进行HPLC检测，获得体外转化曲线，结果如图8所示，并对反应液进行手性鉴定，其中，以购自Sigma的扁桃酸混旋标准品为对照，标准品检测结果如图7(a)所示，反应液检测的鉴定结果如图7(c)所示。
上述手性鉴定结果显示，采用上述酶的组合可将S-扁桃酸转化为R-扁桃酸。
实验证明Streptomyces coelicolor和Amycolatopsis orientalis来源的对羟基扁桃酸氧化酶与Rhodotorula graminis来源的D-扁桃酸脱氢酶组合都可以将S-扁桃酸转化为R-扁桃酸。
根据实施例3.2的结果，联合使用对羟基扁桃酸氧化酶和D-扁桃酸脱氢酶，可以将S-扁桃酸转化为R-扁桃酸，因此，也可以用于手性拆分混旋扁桃酸生成R-扁桃酸。
结合实施例3.1和3.2，联合使用对羟基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶；对羟基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脱氢酶；和D-扁桃酸脱氢酶或D-扁桃酸还原酶，还可以催化苯丙酮酸制备R-扁桃酸。
鉴于大肠杆菌中已有的L-苯丙氨酸代谢途径中具有苯丙酮酸，因此，为检测能否在体内实现上述R-扁桃酸/S-扁桃酸的制备方法，发明人将实施例1中制备的重组质粒pSUFAAohmaS，pSUFASchmaS，pSUFAAQ，pSUFASQ，pSUFAAQSD和pSUFAAQAD，分别转入实施例2中制备的tyrA，tyrB，aspC，trpE基因均缺失的突变体菌株SUN32中，从而利用大肠杆菌中已有的L-苯丙氨酸代谢途径(其中，将L-色氨酸途径和L-酪氨酸途径，以及苯丙酮酸(PP)到L-苯丙氨酸的酶反应途径切断，以控制代谢方向)进行发酵葡萄糖合成S-扁桃酸或R-扁桃酸尝试，结果显示，所构建的基因工程菌株能成功发酵葡萄糖制备S-扁桃酸或R-扁桃酸，具体过程如实施例4-5所示。
实施例4、重组基因工程菌构建
将实施例1中制备获得的重组质粒pSUFAAohmaS，pSUFASchmaS，pSUFAAQ，pSUFASQ，pSUFAAQSD和pSUFAAQAD分别电转入到实施例2获得的重组菌株SUN32中，并分别利用氯霉素抗性平板筛选获得阳性单克隆，同时，随机挑选阳性单克隆分别通过酶切验证(具体酶切用酶参考构建鉴定)，并将成功构建的上述5株重组基因工程菌分别命名为SUN32/pSUFAAohmaS，SUN32/pSUFASchmaS，SUN32/pSUFAAQ，SUN32/pSUFASQ，SUN32/pSUFAAQSD和SUN32/pSUFAAQAD。
实施例5、基因工程菌发酵
5.1、摇瓶发酵培养
取实施例4中制备获得的各重组基因工程菌株的种子液(分别挑单克隆至LB试管，于37℃，220rpm培养，获得种子液)，分别于37℃进行培养，其中，使用的培养基如下：
KH2PO4 1.0g/L，(NH4)2SO4 16.0g/L，Yeast extract 2g/L，L-phe 0.2g/L，L-tyr0.2g/L，L-asp 3.0g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，Glucose 20g/L，L-trp 0.1，MnSO4·5H2O0.008g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，CaCO3 20g/L。
培养到OD至0.6-0.8，开始用0.1mM/L IPTG诱导，同时转至33℃，200rpm接种量6-8％，每隔12小时取样，以用于检测。
5.2、发酵液中扁桃酸的检测与手性鉴定
检测实施例5.1中所取的各发酵液的OD600，并以HPLC测定实施例5.1中所取的各发酵液中的扁桃酸的含量并鉴定其手性，其中：
发酵液检测条件：HPLC(Agilent technologies，1100)，柱子：ZORBAX XDB-C8，流动相组成为水∶1.29％冰乙酸∶甲醇＝90∶5∶5，流速是1ml/min，检测波长215nm。
根据扁桃酸含量和OD值，对取样时间作图，获得重组菌株SUN32/pSUFAAQ的发酵曲线，结果如图9所示，发酵液的手性鉴定结果如图10所示。根据图9和图10的结果，发酵液中的扁桃酸为S-扁桃酸，因此本发明成功实现了利用重组基因工程菌发酵葡萄糖合成手性单体S-扁桃酸。
同时，重组菌株SUN32/pSUFAAohmaS，SUN32/pSUFASchmaS和SUN32/pSUFASQ的检测结果显示，使用这3株菌株进行发酵培养也能发酵制备S-扁桃酸。
另外，将实施例1中制备获得的重组质粒pSUFAAQ转入实施例2中所制备的突变体菌株SUN21中构建的重组基因工程菌SUN21/pSUFAAQ，通过摇瓶发酵HPLC检测S-MA和PP(SUN32/pSUFAAQ作为对照)结果见表1：
表1、SUN21/pSUFAAQ和SUN32/pSUFAAQ发酵液的HPLC检测结果
从表1数据得知，尽管重组菌株SUN21/pSUFAAQ代谢流优化的效果比重组菌株SUN32/pSUFAAQ差，但也可以生产S-MA。
重组菌株SUN32/pSUFAAQSD的发酵曲线如图11所示，发酵液的手性鉴定结果如图12所示。根据图11和图12的结果，本发明成功实现了利用重组基因工程菌发酵葡萄糖合成手性单体R-扁桃酸。
同时，重组菌株SUN32/pSUFAAQAD进行发酵培养也能发酵制备R-扁桃酸。
根据上述结果，利用本发明构建的重组菌株，能够发酵葡萄糖合成单一构型的S-扁桃酸或R-扁桃酸。
虽然在上述实施例中，仅提供了使用对羟基扁桃酸合成酶催化苯丙酮酸生成S-扁桃酸的例子，但本领域的技术人员能很容易的根据该催化反应明确其他一些酶，例如扁桃酸合成酶也具有相同的功能，即催化苯丙酮酸生成S-扁桃酸；同样的，本领域的技术人员，也能根据提供的上述实施例确定，在催化S-扁桃酸制备R-扁桃酸的过程中，对羟基扁桃酸氧化酶、扁桃酸氧化酶和扁桃酸脱氢酶能具有相同的功能；D-扁桃酸脱氢酶和D-扁桃酸还原酶能具有相同的功能，因此，使用其他几种酶进行催化反应，也是本发明所要求保护的。
综上所述，本发明提供的方法可用于体外和体内制备单一构型的S-扁桃酸或R-扁桃酸，还可以用于手性拆分混旋扁桃酸生成R-扁桃酸或将S-扁桃酸转化为R-扁桃酸。同时，与现有的制备单一构型的扁桃酸的方法相比，本发明提供的重组基因工程菌株用于发酵培养合成S-扁桃酸或R-扁桃酸时，可以利用可再生的原料如葡萄糖，实现方法的可持续性并能降低成本，为将来开发利用生物秸杆发酵生产扁桃酸奠定了基础，并且发酵法比较温和，对环境和人更加友好，属于绿色方法，符合未来生物技术的发展方向。
Claims (45)
1.一种S-扁桃酸的制备方法，其特征在于，所述方法以苯丙酮酸为底物，使用对羟基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶催化获得。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于体内或体外制备S-扁桃酸。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述体内制备S-扁桃酸为向产生苯丙酮酸的菌株或重组菌株内导入表达对羟基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶的序列。
4.如权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，所述对羟基扁桃酸合成酶来源于Amycolatopsis orientalis或Streptomyces coelicolor。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的产生苯丙酮酸的菌株或重组菌株体内具有L-苯丙氨酸代谢途径。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的L-苯丙氨酸代谢途径经过人工改造，不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株存活的代谢支路被部分或全部切断。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株存活的代谢支路包括L-色氨酸途径、L-酪氨酸途径和/或苯丙酮酸到L-苯丙氨酸的反应途径。
8.如权利要求3或5所述的方法，所述的产生苯丙酮酸的菌株或重组菌株为大肠杆菌。
9.如权利要求8所述的方法，所述的大肠杆菌为tyrB aspC tyrA三突变体菌株或tyrA，tyrB，aspC，trpE四突变体菌株。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的菌株中aroFfbr，pheAfbr过表达。
11.如权利要求3-1任一项所述的方法，其特征在于，所述菌株或重组菌株利用葡萄糖发酵。
12.一种用于发酵生产S-扁桃酸的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株产生苯丙酮酸，且所述重组菌株表达对羟基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶。
13.如权利要求12所述的重组菌株，其特征在于，所述对羟基扁桃酸合成酶来源于Amycolatopsis orientalis或Streptomyces coelicolor。
14.如权利要求12所述的重组菌株，其特征在于，所述苯丙酮酸通过重组菌株人工改造的L-苯丙氨酸途径代谢获得。
15.如权利要求14所述的重组菌株，其特征在于，所述人工改造的L-苯丙氨酸代谢途径是指不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株存活的代谢支路被部分或全部切断。
16.如权利要求15所述的重组菌株，其特征在于，所述的不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株存活的代谢支路包括L-色氨酸途径、L-酪氨酸途径和/或苯丙酮酸到L-苯丙氨酸的酶反应途径。
17.如权利要求12-16所述的重组菌株，其特征在于，所述的重组菌株为大肠杆菌重组菌株。
18.如权利要求17所述的重组菌株，其特征在于，所述的大肠杆菌重组菌株为tyrB aspC tyrA三突变体菌株或tyrA，tyrB，aspC，trpE四突变体菌株。
19.如权利要求18所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株中aroFfbr，pheAfbr过表达。
20.一种R-扁桃酸的制备方法，其特征在于，所述方法以苯丙酮酸为底物，依次使用：
A)对羟基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶催化苯丙酮酸生成S-扁桃酸；
B)对羟基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脱氢酶催化S-扁桃酸生成苯乙酮酸；和
C)D-扁桃酸脱氢酶或D-扁桃酸还原酶催化苯乙酮酸生成R-扁桃酸。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述方法用于体内或体外制备R-扁桃酸。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述体内制备R-扁桃酸为向产生苯丙酮酸的菌株或重组菌株内导入表达A)对羟基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶；B)对羟基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脱氢酶；和C)D-扁桃酸脱氢酶或D-扁桃酸还原酶的序列。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述对羟基扁桃酸合成酶来源于Amycolatopsis orientalis或Streptomyces coelicolor。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述对羟基扁桃酸氧化酶来源于Streptomyces coelicolor和Amycolatopsis orientalis。
25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述D-扁桃酸脱氢酶来源于Rhodotorula graminis。
26.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述的产生苯丙酮酸的菌株或重组菌株体内具有L-苯丙氨酸代谢途径。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述的L-苯丙氨酸代谢途径经过人工改造，不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株存活的代谢支路被部分或全部切断。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述的不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株存活的代谢支路包括L-色氨酸途径、L-酪氨酸途径和/或苯丙酮酸到L-苯丙氨酸的反应途径。
29.如权利要求22或26所述的方法，所述的产生苯丙酮酸的菌株或重组菌株为大肠杆菌。
30.如权利要求29所述的方法，所述的大肠杆菌为tyrB aspC tyrA三突变体菌株或tyrA，tyrB，aspC，trpE四突变体菌株。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述的菌株中aroFfbr，pheAfbr过表达。
32.如权利要求22、26、29、30、31任一项所述的方法，其特征在于，所述菌株或重组菌株利用葡萄糖发酵。
33.一种用于发酵生产R-扁桃酸的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株产生苯丙酮酸，且所述重组菌株表达
A)催化苯丙酮酸转变为S-扁桃酸的酶；
B)催化扁桃酸转变为苯乙酮酸的酶；和
C)催化苯乙酮酸转变为R-扁桃酸的酶。
34.如权利要33所述的重组菌株，其特征在于，所述苯丙酮酸通过重组菌株人工改造的L-苯丙氨酸途径代谢获得。
35.如权利要求34所述的重组菌株，其特征在于，所述人工改造的L-苯丙氨 酸代谢途径是指不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株存活的代谢支路被部分或全部切断。
36.如权利要求35所述的重组菌株，其特征在于，所述的不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株存活的的代谢支路包括L-色氨酸途径、L-酪氨酸途径和/或苯丙酮酸到L-苯丙氨酸的酶反应途径。
37.如权利要求33-36任一项所述的重组菌株，其特征在于，所述的重组菌株为大肠杆菌重组菌株。
38.如权利要求37所述的重组菌株，其特征在于，所述的大肠杆菌重组菌株为tyrB aspC tyrA三突变体菌株或tyrA，tyrB，aspC，trpE四突变体菌株。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述的菌株中aroFfbr，pheAfbr过表达。
40.一种将S-扁桃酸转化为R-扁桃酸的方法，其特征在于，所述方法向S-扁桃酸中依次加入：
A)对羟基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脱氢酶催化S-扁桃酸生成苯乙酮酸；和
B)D-扁桃酸脱氢酶或D-扁桃酸还原酶催化苯乙酮酸生成R-扁桃酸。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述对羟基扁桃酸氧化酶来源于Streptomyces coelicolor和Amycolatopsis orientalis。
42.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述D-扁桃酸脱氢酶来源于Rhodotorula graminis。
43.一种手性拆分对映消旋体扁桃酸的方法，其特征在于，向对映消旋体扁桃酸中依次加入：
A)对羟基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脱氢酶催化S-扁桃酸生成苯乙酮酸；和
B)D-扁桃酸脱氢酶或D-扁桃酸还原酶催化苯乙酮酸生成R-扁桃酸。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述对羟基扁桃酸氧化酶来源于Streptomyces coelicolor和Amycolatopsis orientalis。
45.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述D-扁桃酸脱氢酶来源于 Rhodotorula graminis。
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